TITRE : PROTEINE A ACTIVITE XYLANASE

La présente invention concerne une protéine ayant au moins une activité xylanase.

Par activité xylanase, on entend selon l’invention une protéine ou une enzyme, d’origine naturelle ou modifiée, capable de favoriser la dégradation, au moins partielle, du xylane, par hydrolyse, en libérant du xylose ou une molécule intermédiaire susceptible d’être transformée en xylose par une autre enzyme, dans des conditions déterminées. On connait plusieurs enzymes, ou xylanases, répondant à cette définition, qui diffèrent par leur mode d’action spécifique de certaines liaisons chimiques, parmi lesquelles l’endoxylanase ou endo-1 ,4-p- xylanase et la beta-xylosidase.

Le xylane est un polysaccharide dit non amylacé (PNA) abondant dans la nature, il est un constituant majoritaire de l’hémicellulose. Il est largement présent dans l’alimentation humaine et animale du fait de régimes pouvant être riches en fibres végétales. Ni l’homme, ni les mammifères ne sont cependant aptes à produire une xylanase ou en tout cas pas en quantité suffisante pour une hydrolyse efficace, et un apport de xylanase dans l’alimentation peut être souhaitable pour favoriser la digestion des glucides. Ainsi, il est fortement recouru à la supplémentation de xylanase, en nutrition animale, en particulier pour les animaux d’élevage, et ceci afin d’optimiser l’utilisation de la part fibreuse de l’aliment par l’animal entraînant une augmentation des performances de croissance. On parle d’additif zootechnique.

L’action d’une xylanase étant spécifique, on utilise avantageusement un mélange de xylanases à mécanismes de préférence complémentaires. Une xylanase ou un mélange de xylanases est(sont) aussi généralement utilisée(s) en combinaison avec une ou plusieurs autres enzymes afin de dégrader d’autres polysaccharides présents dans l’alimentation, telles qu’une beta-glucanase, une amylase, une protéase ou afin de conférer un bénéfice supplémentaire à l’additif, telles qu’une phytase.

Les xylanases peuvent être produites naturellement par de nombreux organismes comme des plantes, des algues, des gastropodes, des arthropodes, des levures, des champignons, des bactéries, des protozoaires ; elles ont cependant fait l’objet de nombreuses études pour améliorer leur propriétés et l’industrie a recours majoritairement à des protéines produites par des organismes génétiquement modifiés.

Si, dans le présent texte, l’intérêt d’une xylanase selon l’invention est illustré dans une application à la nutrition animale, l’invention n’y est pas limitée et la vocation d’une telle xylanase peut être toute autre par exemple dans les domaines du traitement des déchets, de l’industrie des pâtes et papiers, des textiles, de la production de biocarburants, de l’industrie agroalimentaire comme dans la panification.

En tant qu’additif zootechnique, la xylanase ou le mélange d’enzymes la contenant doit résister aux conditions notamment thermiques de l’environnement dans lequel il est utilisé, à savoir, celles du système digestif de l’animal dont la température peut varier d’environ 35°C à 42°C, voire plus. Par ailleurs, la xylanase ou le mélange d’enzymes la contenant est mélangé à l’aliment et de ce fait soumis à un processus de transformation pour sa mise en forme, comprenant des étapes de traitement mécanique, de traitement thermique. Le recours à la chaleur pour mettre en forme l’aliment peut atteindre des températures de l’ordre de 80°C voire plus et il est essentiel que la ou les enzymes ne soient pas dénaturées par un tel traitement pour conserver leur potentiel hydrolytique et donc leur bénéfice (J. Inborr et al. Animal Feed Science and Technology : Stability of feed enzymes to steam pelleting during feed processing, 46 (1994) pp 179-196). Si la xylanase d’origine naturelle n’est pas affectée par des températures allant jusqu’à 50°C, ce n’est plus le cas à des températures supérieures, et son activité peut chuter drastiquement. En effet, l’exposition à de telles températures provoque des modifications irréversibles de l’enzyme notamment par destruction des liaisons intramoléculaires dans les structures tertiaire ou quaternaire protéiques, inhibant l’activité de l’enzyme.

On est donc à la recherche d’enzymes à activité xylanase, thermostables, capables de supporter les traitements thermiques qui lui sont appliqués et qui possèdent une activité xylanase supérieure à celle de l’enzyme naturelle exposée aux mêmes conditions.

La mise au point d’une xylanase thermostable qui puisse être utilisée à l’échelle industrielle comme dans le domaine de la nutrition animale se heurte néanmoins à un autre obstacle, celui d’une production rentable.

