エリスロポエチン
 本発明に用いるエリスロポエチンは、どの� ��うなエリスロポエチンでも用いることがで� ��るが、好ましくは高度に精製されたエリス� ��ポエチンであり、より具体的には、哺乳動� ��EPO、特にヒトEPOと実質的に同じ生物学的活� ��を有するものである。

 本発明で用いるエリスロポエチンは、い� ��なる方法で製造されたものでもよく、例え� ��、ヒト由来の抽出物から精製して得られた� ��然のヒトEPO(特公平1-38800号公報、など)や、� ��るいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イ� ��スト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞( CHO細胞)、C127細胞、COS細胞、ミエローマ細胞� ��BHK細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種� ��の方法で抽出し分離精製したヒトEPOなどを� ��いることができる。本発明において用いら� ��るエリスロポエチンは、遺伝子工学的手法� ��より製造されたEPOが好ましく、哺乳動物細� ��(特にCHO細胞)を用いて製造されたEPOが好ま� �い(例えば、特公平1-44317号公報、Kenneth Jacobs  et al., Nature, 313 806-810 (1985)、など)。

 遺伝子組換え法により得られるエリスロ� ��エチンには、天然由来のEPOとアミノ酸配列� ��同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列� ��の1または複数のアミノ酸を欠失、置換、付 加等したもので、天然由来のEPOと同様の生物 学的活性を有するもの等であってもよい。ア ミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公 知の方法により行うことが可能である。例え ば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法 (Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275;Zoller, M .J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-5 00;Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12,  9441-9456;Kramer, W. and Fritz, H.J. (1987) Methods E nzymol. 154, 350-367;Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl.  Acad. Sci. USA. 82, 488-492;Kunkel (1988) Methods Enz ymol. 85, 2763-2766)などを用いて、EPOのアミノ� �に適宜変異を導入することにより、EPOと機� �的に同等なポリペプチドを調製することが� �きる。また、アミノ酸の変異は自然界にお� �ても生じうる。一般的に、置換されるアミ� �酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が� �存されている別のアミノ酸に置換されるこ� �が好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質と� �ては、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、 Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H 、K、S、T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、 A、V、L、I、P)、水酸基含有側鎖を有するアミ ノ酸(S、T、Y)、硫黄原子含有側鎖を有するア� ��ノ酸(C、M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖 を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、塩基含有側鎖 を有するアミノ離(R、K、H)、芳香族含有側鎖� ��有するアミノ酸(H、F、Y、W)を挙げることが� ��きる(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標 記を表す)。あるアミノ酸配列に対する1又は� ��数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は 他のアミノ酸による置換により修飾されたア ミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物 学的活性を維持することはすでに知られてい る(Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1984) 81, 5662-5666;Zoller, M.J. & Smith, M. Nucl eic Acids Research (1982) 10, 6487-6500;Wang, A. et  al., Science 224, 1431-1433;Dalbadie-McFarland, G. et  al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 )。

 又、本発明のエリスロポエチンとして、E POと他のタンパク質との融合タンパク質を用� ��ることも可能である。融合ポリペプチドを� ��製するには、例えば、EPOをコードするDNAと� ��のタンパク質をコードするDNAをフレームが� ��致するように連結してこれを発現ベクター� ��導入し、宿主で発現させればよい。本発明� ��エリスロポエチンとの融合に付される他の� ��ンパク質は、特に限定されない。

 又、本発明のエリスロポエチンとして、� ��学修飾したEPOを用いることも可能である。� ��学修飾したEPOの例として、例えば、ポリエ� ��レングリコール等により化学修飾されたEPO( WO90/12874など)、糖鎖のついていないEPOをポリ� ��チレングリコール等により化学修飾したも� ��、その他、ビタミンB12等、無機あるいは有� ��化合物等の化合物を結合させたEPOなどを挙� ��ることができる。

 さらに、本発明のエリスロポエチンとし� ��EPO誘導体を用いることも可能である。EPO誘� ��体とは、EPO分子中のアミノ酸を修飾したEPO� ��はEPO分子中の糖鎖を修飾したEPOのことをい� ��。

 EPO分子中の糖鎖の修飾としては、糖鎖の� ��加、置換、欠失などが含まれる。本発明に� ��いて好ましい糖鎖の修飾としては、EPO分子� ��のシアル酸の欠失を挙げることができる。

