Rama de Ia Técnica

Esta invención está relacionada con el inmunodiagnóstico, específicamente Ia parte dedicada a los microarreglos de proteínas. Además, está vinculada con Ia

Inmunoquímica y los ensayos Inmunofluorescentes para Ia detección de diferentes analitos y con Ia Química, en el campo de Ia Síntesis Química Orgánica, específicamente Ia dedicada a Ia síntesis química de péptidos en fase sólida. También se relaciona con Ia Bioquímica en Io referido a Ia estructura de proteínas y predicción de sus determinantes antigénicos.

Arte Previo

En los últimos años, Ia tecnología de los microarreglos ha sido de gran interés para los científicos dedicados al área de Ia bioquímica y Ia genómica, ya que ofrece valiosas posibilidades en el estudio de Ia función de los genes (Duggan DJ. y col. Nat. Genet. 1999, 21 : 10), en el descubrimiento de nuevos fármacos y el diagnóstico de diversas patologías.

La técnica consiste en Ia adsorción de biomoléculas sobre un soporte sólido formando una matriz. Dichas biomoléculas se incuban con Ia muestra a analizar, donde se produce el reconocimiento y unión con las moléculas complementarias. A continuación Ia reacción es revelada con el uso de marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, cromogénicos, radioactivos o por espectrometría de masas. Posteriormente, equipos diseñados al efecto y las herramientas bioinformáticas permiten interpretar y analizar los resultados. La principal ventaja de un ensayo de microarreglo es que permite determinar diferentes analitos simultáneamente y es más sensible y rápido que el sistema ELISA {Enzyme-Lynked Immunosorbent Assay) convencional. La tecnología de microarreglos miniaturizada es particularmente conveniente para aplicaciones diagnósticas porque requiere de pequeños volúmenes de muestras. En principio Ia enorme cantidad de determinaciones que pueden realizarse en una sola reacción, ha servido perfectamente para las necesidades y propósitos de los estudios genómicos. De hecho el rápido progreso en Ia secuenciación de genomas completos ha estado condicionado fundamentalmente por el desarrollo alcanzado de esta tecnología. Su uso para el análisis del polimorfismo nucleotídico y Ia expresión génica ha cambiado el curso de las investigaciones farmacéuticas, y su utilización como herramienta de

diagnóstico está teniendo un gran impacto en las investigaciones biomédicas (Wilson D.S. y Nock S. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42(5): 494-500).

Los Inmunoensayos para Ia detección de múltiples analitos, son una variante de Ia tecnología de microarreglos de proteínas basados en Ia detección específica de múltiples señales de emisión fundamentalmente fluorescente, emitidos de microspots distribuidos espacialmente. El desarrollo de métodos eficientes para Ia detección de los microspots con una alta sensibilidad y especificidad permitirá nuevas aplicaciones en estudios futuros aplicados a los microarreglos de proteínas. (Ekins R. y Chu F.W. Trends Bioctechnol. 1999, 17: 217). El cambio de los microarreglos de ADN a microarreglos de proteínas constituye un reto adicional para esta tecnología ya que para el desarrollo de este tipo de microarreglos es necesario garantizar Ia adsorción de proteínas de diferente estructura y composición en un mismo soporte sólido, sin afectar Ia actividad biológica de las mismas (Angenendt P. DDT. 2005, 10: 503-511).

Algunos de los trabajos reportados sobre el tema se relacionan con Ia detección de antígenos o anticuerpos utilizando los microarreglos. Las técnicas existentes para Ia detección de virus y otros patógenos adolecen de algunas limitaciones, las cuales se ven agravadas por Ia complejidad etiológica que caracteriza muchas de las actuales enfermedades infecciosas. Los microarreglos ofrecen Ia posibilidad de poder detectar varios patógenos en un mismo ensayo, incluso de identificar y discriminar entre los subtipos de un mismo agente infeccioso. Se han publicado trabajos relacionados con Ia detección simultánea de anticuerpos contra diferentes agentes infecciosos, empleando microarreglos de proteínas. Así, Zhang CX. y col (8 ^th Internacional Conference on Electronics Materials, IUMRS-ICEM ₁ 2002, Xi'an, China, 10-14 June), desarrollaron un microarreglo de proteínas en láminas de vidrio, por impresión de anticuerpos, para Ia detección simultánea de anticuerpos IgM contra toxoplasma gondii, virus de Ia rubéola, citomegalovirus y virus herpes simple tipo 2 utilizando un ensayo fluorescente. Los datos experimentales indicaron que un arreglo de proteínas con detección indirecta de Ia fluorescencia, puede ser utilizado para determinar Ia presencia o ausencia de anticuerpos específicos contra varios antígenos microbianos en suero humano. Estos autores concluyeron que los ensayos de microarreglos tienen Ia misma eficiencia para identificar muestras positivas y negativas que los ensayos ELISA.