Le document Zhe Xu et al., Recent advances in the improvement of enzyme thermostability by structure modification, 2020, vol. 40, no. 1 pp 83-98, rapporte les derniers développements sur l’élaboration d’enzymes thermostables en lien avec leur structure secondaire et tertiaire. Des mutations sont effectuées en vue d’engendrer des interactions covalentes et non covalentes susceptibles de conférer à l’enzyme une plus forte thermostabilité. Si une relation existe effectivement entre structure moléculaire et thermostabilité, l’amélioration de la thermostabilité d’une enzyme reste une difficulté malgré les outils de l’ingénierie des protéines.

L’invention apporte une xylanase mutée qui est un bon compromis entre thermostabilité et production industrielle. En effet, après une exposition à des températures de l’ordre de 80°C, l’enzyme de l’invention conserve une forte activité xylanase et ce, dans les conditions environnementales auxquelles elle est soumise dans le système digestif d’un animal, tel qu’un pH acide, une température d’environ 35°C à 42°C, tout en pouvant être produite en des rendements de l’ordre de ceux de l’enzyme naturelle.

Le point de départ de l’invention est une xylanase recombinante EvAuXyn11A présentant une plus grande thermostabilité que les xylanases de la famille 11 des glycosidehydrolases (GH) naturellement produites et qui est décrite dans le document CN102492676A. EvAuXyn11A est obtenue à partir de la xylanase AuXyn11 dont la séquence N-terminale a été substituée par celle de EvXynATS.

Selon l’invention, en partant d’une xylanase thermostable XYN3 identifiée par SEQ ID NO : 1 , une ou des mutations spécifiques ont été introduites, entraînant une augmentation de la thermostabilité de la xylanase inattendue.

Précisément, l’invention concerne une protéine thermostable exprimant au moins une activité xylanase, ladite protéine comprenant ou consistant en une séquence peptidique représentée par SEQ ID NO : 1 comportant au moins les mutations L34C et R38C.

Comme le montrent les résultats présentés plus loin dans le texte, ces mutations entraînent, après une exposition de 50 minutes à 80°C, plus qu’un doublement de l’activité xylanase de la protéine XYN3 mesurée à 50°C.

Il a été en outre découvert que des mutations complémentaires pouvaient contribuer à une augmentation du rendement de production de la protéine et/ou une amélioration de sa thermostabilité. Ainsi, l’invention concerne une protéine thermostable exprimant au moins une activité xylanase, ladite protéine comprenant ou consistant en une séquence peptidique représentée par SEQ ID NO : 1 qui comporte au moins les mutations L34C et R38C et une ou plusieurs mutations choisies parmi T1 12E, Q145E, S187R. La présence de l’une de ces mutations complémentaires, voire deux et même trois, conduit à une protéine hautement thermostable sans significativement affecter son rendement de production.

L’invention a aussi pour objet un polynucléotide codant pour une protéine de l’invention telle que définie précédemment.

Par polynucléotide codant pour une protéine, on comprend une séquence d’acide(s) nucléique(s) d’ADN, ADNc, ou ADN de synthèse qui répond au cadre de lecture ouvert (ORF) qui est traduit en ladite protéine, en particulier, il peut comprendre un codon start et un codon stop. Il peut en outre comporter toute séquence nucléique supplémentaire nécessaire à l’expression de ladite protéine ; il s’agira notamment de séquences régulatrices incluant au moins un ou des promoteurs et des signaux de début et d’arrêt de la transcription ou de la traduction. Il appartient bien entendu aux connaissances générales de l’homme du métier de recourir à tous les outils, méthodes et techniques auxquels il a accès dans ce domaine de la biologie.

Ainsi, un polynucléotide de l’invention comprend ou consiste en une séquence nucléotidique SEQ ID No : 2 présentant à chacune des positions 100-102 et 112-114, le codon TGT ou TGC codant pour la cystéine, pour prendre en compte la dégénérescence du code génétique. Un autre polynucléotide de l’invention comprend ou consiste en SEQ ID NO : 2 présentant à chacune des positions 100-102 et 112-114, le codon TGT ou TGC codant pour la cystéine, et présentant en outre au moins l’une quelconque des mutations suivantes, ou deux quelconques des mutations, voire les trois mutations suivantes : à la position 334-336, le codon GAA ou GAG codant pour l’acide glutamique, à la position 433-435, le codon GAA ou GAG codant pour l’acide glutamique, à la position 559-561 , le codon CGT, CGC, CGA, CGG, AGA.AGG codant pour l’arginine.

