Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно, к онкологии, и может быть использовано для диагностики рака предстательной железы.

Уровень техники

После рака кожи рак простаты (рак предстательной железы, РПЖ) - наиболее часто диагностируемая форма рака. Во многих странах РПЖ является второй/ третьей по распространенности причин смерти мужчин в возрасте после 40 лет. В настоящее время считается, что важнейшим фактором борьбы с РПЖ является ранняя диагностика.

Традиционным и наиболее распространенным методом выявления РПЖ является тест на ПСА (простатспецифический антиген, prostate specific antigen PSA) в сыворотке крови (Stamey Т.А. et al. Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of the prostate // N Engl J Med. 1987 Oct 8; 317(15):909-16). Однако за 30 лет клинической практики накопился большой объем статистических данных, свидетельствующих о низкой специфичности ПСА как онкомаркера, что проявляется в виде значительного числа ложноположительных результатов. Поэтому внимание многих исследователей сосредоточено на поиске новых онкомаркеров.

Востребованными в медицинской практике могут быть два разных метода диагностики РПЖ: первый - неинвазивный, быстрый, легкий, реализуемый на стандартном для клинической лаборатории оборудовании, который может использоваться для рутинных / серийных анализов при диспансеризации, обследовании населения, мониторинге групп риска, мониторинге рецидивов, мониторинге хода болезни, мониторинге терапии и др.; второй - метод, необходимый для окончательного дифференциального анализа, для которого единственным важнейшим параметром является близкая к 100% точность.

В настоящее время активно исследуется ряд биомаркеров рака простаты (например РСАЗ, TMPRSS2:ERG, PSCA (prostate stem cell antigen), AMCAR), которые определяются неинвазивными методиками за счет измерения их количства в моче (см., например, Коо К.М. et al. Colorimetric TMPRSS2-ERG Gene Fusion Detection in Prostate Cancer Urinary Samples via Recombinase Polymerase Amplification // Theranostics., 2016 Jun 15;6(9): 1415-24; Deras I.L. et al., PCA3: a molecular urine assay for predicting prostate biopsy outcome // J Urol. 2008 Apr; 179(4): 1587-92). Однако это маркеры требуют для своего обнаружения использования достаточно дорогостоящих методов, основанных на полимеразной цепной реакции и/или иммуногистохимическом исследовании, и эти анализы сложно произвести в рамках стандартной клинической лаборатории. В последнее время активно исследуется возможность диагностики РПЖ по биомаркерам экзосом мочи. Так, например, патент US7897356B2 раскрывает способ диагностики РПЖ путем идентификации биосигнала на экзосомах, включающий захват и выделение экзосом с использованием обычных поверхностных белков экзосом CD63, CD9 или CD81 , а затем качественный и количественный анализ уровня специфических для РПЖ маркеров PSMA, PCSA, EpCam, В7НЗ (CD276). Также известен способ и набор для количественной оценки и определения экзосом для диагностики рака предстательной железы и гиперплазии предстательной железы (US20130196355A1), основанный на иммуноферментном анализе с использованием анти-Р _* аЬ5 в качестве улавливающего антитела для выделения всех экзосом, из которых в последующем выделяют экзосомы с помощью анти-PSA детектирущего антитела и сравнивают уровень таких экзосом с эталонным. Однако, во-первых, биомаркер, подходящий для неинвазивной, быстрой, реализуемой на стандартном для клинической лаборатории оборудовании диагностики РПЖ, так и не был найден; а во-вторых, выделение экзосом, необходимое для реализации вышеупомянутых способов, - весьма нетривиальная задача, нерешаемая для большинства клинических лабораторий.

Таким образом, несмотря на существующие исследования по диагностике РПЖ, медицинская практика диспансеризации населения, а также задачи мониторинга групп риска, хода болезни, ее терапии и рецидивов нуждаются в рутинном методе анализа РПЖ, реализуемом на стандартном оборудовании.

Раскрытие изобретения

Задачей и техническим результатом изобретения является нахождение нового диагностического маркера рака предстательной железы (РПЖ), позволяющего осуществлять неинвазивную диагностику заболевания, а также разработка на его основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях стандартной клинической лаборатории клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики РПЖ.

Поставленная задача решается за счет применения для диагностики РПЖ нового биомаркера, представляющего собой интегрин альфа V или его фрагмент, выявляемого в цельной моче пациента. Согласно изобретению, интегрин альфа V или его фрагмент могут быть использованы в качестве биомаркера путем их выявления как в виде отдельных субъединиц, так и в составе гетеродимеров интегринов, таких как ανβ1 , ανβ3, ανβ5, ανβ6 и/или ανβδ.