Bacarese-Hamilton T. y col. Biotechniques. 2002, Suppl: 24-29, hacen una reseña sobre los microarreglos de proteínas utilizados para Ia detección de anticuerpos contra antígenos microbianos. El desarrollo de estos ensayos conjuntamente con Ia tecnología computacional para el procesamiento de los datos y Ia combinación de Ia información genómica, permiten Ia identificación de diversos antígenos microbianos. Estos antígenos funcionan como blanco de Ia inmunidad natural adquirida contra enfermedades infecciosas. Los resultados de este trabajo son de gran utilidad en el desarrollo de vacunas contra una serie de microorganismos de relevancia médica.

Mezzasoma L. y col. Clinical Chemistry. 2002, 48: 121-130, desarrollaron un microarreglo de proteínas en láminas de cristal, con el uso de antígenos naturales, para Ia detección simultánea de anticuerpos contra toxoplasma gondii, virus de Ia rubéola, citomegalovirus, herpes simple tipo 1 y 2.

Peng Yongji y col. (CN 1373365, 2002-10-09, Jingtai Bio Technology CO. Ltd) diseñaron un chip de proteínas para el diagnóstico en banco de sangre del antígeno de superficie de Ia hepatitis B (HBsAg), del virus de Ia hepatitis C (HCV), del virus de Inmunodeficiencia humana (VIH) y Ia sífilis. Los anticuerpos o antígenos fueron fijados al soporte sólido mediante enlaces químicos.

Delehanty J.B. y col. Anal. Chem. 2002, 74 (21): 5681-7, reportaron en su trabajo el desarrollo y caracterización de un biosensor de microarreglo de anticuerpos para Ia detección rápida de Ia toxina del cólera, estafilococos, enterotoxinas y bacilos. Para Ia adsorción de los anticuerpos de captura a Ia fase sólida se biotinilaron los mismos y se inmovilizaron sobre un portaobjeto de vidrio previamente recubierto con avidina.

Otro aspecto importante en el desarrollo de los microarreglos son los soportes sólidos, donde se inmovilizan las biomoléculas. Para este fin, se han utilizado una gran variedad de materiales, entre ellos se pueden mencionar el vidrio, plástico, látex, nylon, gel, esteres de celulosa o Ia combinación de algunos de ellos (Kersten B. Anal. Biochem. 2004, 331 : 303-313; Sobek J. y Schlapbach R. Pharmagenomics. 2004: 32- 44). La selección del soporte adecuado depende de varios factores, debe ser Io más inerte posible para que no se afecte Ia estructura de las moléculas que serán inmovilizadas y además para que no ocurran adsorciones inespecíficas. El vidrio es uno de los materiales más utilizados en el desarrollo de los microarreglos ya que posee una

alta resistencia mecánica, no es muy caro, es inerte y muy funcional (US20010031504, LG Electronics 2001 ; US20020164656, Hoeffler y col. 2002; US6534270, LG Electronics 2003; WO0204477, Cuno Inc 2002; WO0239120, Bionova Pharmaceuticals Inc, 2002). Actualmente Ia modificación de los soportes, en especial el vidrio, constituye una práctica frecuente, sin embargo, esto trae como consecuencia efectos indeseables ocasionados por Ia carga que adquiere el soporte, así como problemas de difusión. Por otra parte, las membranas son muy versátiles y se utilizan mucho para inmovilizar tanto el ADN como las proteínas, debido a Ia gran superficie interna de Ia misma que está compuesta por una red de largos canales que garantizan Ia eficiencia de absorción de las moléculas a Ia fase (WO0248674, Gene Systems Inc 2001 ; WO0183825, The Center for Blood Res. Inc 2001 ; WO03005013, Georgia Tech Res Corp, 2003; US5807522 y US6110426, The Board of Trustees of the Leland Standford Jr. Univ., 1995, 1997).

Los microarreglos de proteínas también han sido desarrollados en analizadores miniaturizados conocidos como microchips analíticos los cuales pueden estar formados por microcanales, microcámaras o microfiltros (Jakeway S. C. y col. J. Anal. Chem. 2000, 366: 525-539). Estos dispositivos se han fabricado de diferentes materiales como silicona, vidrio, plástico o Ia combinación de vidrio y silicona, basados en Ia utilización de técnicas adaptadas de Ia industria microelectrónica.

