Bei der Entschleimung von Speiseöl werden nicht hydratisier- bare Phospholipide durch Phopholipase wasserlöslich gemacht und so schonend, kostensparend und umweltfreundlich aus dem Speiseöl entfernt. In der europäischen Patentanmeldung 0 513 709 (Röhm/Lurgi) wird erstmals ein wirksames enzymati- sches Verfahren zur Entschleimung vorgestellt. Dabei wird ein mit Wasser vorentschleimtes Speiseöl mit einer wäßrigen Lösung einer Phospholipase zu Tröpfchen kleiner 10 Hm emul- giert. Nach der Hydrolyse (pH 3 bis 6, Temperatur 50 bis 70°C) wird die wäßrige Phase abgetrennt. Das enzymatische Entschleimungsverfahren wurde als"EnzyMax-Verfahren"von der Firma Lurgi in der Speiseölindustrie eingeführt. In der DE 43 39 556 wird als weitere Variante dieses Verfahrens die Wiederverwendung des Enzyms beschrieben, indem man das Enzym aus einer gebrauchten, schlammhaltigen wäßrigen Phase durch Zusatz von Tensiden oder Lösungsvermittlern ablöst und als weitgehend schlammfreie, enzymhaltige Lösung wiederverwendet.

Die Bereitstellung der erforderlichen Mengen an Enzym für die Betreibung eines großtechnischen Verfahrens kann nur mit Hil- fe von Mikroorganismen gedeckt werden. Es besteht also ein Bedarf nach einer mikrobiellen Quelle, die erlaubt, das Enzym Phospholipase in unbeschränkten Mengen zu produzieren. In der DE-OS 195 27 274. 9 vom 26. 07. 1995 (Röhm/Lurgi) wird be- schrieben, daß in Aspergillus niger eine geeignete Phospho- lipase gefunden wurde. Sie spaltet Lecithin zu Lysolecithin, ist aber auch in der Lage Lysolecithin weiter zu spalten zum Phosphatidylcholin. Reine Lysophospholipasen aus Aspergil- lus, die nur Lysolecithin zu spalten vermögen, sind im Ent- schleimungsprozeß wirkungslos. Das gilt auch für die nicht acylspaltenden Phospholipasen C und D.

Ferner können Phospholipasen auch als Backhilfsmittel zur Verbesserung der Verarbeitung des Teigs verwendet werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine kostengünstige Phospholipase in hoher Reinheit herzustellen.

Die Phospholipase soll durch einen transformierten Wirtsorga- nismus in großen Mengen produziert werden können. Mit dem Enzym sollen Präparate hergestellt werden können, die sich besonders gut zur Hydrolyse von Phospholipiden und somit zur Klärung von Stärkehydrolysaten und zur Herstellung von Back- hilfsmitteln eignen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Protein mit Phospholipaseaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die reife Sequenz der Aspergillus-Lysophospholipase oder eine davon abgeleitete Sequenz besitzt und an mindestens einer Stelle gespalten sein kann, wobei im Falle einer Spal- tung die Spaltstücke entweder aber mindestens eine unter re- duzierenden Bedingungen spaltbare Bindung verknüpft sind oder von den unverknüpften Spaltstücken mindestens eines Phospho- lipaseaktivität besitzt. Ferner wird diese Aufgabe gelöst durch ein Protein mit Phospholipaseaktivität, das dadurch ge- kennzeichnet ist, daß es von einem Antikörper gegen gereinig- te Phospholipase aus Aspergillus foetidus RH 3046 erkannt wird.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß ein mit der aus Aspergillus isolierbaren Desoxyribonukleinsäure (DNA) gemäß der DE-OS 196 20 649. 9 transformierter Mikroorganismus nicht nur eine Lysophospholipase codiert, sondern unter bestimmten Kulturbedingungen auch in eine Phospholipase prozessiert wird. Die Phospholipase besitzt somit die gleiche Primär- struktur wie die Lysophospholipase, jedoch eine andere Sekun- där-und Tertiärstruktur und somit andere physiologische Eigenschaften. Die entsprechende Sequenz ist in SEQ ID No. 1 der DE-OS 196 20 649. 9 dargestellt. Eine weitere Phospholi- pase codierende Sequenz wurde aus Aspergillus niger isoliert, sie unterscheidet sich in nur 6% der Aminosäuren von der ho- mologen Sequenz aus Aspergillus foetidus. Sowohl die Phospho- lipase aus Aspergillus niger wie die Lysophospholipase aus Aspergillus foetidus bestehen aus 270 Aminosäuren und haben ein Molekulargewicht von 36000 Da (siehe SEQ ID No. 1+2).