Задача также решается при осуществлении способа диагностики РПЖ, включающего выявление в цельной моче пациента интегрина альфа V или его фрагмента. При этом, при обнаружении интегрина альфа V или его фрагмента в цельной моче в количестве от 20 нг/мл диагностируют отсутствие рака предстательной железы.

В некоторых вариантах изобретения при осуществлении способа диагностики РПЖ проводят дополнительные клинические, лабораторные и/или инструментальные обследования.

В некоторых частных вариантах осуществления изобретения дополнительные клинические, лабораторные и/или инструментальные методы обследования проводят, если количество интегрина альфа V или его фрагмента, обнаруженного в моче пациента, составляет 20 нг/мл или менее этого уровня.

Также задача решается путем разработки набора для проведения диагностики рака предстательной железы в цельной моче пациента, который включает по меньшей мере одно антитело или его функциональный фрагмент, специфичное к интегрину альфа V или его фрагменту и не обладающее кросспецифичностью к другим пептидам мочи.

В некоторых вариантах изобретения набор представляет собой тест-систему для проведения твердофазного иммуноферментного анализа.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 Результаты измерений интегрина альфа V в утренней моче мужчин старше 50 лет: п - число измерений. Горизонтальная линия - 20 нг/мл биомаркера.

Фиг 2. Результаты математической обработки данных, приведенных на Фиг.1 По оси X - концентрация интегрина альфа V, нг/мл,

По оси Y - вероятность обнаружения интегрина альфа V в моче различных групп обследуемых. Вертикальные линии - математические ожидания.

Термины и определения

В настоящем описании термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин РПЖ расшифровывается как рак предстательной железы, ДГПЖ - подразумевает доброкачественные образования простаты (аденома, простатит) и термин норма описывает образцы, полученные от индивидуумов старше 50 лет без патологий предстательной железы.

Под термином «цельная моча» подразумеваются образцы мочи как не подвергавшиеся никакой обработке, так и образцы, полученные после центрифугирования, фильтрации или других процедур, позволяющих отделить растворимые компоненты мочи от нерастворимой фракции. Под «маркером» или «биомаркером», если не указано иное, в настоящем описании подразумевается интегрин альфа V (идентификационный номер UniProtKB Р06756-1) и его изоформы (Р06756-2; Р06756-3). ). Интегрин альфа V (другие названия - aV, CD51 , MSK8, vitronectin receptor a (VNRa)) - мембранный белок, гликопротеин из надсемейства интегринов, продукт гена ITGaV, находящегося на 2-й хромосоме в положении 2q31-q32.

Используемый здесь термин «антитело» касается целого иммуноглобулина или его фрагмента, например, типа Fab или (Fab') ₂ , сохраняющего антигенсвязывающую активность. Это может быть встречающееся в природе антитело или антитело, полученное путем иммунизации (в том числе, например, химерное антитело или гуманизированное антитело) или рекомбинантное антитело, построенное с помощью методов генной инженерии.

В настоящем описании под антителом или его фрагментом подразумевается антитело, специфически связывающиеся с интегрином альфа V или его фрагментом и не обладающее кросспецифичностью к другим белкам (пептидам, их фрагментам) мочи, т.е. такое антитело, которое обладает (значительно) большей аффинностью к интегрину альфа V или его фрагменту, чем к другим белкам (пептидам, их фрагментам) мочи.

В диагностическом наборе по настоящему изобретению могут быть использованы антитела, которые можно получить от поставщиков. Или же эти антитела могут быть получены упомянутыми выше или иными способами.

Без дальнейшего уточнения предполагается, что на основе приведенного выше описания квалифицированный в данной области специалист способен применить настоящее изобретение во всей его полноте. Приведенные далее варианты являются только иллюстративными. Они никаким образом не ограничивают раскрытие настоящего изобретения. Все цитируемые публикации включены в виде ссылок.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученными в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется графическими материалами.

Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования способа согласно настоящему изобретению и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Подробное раскрытие изобретения

Интегрин альфа V (HGNC: 6150: Entrez Gene: 3685: Ensembl: ENSG00000138448: OMIM: 193210: UniProtKB: P06756) - мембранный белок, гликопротеин из надсемейства интегринов, продукт гена ITGaV, находящегося на 2-й хромосоме в положении 2q31-q32. Интегрин альфа V состоит из 1048 аминокислот. Зрелая молекула интегрина альфа V представляет собой гликопротеин длиной 1018 аминокислот (см. SEQ NO: 1), молекулярная масса белковой части— 116,0 кДа.

Зрелая молекула интегрина альфа V образует гетеродимерный комплекс с интегринами бета-1 , бета-3, бета-5, бета-6 или бета-8. Интегрины с альфа V являются рецепторами для ряда лигандов, распознавая последовательность аргинин-глицин- аспартат (R-G-D). Интегрины с альфа V участвуют во многих процессах развития эмбриона, в ангиогенезе и остеопорозе.

