HEPTA-REPETICIONES N-TERMINALES (HRN) DE GP41

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece, de forma general, al campo de la inmunología y, en particular, al campo de los agentes y composiciones apropiadas para su administración a un huésped, y de esta forma inmunizarlo y generarle protección contra la infección y la enfermedad provocada por el VIH.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Desde que el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) fuera descrito por primera vez en 1981 , las estimaciones de UNAIDS indican que 34,2 millones de adultos y niños vivían con SIDA a finales de 201 1 . El SIDA sigue siendo la cuarta causa de muerte en los países menos desarrollados y se necesitan con urgencia tecnologías de prevención del VIH, especialmente para las mujeres, que son las más afectadas por la epidemia del VIH. Aunque el número total de nuevas infecciones ha disminuido en los últimos años, los niveles de nuevas infecciones siguen siendo altos y se estima que en 201 1 se infectaron 2,5 millones de personas. Además, esta disminución no es generalizada y algunas áreas se observa un número creciente de nuevas infecciones. Aunque la introducción de la terapia antirretroviral de gran actividad (en sus siglas en inglés: HAART) ha mejorado significativamente el tratamiento del VIH / SIDA, el número de nuevas infecciones sigue superando al de personas puestas en tratamiento y el virus es deprimido pero no erradicado. Además, la eficacia de los tratamientos se ve obstaculizada por la aparición de cepas virales resistentes a los fármacos y por graves interacciones fármaco-fármaco.

El desarrollo de una vacuna frente a VIH segura, eficaz y accesible a nivel mundial sigue siendo la mejor esperanza para el futuro control de la pandemia del VIH-1 . La inmunidad protectora, entendiendo como tal la protección que ofrecen las vacunas frente a la infección por el VIH, sigue siendo, sin embargo, una importante meta aún no alcanzada. Los obstáculos fundamentales para el desarrollo de vacunas frente a VIH-1 provienen del hecho de que no existe una cura espontánea de la enfermedad y se encuentran en las propiedades propias del virus: Su entrada se produce principalmente a través de las mucosas y es seguida inmediatamente por una hiper-activación del sistema inmunológico que poco a poco se desborda causando un colapso de los mecanismos de protección inmune que da lugar al SIDA. Además, el virus presenta un increíble nivel de diversidad y escapa neutralizando con facilidad las respuestas de anticuerpos mediante mutaciones puntuales, variaciones de su secuencia y recombinación. Al mismo tiempo, la infección por VIH-1 está acompañada de

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) una regulación decreciente del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I en la superficie de las células infectadas, permitiéndole eludir las respuestas CTL antivirales. Cómo provocar la respuesta inmune de protección contra el VIH mediante una vacuna sigue siendo aún un desafío de enormes proporciones.

Se ha desarrollado ya un gran número de candidatos a vacunas frente al VIH-1 , las cuales han provocado diversos grados de respuestas protectoras en modelos de primates no humanos, algunos de los cuales han avanzado a ensayos en humanos. Hasta ahora se han probado cuatro regímenes de vacunación en ensayos de eficacia de Fase III o llb sobre voluntarios humanos. Dos de ellos involucraban a la proteína gp120 en solitario (AIDSVAX ® B / B, AIDSVAX ® B / E (VaxGen)), pero no han demostrado una protección contra la infección por el VIH. La vacuna trivalente Ad5-1 -VIH de Merck (Gag, Pol, Nef) tampoco mostró eficacia alguna e incluso provocó un mayor riesgo de infección. Por último, el gran ensayo RV144 (Tailandia) combinaba AIDSVAX ® B / E (VaxGen) con ALVAC-VIH (vCP1521 ), una preparación de virus recombinante derivado de la viruela del canario que expresa los productos de los genes env y gag del VIH-1 , pero sólo se pudo detectar una modesta eficacia protectora.

La glicoproteína de la envoltura del VIH (env) promueve la infección viral favoreciendo la fusión de la membrana viral con la membrana de la célula huésped. Env es un trímero de heterodímeros de dos subunidades asociadas no covalentemente, gp120 y gp41 , que se originan a partir de la escisión proteolítica de la proteína precursora gp160. La subunidad transmembrana gp41 se ancla a la membrana viral e impulsa a la fusión de membranas. Se compone de un dominio extracelular (ectodominio), un segmento transmembrana y una cola intra-citoplasmática. El ectodominio gp41 contiene un péptido de fusión N-terminal hidrófobo (FP), una región N-terminal de hepta-repeticiones (NHR), una región de lazo ligado mediante un puente disulfuro, una región C-terminal de hepta-repeticiones (CHR), y una región proximal a la membrana externa (MPER). El modelo actual de la infección por el VIH sugiere que la unión de gp120 al receptor CD4 y a un co-receptor, tal como CCR5 ó CXCR4, desencadena un cambio conformacional en gp41 . Como resultado, el péptido de fusión en el extremo N-terminal de gp41 queda expuesto y penetra en la membrana celular del huésped. Esto es seguido por la disociación de la gp120 y por un gran cambio conformacional en la gp41 desde de un estado "pre-fusión" o estado extendido, en la que sus regiones CHR y NHR se encuentran desplegadas, hasta un estado "post-fusión" altamente estable formando un haz de 6-hélices con estructura de hélice superenrrollada o superhélice. Se cree que la gran ganancia de energía que se obtiene con este cambio conformacional sirve para aproximar estrechamente las dos membranas facilitando su fusión.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Debido a su participación en la fusión de la membrana y la entrada del virus, así como su secuencia altamente conservada entre las diversas cepas virales, gp41 ofrece objetivos potenciales para fármacos o anticuerpos. Se han descubierto varios anticuerpos ampliamente neutralizantes (NAbs) contra gp41 , de los que tres de ellos, 2F5, 4E10 y Z13e1 , se dirigen a diferentes epítopos que se solapan parcialmente en la región MPER de la gp41 . Recientemente se ha aislado un anti-MPER ampliamente neutralizante MAb, 10E8. Este NAb neutraliza el 98% de los virus ensayados, no se une a fosfolípidos y no es auto reactivo. Otro NAb, m48, también ha sido aislado recientemente utilizando una metodología basada en paneles de antígenos competitivos. M48 reconoce un epítopo conformacional de la gp41 y es más potente que los otros Abs. Otros epítopos neutralizantes han sido descritos en la gp41 .

Actualmente se acepta que durante la infección de VIH mediada por gp41 , la región NHR queda expuesta transitoriamente formando una superhélice enrrollada trimérica paralela. Sobre esta base, han sido desarrollados potentes fármacos neutralizantes del VIH dirigidas a la región de NHR, de las cuales es pionero el Fuzeon (T20), un péptido mimético CHR que se cree que se une a la estructura pre-horquilla en superhélice trimérica NHR, interfiriendo con la formación del haz de 6 hélices NHR / CHR. También se han descrito otros péptidos de CHR y pequeñas moléculas dirigidas a la superhélice NHR.

Sin embargo, aunque los péptidos derivados de NHR también pueden inhibir la entrada del VIH dirigiéndose a la región CHR, esos péptidos muestran mucha menos potencia de forma aislada por su baja estabilidad conformacional y su tendencia a la agregación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención resuelve el problema de proporcionar pequeños constructos proteicos que presenten una superficie estable de superhélice enrollada NHR. Para ello, se describe aquí un nuevo enfoque, que aprovecha la gran versatilidad estructural de los super- enrollamientos de α-hélices, que ha permitido a los inventores transformar la topología trimérica paralela de la superhélice NHR en un haz de cadena simple con de tres hélices antiparalelas ligadas por lazos cortos. Estas pequeñas proteínas de cadena simple se pliegan formando estructuras en α-hélice monoméricas y altamente estables y se unen a péptidos sintéticos que abarcan la región CHR de gp41 con una afinidad muy elevada.

Por lo tanto, un primer aspecto de la invención, se refiere a una proteína en superhélice trimérica antiparalela (de aquí en adelante "proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención") que comprende tres α-hélices, en la que (i) dos de las tres a-hélices

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) comprenden una secuencia con un 70% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de SEQ ID No 1 (secuencia WT de la región NHR de gp41 ) o un fragmento de la misma; en la que (ii) la α-hélice restante comprende una secuencia que tiene un 70% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de la SEQ ID No 2 (secuencia WT inversa de la región NHR de gp41 ) o un fragmento de la misma; en el que (iii) las α-hélices se ligan entre sí mediante lazos de conexión; y en el que (iv) la proteína en superhélice trimérica antiparalela es capaz de unirse a cualquier péptido CHR de gp41 de la lista que consiste en: CHR-127-162 (T20), CHR-1 17-150 (W34L), CHR-1 10-141 (Q32Q) y CHR-1 10-129 (Q20S) (las secuencias específicas de cada uno de estos péptidos pueden verse en la tabla 3).