Bezüglich des Erhalts der transformierten Mikroorganismen wird auf die Offenbarung der DE OS 196 20 649. 9 Bezug genom- men. Eine Phospholipase aus Aspergillus wurde bisher im Stand der Technik nicht beschrieben. Die Druckschrift Nakaya et al., Eur. J. Biochem. 1990, 193 (1) 31-38 beschreibt ein Protein, dessen Sequenz der Phospholipase A2 ähnlich ist.

Durch proteinchemische Methoden ließ sich Phospholipase von Lysophospholipase trennen und hochgereinigt gewinnen. Beim Vergleich der gereinigten Phospholipase und Lysophospholipase ergaben sich folgende Unterschiede : -Die Molekulargewichte von Phospholipase und Lysophospholi- pase aus Aspergillus foetidus, gemessen mit der SDS-Gelelek- trophorese, betragen unter reduzierenden Bedingungen ca.

30000 Da für Phospholipase und ca. 36000 Da für Lysophospho- lipase, unter nicht reduzierenden Bedingungen dagegen liegen sie für beide Enzyme gleich bei ca. 36000 Da. Unter reduzie- renden Bedingungen zerfällt die Phospholipase in zwei Ketten, von denen die größere (30000 Da) im Elektrophoresegel erfaßt wird. Das Teilstück in der Größe von ca. 6000 Da kann aus methodischen Gründen im gleichen Elektrophoresegel nicht nachgewiesen werden, jedoch kann man aus diesem Befund ablei- ten, daß Phospholipase aus zwei Peptidketten besteht. Diese Vorstellung wird durch das Ergebnis der Proteinsequenzierung bestätigt.

-Die Proteinsequenzierung der Phospholipase aus Aspergillus foetidus ergab eine hohe Übereinstimmung mit der Sequenz der Lysophospholipase, jedoch auch Unterschiede. Bei Phospholi- pase wurden zwei NH2-Termini im Verhältnis 1 : 1 gefunden, bei Lysophospholipase dagegen nur einer. Einer der beiden NH2- Termini der Phospholipase gehört zu einem 6000 Da-Peptid, während der andere der NH2-Terminus des 30000 Da-Proteins ist. Während das kleinere Peptid mit den Aminosäuren 1 bis 44 des reifen Lysophospholipase-Proteins (vgl. Sequenz ID No. 1 in DE-OS 196 20 649. 9) übereinstimmt, entspricht die Sequenz des 30000 Da-Proteins den Aminosäuren 45 bis 270 der Lysophospholipase (vgl. Sequenz ID No. 1 in DE-OS 196 20 649. 9).

Dieser Befund legt nahe, daß die Phospholipase aus Aspergil- lus foetidus durch Prozessierung des Lysophospholipase-Pro- teins entstehen kann, wobei noch ungeklärt ist, ob die Pro- zessierung innerhalb oder außerhalb der Zelle stattfindet und in welcher Weise sie abläuft. Die Beziehungen zwischen Phos- pholipase und Lysophospholipase sind in Figur 1 dargestellt.

Weiter unterscheiden sich Phospholipase und Lysophospholipase in ihren isoelektrischen Punkten, ihren pH-und Tempera- turoptima sowie sehr deutlich in ihren Temperaturstabilitä- ten. In der folgenden Tabelle werden diese Werte gegenüber- gestellt.

Tabelle 1 : Vergleich der Eigenschaften von Phospholipase und Lysophospholipase aus Aspergillus foetidus Phospho-Lysophos- lipase pholipase Molgewicht (SDS-Gel, reduz.) 30000 Da 36000 Da Molgewicht (SDS-Gel, nicht-reduz.) 36000 Da 36000 Da Isoelektr. Punkt pH 4, 3 pH 4, 2 Temperatur-Optimum 50°C 55°C pH-Optimum pH 3-4 pH 4, 5 pH-Stabilität (1 Std. bei 60°C) pH 3, 5 pH 4, 5 >75% Restakt. 10% Restakt.

Zum Erhalt der Phospholipase an Stelle der Lysophospholipase aus den betreffenden Mikroorganismen sind die Fermentations- bedingungen wesentlich. Wesentlich für die Bildung der Phos- pholipase ist die Durchführung der Kultur in einem sauren bis leicht alkalischen Medium. Der pH-Wert liegt dabei geeigne- terweise in einem Bereich von 2 bis 9, bevorzugt 3 bis 8.