В ходе проведенных исследований неожиданно было обнаружено, что количественное содержание интегрина альфа V в цельной моче коррелирует с заболеванием раком предстательной железы, что позволило использовать его в качестве биомаркера для диагностики РПЖ, а также позволило разработать на основе нового биомаркера новый метод диагностики РПЖ. Количественное определение интегрина альфа V в цельной моче позволяет осуществлять неинвазивную диагностику заболевания, а простая методика проведения анализа позволяет использовать предлагаемый метод в условиях стандартной клинической лаборатории клинических или поликлинических медицинских учреждений.

Изобретением также охватываются наборы для проведения диагностики РПЖ по изобретению. Такие наборы включают антитела против интегрина альфа V или его фрагментов, которые могут быть выявлены как в виде отдельных субъединиц, так и в составе гетеродимеров, таких как гетеродимерные комплексы с интегринами бета-1 , бета-3, бета-5, бета-6 и/или бета-8. Согласно изобретению, могут быть использованы любые антитела или их фрагменты, специфически связывающиеся с интегрином альфа V и не обладающее кросспецифичностью к другим пептидам мочи. К таким антителам могут относиться, но не ограничиваются ими, как любые известные из уровня техники антитела/фрагменты антител против интегрина альфа V (например, Polyclonal Antibody to Integrin Alpha V (ITGaV) http://www.elabscience.com/Manual/Antibody/ ENZENT2365.pdf , http://cloud-clone.com/products/PAB282Hu01.html, http://www.genetex.com/ lntegrin-alpha-5- antibodv-C-term-GTX81964.html. Monoclonal Antibody to Integrin Alpha V (ITGaV) http://www.abcam.com/integrin-alpha-5-antibodv-epr7854-ab150 361.html,

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/mabt207?la ng=en&region=RU, http://cloud- clone.com/products/MAB282Hu22.html, http://www.antibodies-online.com/abstract/lntegrin +alpha+V+(ITGAV)+Antibody/), так и новые, не известные ранее антитела/фрагменты антител, в том числе антитела (фрагменты антител), модифицированные с целью повышения их аффинности известными способами, которые могут быть получены с использованием известных методов, таких как метод иммунизации (в том числе это могут быть, например, химерные антитела или гуманизированные антитела) или метод получения рекомбинантных антител, построенных с помощью методов генной инженерии.

Диагностический набор включает в себя по меньше мере одно антитело/фрагмент антитела, специфически связывающееся с интегрином альфа V (например, либо иммобилизованное на подложке, либо в лиофилизированной форме, либо в виде водного раствора) и один или более чем один реагент, полезный для проведения диагностического анализа. Когда антитело против интегрина альфа V мечено ферментом, набор может включать субстраты и кофакторы, требующиеся для данного фермента (например, субстрат-предшественник, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, в набор могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или буфер для лизиса) и тому подобное. В определенных воплощениях антитело против интегрина альфа V, включенное в диагностический набор, иммобилизовано на твердой поверхности, или твердая поверхность (например, предметное стекло или пластиковая плашка, или диагностическая полоска и др.), на которой можно иммобилизовать антитело, включена в набор. Относительные количества разных реагентов могут широко варьировать для обеспечения концентраций реагентов в растворе, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В конкретном воплощении антитело и один или более чем один реагент могут быть предоставлены (по отдельности или совместно) в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включающих эксципиенты, которые при растворении будут давать раствор реагента, имеющий подходящую концентрацию.

В некоторых вариантах набор для диагностики РПЖ может представлять собой тест-систему произвольной конструкции, например, диагностические полоски, массив, чип и пр. или набор реагентов, предназначенный для использования при ручном или автоматизированном анализе, или с частично/ полностью автоматическим/ роботизированным анализатором; набор реагентов также может включать приспособление, например плашку, с иммобилизованными антителами, позволяющую провести твердофазный ИФА или любой другой анализ с чувствительностью не менее 0.2 нг /мл.

В некоторых вариантах изобретения при осуществлении способа диагностики РПЖ дополнительно проводят любые известные из уровня техники клинические, лабораторные и/или инструментальные методы обследования.

Оригинальный биомаркер интегрин альфа V детектируется в цельной или любой фракции мочи пациента, включая экзосомы, но не ограничиваясь ими.

В некоторых вариантах воплощения изобретения биомаркер интегрин альфа V может быть использован в диагностике РПЖ в комбинации с любыми другими биомаркерами, повышающими качество (достоверность, точность и/или др.) диагностики РПЖ. К таким биомаркерам относятся, но не ограничиваются ими, такие как, например, простатспецифический антиген, РСАЗ, TMPRSS2:ERG, PSCA (prostate stem cell antigen), AMCAR и/или другие.