Il appartient bien entendu aux connaissances générales de l’homme du métier de déduire d’une protéine de l’invention, la séquence nucléotidique du cadre de lecture correspondant.

Encore un autre objet de l’invention est un vecteur d’expression tel qu’un plasmide, comprenant un polynucléotide de l’invention, et au moins les éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte.

L’invention concerne encore une cellule hôte comprenant un vecteur d’expression précité.

Comme dit précédemment, une protéine de l’invention trouve une application, sans y être limitée, dans l’alimentation et en particulier dans la nutrition animale. A cet égard, l’invention a trait à un additif zootechnique comprenant au moins une telle protéine, et aussi à un aliment pour la nutrition animale comprenant au moins un tel additif zootechnique. Une cible préférée est les animaux d’élevage monogastriques.

Ainsi, toute utilisation d’une protéine de l’invention pour l’alimentation d’animaux par exemple d’animaux d’élevage et en particulier d’animaux d’élevage monogastriques, ou pour préparer un additif zootechnique tel que défini ci-dessus ou un aliment tel que défini ci-dessus fait partie de l’invention.

L’invention concerne aussi un procédé de fabrication d’une protéine de l’invention, comprenant au moins une étape de mise en culture d’une cellule hôte ci-dessus définie dans des conditions adaptées à la production de ladite protéine et une étape de récupération de ladite protéine.

L’invention est illustrée dans les exemples qui suivent à l’appui des figures selon lesquelles :

[Figure 1] représente la thermostabilité du variant XYN321 par rapport à la protéine XYN3 de référence ;

[Figure 2] représente la thermostabilité des variants XYN321 , XYN328 et XYN320 par rapport à la protéine XYN3 de référence ; [Figure 3] représente la thermostabilité du variant XYN321 , XYN326 et XYN327 par rapport à la protéine XYN3 de référence ;

[Figure 4] illustre la thermostabilité du variant XYN321 par rapport à la protéine XYN3 de référence au cours la fabrication d’un aliment selon l’invention.

Exemple 1 : Fabrication des variants de XYN3

Les variants ont été obtenus par la technologie d’ADN recombinant classique mettant en œuvre les étapes de fourniture d’une séquence d’acide nucléique codant pour la protéine d’intérêt, l’insertion de ladite séquence dans un vecteur d’expression et introduction dudit vecteur dans un système cellulaire approprié permettant par culture de produire la protéine recombinante.

Les gènes codant les variants ont été obtenus par synthèse chimiques des séquences nucléotidiques.

Ces technologies font entièrement partie des connaissances générales de l’homme du métier. A toutes fins utiles, il peut être fait référence à AL Demain ét al., Biotechnology Advances, Production of Recombinant Proteins by Microbes and Higher Organisms, 27 2009, pp 297-306 pour la production des protéines, et à RA Hugues et al., Methods in Enzymology, Volume 498, 2011 , Elsevier Inc. Gene Synthesis : Methods and Applications, Chapter 12, pp 277-309 pour la synthèse des gènes impliquée dans la production des variants.

Les variants listés dans le tableau 1 ci-dessous ont été fabriqués.

[Tableau 1]

Exemple 2 : Influence de la ou des mutations sur la production de la protéine, sur son activité xylanase et sur sa thermostabilité

2.1-lnfluence sur la production :

La production de chacun des variants listés dans le tableau 1 est évaluée sur la base de l’activité enzymatique dosée selon la méthode DNS. Cette méthode consiste à incuber une solution contenant le variant en présence de xylane de hêtre pendant 10 minutes à 50°C. La xylanase coupe la chaine de xylane (composée de xyloses) en chaines plus courtes ou oligosaccharides et libère ainsi des extrémités réductrices ou xyloses réducteurs. Ceux-ci sont dosés par l’acide dinitrosalicylique (DNS) à 95°C et à pH alcalin, le DNS se fixe sur les oses réducteurs laissant apparaître une couleur jaune-orangée proportionnelle à la quantité d’oses réduits et mesurable au spectrophotomètre à 540 nm. Chaque mesure est réalisée en duplicat. La quantification est faite grâce à une gamme étalon de xylose, sucre réducteur.