Unter diesen Bedingungen wird bevorzugt Phospholipase gebil- det. Dabei wird wie folgt vorgegangen : Zunächst wird ein geeigneter Wirt ausgewählt mit dem Ziel einer möglichst einfachen Herstellung der Phospholipase. Ob- wohl viele Arten von Schimmelpilzen als mögliche Wirte in Be- tracht kommen, wie zum Beispiel Vertreter der thermophilen Gattungen Humicola, Thermomyces und Mucor, der Gattungen Rhi- zopus, Absidia, Chaetomium, Trichoderma, Thielavia, Penicil- lium und Cephalosporium, wurden bevorzugt Arten der Gattung Aspergillus verwendet. Nach Transformation mit den erfin- dungsgemäßen Plasmiden lassen sich Transformanten isolieren, die, verglichen mit den Wirten, Phospholipase in großen Men- gen produzieren. Bevorzugt ist der transformierte Wirtsorga- nismus ein Aspergillus-Stamm der Arten Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus ellipticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus carbonarius oder Aspergillus phoenicis oder ein Trichoderma-Stamm der Arten Trichoderma viride, Trichoderma longibrachiatum oder Trichoderma reesei.

Eine Transformante, die durch Cotransformation eines Wirts- stammes mit einem Selektionsplasmid, bevorzugt mit pAN7-1, p3SR2 oder pSTAlO, und einem Expressionsplasmid, bevorzugt mit pKC3, pKC9, pKC12 oder pKCN2, hergestellt wird, züchtet man in einer für den Wirtsstamm üblichen Nährlösung, die min- destens eine verwertbare C-Quelle, wie z. B. Maisschrot, Stär- ke, Dextrin aus Stärke, und mindestens eine verwertbare orga- nische N-Quelle, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeautolysat, Sojamehl, Sojaprotein oder-pepton allein oder in Kombination mit anorganischen N-Quellen wie Ammoniumsalzen oder Nitraten, enthält und nach der Sterilisation auf einen sauren bis leicht alkalischen pH-Wert eingestellt wird. Die Nährlösung kann durch Zugabe von Substanzen, die in besonderem Maße die Bildung der Phospholipase erhöhen, ergänzt werden. Phospho- lipide aus Soja enthalten solche Substanzen, doch kommen sie auch in anderen Stoffklassen, wie z. B. den Polyoxyethylen- ethern vor. Nach Beimpfen der sterilisierten Nährlösung mit Konidien oder vegetativem Mycel der Transformante wächst diese unter Belüftung bei Temperaturen zwischen 20° und 60°C, vorzugsweise zwischen 25° und 45°C, und produziert die erfin- dungsgemäße Phospholipase. Während der Kultivierung wird der pH-Wert der Kultur durch Säure-oder Laugezugabe korrigiert, so daß er im sauren bis schwach alkalischen Bereich, vorzugs- weise zwischen pH 3 und 8, gehalten wird. Nach 48 bis 120 Stunden Kulturdauer kann man die Phospholipase gewinnen, in- dem man die unlöslichen Nährlösungsreste und die Biomasse ab- trennt, was üblicherweise durch Filtration geschieht, und das Filtrat mit üblichen Methoden, wie z. B. durch Ultrafiltra- tion, konzentriert. Das Konzentrat (Retentat) kann zur Ent- schleimung von Pflanzenölen oder zur Behandlung von Phospho- lipiden eingesetzt werden. Ferner kann die Phospholipase auch zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften von Le- bensmitteln verwendet werden.

Die folgenden Mikroorganismen wurden bei der Deutschen Samm- lung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Deutschland, gemäß den Bestimmun- gen des Budapester Vertrages hinterlegt : A. oryzae RH 3745 : Hinterlegungsnummer DSM 11283 (Hinterlegungsdatum : 11. 11. 1996) A. ellipticus RH 3886 : Hinterlegungsnummer DSM 11284 (Hinterlegungsdatum : 11. 11. 1996) A. foetidus RH 3046 : Hinterlegungsnummer DSM 10652 (Hinterlegungsdatum : 24. 04. 1996) E. coli DH5a pKC3 : Hinterlegungsnummer DSM 10653 (Hinterlegungsdatum : 24. 04. 1996) E. coli DH5a pKC9 : Hinterlegungsnummer DSM 10654 (Hinterlegungsdatum : 24. 04. 1996) E. coli DH5a pKC12 : Hinterlegungsnummer DSM 10655 (Hinterlegungsdatum : 24. 04. 1996) E. coli pKCN2 : Hinterlegungsnummer : DSM 11352 (Hinterlegungsdatum : 23. 12. 1996) A. niger RH 3909 : Hinterlegungsnummer DSM 11353 (Hinterlegungsdatum : 23. 12. 1996) Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele und Figuren näher erläutert.