Un segundo aspecto de la invención se refiere a la proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención, en la que una de las tres α-hélices comprende una secuencia que tiene un 90% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de SEQ ID No 3 (hélice 1 de covNHR3) o un fragmento de la misma; en el que otra de los tres a-hélices comprende una secuencia que tiene un 90% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de la SEQ ID No 4 (hélice 2 de covNHR3) o un fragmento de la misma; en el que la α-hélice restante comprende una secuencia que tiene un 90% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de la SEQ ID No 5 (hélice 3 de covNHR3) o un fragmento de la misma; en el que las α-hélices están unidas por lazos de conexión que tienen al menos tres residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos cuatro residuos de aminoácidos; y en donde la proteína en superhélice trimérica antiparalela es capaz de unirse a cualquier péptido CHR de gp41 , perteneciente a la lista que consiste en: CHR-127-162 (T20), CHR- 1 17-150 (W34L), CHR-1 10-141 (Q32Q) y CHR-1 10-129 (Q20S) (las secuencias específicas de cada uno de estos péptidos pueden verse en la Tabla 3).

En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la proteína en superhélice trimérica antiparalela comprende una secuencia seleccionada de entre cualquiera del siguiente grupo: SEQ ID No 6 (covNHR2), SEQ ID No 7 (covNHR3), SEQ ID No 8 (covNHR3-A), SEQ ID No 9 (covNHR3-AC), SEQ ID No 10 (covNHR3-B), SEQ ID No 1 1 (covNHR3-AB) y SEQ ID No 12 (covNHR3-ABC).

En una realización más preferida de la invención, la proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención consiste en una secuencia seleccionada de entre cualquiera del siguiente grupo: SEQ ID No 6 (covNHR2), SEQ ID No 7 (covNHR3), SEQ ID No 8 (covNHR3-A), SEQ ID No 9 (covNHR3-AC), SEQ ID No 10 (covNHR3-B), SEQ ID No 1 1 (covNHR3-AB) y SEQ ID No 12 (covNHR3-ABC).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Un tercer aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica la proteína en superhélice trimérica antiparalela según cualquiera de los aspectos anteriores de la invención. Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión que contiene el ácido nucleico del tercer aspecto de la invención.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector de expresión del cuarto aspecto de la invención.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína en superhélice trimérica antiparalela del primer o segundo aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, dicha composición farmacéutica puede comprender además un adyuvante.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a la proteína en superhélice trimérica antiparalela del primer o segundo aspecto de la invención o a la composición de acuerdo con el sexto aspecto de la invención para su uso como un medicamento. Un octavo aspecto de la invención se refiere a la proteína en superhélice trimérica antiparalela del primer o segundo aspecto de la invención o a la composición de acuerdo con el sexto aspecto de la invención para su uso como vacuna.

Un noveno aspecto de la invención se refiere a proteína en superhélice trimérica antiparalela del primero o segundo aspecto de la invención o a la composición de acuerdo con el sexto aspecto de la invención para su uso en el tratamiento del VIH.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a proteína en superhélice trimérica antiparalela del primero o segundo aspecto de la invención o la composición de acuerdo con el sexto aspecto de la invención para la administración a un sujeto humano.

Un undécimo aspecto de la invención se refiere a la proteína en superhélice trimérica antiparalela del primer o segundo aspecto de la invención o a la composición de acuerdo con el sexto aspecto de la invención para la administración en una o varias dosis. La dosificación se hará evidente para la persona experta en la técnica. En este sentido, y únicamente con propósito ilustrativo, si la proteína en superhélice trimérica antiparalela del primer o segundo aspecto de la invención o la composición de acuerdo con el sexto aspecto de la invención es una vacuna, la dosificación/posología podría oscilar de 30 a 300 μg por

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) dosis. Si se trata de un fármaco que es capaz de inhibir el VIH directamente, la dosis puede ser mayor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Diseño de un haz de tres hélices antiparalelas basado en gp41 . A) Ilustración esquemática de la topología de la cadena de los constructos covNHR. Las hélices de color gris claro se orientan en paralelo a la secuencia original de NHR gp41 , mientras que la hélice de color gris oscuro es antiparalela. Las hélices están conectadas mediante lazos cortos de conexión. B) Ilustración de la estabilización mediante puentes salinos diseñados sobre la superficie del constructo covNHR2.

Figura 2: Análisis de la estructura secundaria mediante CD en UV lejano (Far-UV CD) de proteínas covNHR a pH 2,5 y pH 7,4. Los espectros son típicos de las proteínas alfa- helicoidales.

Figura 3: Desplegamiento térmico de proteínas covNHR analizadas por DSC a diferentes valores de pH indicados a lo largo de cada termograma de DSC. Las curvas se han desplazado a lo largo del eje Y para aportar mayor claridad.

Figura 4: Desplegamiento térmico de covNHR2 monitorizado mediante CD en UV lejano (Far-UV CD). Las transiciones indican una gran pérdida de estructura secundaria con el desplegamiento.

Figura 5: Espectros obtenidos mediante CD en UV lejano (Far-UV CD) de mezclas equimolares entre covNHR3 y péptidos sintéticos CHR. El aumento de la elipticidad negativa indica la formación de la estructura en alfa-hélice debido a la unión con el péptido. Los tipos de línea representan: Sólida: mezclas equimolares; Discontinua: péptidos aislados; Punteada: covNHR3 aislado; Rayas y puntos: suma teórica de los espectros.

Figura 6: Espectros obtenidos mediante CD en UV cercano (Near-UV CD) de mezclas equimolares entre la proteínas covNHR y péptidos de CHR a pH 7,4. El espectro de una forma recombinante del ectodominio gp41 en una conformación de haz de 6 hélices se muestra en líneas discontinuas. Los espectros de las proteínas covNHR aisladas también se muestran en líneas de puntos. Una banda intensa de elipticidad negativa indica una estrecha interacción CHR-NHR, similar a la observada en gp41 .

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Figura 7: Titulaciones de covNHR3 con diferentes concentraciones de péptidos de CHR como se indica. Los símbolos representan los valores de elipticidad a 293 nm en los espectros de CD en el UV cercano. Las líneas corresponden al ajuste de la curva usando un modelo de unión sencilla 1 :1 .

Figura 8: Efectos estabilizantes de la unión de los péptidos de CHR a las proteínas covNHR monitorizados mediante DSC. Los aumentos en la temperatura de desplegamiento y/o el cambio de entalpia de desplegamiento indican la estabilización producida por la unión. Figura 9: Isotermas de ITC para la unión del péptido W34L a covNHR3 y covNHR3-ABC. Los símbolos representan los calores experimentales medidos para cada inyección del péptido normalizados por mol de péptido inyectado. Las curvas corresponden a los mejores ajustes obtenidos utilizando un modelo teórico de unión de tres tipos de sitios de unión, diferentes e independientes, (véase el texto para detalles adicionales).

Figura 10: Análisis estructural del modelo covNHR3. A) Ilustración de la pseudo-simetría ternaria de la topología de la molécula covNHR. Se han representado sólo los átomos del esqueleto para mayor claridad. Cada región helicoidal ha sido coloreada en rojo, verde y cian. Los conectores interhelicoidales se han coloreado en amarillo. B) Representación de la superficie de las tres caras del modelo covNHR3 (coloreado en gris). Las varillas verdes y rojas representan las cadenas laterales hidrófobas de residuos CHR que interactuarían en cada bolsillo hidrofóbico en la superficie de NHR.

Figura 11 : Espectro CD en UV lejano (Far-UV CD) de las proteínas covNHR de segunda generación en comparación con covNHR3. Todas las proteínas tienen una estructura alfa- helicoidal similar.

Figura 12: Desplegamiento térmico de las proteínas covNHR de segunda generación en comparación con covNHR3. La estabilidad se incrementa para todos los mutantes para ambos valores de pH en comparación con la molécula parental.

Figura 13: Espectros de CD en UV cercano (Near-UV CD) de mezclas equimolares entre las proteínas covNHR de segunda generación y el péptido sintético Q32Q que muestra la formación de la interacción CHR-NHR.

Figura 14: Titulaciones de covNHR3-ABC con diferentes concentraciones de péptidos de CHR. Los símbolos representan la elipticidad de CD en UV cercano (Near-UV CD) a 293 nm. Las líneas corresponden al ajuste de la curva usando un modelo de unión sencilla 1 :1 .

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La siguiente descripción detallada da a conocer variantes preferidas y/o específicas de las características individuales de la invención. La presente invención también contempla como realizaciones particularmente preferidas aquellas realizaciones, que se generan combinando dos o más de las variantes preferidas y/o específicas descritas para dos o más de las características de la presente invención.

A menos que se especifique expresamente lo contrario, el término "que comprende" se usa en el contexto del presente documento para indicar que pueden estar presentes elementos adicionales opcionalmente además de los elementos de la lista introducida por "que comprende". Sin embargo, se contempla como una realización específica de la presente invención que el término "que comprende" engloba la posibilidad de que no estén presentes elementos adicionales, es decir para el fin de esta realización "que comprende" debe entenderse como que tiene el significado de "que consiste en".