Otro tema de interés en el desarrollo de los microarreglos es Ia inmovilización de las proteínas a Ia fase sólida. Este proceso ocurre frecuentemente mediante interacciones no covalentes de las proteínas con Ia superficie sólida hidrofóbica, como el poliestireno y Ia nitrocelulosa o con superficies con cargas positivas por adsorción de Ia poli-L-lisina y el aminosilano. También es utilizada Ia unión covalente en una variedad de superficies activadas químicamente, las interacciones electrostáticas y las interacciones biomoleculares específicas (Lúe R.Y. y col. Methods Mol. Biol. 2004, 278:85-100, Angenendt P. y col. J. Chromatogr. A. 2003, 1009(1-2): 97-104).

En los microarreglos de proteínas son utilizadas biomoléculas de diferente naturaleza como son los anticuerpos monoclonales, los policlonales, las proteínas naturales, las proteínas recombinantes y los péptidos sintéticos.

Con el descubrimiento continuo de nuevos péptidos naturales con actividad biológica se ha incrementado en los últimos años el interés por los péptidos sintéticos. Los péptidos, son usados en muchas investigaciones, por ejemplo, en el análisis de Ia estructura antigénica y el reconocimiento de sitios activos de las proteínas. También son empleados como vacunas sintéticas contra enfermedades virales, bacterianas y parasitarias y como antígenos específicos en sistemas diagnósticos para Ia detección de anticuerpos en muestras de suero (LaI R.B. y col. J. Clin. Microbiol, 1991 , 29: 2253); Zrein M. y col. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998, 5: 45).

Considerando que las moléculas que se inmovilizan son péptidos sintéticos, es importante mencionar que los microarreglos de tales moléculas pequeñas son utilizados para el estudio de Ia función proteica y análisis de las interacciones entre las moléculas. Pocos son los documentos relacionados con su aplicación en el diagnóstico (US20020076727, US20020142351), en los cuales se conjugan los péptidos sintéticos a proteínas de mayor peso molecular o se utilizan las características de enlace de algunos grupos químicos reactivos.

La inmovilización de variados péptidos y proteínas en un soporte sólido constituye Ia mayor dificultad de Ia técnica de microarreglos de proteínas, ya que estas biomoléculas: a) son química y estructuralmente mucho más complejas y heterogéneas que los ácidos nucleicos, b) las proteínas pierden fácilmente su estructura y actividad biológica debido a Ia desnaturalización, deshidratación u oxidación, c) Ia detección de proteínas por las interacciones antígeno-anticuerpo es caracterizada por un amplio rango de especificidad y afinidad. Adicionalmente, se conoce que Ia afinidad de enlace de los anticuerpos por las proteínas disminuye después de su inmovilización a Ia fase sólida (Kusnezow W. y col. J. Mol. Recognit. 2003, 16: 165-176). Es por ello que su generalización en Ia práctica clínica ha dependido en gran medida del desarrollo de técnicas más sofisticadas y eficientes para Ia inmovilización de tales moléculas que generalmente se basan en Ia modificación de Ia fase sólida, sin embargo, se han obtenido péptidos sintéticos con una estructura más compleja que simulan los epítopos de reconocimiento, como son los péptidos cíclicos ( Patel G. y col. J. Pept. Res. 1999, 53(1): 68-74), péptidos multiantígenos (Múltiple Antigen Peptides, MAPs) (Shin S.Y. y col. Biochem. Mol. Int. 1997, 43(4): 713-721 ), que son moléculas que están formadas por un núcleo de lisina, ramificada de forma radial, en el que crecen un número de péptidos antigénicos, con la variante de repetir Ia misma secuencia antigénica o

sintetizar secuencias diferentes. Además de estos péptidos se utilizan los péptidos quiméricos que incorporan en una misma molécula dos secuencias de aminoácidos diferentes. Nuestro grupo de trabajo ha reportado Ia síntesis química de nuevos péptidos quiméricos para el inmunodiagnóstico del VIH (Hernández M. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 272: 259-262; Hernández M. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001 , 282: 1-3; Hernández M. y col. Prep. Biochem. Biotechnol. 2004, 34(3): 227-237) y el Virus Linfotrópico de las Células T humanas (HTLV) (CU22970 A1 , 2004; CU 23033 A1 , 2005; Hernández M. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 276: 1085-1088; Hernández M. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001 , 289: 1-6; Hernández M. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001 , 289: 7-12; Hernández M. y col. Prep Biochem Biotechnol. 2003, 33: 29-38; Márquez Y. y col. J. Immunoassay Immunochem. 2004, 25(3): 205-214).