Die Figur 1 zeigt die Prozessierung des Lysophospholipasegens aus Aspergillus und den Erhalt der Phospholipase.

Die Figur 2 zeigt die Konstruktion des Plasmids pKCN2.

B e i s p i e l e Beispiel 1 Konstruktion des Expressionsvektors pKCN2 Isolierung des Lysophospholipase-Gens aus A. niger NRRL3 Die chromosomale DNA von A. niger NRRL3 wurde nach einer Vor- schrift von Hynes, M. J. et al. (1983), Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439, isoliert.

Die erhaltene hochmolekulare DNA wurde mit Sau3AI partiell hydrolysiert und durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifuga- tion nach ihrer Größe fraktioniert. DNA-Moleküle der Größe von 9 bis 20 kb wurden in BamHI/EcoRI-hydrolysierte EMBL3-DNA insertiert und in-vitro verpackt.

Zur Identifizierung des chromosomalen Lysophospholipase-Gens in einer Lambda EMBL3-Genbank wurde das HindIII/SalI-cDNA Fragment aus dem Plasmid pKC1/36 als Hybridisierungssonde verwendet. Plasmid pKC1/36 enthielt die aus A. foetidus RH 3046 isolierte Lysophospholipase-cDNA.

Nach der Hybridisierung und mehrfacher Vereinzelung ließen sich zwei positive Klone identifizieren. Die Phagen-DNA von Klon Nr. 1 wurde präpariert und mit BamHI hydrolysiert. Sie wies nach der Southern-Hybridisierung ein positives Signal bei ca. 9 kb auf. Das BamHI-Fragment wurde in pUC18 klo- niert, und das resultierende Plasmid, welches das vollstän- dige chromosomale Lysophospholipase-Gen enthielt, wurde als pKCN bezeichnet.

Konstruktion des Expressionsvektors pKCN2 In das Plasmid pKCN2 wurde das Lysophospholipase-Gen unter Kontrolle des A. oryzae alpha-Amylase-Promotors und des A. nidulans trpC-Terminators gesetzt.

Die Isolierung des Lysophospholipase-Gens aus dem Plasmid pKCN erfolgte mit Hilfe der PCR-Methode. Es wurden zwei Oli- gonukleotid-Primer mit den folgenden Sequenzen verwendet : KC29 : 5'-GGA ATT CAC CTG CTA ACC ATG TTC TCT GGA CGG TTT GGA GTG-3' BspMI Met (SEQ ID No. 3) KC43 : 5'-CG GGATCC AAG CTA TAG CAG ACA CTC TGA AAT TG-3' BamHI AMB (SEQ ID No. 4) Für die Polymerase-Ketten-Reaktion wurden in einem Reaktions- volumen von 0, 1 ml 20 mM Tris-HC1, pH 8, 4, 50 mM KCl, 1, 5 mM MgCl2, 0, 2 mM dNTP (je 0, 2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) je 50 pmol KC29 und KC43, 1 ng pKCN als Matrize und 2, 5 U Tag- Polymerase vermischt. Der Ansatz wurde für 20 Zyklen (94°C, 40 sek ; 40°C, 1 min ; 72°C, 1 min) durchgeführt. Nach Beendi- gung der Reaktion wurde das amplifizierte Fragment gereinigt, mit BspMI und BamHI hydrolysiert und in das mit NcoI/BamHI gespaltene Plasmid pKE2 insertiert. Das Plasmid pKE2 enthält den A. oryzae alpha-Amylase-Promotor und den A. nidulas trpC- Terminator.

Die Konstruktion des Plasmids pKCN2 wurde durch eine Restrik- tionsanalyse und die anschließende Sequenzierung bestätigt.