A menos que se especifique expresamente lo contrario, todas las indicaciones de cantidades relativas en la presente solicitud se hacen en una base en peso/peso. Las indicaciones de cantidades relativas de un componente caracterizado por un término genérico pretenden referirse a la cantidad total de todas las variantes o elementos específicos cubiertos por dicho término genérico. Si se especifica que un determinado componente definido por un término genérico está presente en una determinada cantidad relativa, y si se caracteriza además que este componente es una variante o elemento específico cubierto por el término genérico, se pretende que ninguna otra variante o elemento cubierto por el término genérico está presente adicionalmente de modo que la cantidad relativa total de componentes cubiertos por el término genérico supera la cantidad relativa especificada; más preferiblemente ninguna otra variante o elemento cubierto por el término genérico está presente en absoluto. La presente invención resuelve el problema de proporcionar pequeños constructos proteicos que presentan una superficie de superhélice de NHR estabilizada. Para ello, los autores de la invención describen en este documento un nuevo enfoque, que se aprovecha de la gran versatilidad estructural de superhélices α-helicoidales enrrolladas, lo que les permitió transformar la topología trimérica paralela de la región NHR de gp41 en un haz de cadena simple de tres hélices antiparalelas unidas por bucles cortos de conexión. Estas pequeñas proteínas de cadena simple se pliegan en estructuras α-helicoidales monoméricas altamente estables y unen péptidos sintéticos que abarcan la región CHR de gp41 con una afinidad muy elevada. Por otra parte, estos constructos muestran una fuerte actividad antiviral contra varias cepas de VIH-1 , son altamente inmunogénicos en conejos y produjeron antisueros

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) neutralizantes. Además, estos constructos proteicos son fáciles de producir, no necesitan ninguna modificación post-producción y constituyen una buena base para el desarrollo de vacunas, medicamentos antivirales y microbicidas contra el VIH. Como ya se ha dicho, los autores de la presente invención se enfrentaron con el problema de proporcionar pequeños constructos de proteínas que presentaran una superficie de superhélice de NHR estable. Con el fin de resolver este problema los autores diseñaron un constructo proteico en superhélice trimérica antiparalela NHR, en el que la superficie expuesta al disolvente de dos de las tres α-hélices imitaría la de la espiral de la superhélice paralela de la gp41 . Para este propósito, los autores utilizaron la estructura del haz de tres hélices formada por la región de NHR en el modelo de estructura de post-fusión de gp41 (Código PDB: 1 IF3) y se seleccionaron los tres segmentos helicoidales A30-L81 , (aminoácidos A30-L81 que en este documento se muestran como SEQ ID No 1 ). Por lo tanto, el proceso inicial se hizo con tres segmentos idénticos que corresponden a la secuencia WT de NHR (SEQ ID No 1 )

Para construir la superhélice antiparalela de tres hélices, los autores de la presente invención utilizaron dos de los segmentos helicoidales de la SEQ ID No 1 para crear las dos α-hélices paralelas de la proteína. Para modelar la hélice antiparalela, los autores utilizaron la secuencia inversa del polipéptido NHR, es decir, SEQ ID No 2, como "segundo segmento".

A continuación, los autores de la invención invirtieron la orientación de la cadena de la secuencia inversa antes mencionada y de forma manual acoplaron la nueva hélice antiparalela sobre las dos originales, es decir, sobre las hélices al primer y tercer segmento, usando las hélices paralelas como guía y tratando de mantener el empaquetamiento del núcleo interno de la nueva superhélice. Las colisiones se resolvieron mediante la optimización de los rotámeros de cadenas laterales. Las hélices fueron conectadas a continuación usando segmentos cortos creando una topología de hélice-giro-hélice-giro- hélice (Figura 1 a). Los aminoácidos que constituyen los conectores fueron elegidos para crear interacciones favorables en tapadera de hélice para estabilizar α-hélices. Este primer constructo, denominado covNHRI , se ilustra en la tabla 1 . Una descripción completa del método utilizado para obtener este constructo se detalla en el Ejemplo 1 . El análisis estructural de dicho modelo covNHRI indicó una alta hidrofobicidad en su superficie y una ausencia relativa de aminoácidos cargados en un extremo de la molécula cerca de la región N-terminal. Por lo tanto, con el fin de estabilizar el plegamiento antiparalelo trimérico y mejorar la solubilidad, la secuencia de covNHRI fue rediseñada para introducir interacciones favorables. Para este fin varios residuos hidrófobos expuestos al

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) disolvente fueron sustituidos por aminoácidos cargados edificar varios puentes salinos en un segundo constructo llamado covNHR2 (Figura 1 b). Las mutaciones fueron seleccionadas en lugares que no alterasen el prominente bolsillo hidrofóbico, que es reconocido por los NAbs D5 y HK20 sobre la superficie del trímero NHR (para una explicación detallada sobre este prominente bolsillo hidrofóbico que es reconocido por los D5 y HK20 NAbs, consultar "A human monoclonal antibody neutralizes diverse HIV- 1 isolates by binding a critica! gp41 epitope". Miller MD, et al. Proc Nati Acad Sci U S A. 2005 Oct 1 1 ;102(41 ):14759-64. Epub 2005 Oct 3, y "Crystal structure and size-dependent neutralization properties oí HK20, a human monoclonal antibody binding to the highly conserved heptad repeat 1 of gp41". Sabin C et al. PLoS Pathog 2010 Nov 18;6(1 1 ):e1001 195).

Por último, un tercer constructo denominado covNHR3 fue diseñado a partir de covNHR2 rediseñando lazos de conexión más largos entre las hélices. Las secuencias polipeptídicas de estos constructos se enumeran en la Tabla 1 . Tanto las proteínas covNHR2 como covNHR3 han podido expresarse en E. coli con un buen rendimiento y también se han podido purificar fácilmente. Estas dos proteínas, es decir, covNHR2 y covNHR3, constituyen una primera generación de constructos.

Así, un primer aspecto de la invención, se refiere a una proteína en superhélice trimérica antiparalela (en lo sucesivo, proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención) que comprende tres α-hélices, en las que (i) dos de las tres α-hélices comprenden una secuencia que tiene un 70% o más de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID No 1 (secuencia WT de la región NHR de gp41 ) o un fragmento de la misma; en el que (ii) la restante α-hélice comprende una secuencia que tiene un 70% o más de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID n ^e 2 (secuencia WT inversa de la región NHR de gp41 ) o un fragmento de la misma; en el que (iii) las α-hélices se ligan entre sí mediante lazos de conexión y en la que (iv) la proteína en superhélice trimérica antiparalela es capaz de unirse a cualquiera de los siguientes péptidos CHR de gp41 : CHR-127-162 (T20), CHR- 1 17-150 (W34L), CHR-1 10-141 (Q32Q) y CHR-1 10-129 (Q20S) (las secuencias específicas de cada uno de estos péptidos pueden verse en la tabla 3).

En el contexto de la presente invención, el término "fragmento" se entiende como un polipéptido obtenible a partir de una secuencia que tiene un 70% o más de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID No 1 (secuencia WT de la región NHR de gp41 ) o con el polipéptido de la SEQ ID No 2 (secuencia WT inversa de la región NHR de gp41 ) por eliminación de hasta 5, hasta 10, hasta 15, hasta 20, hasta 25, hasta 30, hasta 35 o hasta 40 residuos de aminoácidos consecutivos desde el extremo N -terminal y / o desde el extremo C-terminal.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En el contexto de la presente invención, el conector tiene al menos tres residuos consecutivos de aminoácidos, preferiblemente al menos cuatro residuos de aminoácidos consecutivos, más preferiblemente entre 3 y 6 residuos de aminoácidos. En el contexto de la presente invención, se entiende por "capacidad de unión" la capacidad de la proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención para interactuar con cualquiera de los péptidos CHR de gp41 mostrados en la tabla III con una constante de disociación de 200 micromolar o inferior, más preferiblemente 10 micromolar o menor, determinada en un experimento típico de calorimetría de titulación isotérmica.

Las secuencias de las dos α-hélices paralelas y la secuencia inversa de la a-hélice antiparalela (es decir, la secuencia inversa de la secuencia WT de la región NHR de gp41 ) de la proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención son preferiblemente una variante, natural o sintética, de hepta-repeticiones N-terminales (NHR) del ectodominio gp41 . En el sentido más amplio, comprende cualquier variante conocida de hepta- repeticiones N-terminales (NHR) de la secuencia de gp41 ; el polipéptido gp41 conocido también puede ser denominado como secuencia padre (o parental) de hepta-repeticiones N- terminales (NHR). En el contexto de la presente invención, se entiende que dicha secuencia parental de hepta-repeticiones N-terminales (NHR) está constituida por la secuencia SEQ ID No 1 , es decir, la secuencia

ARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL.

Las secuencias de las dos α-hélices paralelas de la proteína en superhélice trimérica de la invención pueden diferir de la SEQ ID No 1 en al menos una cadena lateral de aminoácido. Las variantes más preferidas son las que tienen un 70% o más, tal como 80% o más, incluyendo 85% o más, tal como 90% o más, y preferiblemente 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98 % o más, 99% o más, de identidad de secuencia con el polipéptido mostrado como SEQ ID No 1 .

La secuencia de la α-hélice antiparalela de la proteína en superhélice trimérica de la invención puede diferir de la SEQ ID No 2 en al menos una cadena lateral de aminoácido. Las variantes más preferidas son los que tienen un 70% o más, tal como 80% o más, incluyendo 85% o más, tal como 90% o más, y preferiblemente 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98 % o más, 99% o más, de identidad de secuencia con el polipéptido mostrado como SEQ ID No 2.