En el desarrollo de los microarreglos de proteínas queda mucho por hacer, sobretodo para lograr protocolos reproducibles que permitan un diagnóstico clínico fiable de manera que resulta una temática en Ia que hay una gran demanda de nuevas soluciones técnicas.

Divulgación de Ia Invención El objetivo de este trabajo es el desarrollo de microarreglos de proteínas para el inmunodiagnóstico, basados en un ensayo fluorescente para Ia detección simultánea de varios analitos. Se utilizaron diferentes fases sólidas sobre las que se inmovilizaron varios anticuerpos monoclonales, policlonales, proteínas recombinantes y péptidos sintéticos. Este multiensayo nos permite su utilización en Ia detección de antígenos o anticuerpos contra diferentes enfermedades simultáneamente.

La detección simultánea de los analitos puede ser mediante diversos principios de ensayos los cuales pueden ser de tipo indirecto, ensayos de tipo sandwich, ensayos competitivos y ensayos de captura.

La detección simultánea de los analitos se puede realizar en diferentes tipos de muestras, tales como, muestra de suero, plasma, sangre total, sangre seca, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo y otros fluidos corporales. Esta detección puede realizarse a partir de las muestras aplicadas directamente o a través de los eluatos de las mismas.

El microarreglo de proteínas objeto de Ia presente invención utiliza como fase sólida materiales como celulosa, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poliéter sulfona, fluoruro de polivinilideno, nylon, poliestireno, polipropileno, poliacrilamida, agarosa, vidrio o Ia combinación de algunos de ellos. Además, incluye varias proteínas de diversa naturaleza en Ia fase sólida, que pueden ser péptidos sintéticos monoméricos, quiméricos y ramificados, proteínas recombinantes, antígenos naturales, anticuerpos monoclonales y policlonales.

Por otra parte, deseamos señalar que más del 50% de las proteínas inmovilizadas en Ia fase sólida son péptidos sintéticos. Los péptidos sintéticos monoméricos, quiméricos y ramificados se inmovilizan a Ia fase sólida sin necesidad de conjugarlos a proteínas de mayor peso molecular, Io que constituye una de las ventajas de esta invención. Estos péptidos se inmovilizan a las fases sólidas a una concentración entre 10-1000 μg/mL

El microarreglo de proteínas objeto de Ia presente invención tiene una amplia utilización en Ia evaluación diagnóstica de varias enfermedades simultáneamente las cuales pueden ser Hepatitis C, Hepatitis B, HTLV, HIV, chagas, entre otras.

Adicionalmente, deseamos señalar que el microarreglo de proteínas objeto de nuestra invención permite el estudio de Ia respuesta de anticuerpos específicos presentes en una muestra frente a medicamentos y vacunas.

De manera general deseamos puntualizar que el ensayo de microarreglos propuesto ofrece las siguientes ventajas:

1. Disponibilidad de un ensayo que permita el diagnóstico simultáneo de varias enfermedades.

2. Posibilita Ia detección simultánea de varios antígenos y anticuerpos específicos presentes en una misma muestra. 3. Permite el estudio del comportamiento de una muestra específica frente a diferentes secuencias de proteínas Io que permitiría Ia caracterización de dicha muestra desde el punto de vista de confirmación y estadio clínico de Ia enfermedad, respuesta de anticuerpos frente a un medicamento así como identificar y discriminar entre los subtipos de un mismo agente infeccioso.

4. Puede ser utilizado en diferentes fases sólidas como filtros de membranas, placas de diferente naturaleza y slides o láminas de vidrio, plástico, membranas o combinación de algunos de ellos.

5. Para el enlace de las moléculas de captura a Ia fase sólida no se necesita Ia conjugación de estas moléculas a proteínas de mayor peso molecular o el aprovechamiento de las propiedades de enlace de algunos grupos químicos reactivos.

6. Entre las moléculas de captura en Ia fase sólida utilizadas en este multiensayo se encuentran varios péptidos quiméricos diseñados y sintetizados para estos ensayos. 7. El desarrollo de este multiensayo garantiza Ia reducción del tiempo, el volumen de reactivos a dispensar y los costos del ensayo.