 通常、組換え動物細胞により生産したEPO� ��尿由来のEPOのいずれも、糖鎖構造の異なる� ��様なEPOを含むEPO組成物として得られる。EPO� ��成物中のEPO分子に付加しているシアル酸の� ��は、個々のEPO分子によって異なるが、通常� ��1つのEPO分子に11個~15個のシアル酸が付加し� ��いる。これらのシアル酸を除去することに� ��りアシアロ化されたEPO(アシアロEPO)を作製� �ることが可能である。アシアロ化の際に除� �されるシアル酸の数は特に限定されず、全� �のシアル酸を除去してもよいし、1、2、3、4� ��5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14個のシ� ��ル酸を除去してもよい。本発明において好� ��しいアシアロEPOは、EPO分子に付加している� ��アル酸の数が10個以下であり、さらに好ま� �くは5個以下であり、特に好ましくは2個以下 である。なお、本発明において用いられるシ アル酸の数は、EPO組成物に含まれているEPO分 子の平均数を用いる。1分子あたりのシアル� �の平均は当業者に公知の方法によって測定� �ることが可能である(EP0428267公報、など)。

 シアル酸が除去されたEPO(アシアロEPO)は当� �者に公知の方法で作製することができ、例� �ば、シアリダーゼなどの酵素でEPOを処理す� �こと等により作製することが可能である。� �アリダーゼは市販されているものを用いる� �とが可能である。(特表2005-507426号、Nobuo Imai  et al., Eur.J.Biochem, 194, 457-462 (1990)、など)
 さらには、本発明のエリスロポエチンは、� ��鎖改変体EPOであってもよく、これにはEPOのN 末端にシアル酸が付着した糖鎖改変体EPOであ るNESP(Novel Erythropoietin Stimulating Protein: WO85/0 2610、WO91/05867,WO95/05465等に記載)などの糖鎖の� ��変されたEPO類似体が挙げられる。

 EPO分子中のアミノ酸の修飾としては、カ� ��バミル化、ビオチン化、アミジン化、アセ� ��ル化、グアニジン化、などを挙げることが� ��きる。

 修飾されるアミノ酸残基は特に限定されず� ��例えば、リジン、アルギニン、グルタミン� ��、トリプトファンなどを挙げることができ� ��。
組成物
 本発明の組成物には、必要に応じて、懸濁� ��、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存� ��、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形� ��、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元� �、酸化防止剤等を適宜添加することができ� �。

 懸濁剤の例としては、メチルセルロース� ��ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセル� �ース、アラビアゴム、トラガント末、カル� �キシメチルセルロースナトリウム、ポリオ� �シエチレンソルビタンモノラウレート等を� �げることができる。

 溶液補助剤としては、ポリオキシエチレ� ��硬化ヒマシ油、ポリソルベート80、ニコチ� �酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタン� �ノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂� �酸エチルエステル等を挙げることができる� �

 安定化剤としては、デキストラン40、メ� �ルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウ� �、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることが� �きる。

 また、安定化剤としてある種のアミノ酸� ��添加することも可能である(例えば、特開平 10-182481号公報など)。安定化剤として添加さ� �るアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そのナ� �リウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩な� �が含まれる。アミノ酸は1種又は2種以上を組 み合わせて添加することができる。安定化剤 として添加されるアミノ酸は特に限定されな いが、好ましいアミノ酸としては、ロイシン 、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、 アルギニン、ヒスチジン、リジンを挙げるこ とができる。

 等張化剤としては例えば、D-マンニトー� �、ソルビート等を挙げることができる。

 保存剤としては例えば、パラオキシ安息� ��酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソ� ��ビン酸、フェノール、クレゾール、クロロ� ��レゾール等を挙げることができる。

 吸着防止剤としては例えば、ヒト血清ア� ��ブミン、レシチン、デキストラン、エチレ� ��オキサイド・プロピレンオキサイド共重合� ��、ヒドロキシプロピルセルロース、メチル� ��ルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ� ��、ポリエチレングリコール等を挙げること� ��できる。