Cuando en este documento se hace alusión a las posiciones numeradas de aminoácidos (residuos), salvo que se indique específicamente, la numeración se corresponde con la

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) longitud completa de la molécula gp41 en su forma natural de la que la SEQ ID No 1 es un fragmento correspondiente a la región NHR. Por lo tanto, la primera posición de la SEQ ID No 1 (A) tiene el número 30, la siguiente posición en SEQ ID No 1 (R) tiene el número 31 , y así sucesivamente. Para la secuencia inversa del polipéptido NHR (SEQ ID No 2) la numeración de residuo también se ha invertido, por lo que la primera posición, L, tiene el número 30, el segundo residuo, Q, tiene el número 31 , y así sucesivamente. Se detallan específicamente ejemplos de mutaciones de polipéptidos de SEQ ID No 1 y SEQ ID No 2 a lo largo de los ejemplos descritos en este documento. De acuerdo con la invención tal como se describe en esta memoria descriptiva, "mutación" puede significar una acción cualquiera seleccionada de inserción(es), eliminación(es) y la sustitución(es). Sustitución(es) puede ser preferible.

Naturalmente, la invención también se refiere a cualquier proteína en superhélice trimérica, que cumple con todos los requisitos que se describen para el primer aspecto - en relación con la estructura de la proteína tal y como se describió anteriormente. En este sentido, los siguientes aspectos de la invención se refieren además a proteínas en superhélice trimérica antiparalela que cumplan todos los requisitos descritos en el primer aspecto. En este sentido, un segundo aspecto de la invención se refiere a la proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención, en la que una de las tres α-hélices comprende una secuencia que tiene un 90% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de SEQ ID No 3 (hélice 1 de covNHR3) o un fragmento de la misma; en el que otra de los tres a-hélices comprende una secuencia que tiene un 90% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de la SEQ ID No 4 (hélice 2 de covNHR3) o un fragmento de la misma; en el que la α-hélice restante comprende una secuencia que tiene un 90% o más de identidad con la secuencia del polipéptido de la SEQ ID No 5 (hélice 3 de covNHR3) o un fragmento de la misma; en el que las α-hélices están unidas por lazos de conexión que tienen al menos tres residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos cuatro residuos de aminoácidos; y en donde la proteína en superhélice trimérica antiparalela es capaz de unirse a cualquiera de los siguientes péptidos CHR de gp41 : CHR-127-162 (T20; SEQ ID No 13), CHR-1 17-150 (W34L; SEQ ID No 14), CHR-1 10-141 (Q32Q; SEQ ID No 15) and CHR-1 10-129 (Q20S; SEQ ID No 16). En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la proteína en superhélice trimérica antiparalela comprende una secuencia seleccionada de entre cualquiera del siguiente grupo: SEQ ID No 6 (covNHR2), SEQ ID No 7 (covNHR3), SEQ ID No 8 (covNHR3-A), SEQ ID No 9 (covNHR3-AC), SEQ ID No 10 (covNHR3-B), SEQ ID No 1 1 (covNHR3-AB) y SEQ ID No 12 (covNHR3-ABC).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) La proteína en superhélice trimérica antiparalela de la invención, en particular la proteína en superhélice trimérica antiparalela del segundo aspecto de la invención, tiene preferiblemente una o más sustituciones seleccionadas entre las siguientes: el residuo de aminoácido en la posición 47 de la SEQ ID No 3 puede sustituirse por una glutamina; el residuo de aminoácido en la posición 60 de la SEQ ID No 3 puede sustituirse por una serina; el residuo de aminoácido en la posición 61 de la SEQ ID No 3 puede sustituirse por una lisina, el residuo de aminoácido en la posición 50 de la SEQ ID No 3 puede sustituirse por un ácido glutámico, el residuo de aminoácido en la posición 51 de la SEQ ID No 4 puede sustituirse por una serina; el residuo de aminoácido en la posición 52 de la SEQ ID No 4 puede sustituirse por un ácido glutámico y el residuo de aminoácido en la posición 52 de la SEQ ID No 5 puede sustituirse por una lisina. Se hace notar que en una realización preferida, el residuo de aminoácido en la posición 47 de la SEQ ID No 3 puede sustituirse por un aminoácido polar / hidrófilo; el residuo de aminoácido en la posición 60 de la SEQ ID No 3 puede sustituirse por un aminoácido polar / hidrófilo; el residuo de aminoácido en la posición 61 de la SEQ ID No 3 puede sustituirse por un aminoácido básico; el residuo de aminoácido 15 en la posición 50 de la SEQ ID No 4 puede sustituirse por un aminoácido ácido; el residuo de aminoácido en la posición 51 de la SEQ ID No 4 puede sustituirse por un aminoácido polar / hidrófilo; el residuo de aminoácido en la posición 52 de la SEQ ID No 4 puede sustituirse por un aminoácido ácido y el residuo de aminoácido en la posición 52 de la SEQ ID No 5 puede sustituirse por un aminoácido básico.

Las características genéricas dentro de los que se encuentran los residuos de aminoácidos, tal como se menciona en este documento, son tal como sigue:

Polares / hidrófilos: N, Q, S, T, K, R, H, D, E, (y en algunas realizaciones C, Y)

No polares/hidrófobos: A, V, L, I, P, Y, F, W, M, C (en algunas realizaciones G)

Que contienen azufre - C, M

Ácidos (cargados negativos a pH neutro)- D, E, (y en algunas realizaciones C)

Básicos (cargados positivos a pH neutro) K, R, (y en algunas realizaciones H)

Aromáticos: F, W, Y, (y en algunas realizaciones H)

Alifáticos: G, A, V, L, I, P

Pequeños: G, A, S, T, D, N

Los inventores también han demostrado que algunos de los ejemplos de proteínas en superhélice trimérica de la invención son solubles a pH fisiológico (Ejemplos 3 y 5). El pH

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) fisiológico en el sentido más amplio puede significar cualquier pH de desde 6,9 hasta 7,8, pero se prefiere un pH de desde pH 7,0 hasta 7,6, tal como de 7,2 a 7,5, y particularmente se prefiere un pH de 7,4. Particularmente, dicho polipéptido puede ser como tal soluble a pH 7,4 o, preferiblemente, ser más soluble que el polipéptido de SEQ ID NO: 1 a pH 7,4. Aunque no todos los polipéptidos de la invención pueden mostrar la misma solubilidad, un aumento de la solubilidad puede ser una ventaja en algunas circunstancias. Por ejemplo, la preparación de vacunas puede lograrse técnicamente de manera más conveniente con péptidos solubles, y/o los péptidos solubles pueden ser más accesibles al sistema inmunitario tras la administración. La preparación de un polipéptido soluble se muestra en el ejemplo 1 . La determinación de la solubilidad es tal como sigue.

Determinación de la solubilidad

Si un polipéptido particular es soluble (o más soluble que otro polipéptido) a un determinado pH, por ejemplo pH 7,4, se determina tal como sigue.

La determinación de la solubilidad se realiza según el siguiente ensayo: Se dializa una disolución de un polipéptido que va a someterse a prueba al menos durante la noche frente al tampón objetivo (fosfato de sodio 50 mM pH 7,4). Tras la diálisis, se centrifuga la muestra en una microcentrífuga de laboratorio para retirar cualquier material insoluble. El sobrenadante se retira con cuidado ("disolución") y entonces se concentra la disolución en varias etapas mediante ultrafiltración usando concentradores de centrífuga apropiados. Se mide la concentración de proteína soluble después de cada etapa de manera espectrofotométrica mediante absorción a 280 nm. El límite de solubilidad se establece cuando la concentración de proteína alcanza un máximo. Una proteína de la que no puede prepararse una disolución que tenga una concentración de proteína de 1 mg/ml o más en estas condiciones se clasifica como insoluble. Este protocolo se refiere a una medición a pH 7,4, pero el protocolo también puede adaptarse usando un tampón de pH diferente, para determinar así la solubilidad a dicho pH diferente.

La proteína en superhélice trimética de la invención puede comprender, además, mutaciones. Dichas mutaciones adicionales se especifican más adelante en la tabla 6.

Los inventores han demostrado que las proteínas en superhélice trimérica de la invención son particularmente inmunogénicas (véase por favor el ejemplo 7). En este sentido, se espera que las hepta-repeticiones N-terminales (NHR) de la secuencia de gp41 estén expuestas durante la reorganización estructural asociada con la entrada viral en una célula diana (etapa prefusión). Por tanto, se espera que los anticuerpos que se induzcan tras la inmunización con los polipéptidos de la presente invención se puedan unir a la conformación

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) de pre-fusión de gp41 . Por lo tanto se espera que los anticuerpos se unan al virus después de la unión del receptor y co-receptor. Alternativamente, es concebible que estos anticuerpos puedan unirse al virus antes de la unión a su receptor. Este punto de vista se sustenta en el hecho de que el haz de 5 hélices, una molécula capaz de neutralizar la fusión mediante la unión a CHR, ha demostrado ser activa también cuando se une a un virus libre. Por lo tanto, es probable que los anticuerpos inducidos contra la región NHR tengan propiedades similares. Se supone que el acceso a los epítopos diana será más fácil para tales Abs que para los receptores en los linfocitos B. En tal caso, la eficiencia con la que los anticuerpos disponibles mediante inmunización con los polipéptidos de la presente invención neutralizarán el virus será mayor, ya que se inhibirán virus libres y virus asociados a las células. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la presente invención no está vinculada a ninguna teoría científica en particular.