A continuación se describirán las características del ensayo de microarreglos de proteínas objeto de Ia presente invención, a partir de tres figuras: Figura 1. Muestra el diseño de un microarreglo de proteínas utilizando como antígenos péptidos sintéticos y proteínas recombinantes del VIH-1/2, HTLV-I/II, trypanosoma cruzi y HCV.

Figura 2. Muestra el comportamiento de una muestra VIH-1 positiva en un microarreglo de un péptido quimérico del VIH-1 en diferentes fases sólidas. A: Placa de poliestireno.

B: Membrana.

Figura 3. Muestra el comportamiento de diferentes muestras positivas en un microarreglo de proteínas en membrana.

A: Muestra VIH-1 positiva. B: Muestra VIH-2 positiva.

C: Muestra HTLV-II positiva.

D: Muestra HCV positiva.

E: Muestra positiva al trypanosoma cruzi.

F: Muestra negativa.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Ejemplo 1 Obtención de péptidos sintéticos y proteínas recombinantes.

Los péptidos fueron obtenidos mediante síntesis química en fase sólida empleando Ia estrategia Boc (tert-butiloxicarbonilo) en bolsas de polipropileno. Las reacciones de acoplamiento se realizaron a temperatura ambiente, por activación del grupo carboxilo de cada aminoácido con Λ/,Λ/-diisopropilcarbodiimida a 0.2 mol/L en diclorometano y fueron verificados por el ensayo cualitativo de Ia ninhidrina. El grupo Boc fue eliminado con ácido trifluoracético al 37.5% en diclorometano. La eliminación de los grupos protectores de las cadenas laterales y Ia ruptura del péptido de Ia resina se realizó mediante el procedimiento "Low-High HF", utilizando ácido fluorhídrico. Posteriormente, las bolsas se lavaron con éter dietílico, se secaron al vacío y se extrajeron los péptidos de Ia resina con ácido acético al 30% en agua destilada. El extracto final se diluyó con agua y se liofilizó.

Proteína recombinante p24 del núcleo del VIH-1. Incluye en el extremo amino terminal un fragmento de 58 aa de Ia interleucina 2 humana y se expresó en Ia Cepa HB101 de E.coli. La proteína contiene en su secuencia los 231 aa de Ia proteína nativa correspondiente al aislamiento SF2. Identificada por SDS-PAGE estándar se obtiene una banda mayoritaria de 29 kDa y el correspondiente dímero de 58 kDa. La proteína tiene una pureza mayor del 95% (incluyendo el dímero), estimada por estándar SDS- PAGE y RP-HPLC analítico. Proteína recombinante de Ia transmembrana qp41 del VIH-1. Contiene en el extremo amino terminal un fragmento de 58 aa de Ia interleucina 2 humana y se expresó en una Cepa de E.coli W3110. La secuencia de Ia proteína contiene los aa 558-637. Identificada por SDS-PAGE estándar se obtiene una banda de 15 kDa y el correspondiente dímero de 30 kDa, reconocidas ambas en Western Blot (WB). La pureza de Ia proteína es mayor del 95% (incluyendo el dímero) estimada por estándar SDS-PAGE y RP-HPLC analítico.

Proteína recombinante de Ia envoltura gp120 del VIH-1. Está constituida por tres epítopos antigénicos, de 15 aa cada uno, correspondiente a tres aislamientos diferentes (MN, SC y WMJII) del lazo hipervariable V3, y un péptido de 11 aa de Ia región conservada C1 , fusionados a 58 aa del extremo /V-terminal de Ia interleucina 2 humana. Esta se expresó en Ia Cepa W3110 de E.coli. Identificada por SDS-PAGE estándar se obtiene una banda mayoritaria a 18 kDa, una banda de 36 kDa correspondiente al dímero (5-10%), y varias bandas menores a más bajo peso molecular (< 5%), correspondientes a Ia degradación de Ia proteína principal, todas reconocidas en WB. La gp120 tiene una pureza mayor del 95% estimada por estándar SDS-PAGE.