Beispiel 2 Transformationsmethode für Aspervillus-und Trichoderma ree- sei-Stämme Von einer ca. zwei Wochen alten Petrischalenkultur des zu transformierenden Pilzstammes wurde eine Sporensuspension in ca. 10 ml 0, 85 % NaCl durch Abschwemmen unter Zuhilfenahme eines Spatels hergestellt. Es wurden je vier 1 1-Schüttel- kolben mit 100 ml Czapek-Dox-Minimalmedium (Oxoid) mit 0, 1 % Hefeextrakt mit je 1 ml Sporensuspension beimpft und ca. 16 Stunden bei 28°C auf einem Rundschüttler bei 120 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Das Mycel aus je vier Schüttelkolben wurde aber einem Papierfilter geerntet und mit ca. 50 ml MP- Puffer (1, 2 M MgSO4 in 10 mM Phosphatpuffer, pH 5, 8) gespült.

Nach dem Ablaufen des Puffers wurde das feuchte Mycel gewo- gen. In der Regel wurden ca. 3 bis 5 g Feuchtmycel erhalten.

Pro g Feuchtmycel wurden 5 ml MP-Puffer, 120 p. l Novozym-Lö- sung (lg Novozym 234 (Novo Nordisk) in 6 ml MP-Puffer) und 25 p1 ß-Glucuronidase (Sigma) zugegeben. Die Mycel-Suspen- sion wurde 5 min in Eiswasser gestellt. Anschließend wurden 60 Ll Rinderserumalbumin-Lösung (0, 2 g Rinderserumalbumin in 4 ml MP-Puffer, sterilfiltriert) zugegeben, und der Ansatz wurde unter leichtem Schütteln bei 30°C inkubiert. Die Bil- dung von Protoplasten wurde visuell im Mikroskop verfolgt.

Wenn keine wesentliche Zunahme der Protoplastenbildung mehr festzustellen war, wurde der Ansatz zur Ernte der Protopla- sten abgebrochen. Dies war in der Regel nach etwa 3 bis 5 Stunden der Fall.

Die Protoplastensuspension wurde zur Abtrennung noch vorhan- dener grober Mycelbestandteile über ein mit MP-Puffer ge- tränktes Glaswollefilter gegeben und in Zentrifugenröhrchen überführt. Die obere Hälfte der Röhrchen wurde mit 600 mM Sorbit, 100 mM Tris/HC1, pH 7, 0 überschichtet. Die Röhrchen wurden 10 min bei 2500 g zentrifugiert. Die Protoplasten wurden aus der Zwischenschicht abgenommen und in 1 M Sorbit, 10 mM Tris/HC1, pH 7, 5 aufgenommen. Anschließend wurden die Protoplasten zweimal mit STC-Puffer (1 M Sorbit, 10 mM Tris/HC1, pH 7, 5, 10 mM CaCl2) durch Zentrifugation bei 1500 g gewaschen und zuletzt in 1 ml STC-Puffer aufgenommen.

Zur Transformation von A. oryzae wurden 300 J. l Protoplasten- suspension ca. 10 g p3SR2 als Selektionsplasmid und 10 pg des jeweiligen Plasmids zur Expression der LPL in 25 p1 10 mM Tris/HC1 pH 8, 0 zusammengegeben und 10 min bei 0°C inkubiert.

Anschließend wurden nochmals 25 p1 des gleichen Plasmidgemi- sches und 400 p1 PEG-Lösung (60t Polyethylenglykol 6000 (Fluka) in 10 mM Tris/HC1, pH 7, 5, 50 mM CaCl2) zusammengege- ben, sehr vorsichtig vermischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden nochmals 600 l PEG-Lösung zugegeben, vermischt und der Ansatz für weitere 20 min bei Raumtempera- tur inkubiert. Der Ansatz wurde mit ca. 9 ml Acetamid-Weich- agar (Minimalmedium mit 10 mM Acetamid als einziger N-Quelle, 1 M Saccharose, 0, 6 Gew.-% Agar) bei 45°C gemischt und auf vier Petrischalen mit dem gleichen Medium, jedoch mit 1, 5 Gew.-% Agar (Oxoid) und zusätzlich 15 mM CsCl, verteilt. Die Platten wurden bei 28°C inkubiert. Nach 6 bis 10 Tagen wur- den schnell wachsende Kolonien (Transformanten) auf Acetamid- Medium ohne Saccharose überimpft, zweimal aber Einzelsporko- lonien gereinigt und zuletzt auf Vollmedium, z. B. Kartoffel- Dextrose-Agar, übertragen.