La invención también se refiere a un ácido nucleico de una sola cadena que codifica la proteína en superhélice trimérica de la invención tal y como se ha descrito anteriormente. Si se desea la expresión en un huésped particular, debe considerarse la frecuencia de uso de codones de dicho huésped. La invención también se refiere a un ácido nucleico de cadena sencilla que puede hibridarse en condiciones rigurosas con el primer ácido nucleico descrito. La invención también se refiere a un ácido nucleico de doble hebra que comprende el ácido nucleico monocatenario descrito en primer lugar y su complementario - o esencialmente su hebra complementaria. La invención también se refiere a un vector de expresión, tal como un plásmido, que contiene el ácido nucleico mencionado anteriormente.

La proteína en superhélice trimérica de la invención se puede obtener por cualquier método conocido, tal como mediante síntesis química de péptidos in vitro, o mediante la expresión de un gen que codifica, por ejemplo, el ácido nucleico antes descrito o un vector, en una célula huésped. La invención también comprende un método para la síntesis in vitro de las proteínas en superhélice trimérica de la invención así como un método para obtener el polipéptido a partir de una célula huésped y obtenerlo posteriormente y, opcionalmente, purificarlo. La invención también comprende la célula huésped.

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende la proteína en superhélice trimérica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además un adyuvante. En una realización particular, la composición farmacéutica tiene el formato de una formulación en liposomas. Ejemplos de liposomas pueden comprender di-miristoil-fosfatidilcolina (DMPC), colesterol, y di-miristoil- fosfatidilglicerol (DMPG). En ciertas realizaciones, la relación molar de DMPC a colesterol y a DMPG en la composición es de aproximadamente 9:7:1 . También se proporcionan métodos para producir tales liposomas. Los liposomas comprenden típicamente fosfolípidos,

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) ya sea como una preparación homogénea (por ejemplo, un único tipo de fosfolípido) o una mezcla de diferentes fosfolípidos. Por ejemplo, se pueden utilizar fosfolípidos con diferentes longitudes de cadena (por ejemplo, uno o más de C14, C16, C18, C20, o fosfolípidos naturales con longitudes de cadena mixtas). También se pueden usar mezclas de colesterol(es) y lípido(s) en varias proporciones. En algunas formas de realización, se puede usar un fosfolípido proporcionando una carga superficial negativa al liposoma (por ejemplo, DMPG, DMPA, DOTAP, DOTMA). En ciertas formas de realización, los liposomas se producen mediante la combinación de un lípido con el polipéptido en presencia de octil-B-D- glucopiranósido (β-OG), Tween 20 y / o otros detergentes adecuados, que pueden ser necesarios para solubilizar y estabilizar las proteínas hidrófobas de membrana. En algunas formas de realización, los liposomas dentro de una composición son de tamaños sustancialmente similares (por ejemplo, un diámetro medio z de aproximadamente cualquiera de 70 a 130, 70-80, 80-90, 90-100, 100-1 10, 1 10-120, y de 120 a 130 nm, según su determinación mediante dispersión dinámica de la luz). Los liposomas se pueden preparar usando métodos descritos en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N ^e 6.843.942.

La proteína en superhélice trimérica de la invención puede ser utilizada como un medicamento, en particular como una vacuna. Dicho medicamento o vacuna pueden administrarse a un animal (por ejemplo, a un mamífero) o sujeto humano. Se prefiere la administración a un sujeto humano.

La proteína en superhélice trimérica de la invención se puede administrar en una o varias dosis, como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez dosis. No hay limitaciones particulares relativas a la cantidad de ingrediente activo por dosis.

Como se muestra en el Ejemplo 7, las proteínas en superhélice trimérica de la invención producen una respuesta robusta de IgG en suero, pobre/mala respuesta de IgA en suero y una respuesta preferencial de IgG frente a IgA en mucosa post-mortem. Por tanto, las proteínas superhélice trimérica de la invención se pueden utilizar como inmunógenos y son particularmente buenos candidatos para usarse como inmunógenos de la mucosa, con el fin de potenciar la respuesta inmunitaria mucosal local.

El conejo se usa frecuentemente en la técnica para evaluar la inmunogenicidad de los antígenos. Parece lógico que las proteínas en superhélice trimérica de la invención, puesto que son inmunogénicas en conejos, también seán inmunogénicas en seres humanos. En conejo, covNHR2 y covNHR3 pueden inducir Abs neutralizantes. En resumen, si es inmunogénica en conejo, probablemente será inmunogénica en ser el humano (producción de Abs). La función y calidad de estos Abs inducidos pueden mostrar alguna diferencia.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. EJEMPLOS Ejemplo 1 . Diseño de una primera generación de haces antiparalelos de NHR de cadena simple

El reto consistía en diseñar una proteína en superhélice trimérica antiparalela, en el que la superficie expuesta al disolvente de dos de las tres α-hélices se asemejaran a la superficie expuesta en la superhélice trimérica de la región NHR de gp41 . Para este propósito, se partió de la estructura del haz de tres hélices formada por la región de NHR en el modelo de estructura de post-fusión de gp41 (código PDB: 1 IF3) y seleccionaron los tres segmentos helicoidales A30-L81 y eliminaron todos los residuos restantes de la estructura modelo. El proceso de modelado se realizó utilizando el software de Swiss-PDB Viewer.

Entonces, utilizando la segunda de las hélices NHR como plantilla, se modeló una hélice adicional con la secuencia inversa de la secuencia WT de la región NHR. La hélice recién modelada se giró espacialmente hasta obtener una orientación antiparalela respecto a las otras hélices y estructuralmente superpuesta a la plantilla original, usando los carbonos alfa de cada residuo como elementos de alineación. La segunda hélice de la proteína en superhélice trimérica de NHR se reemplazó a continuación en el modelo por esta nueva hélice antiparalela. Las colisiones estéricas entre las cadenas laterales de la nueva hélice antiparalela y las otras hélices se eliminarion mediante optimización de los rotámeros de las cadenas laterales. A continuación, las hélices fueron ligadas construyendo conectores que consistieron en segmentos cortos polipéptídicos de unos pocos aminoácidos, cuyas conformaciones fueron optimizadas manualmente para permitir una ligadura adecuada entre los extremos C- y N-terminales de cada par de hélices. Esto creó una estructura en superhélice trimérica con forma de varilla con una topología de hélice-giro-hélice-giro-hélice (véase la figura 1 a).

Para mejorar la estabilidad estructural de las hélices, se crearon interacciones favorables de tipo tapadera de hélices. Esto se realizó mediante la introducción de varias mutaciones en el extremo de las hélices y mediante una selección apropiada de los aminoácidos que constituyen los conectores. Por último, se añadió una metionina N-terminal y una cola de histidinas a la secuencia de aminoácidos final del constructo para facilitar su expresión y purificación.

El constructo modelo resultante, denominado covNHRI , fue clonado en E. coli como se describe a continuación en el Ejemplo 9, pero tuvo niveles de expresión muy pobres debido

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) posiblemente a su inestabilidad estructural o a su propensión a la agregación. El análisis estructural de este modelo de constructo mostró una alta hidrofobicidad en la superficie expuesta y una frecuencia relativamente baja de residuos cargados en el extremo N- terminal. Dicha elevada hidrofobicidad podría ser responsable de la falta de expresión en E. coli. Por lo tanto, covNHRI fue diseñado de nuevo para introducir interacciones favorables. En este sentido, varios residuos hidrófobos expuestos al disolvente fueron sustituidos por aminoácidos cargados en un segundo constructo llamado covNHR2 (véase la figura 1 b). Estas mutaciones se hicieron en aquellos lugares que no alteran el bolsillo hidrofóbico prominente, que es reconocido por los anticuerpos neutralizantes D5 y HK20 en la superficie del trímero NHR.

Además, un tercer constructo, llamado covNHR3, fue diseñado a partir covNHR2 mediante el rediseño de los conectores que conectan cada par de hélices consecutivas. En este sentido, se alargaron los conectores mediante la inserción de un aminoácido adicional. Las secuencias de polipéptidos de cada una de estos constructos, es decir covNHRI , covNHR2 y covNHR3, se muestran en la tabla 1 y se nombraron primera generación de constructos covNHR. Se hace notar que tanto covNHR2 y covNHR3 se pudieron expresarse en E. coli con un buen rendimiento y purificarse hasta la homogeneidad.