Ejemplo 2

Preparación de los microarreglos de un péptido sintético quimérico en membrana El péptido sintético quimérico fue dispensado en una membrana de polietersulfona (0,45 μm) utilizando un robot dispensador de alta precisión con inyector piezoeléctrico. Las soluciones de recubrimiento fueron transferidas de placas de 96 pocilios, los que contenían 150 μl_ del péptido sintético sin conjugar a una concentración entre 50-100 μg/mL en BSA 1 % disuelta en solución amortiguadora de fosfato salina (PBS, pH 7,4). Se desarrollaron matrices compuestas cada una por un péptido sintético quimérico representativo de diferentes proteínas del VIH. Se dispensaron aproximadamente 0,2 nl_ por punto y Ia distancia entre los mismos fue de 400 μm, generando microarreglos de proteínas rectangulares. Se procedió al secado de las membranas, conservándose a temperatura ambiente (TA) con una cubierta protectora y una bolsa de silica gel, hasta el momento de su uso.

Ejemplo 3

Preparación de los microarreglos de un péptido sintético quimérico en placas de poliestireno

El péptido sintético quimérico fue dispensado en una placa de poliestireno de 96 pocilios con una altura de 0.3 mm, utilizando un robot dispensador de alta precisión con inyector piezoeléctrico. Las soluciones de recubrimiento fueron transferidas de placas de 96 pocilios, los que contenían 150 μL del péptido sintético sin conjugar a una concentración entre 100-1000 μg/mL en BSA 1 % disuelta en solución amortiguadora de fosfato salina (PBS, pH 7,4). Se desarrolló una matriz compuesta por un péptido sintético quimérico representativo de diferentes proteínas del VIH. Se dispensaron aproximadamente 0,2 nL por punto y Ia distancia entre los mismos fue de 400 μm, generando microarreglos de proteínas rectangulares. Posteriormente se incubaron las placas en cámara húmeda y se añadió solución de bloqueo. Se procedió al secado de las placas, conservándose a 4 ⁰ C con una cubierta protectora y una bolsa de silica gel, hasta el momento de su uso.

Ejemplo 4

Preparación de los microarreglos de péptidos sintéticos y proteínas recombinantes en membrana para el multidiaqnóstico

Los péptidos sintéticos y las proteínas recombinantes fueron dispensadas en una membrana de polietersulfona (0,45 μm) utilizando un robot dispensador de alta precisión con inyector piezoeléctrico. Las soluciones de recubrimiento fueron transferidas de placas de 96 pocilios, los que contenían 150 μL de solución de cada proteína recombinante y péptido sintético sin conjugar a una concentración entre 50- 500 μg/mL en BSA 1% disuelta en solución amortiguadora de fosfato salina (PBS, pH 7,4). Se desarrolló una matriz de 5 filas por 6 columnas compuesta por antígenos recombinantes y sintéticos representativos de diferentes proteínas del VIH-1/2, del HTLV-I/II, del HCV y el trypanosoma cruzi. Se dispensaron aproximadamente 0,2 nL por punto y Ia distancia entre los mismos fue de 400 μm, generando microarreglos de proteínas rectangulares de 1 ,8cm x 2cm (Figura 1). Se procedió al secado de las membranas, conservándose a TA con una cubierta protectora y una bolsa de silica gel, hasta el momento de su uso.

Ejemplo 5

Inmunoensavo para evaluar Ia actividad biológica de los péptidos sintéticos monoméricos. quiméricos y proteínas recombinantes en Membrana. Se cortaron las membranas, previamente recubiertas con los microarreglos de proteínas (Ejemplos 2 y 4), en pequeñas láminas que contenían un microarreglo cada una, las cuales fueron colocadas en las cubetas de trabajo. Se realizó un pre-bloqueo con leche descremada al 5% diluida en PBS-Tween 20 (PBS-T) durante 30 minutos, con agitación en una zaranda con movimiento circular. Se adicionaron las muestras diluidas 1 :500 en solución de bloqueo (leche descremada al 5% + PBS-T), se incubaron durante una hora con agitación a TA. Posteriormente se realizaron cuatro lavados con PBS-T por cinco minutos cada uno. Se añadió un conjugado Anti-lgG humana, obtenida en carnero, marcada con el fluoróforo CY3, diluido en PBS-T, se incubó durante una hora con agitación a TA. Se realizaron cuatro lavados con PBS-T. Posteriormente se procedió al secado de las membranas. La señal fluorescente fue detectada utilizando una cámara de CCD. En todos los experimentos se incluyeron un control positivo y negativo.

Ejemplo 6

Inmunoensavo para evaluar Ia actividad biológica de un péptido sintético quimérico en placas de poliestireno

Las muestras a evaluar, diluidas 1 :20 en solución amortiguadora Tris-HCL en suero de carnero al 20%, se incubaron una hora a 37°C en las placas de reacción. Después de lavar cuatro veces con solución amortiguadora Tris-HCI, con el objetivo de eliminar los componentes no fijados, se adicionó un conjugado anti-lgG humana en carnero marcada con el fluoróforo CY3 y se incubó nuevamente durante una hora a TA y en cámara húmeda. Se realizaron cuatro lavados en las mismas condiciones, para eliminar el conjugado en exceso. La señal fluorescente fue detectada utilizando una cámara de CCD. En todos los experimentos se incluyeron un control positivo y negativo.