 界面活性剤としては、非イオン界面活性� ��、例えばソルビタンモノカプリレート、ソ� ��ビタンモノラウレート、ソルビタンモノパ� ��ミテート等のソルビタン脂肪酸エステル;グ リセリンモノカプリレート、グリセリンモノ ミリテート、グリセリンモノステアレート等 のグリセリン脂肪酸エステル;デカグリセリ� �モノステアレート、デカグリセリルジステ� �レート、デカグリセリルモノリノレート等� �ポリグリセリン脂肪酸エステル;ポリオキシ� ��チレンソルビタンモノラウレート、ポリオ� ��シエチレンソルビタンモノオレエート、ポ� ��オキシエチレンソルビタンモノステアレー� ��、ポリオキシエチレンソルビタンモノパル� ��テート、ポリオキシエチレンソルビタント� ��オレエート、ポリオキシエチレンソルビタ� ��トリステアレート等のポリオキシエチレン� ��ルビタン脂肪酸エステル;ポリオキシエチレ ンソルビットテトラステアレート、ポリオキ シエチレンソルビットテトラオレエート等の ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステ ル;ポリオキシエチレングリセリルモノステ� �レート等のポリオキシエチレングリセリン� �肪酸エステル;ポリエチレングリコールジス� ��アレート等のポリエチレングリコール脂肪� ��エステル;ポリオキシエチレンラウリルエー テル等のポリオキシエチレンアルキルエーテ ル;ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ� �グリコール、ポリオキシエチレンポリオキ� �プロピレンプロピルエーテル、ポリオキシ� �チレンポリオキシプロピレンセチルエーテ� �等のポリオキシエチレンポリオキシプロピ� �ンアルキルエーテル;ポリオキシエチエレン� ��ニルフェニルエーテル等のポリオキシエチ� ��ンアルキルフェニルエーテル;ポリオキシエ チレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒ マシ油(ポリオキシエチレン水素ヒマシ油)等� ��ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油;ポリオキ シエチレンソルビットミツロウ等のポリオキ シエチレンミツロウ誘導体;ポリオキシエチ� �ンラノリン等のポリオキシエチレンラノリ� �誘導体;ポリオキシエチレンステアリン酸ア� ��ド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等� ��HLB6~18を有するもの;陰イオン界面活性剤、� �えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸� �トリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭� �原子数10~18のアルキル基を有するアルキル硫 酸塩;ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナト� �ウム等の、エチレンオキシドの平均付加モ� �数が2~4でアルキル基の炭素原子数が10~18であ るポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸 塩;ラウリルスルホコハク酸エステルナトリ� �ム等の、アルキル基の炭素原子数が8~18のア� ��キルスルホコハク酸エステル塩;天然系の界 面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂 質;スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂� �;炭素原子数12~18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エ� �テル等を典型的例として挙げることができ� �。本発明の製剤には、これらの界面活性剤� �1種または2種以上を組み合わせて添加するこ とができる。好ましい界面活性剤は、ポリソ ルベート20,40,60又は80などのポリオキシエチ� �ンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリ� �ルベート20及び80が特に好ましい。また、ポ� ��キサマー(プルロニックF-68(登録商標)など)� �代表されるポリオキシエチレンポリオキシ� �ロピレングリコールも好ましい。

 含硫還元剤としては例えば、N-アセチル� �ステイン、N-アセチルホモシステイン、チオ クト酸、チオジグリコール、チオエタノール アミン、チオグリセロール、チオソルビトー ル、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸 ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数1~7の チオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等が挙げられる。

 酸化防止剤としては例えば、エリソルビ� ��酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチル� ��ドロキシアニソール、α-トコフェロール、� ��酸トコフェロール、L-アスコルビン酸及び� �の塩、L-アスコルビン酸パルミテート、L-ア� ��コルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナト� ��ウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリア� ��ル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジ� ��ミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、ピロリン酸� ��トリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレ� ��ト剤が挙げられる。

 さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウ� ��、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リ� ��酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無� ��塩;クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム 、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添 加される成分を含んでいてもよい。

 本発明のエリスロポエチン含有組成物に� ��ける、有効成分の含有量は、移植臓器 の� �態や大きさ、患者(移植者、非移植者)の症状 、体重、年齢や性別等を考慮して適宜各有効 成分毎に決定する。通常、10~1000U/kg体重、好� ��しくは100~600U/kg体重程度である。

 本発明のエリスロポエチン含有組成物は� ��被移植者(レシピエント)に対する移植手術� �および/または術前・術後において被移植者� ��投与することができるが、好ましくは、移� ��臓器に直接投与することによって本発明の� ��果を得ることができる。投与は、移植者(ド ナー)から摘出した臓器を移植前に当該組成� �に直接接触させることで投与してもよいし� �下記実施例に記載のように、スポンジ等に� �み込ませて投与することもできる。また、� �植前の保存液として使用してもよい。保存� �の添加物として、例えば、生理食塩水、リ� �酸緩衝生理食塩水、クエン酸緩衝液などの� �理的に許容される緩衝液や等張化液を用い� �ことができる。また従来から移植用臓器の� �存液として臨床的に用いられているユーロ� �コリンズ液やUW液などと併用することも可能 である。