Tabla 1: Secuencias de constructos covNHR de primera generación Secuencia NHR WT de gp41

ARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

Hélice 1

covNHRI MARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL covNHR2 MARQELSGIEQKQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL covNHR3 MARQELSGIEQKQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

Bucle 1

covNHRI GKAD

covNHR2 GKAD

covNHR3 GKGNQ

Hélice 2

covNHRI PQQDKLYREVALIRAQLQKIGWVTLQLLHQQAEIARLLNNQQQVIGSLLQR covNHR2 PQQDKLYREVALIRAQLQKIGWVTLQLLHQQAEIARLLNNQEQEIGSLKQR covNHR3 PQQDKLYREVALIRAQLQKIGWVTLQLLHQQAEIARLLNNQEQEIGSLKQR

Bucle 2

covNHRI GILD

covNHR2 GILD

covNHR3 GLIDG

Hélice 3

covNHRI PLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL covNHR2 PLLSGIDQRQNNLKRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL covNHR3 PLLSGIDQRQNNLKRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Ejemplo 2. Caracterización biofísica de proteínas covNHR de primera generación

Tanto covNHR2 y covNHR3 son altamente solubles en pH ácido y fisiológico. En particular, covNHR3 pudo ser concentrado hasta 20 mg/mL. Ambas proteínas pueden ser liofilizadas y volver a solubilizarse en un medio tampón sin perder su conformación estructural.

Además, se realizaron mediciones de dispersión dinámica de luz para caracterizar el tamaño molecular de las proteínas (véase la tabla 2 a continuación).

A pH 2,5 los radios hidrodinámicos experimentales son de aproximadamente 2,6 nm, muy acorde con el valor de 2,65 nm calculados para un modelo rígido de covNHR2 usando el software HYDROPRO. A pH 7,4 los radios aparentes son significativamente mayores sugiriendo una tendencia de las proteínas a auto-asociarse. Esto se confirmó por la dependencia considerable del radio hidrodinámico con la concentración de proteína y mediante mediciones de dispersión estática de luz (SLS) a diferentes concentraciones.

Los espectros por dicroísmo circular (CD) en el UV lejano son coherentes con los de proteínas altamente α-helicoidales (Figura 2). El porcentaje de α-hélice es de aproximadamente el 85%, como se estima de acuerdo con la elipticidad negativa a 222 nm. En el rango de CD UV cercano los espectros por CD muestran muy baja elipticidad por la completa exposición al disolvente de todos los residuos aromáticos de las proteínas. El desplegamiento térmico de las proteínas también se investigó mediante el uso de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) a diferentes valores de pH (Figura 3). A pH ácido las dos proteínas se despliegan en una única transición aguda con una temperatura de

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) fusión muy elevada. Esta transición es parcialmente reversible en un segundo calentamiento. A medida que aumenta el pH, la temperatura de las transiciones de desnaturalización aumenta pero los picos de desnaturalización se distorsionan y ensachan progresivamente y el desplegamiento térmico se hace irreversible. A pH fisiológico los termogramas DSC de ambas proteínas sólo muestran dos picos débiles. El primero a aproximadamente 60 ^e C está acompañado por un considerable deplegamiento, como se demuestra mediante dicroísmo circular (CD) en el UV lejano (Figura 4), y la formación de grandes agregados de proteína de acuerdo con medidas de DLS en función de la temperatura.

Estos resultados indican que a pH ácido los dos constructos de proteínas se comportan como unidades altamente estables, bien estructuradas y cooperativas, mientras que a valores de pH fisiológicos la estabilidad estructural es menor y aumenta la tendencia de las proteínas a auto-asociarse. A cada pH, la entalpia de desplegamiento de covNHR3 es ligeramente mayor que la de covNHR2 y las transiciones de desnaturalización son más simétricas, lo que indica una estructura ligeramente más organizada y cooperativa.

Ejemplo 3. Interacción de las proteínas covNHR con péptidos exóqenos CHR deivados de gp41

Para evaluar la capacidad de estos constructos, covNHR2 y covNHR3, de mostrar una superficie de NHR trimérica similar a la de gp41 , hemos probado su capacidad para unirse a péptidos sintéticos que abarcan diferentes segmentos de la región CHR de la gp41 . Para este propósito, hemos probado la unión de varios péptidos (véase la tabla 3 a continuación), CHR-127-162 (T20), CHR-1 17-150 (W34L) y CHR-1 10-141 (Q32Q) y CHR-1 10-129 (Q20S).

Tabla 3. Péptidos sintéticos derivados de gp41 utilizados en el estudio en la unión a la superficie de NH R. Las secuencias se han desplazado para que coincidan los residuos idénticos.

T20 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

W34L WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL

Q32Q QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQ

Q20S QIWNNMTWMEWDREINNYTS

En las pruebas iniciales, cada proteína covNHR se mezcló con el péptido ensayado a concentraciones equimolares y varias propiedades biofísicas se midieron y compararon con las de cada entidad aislada. T20 es capaz de unirse a covNHR2 a pH 2,5 a temperatura ambiente, como se deduce de los cambios significativos en los espectros de CD en el UV lejano y UV cercano de las mezclas, pero las mezclas tienden a formar precipitados insolubles imposibilitando su caracterización detallada. Las mezclas equimolares de

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) covNHR2 y covNHR3 con los otros péptidos a pH 2.5 y 7.4 también mostraron cambios significativos en la estructura α-helicoidal en relación con los restos aislados de acuerdo con los valores de elipticidad negativos en los espectros de CD en el UV lejano (Figura 5). Estos cambios son sin embargo relativamente pequeños en comparación con los grandes valores que presentan las proteínas aisladas por lo que este observable no es apropiado para caracterizar la unión.

Una sonda física más sensible se obtuvo a partir de los espectros de CD en el UV cercano. Se ha observado previamente que una característica prominente de la interacción entre las regiones CHR y NHR en la conformación post-fusión de gp41 involucra a las cadenas laterales de dos residuos de triptófano de la región CHR (W1 17 y W120), que interactúan con el bolsillo hidrófobo de la región NHR. Esta disposición particular de cadenas laterales de triptófano da lugar a un espectro característico de CD con una banda negativa nítida e intensa centrada en 294 nm. Esta banda de CD se puede observar en el espectro de un ectodominio gp41 recombinante en su conformación post-fusión (Figura 6). Dado que las proteínas covNHR aisladas carecen de señal de CD en el rango UV cercano, la unión de una manera similar a gp41 de péptidos CHR que contienen el motivo de dos triptófanos restauraría la señal CD. La Figura 6 muestra los espectros de diferencia de CD en el UV cercano de mezclas equimolares de cada proteína y el péptido en comparación con las moléculas aisladas. Los espectros de CD muestran una banda similar en forma e intensidad a la observada para el ectodominio de gp41 en conformación en haz de 6 hélices (6HB). Esto indica que los péptidos CHR se unen a las proteínas covNHR en una conformación similar a la de la gp41 . La unión parece más fuerte para el péptido Q32Q que para W34L de acuerdo con una señal de CD de intensidad superior y covNHR3 parece tener más afinidad que covNHR2 para cada péptido equivalente. Las titulaciones de la proteína covNHR3 con los péptidos a pH 2,5 y 7,4 se hicieron monitorizando la señal de CD a 294 nm (Figura 7). Los datos se corresponden con un evento de unión de alta afinidad con constantes de disociación aparentes en el intervalo micromolar (Tabla 4).

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) El efecto de la unión de péptidos CHR sobre la estabilidad estructural de las proteínas se analizó por DSC. Para ambos valores de pH 2.5 y 7.4 las dos proteínas se estabilizan en presencia de los péptidos CHR (Figura 8). Q32Q parece ejercer una estabilización más alta que W34L.

La unión del péptido a W34L a covNHR3 se investigó con más detalle por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) a pH 7,4 y 25 ^e C. Las isotermas de ITC no obedecen a un modelo de unión 1 :1 (Figura 9), en marcado contraste con la unión aparente de tipo 1 :1 que se observa por CD. Estos datos muestran que los constructos de proteínas de covNHR se pueden unirse a más de una molécula de péptido. Esto podría explicarse teniendo en cuenta que las moléculas poseen una pseudo-simetría ternaria (Figura 10a), con tres hendiduras hidrófobas altamente similares en las que tres péptidos CHR podrían unirse. Además, su alta hidrofobicidad superficial también podría favorecer las interacciones intermoleculares responsables de la propensión a la auto-asociación observada para estas proteínas.

Los datos de ITC se pueden entender si suponemos un modelo de 3 sitios de unión, diferentes e independientes, para el péptido CHR (Figura 9). Las magnitudes termodinámicas resultantes de este análisis indican dos sitios de unión de alta afinidad y un tercer sitio con menor afinidad (Tabla 5).

Tabla 5. Magnitudes termodinámicas para la unión de péptido gp41 W34L a proteínas covNHR a pH 7,4 y 25 ^Q C. Las magnitudes se han obtenido a partir del análisis de las isotermas de unión de ITC utilizando un modelo de dos conjuntos de sitios diferentes e independientes.

La constante de disociación para los dos sitios de alta afinidad es 0.23 ± 0.03 μΜ, que es aproximadamente un orden de magnitud mayor que la medida por CD para el mismo péptido. Esto podría atribuirse a las limitaciones experimentales inherentes a los experimentos de titulación de CD, que deben llevarse a cabo a una concentración relativamente alta de proteínas y no pueden proporcionar valores precisos para estas elevadas afinidades de unión. Los dos sitios de unión de alta afinidad podrían atribuirse a dos de las tres caras de la molécula covNHR3, que pueden establecer los contactos adecuados con el péptido. La gran magnitud y el carácter exotérmico de la entalpia de unión indican una extensa formación de interacciones proteína-péptido a lo largo de las grietas

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) hidrófobas NHR. La tercera cara de covNHR3 parece mostrar una afinidad más baja, lo que indica una topología de la superficie menos óptima para la unión a los péptidos CHR.