Ejemplo 7

Ensayo UMELISA (UltramicroEL/S/\) de tipo indirecto para el estudio de Ia antiqenicidad y especificidad de los péptidos.

Cada péptido se diluyó en una solución reguladora carbonato-bicarbonato, pH 9,6, a una concentración entre 1-6 μg/mL. Se recubrieron placas de poliestireno de 96 posiciones con capacidad para 30 μL, se añadieron 15 μL/pocillo y se incubó durante 4 h a 45 °C en cámara húmeda. La fase sólida se lavó con una solución reguladora (Tris- NaCI-Tween 20, pH 7,8) utilizando un lavador automático. A continuación, se preservó con una solución bloqueadora (BSA-Tween 20), durante toda Ia noche a temperatura ambiente en cámara húmeda. Las placas fueron aspiradas y secadas durante 2 horas a 37°C; luego se conservaron a 4 °C, con una cubierta protectora, hasta el momento de su uso.

Las muestras a evaluar se diluyeron 1 :21 en una solución Tris-NaCI-Tween 20, pH 7,8, suero de camero al 20% y se dispensaron 10 μL/pocillo en las placas de reacción. Las mismas fueron incubadas 30 minutos a 37°C en cámara húmeda. Después de realizar 4 lavados con una solución reguladora Tris-NaCI-Tween 20, pH 7,8, con el objetivo de eliminar los componentes no fijados, se adicionó un conjugado Anti-lgG humana, obtenido en carnero, marcado con fosfatasa alcalina. Se incubó nuevamente durante 30 minutos a 37 ⁰ C en cámara húmeda y se realizó otro lavado en las mismas condiciones, para eliminar el conjugado en exceso. Se añadió entonces el sustrato fluorigénico 4-Metilumbeliferilfosfato y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda. La fluorescencia emitida fue medida en un lector fluorímetro acoplado a una computadora Ia cual tiene incluido un Software que permite Ia lectura y el cálculo de los resultados de las placas. En todos los experimentos, se incluyeron controles positivos y negativos y las muestras se analizaron por duplicado.

Ejemplo 8

Reactividad de un péptido quimérico en el formato de microarreglos.

Se sintetizó un péptido quimérico representativo de una secuencia de Ia proteína de transmembrana gp41 y otra de Ia proteína de envoltura gp120 del VIH-1 , reportada como muy antigénicas (Ejemplo 1). El péptido quimérico fue adsorbido a las fases sólidas como se describe en los ejemplos 2 y 3. Para medir Ia actividad biológica del péptido en los microarreglos se realizó un inmunoensayo como se describe en los ejemplos 5 y 6.

La reactividad del péptido sintético fue analizada empleando muestras de suero que contenían anticuerpos específicos al VIH-1 , estas muestras fueron confirmadas y caracterizadas por WB. Para evaluar Ia especificidad se utilizaron muestras negativas de donantes de sangre sanos.

En las figuras 2(A) y 2(B) se muestra el comportamiento del péptido quimérico en poliestireno y membrana frente a una muestra VIH-1 positiva, en todos los casos se observa una matriz de doce puntos fluorescentes y bien definidos.

Ejemplo 9

Reactividad de las proteínas en el multiensavo.

Se sintetizaron un total de 23 péptidos: 6 péptidos del VIH 1 y 2, 9 péptidos del HTLV I y II, 5 péptidos del HCV y tres péptidos del trypanosoma cruzi, y se emplearon tres proteínas recombinantes, según se describe en el ejemplo 1. Los péptidos sintéticos y las proteínas recombinantes fueron adsorbidos a Ia fase sólida como se describe en los ejemplos 2 y 4. Para medir Ia actividad biológica de los péptidos sintéticos y las proteínas recombinantes en los microarreglos se realizó un inmunoensayo como se describe en los ejemplos 5 y 6.