2.2-lnfluence sur l’activité xylanase après incubation à 80°C

La stabilité thermique a été étudiée in vitro en incubant les surnageants de cultures contenant une quantité suffisante de chaque enzyme à 80°C et en mesurant leur activité, après une incubation de 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50 et 60 minutes à 80°C. Immédiatement après l’incubation à 80°C, les échantillons sont placés dans de la glace (+4°C) puis centrifugés pour faire descendre tout le surnageant au fond du tube. Le surnageant est ensuite dilué dans du tampon acétate de sodium 25mM pH 4,0 + 0,1 % BSA de façon à obtenir une concentration de xylanase appropriée pour le dosage DNS. L’activité xylanase est ensuite mesurée par DNS pour chaque temps d’incubation.

Les résultats de la production et de l’activité xylanase à 80°C sont présentés dans le [Tableau 2] ci-dessous.

[Tableau 2]

A l’appui du [Tableau 2] et des figures, on observe les phénomènes suivants :

[Figure 1] : les mutations L34C et R38C (XYN321 ) générant un pont disulfure permettent d’augmenter considérablement la stabilité de la xylanase : l’activité résiduelle après 50 minutes d’incubation à 80°C est de 71 % en moyenne contre 31 % pour la protéine native. Même si elles entraînent une légère diminution de la production de l’enzyme XYN321 de l’enzyme XYN-3 exprimée sous le contrôle des mêmes promoteurs, celle-ci est insignifiante par rapport à la thermostabilité conférée à la protéine ;

[Figure 2] : la combinaison des mutations L34C et R38C (XYN321 ) générant un pont disulfure avec une mutation T112E ou S187R générant un pont salin entraîne une augmentation de la stabilité de la protéine de 10% ;

[Figure 3] : la combinaison des mutations L34C et R38C (XYN321 ) générant un pont disulfure avec la mutation T1 12E générant un premier pont salin et l’une ou l’autre des mutations Q145E et S187R générant un second pont salin entraîne une augmentation de la stabilité de la protéine de 25%.

Il ressort en outre du [Tableau 2] que d’autres mutations engendrant la création de ponts disulfure ont pour conséquence d’abaisser la thermostabilité de l’enzyme par rapport à l’enzyme XYN3 de référence (variants XYN32, XYN391 ) et que certaines entraînent l’inactivation de l’enzyme (variant XYN324). On note aussi que les mutations préférentielles selon l’invention (T112E, Q145E et S187R) en l’absence des mutations L34C et R38C mais en présence des mutations T179C/S188C génératrices de ponts disulfure, ne permettent que modestement compenser la thermostabilité de l’enzyme.

Exemple 3 : Influence de la ou des mutations d’une xylanase selon l’invention sur son activité enzymatique mesurée sur un échantillon d’aliment (test in vivo)

Préparation d’un aliment selon l’invention

Un procédé approprié est décrit dans le document W02009/019335A1.

Fabrication des particules d’enzyme

L’enzyme sous forme liquide est déposée sur un support consistant en de la farine (ou tout autre support adapté) par spray-drying, impliquant une pulvérisation de l’enzyme sur la farine et co-séchage, par exemple par atomisation (ou spray-drying) pour obtenir une poudre. Celle-ci est ensuite granulée par voie humide par imprégnation d’un enrobant, puis recouverte par un agent d’enrobage protecteur et ensuite séchée.

Granulation de l’aliment

Les particules d’enzyme et une base nutritionnelle tel qu’un mélange de blé, de tourteau de soja, de graines de soja extrudées, de l’huile de palme, du carbonate de calcium, du phosphate bicalcique, du sel et un prémix contenant de la méthionine, sont mélangées et chauffées à une température de 60 à 100°C, de préférence choisie entre 70 et 90°C. Le mélange est ensuite pelletisé dans une presse à granuler, les pellets obtenus sont coupés à la longueur souhaitée puis séchés, pour obtenir l’aliment granulé.

Mesure de l’activité xylanase de l’aliment ainsi fabriqué

Après extraction de l’enzyme contenue dans l’aliment granulé, l’activité xylanase résiduelle est dosée selon la méthode par viscosimétrie. Cette méthode consiste à incuber une solution contenant le variant en présence d’arabinoxylane de blé à 30°C et à déterminer la viscosité du mélange à l’aide d’un microviscosimètre durant 20 minutes. L’activité xylanase correspond à la dégradation de l’arabinoxylane en oligoarabinoxylane et est proportionnelle à la réduction de la viscosité du substrat en présence de l’enzyme. Chaque mesure est réalisée en duplicat.

Les résultats sont représentés sur la [Figure 4] ; ils mettent en évidence la stabilité de l’activité xylanase de la protéine XYN321 par rapport à la protéine XYN3 de référence.