En conclusión, las proteínas covNHR2 y covNHR3 se pliegan en forma de proteínas altamente estables con estructura α-helicoidal de acuerdo con los modelos de diseño. Además, estas proteínas son capaces de unirse a péptidos exógenos CHR derivados de gp41 con una afinidad muy elevada y en una conformación similar a la del ectodominio gp41 en su conformación post-fusión. Estos resultados demuestran que estas proteínas pueden imitar con precisión la superficie de un haz trimérico NHR de gp41 y por lo tanto podrían constituir buenos candidatos para vacunas contra el VIH dirigidas a esta región de gp41 .

Ejemplo 4. Diseño de proteínas covNHR de 2- generación

Como ya se ha mencionado, el análisis estructural de la estructura del modelo covNHR3 muestra una alta similitud entre las tres grietas hidrófobas de su superficie (Figura 1 0b). Cada cara de la proteína contiene varios bolsillos hidrófobos consecutivos, en los que los grupos hidrófobos de residuos de la región CHR se pueden insertar en la conformación postfusión 6HB. Son particularmente evidentes dos bolsillos hidrófobos conservados creados por la presencia de residuos de aminoácidos con cadenas laterales pequeñas (glicina y alanina) en la posición g en las hélices NHR triméricas. En uno de estos bolsillos (bolsillo 1 ) las dos cadenas laterales de triptofano de la región CHR (W 1 1 7 y W120) quedan insertados en la conformación post-fusión 6HB de la gp41 . Este bolsillo también es reconocido por los mAbs neutralizantes de D5 y HK20. El bolsillo se crea por la presencia de un residuo de glicina en la posición 61 , que deja el espacio necesario. Otro bolsillo menos profundo (Bolsillo 2) se crea por un residuo de alanina en la posición 47, donde pueden interactuar varios residuos hidrófobos de la región CHR. Un patrón de superficie similar se repite en las otras dos caras de la hélice trimérica de la región NHR.

Se diseñaron diferentes tipos de covNHR3, como se muestra en la tabla 6 a continuación, para reducir el potencial de interacción de sus dos caras no nativas. Para hacer esto, varios residuos expuestos fueron mutados para eliminar los bolsillos hidrófobos y crear interacciones estabilizantes adicionales. Las mutaciones de los correspondientes residuos de Gly y Ala por residuos más voluminosos se diseñaron para rellenar los bolsillos hidrófobos en cada una de las dos caras no nativas de covNHR3 y también se mutaron otros residuos para diseñar las interacciones estabilizantes adicionales (Figura 10). Se diseñaron dos grupos de mutaciones: Grupo A) Las mutaciones para eliminar el bolsillo 1 : G33K, V81 E y G79E, y el grupo B) mutaciones para eliminar el bolsillo 2: A1 9Q, L95E, A93E y Q1 35K. Además, las proteínas covNHR tienen tres residuos de triptofano que apuntan hacia el exterior de la superficie. Estos residuos podrían mediar interacciones intermoleculares y

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) promover la auto-asociación. En consecuencia, un tercer grupo de mutaciones (Grupo C) fue diseñado para eliminar dos de estos residuos de las caras no nativas: W32S y W80S. Estos tres grupos de mutaciones se combinaron en 5 mutantes diferentes, que se denominaron según los grupos de mutaciones que contenían (Tabla 6). Estas secuencias de polipéptidos se denominan proteínas covNHR de segunda generación.

Tabla 6: Secuencias de las proteínas covNH R de segunda generación

Hélice 1 :

COVNHR3-A MARQELSGIEQKQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWKIKQLQARILAVERYLKDQQL

COVNHR3-AC MARQELSGIEQKQNNLLRAIEAQQHLLQLTVSKIKQLQARILAVERYLKDQQL

COVNHR3-B MARQELSGIEQKQNNLLRQIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

COVNHR3-AB MARQELSGIEQKQNNLLRQIEAQQHLLQLTVWKIKQLQARILAVERYLKDQQL

CovNHR3—ABC MARQELSGIEQKQNNLLRQIEAQQHLLQLTVSKIKQLQARILAVERYLKDQQL

Bucle 1 :

CovNHR3-A GKGNQ

CovNHR3-AC GKGNQ

CovNHR3-B GKGNQ

CovNHR3-AB GKGNQ

CovNHR3—ABC GKGNQ

Hélice 2 :

CovNHR3—A PQQDKLYREVALIRAQLQKIEWETLQLLHQQAEIARLLNNQEQEIGSLKQR

CovNHR3—AC PQQDKLYREVALIRAQLQKIESETLQLLHQQAEIARLLNNQEQEIGSLKQR

COVNHR3-B PQQDKLYREVALIRAQLQKIGWVTLQLLHQQAEIERELNNQEQEIGSLKQR

COVNHR3-AB PQQDKLYREVALIRAQLQKIEWETLQLLHQQAEIERELNNQEQEIGSLKQR

CovNHR3—ABC PQQDKLYREVALIRAQLQKIESETLQLLHQQAEIERELNNQEQEIGSLKQR

Bucle 2 :

CovNHR3—A GLIDG

CovNHR3—AC GLIDG

CovNHR3-B GLIDG

CovNHR3-AB GLIDG

CovNHR3—ABC GLIDG

Hélice 3 :

CovNHR3—A PLLSGIDQRQNNLKRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

CovNHR3—AC PLLSGIDQRQNNLKRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

COVNHR3-B PLLSGIDQRQNNLKRAIEAQKHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

COVNHR3-AB PLLSGIDQRQNNLKRAIEAQKHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

CovNHR3—ABC PLLSGIDQRQNNLKRAIEAQKHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQL

Ejemplo 5. Caracterización biofísica de las proteínas covNHR de segunda generación

Todos los mutantes se muestran en la tabla 6 anterior, son altamente solubles tanto a pH ácido como a pH fisiológico. El análisis mediante DLS a pH 2,5 indica un tamaño molecular compatible con un estado monomérico para todas las proteínas mutantes, de manera similar a la molécula parental covNHR3 (véase la tabla 2 anterior). En contraste, a pH 7,4 los tamaños moleculares son más variables. Los mutantes que contienen el grupo A de

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) mutaciones muestran menor tamaño molecular, más cerca de lo esperado para el monómero, mientras que covNHR3-B muestra un tamaño similar a covNHR3. El tamaño más compacto se observa para covNHR3-ABC, que contiene todas las mutaciones. Todas las proteínas mutantes muestran espectros de CD en el UV lejano plenamente coherentes con una estructura en haz α-hélices tanto a pH 2,5 y 7,4. Además, el contenido de α-hélices es muy similar para todas las proteínas y, salvo por pequeñas variaciones, no cambia mucho entre pH ácido y pH fisiológico (Figura 1 1 ). La estabilidad térmica de los cinco mutantes es mayor que la de covNHR3 en diferentes grados, como se observa mediante DSC (Figura 1 2). A pH ácido las transiciones térmicas de todos los mutantes son muy nítidas y parcialmente reversibles en un segundo calentamiento. A este pH el grupo de mutaciones A produce un considerable aumento de la temperatura de desplegamiento, Tm, mientras que el conjunto de mutaciones B tiene un impacto principal en el aumento de la entalpia de desplegamiento. Por el contrario, el conjunto de mutaciones C parece ser desestabilizador. A pH 7,4 las transiciones térmicas son completamente irreversibles para todas las proteínas mutantes y muestran diferentes y complejas formas. Todos los mutantes muestran transiciones térmicas más cooperativas que covNHR3. La combinación de los grupos de mutaciones A y B parece producir el efecto estabilizador más alto a este pH.

Ejemplo 6. Unión de proteínas covNHR de 2- generación a péptidos CHR

La exposición de epítopos similares a gp41 en la región NHR fue nuevamente evaluada por CD en el UV cercano de acuerdo con la capacidad de cada proteína para unirse a péptidos CHR exógenos sintéticos. Se prepararon mezclas equimolares entre cada proteína covNHR- mutante y el péptido Q32Q y se analizaron por CD en el UV cercano tanto a pH 2,5 y 7,4 (Figura 1 3). En ambos casos se observó para todos los antígenos, aunque con intensidad variable, la banda negativa nítida a 294 nm, típica de la interacción del motivo de dos triptófanos CHR con el bolsillo hidrofóbico de la región NHR. Específicamente, covNHR3-AB y covNHR3-AC parecen tener una interacción más débil con el péptido a pH 2,5 de acuerdo con una intensidad inferior de la banda de CD, mientras que a pH 7,4 esta intensidad parece ser similar para todos los mutantes, pero menor que la observada para la proteína parental covNHR3. Puesto que se encontró que covNHR3-ABC presentaba las mejores propiedades biofísicas globales, seleccionamos este antígeno para una caracterización más completa de su epítopo NHR expuesto en comparación con covNHR3. Se realizaron titulaciones de covNHR3-ABC con los péptidos CHR mediante la observación de la formación de la banda de CD en el UV cercano a 294 nm (Figura 14). Al igual que en el caso de covNHR3, las afinidades de unión aparentes derivadas de estas titulaciones se encuentran en el rango

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) micromolar bajo para ambos péptidos. Sin embargo, los experimentos de ITC con W34L (Figura 15) indican que para covNHR3-ABC hay un evento de unión 1 :1 de alta afinidad destacado, acompañado de pequeños calores residuales correspondientes uniones inespecíficas. El ajuste de la isoterma de unión con el modelo de sitios de unión diferentes e independientes condujo a un sitio con muy alta afinidad (Kd = 40 ± 3 nM) y dos sitios de baja afinidad. Estos datos demuestran que las mutaciones diseñadas en covNHR3-ABC seleccionaron específicamente el modo de unión similar al nativo y redujeron fuertemente la afinidad de unión de las caras no nativas de la molécula. Ejemplo 7. Inmunoqenicidad en conejos

Las proteínas covNHR, tanto de primera como de segunda generación, se ensayaron para determinar la inmunogenicidad tal como se describe en este documento. Se inmunizaron conejos por vía sistémica, tanto en presencia o ausencia de hidróxido de aluminio, alumbre (AIOOH) como adyuvante. Los esquemas de inmunización se describen en las Tablas 7-1 y 7-2.