La reactividad de los péptidos sintéticos y las proteínas recombinantes fue analizada empleando muestras de suero que contenían anticuerpos específicos al VIH-1/2 y al HTLV-I/II, estas muestras fueron confirmadas y caracterizadas por WB. Las muestras positivas al HCV, confirmadas a partir de un ensayo LIA (Une Immunoassay) y muestras reactivas al trypanosoma cruzi, procedentes de regiones endémicas de este parásito. Para evaluar Ia especificidad de estas proteínas se utilizaron muestras negativas de donantes de sangre sanos.

Algunos de los resultados obtenidos se muestran en Ia figura 3 donde fueron estudiadas muestras positivas al VIH-1 , al VIH-2, al HTLV-I, al HCV y al trypanosoma cruzi, así como una muestra negativa en una matriz de proteínas descrita en el ejemplo

4. En Ia figura 3 (A) se observan los resultados obtenidos frente a una muestra VIH-1 positiva, en Ia misma se evidencian cinco puntos fluorescentes correspondientes al reconocimiento por parte de los anticuerpos específicos presentes en Ia muestra de una proteína recombinante p24, un péptido sintético gp41 , una proteína recombinante gp41 , un péptido quimérico representativo de las regiones de envoltura gp120 y transmembrana gp41 y un péptido sintético gp120, todos pertenecientes al VIH-1 , estos resultados se corresponden con los obtenidos en el ensayo de WB para Ia confirmación y caracterización de esta muestra donde son visualizadas las bandas p24, gp41 y gp120. En Ia figura 3 (B) observamos el reconocimiento del péptido gp36 perteneciente a Ia proteína de transmembrana del VIH-2 frente a una muestra VIH-2 positiva, este resultado coincide con Io descrito en Ia literatura donde se plantea que los antígenos sintéticos de Ia proteína de transmembrana gp36 del VIH-2 muestran una alta sensibilidad y especificidad en Ia detección de anticuerpos presentes en muestras VIH- 2 positivas. La secuencia que conforma este péptido contiene epítopos inmunodominantes que pertenecen a Ia región amino terminal de Ia glicoproteína.

En Ia figura 3(C) se muestran los resultados frente a una muestra HTLV-II positiva, se observan dos puntos fluorescentes, uno correspondiente a un péptido de Ia proteína del núcleo p19 y otro a un péptido de Ia proteína de envoltura gp46 del HTLV-II. Estos resultados también se corresponden con los obtenidos en el ensayo de WB. En Ia figura 3(D) se observan dos puntos fluorescentes obtenidos a partir de Ia reacción de los anticuerpos presentes en una muestra HCV positiva, uno de los puntos pertenece a un péptido de Ia región del núcleo y el otro a un péptido quimérico de las regiones NS4 y NS5. Los resultados anteriores se corresponden con los obtenidos en un ensayo confirmatorio LIA. Se muestran además en Ia figura 3(E) los resultados obtenidos en el multiensayo para una muestra que presenta anticuerpos específicos contra el trypanosoma cruzi, en Ia misma se observan dos puntos fluorescentes correspondientes a los péptidos sintéticos C12 y P17 los cuales pertenecen a diferentes secuencias repetitivas del parásito. Los resultados obtenidos en el microarreglo de proteínas para el multidiagnóstico fueron comparados con los resultados en ensayos UMELISA de tipo indirecto para Ia detección de anticuerpos (Ver ejemplo 7) contra cada uno de los agentes infecciosos de forma independiente, en todos los casos existe una correspondencia de los resultados entre los dos ensayos (Tabla 1). Se probaron además muestras negativas de banco de sangre para el estudio de especificidad. En Ia figura 3(F) se observa el comportamiento en el multiensayo de una

de las muestras negativas estudiadas, en este caso no se evidencia reactividad para ninguno de los antígenos presentes en Ia fase sólida.

Tablai . Resultados de Ia reactividad de los antígenos en el UMELISA y el microarreglo frente a muestras positivas de diferentes agentes infecciosos.

Antígenos UMELISA Microarreglo p24 (Recombinante) VIH-1 ++++ ++++ gp41 (Sintético) Vl H-1 ++ + gp41 (Recombinante) VIH-1 ++++ ++++ gp41-gp120 (Sintético) Vl H-1 +++ +++ 10 gp120 (Sintético) VIH-1 ++ +++ gp36 (Sintético) VIH-2 +++ +++ p19 (Sintético) HTLV-II ++ ++ gp46 (Sintético) HTLV-II +++ ++++ core (Sintético) HCV ++ ++ 15

NS4-NS5 (Sintético) HCV +++ +++

Péptido trypanosoma cruzi (21) +++ +++

Péptido trypanosoma cruzi (23) ++++ ++++

-SQ-