Примеры воплощения изобретения

Диагностика РПЖ по изобретению может быть проведена любым методом анализа, способным определить содержание интегрина альфа V в моче пациента в диапазоне от 0 до 100 нг/мл. В нашем конкретном случае диагностика осуществлялась следующим образом.

У обследуемого брали 30 (можно до 50) мл первой порции утренней мочи.

Для проведения измерения уровня интегрина альфа V в моче использовали следующие процедуры:

- образец мочи осветляли центрифугированием 15 мин при скорости 2 000 оборотов в мин (можно использовать фильтрацию через мембраны с размером пор 0.22- 0.45 нм или любой другой доступный метод, позволяющий отделить растворимую фракцию белков мочи от нерастворимого осадка);

- содержание интегрина альфа V определяли в конкретном случае методом ИФА, используя коммерчески доступный «SEB282Hu 96 Tests. Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Integrin Alpha V (ITGaV)» фирмы Cloud-Clone Corp. (http://cloud- clone.com/products/SEB282Hu.html), строго следуя инструкции (http://cloud- clone.com/manual/ELISA-Kit-for-lnteqrin-Alpha-V-(ITGaV)-SEB2 82Hu.pdf).

Для этого:

- 25 мкл. мочи вносили в лунку 96-луночной плашки с иммобилизованными антителами;

- инкубировали 1.5 часа при 37°С;

- жидкость удаляли и добавляли 100 мкл. детектирующего реагента А;

- инкубировали 1.5 часа при 37°С;

- жидкость удаляли, и лунка промывалась 3 раза промывающим раствором. После каждого промывания жидкость тщательно удалялась вытряхиванием на фильтровальную бумагу;

- добавляли 100 мкл. детектирующего реагента В;

- плашка инкубировалась 0.5 часа при 37°С;

- жидкость удалялась, и лунка промывалась 5 раз промывающим раствором. После каждого промывания жидкость тщательно удалялась вытряхиванием на фильтровальную бумагу;

- добавляли 90 мкл. субстрата ТМБ;

- инкубировали 20 мин. при 37°С; - добавляли 50 мкл. стоп-реагента

- результат измерялся немедленно фотометрически при 450 нм. Для определения уровня ITGAV в каждом экспериментальном образце мочи согласно инструкции производителя использовали калибровочную кривую полученную в результате измерения различных разведений чистого (гомогенного) белка.

При этом повышение точности анализа и воспроизводимости результатов возможно двумя путями:

- за счет контроля процесса сбора мочи: нужно именно 30-50 мл первой порции утренней мочи;

- собирая 30-50 мл первой порции мочи после массажа простаты.

Моча может храниться при +4 °С в течение суток и 2-3 недели - при -18 °С.

В некоторых случаях также бывает целесообразным повторное проведение анализа. Изобретение также может быть использовано для контроля эффективности лечения РПЖ путем проведения повторных анализов с целью выявления уровня интегрина альфа V в цельной моче пациента в процессе, а также после завершения лечения.

На Фиг.1 показаны экспериментальные результаты измерений уровня интегрина альфа V в утренней моче здоровых людей, пациентов с доброкачественными образованиями и больных с РПЖ, полученные по вышеописанной методике.

На графике Фиг.2 показаны кривые вероятности распределения значений для трех наборов данных и математические ожидания соответствующих измерений (вертикальные линии). Как следует из графика, математические ожидания уровня биомаркера у здоровых людей и пациентов с доброкачественными образованиями (между 24 нг/мл и 32 нг/мл) существенно отличаются от математического ожидания уровня биомаркера у больных с РПЖ (~4 нг/мл). Обработка была проведена в предположении гауссова распределения исходных данных.

Как следует из полученных данных, уровень интегрина альфа V в моче выше 20 нг/мл свидетельствует об отсутствии РПЖ (100%), при этом пациент может быть здоров или иметь гиперплазию простаты (простатит / аденому). Уровень интегрина альфа V 20 нг/мл и менее требует дополнительного анализа, например, посредством взятия пункции и гистологического анализа.

Приведенные данные свидетельствуют, что интегрин альфа V может быть использован в качестве нового биомаркера для диагностики РПЖ, а его определение в моче может быть использовано для проведения неинвазивной диагностики РПЖ, а также для разработки на его основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях стандартной клинической лаборатории клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики РПЖ. Предлагаемый способ диагностики может быть использован для обследования населения, мониторинга групп риска, мониторинга рецидивов, мониторинга хода болезни, мониторинга терапии.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.