Tabla 7-1 : Inmunización de conejos por vía sistémica con proteínas covNHR de primera generación

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Tabla 7-2: Esquema de inmunización de conejos a por vía sistémica con proteínas covNHR de segunda generación

Las respuestas inmunes se midieron por ELISA, o mediante ensayos de neutralización (ensayo de TZMbI: IC50 a 1 /40 de dilución para los sueros, IC50 a 1/16 de dilución para lavados; ensayo de PBMC: IC80 en ¼ de dilución para los sueros y lavados) y / o ensayos de inhibición de la infección de macrofagos mediada por gamma-Fc (IC80 a ¼ de dilución para los sueros y lavados). Los datos resultantes de los experimentos de inmunización se resumen en las Tablas 8-1 y 8-2.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Tabla 8-1: Resumen de los resultados de inmunización de los antígenos de 1 ^§ generación

Tabla 8-1 (cont): Resumen de los resultados de inmunización de los antígenos de 1 ^§ generación

+ para 5

Leyenda:

negativo conejos conejos conejos

Tabla 8-2: Resumen de los resultados de inmunización de los antígenos de 2 ^§ generación

O

z

Z)

Tabla 8-2 (cont.): Resumen de los resultados de inmunización de los antígenos de 2 ^§ generación

O

O

<

N

<

ce

Z)

LU

NS: sin muestras este Resultado + para 1 ó 2 + para 3 ó 4 + para 5

Leyenda: día ++ +++

negativo conejos conejos conejos

Todas las proteínas covNHR con o sin AIOOH mostraron una respuesta robusta de IgG en suero en todos los animales, una débil respuesta de IgA en suero y respuestas preferenciales de IgG en mucosa. Las respuestas de IgA en mucosa fueron parcialmente inespecíficas ya que también se observaron respuestas en los controles negativos. Después de la inmunización parenteral, se detectó actividad inhibidora de VIH en el suero de los conejos inmunizados. Sin embargo, también se observó esa actividad inhibidora en algunos casos antes de la inmunización y en los controles negativos, lo cual podría estar relacionado con la liberación de citoquinas, posiblemente debida al estrés o la infecciones concurrentes en animales no SPF (Specific Pathogen Free / libres de patógenos específicos). Por lo tanto, la actividad inhibitoria del VIH medida fue al menos en parte inespecífica.

Ejemplo 8. Actividad inhibidora contra el VIH de los antíqenos de 2- generación

La actividad inhibidora de covNHR3-ABC frente a VIH se estudió usando 3 ensayos funcionales de inhibición : i) Ensayo de TZM-bl: Se usaron 2 pseudo-virus diferentes del VIH (SF-162, pseudovirus clasificado como nivel 1 , y QHO, pseudovirus clasificado como virus nivel 2) para infectar esta línea celular. La inhibición de la replicación del virus se analizó como función de una reducción en la expresión del gen informador de la luciferasa inducida por Tat tras una única ronda de infección de TZM-bl. Se evaluó la detección de la actividad inhibitoria a diferentes concentraciones de inhibidor. Se seleccionaron las concentraciones que produjeron 50% y 80% de disminución de la señal RLU (IC50 y IC80).

Ensayo en PBMC estimuladas infectadas con varios aislados primarios de VIH: SF162 (Nivel 1 , subtipo B), QHO, nivel 2 subtipo B), MN (nivel 1 , subtipo B), TV01 (nivel 1 , subtipo C), KON (nivel 2 / 3, subtipo CRF02 AG), aislado primario X4, UG (subtipo A). Se midió la inhibición del porcentaje de linfocitos T CD4 infectados mediante tinción intracelular de p24. Las muestras se analizaron a diferentes concentraciones para la detección del porcentaje de células infectadas tras un único ciclo de infección. Se registró la concentración de covNHR3-ABC que induce una reducción del 80% (IC80) o 90% (CI90) en el porcentaje de células infectadas.

Ensayo en macrófagos diferenciados infectados con el aislado primario Bal. Se midió la inhibición del porcentaje de macrófagos infectados mediante tinción intracelular de p24. Las muestras se analizaron a diferentes concentraciones para la detección del porcentaje de células infectadas tras un único ciclo de infección. Se registró la concentración de inhibidor que induce una reducción del 80% (IC80) o 90% (CI90) en el porcentaje de células infectadas.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Se observó una fuerte inhibición de la infección por VIH en todos los ensayos con todos los virus probados (Tabla 9).

Tabla 9: Resumen de los resultados in vitro de inhibición de las variantes de covNHR contra el VIH.

En el ensayo TZMbL, se observaron valores de IC50 e IC80 a una concentración por debajo de 50 nM para SF162, y en una concentración entre 0.5 a 2.5 μΜ para el pseudovirus QHO. En el ensayo de PBMC, se observó inhibición a una concentración sub-micromolar para todos los virus ensayados (de diferentes subtipos y diversas sensibilidades a la neutralización). En los macrofagos, se observó inhibición a una concentración <100 nM. El péptido inhibidor de VIH-1 , T20 (Enfuvirtide), utilizado como control positivo en estos experimentos y que interacciona con la región NHR de gp41 muestra una actividad inhibidora similar o inferior.

Ejemplo 9. Materiales v métodos

Los modelos moleculares de las proteínas se construyeron y analizaron mediante Swiss- PDB Viewer.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) El ADN que codifica las secuencias de la proteína se insertó en el vector pM1800 para la expresión en células de E. coli BLR (DE3) (Novagen, referencia: 69053). Se podrían utilizar otras cepas con el prófago DE3 (por ejemplo, BL21 (DE3)). Los plásmidos utilizados para la expresión son pM1800 proporcionados por Sanofi Pasteur, pero podrían ser construidos a partir de plásmidos comerciales. Para facilitar la purificación por cromatografía de afinidad de Sefarosa-Ni, las secuencias de proteínas se fusionaron a la siguiente cola de histidina en el extremo C-terminal: GGGGSHHHHHH. Después de la purificación por el uso de la cola de histidina, los fragmentos se purificaron adicionalmente usando una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. Alternativamente, los fragmentos se pueden purificar utilizando métodos de cromatografía de intercambio iónico, como una etapa de pulido de la purificación.

Los radios hidrodinámicos de las proteínas se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un instrumento DynaPro MS-X (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, EE.UU.). Antes de las mediciones, la muestra de solución se centrifugó durante 30 min a 18.000 rpm en un microcentrífuga de mesa. Las medidas de DLS se hicieron promediando 30 adquisiciones de 10 s cada una. Las curvas de correlación de intensidad se analizaron con el software de Dynamics V6 para obtener las distribuciones de radio hidrodinámico (Rh).

Las mediciones de dicroísmo circular se realizaron en un espectropolarímetro Jasco J-715 (Tokio, Japón) equipado con un soporte de cubetas termostatizado. Las mediciones de los espectros de CD en UV lejano (260-200 nm) se hicieron con una cubeta de cuarzo de 1 mm de longitud de paso de luz. El espectro resultante se registró a una velocidad de barrido de 100 nm/min y por lo general fue el promedio de 5 barridos. Los espectros de CD en UV cercano (350-250 nm) se midieron utilizando una cubeta de 5 mm y son la media de 16 barridos.

La estabilidad térmica de los fragmentos de proteína se caracterizó por calorimetría diferencial de barrido usando un calorímetro VP-DSC equipado con células capilares. Para investigar el grado de exposición de los epítopos correspondientes a la región de NHR de gp41 , las proteínas se mezclaron con péptidos sintéticos exógenos correspondientes a la región CHR de la secuencia de gp41 , tal y como se describió anteriormente. Se ensayaron tres péptidos: Péptido Q32Q, péptido W34L, y Q20S (Tabla 3). Los péptidos se adquirieron a EZ Biolab Inc. (Carmel, CA, EE.UU.). Las mezclas se incubaron durante al menos 1 h antes de su análisis mediante CD en los rangos UV lejano y UV cercano, DLS y DSC, tal y como se ha descrito anteriormente.

Agradecimientos

El trabajo que ha dado lugar a esta invención ha recibido financiación del VII Programa Marco de la Unión Europea [FP7/2007-2013] bajo el acuerdo de financiación n°201038.

HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)