Die Transformation von Stämmen der Arten A. niger, A. awa- mori, A. japonicus oder A. foetidus kann ebenfalls mit dem Plasmid p3SR2 erfolgen. Bevorzugt wurde die Transformation jedoch mit dem Plasmid pAN7-1 ausgeführt. Die Protoplasten- präparation und die Zugabe von Plasmid-DNA erfolgt dabei in analoger Weise, wie oben für das Plasmid p3SR2 beschrieben.

Statt der Zugabe von Acetamid-Weichagar wird jedoch der ge- samte Transformationsansatz zu 100 ml Czapek-Dox-Minimalme- dium (Oxoid) mit 100 g Hygromycin B/ml, 1, 5 Gew.-% Agar (Oxoid) und 1 M Saccharose, abgekühlt auf ca. 45°C gegeben und vorsichtig vermengt. Der Ansatz wird dann in Portionen zu je 10 ml in Petrischalen gegeben, in denen jeweils 10 ml Czapek-Dox-Minimalmedium (Oxoid) mit 1, 5 Gew.-% Agar (Oxoid), jedoch ohne Hygromycin und ohne Saccharose als feste Unter- schicht vorgelegt war. Nach dem Erstarren der oberen Agar- schicht werden die Petrischalen bei 30 bis 37°C inkubiert.

Gegen Hygromycin B resistente Transformanten können nach ca.

3 bis 10 Tagen abgeimpft werden und zur Überprüfung der Resi- stenz auf Czapek-Dox-Minimalmedium (Oxoid) mit 50 J. g Hygromy- cin B/ml und 1, 5 Gew.-% Agar (Oxoid) übertragen werden.

Für die Transformation von A. sojae oder A. phoenicis wird ein drittes Selektionsprinzip genutzt, da die verwendeten Stämme dieser Art sowohl Acetamid verwerten wie auch gegen Hygromycin B resistent sind. Durch Selektion auf chlorathal- tigem Nährboden werden Mutanten isoliert, deren Nitratreduk- tase-Gen (niaD) defekt ist, die also nicht mehr mit Nitrat als alleiniger Stickstoffquelle wachsen (Cove, D. J. (1976) Heredity 36, 191-203). Durch Transformation mit dem Plasmid pSTA10 (Un-kles, S. E. et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 99- 104), auf dem sich die intakte Information für das Nitratre- duktase-Gen befindet, wird der Defekt ausgeglichen, so daß die Transformanten mit Nitrat als alleiniger Stickstoffquelle wachsen, während die nicht transformierten Zellen im Wachstum zurückbleiben.

Diese Methodik zur Selektion ist außer für A. sojae genauso für andere Aspergillus-Arten geeignet ; die Herstellung der niaD-Mutanten bedeutet allerdings einen zusätzlichen Ar- beitsaufwand gegenüber der Verwendung der Hygromycin B-Resi- stenz oder der Acetamidverwertung.

Beispiel 3 Herstellung von PL sezernierenden Transformanten Transformanten von A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. car- bonarius und A. ellipticus Protoplasten dieser Aspergillus-Arten wurden mit der in Bei- spiel 1 beschriebenen Methodik hergestellt und unter Verwen- dung des Plasmids pAN7-1 und jeweils einem der Plasmide pKC3, pKC9, pKC12 oder pKCN2 cotransformiert. Zur Regeneration der Protoplasten wird der Transformationsansatz wie oben be- schrieben auf Hygromycin plattiert, die Transformanten werden von den Regenerationsplatten isoliert, gereinigt und in Schüttelversuchen unter Verwendung der folgenden Nährlösung Maltodextrin 3, 75 % Maisquellpulver 3, 0 % KHPO 1, 0 % K2HPO4 0, 7 % Triton X-100 0, 10 % in Leitungswasser, 30 min bei 121°C sterilisiert, auf Produktion von PL geprüft. Dazu wird die Biomasse der Schüttelkulturen abfiltriert und die Phospholipase-Aktivität (PLU) im Kulturfiltrat gemessen. Transformanten zeichnen sich durch gegenüber dem Wirtsstamm deutlich erhöhte Phospho- lipase-Aktivität aus.

Transformanten von A. oryzae und A. aculeatus Die Protoplastierung und Transformation wird auch mit diesen Arten wie im Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Proto- plasten werden unter Verwendung des Plasmids p3SR2 und je- weils einem der Plasmide pKC3, pKC9, pKC12 oder pKCN2 co- transformiert. Zur Regeneration der Protoplasten wird der Transformationsansatz wie oben beschrieben auf Nährboden mit Acetamid als alleiniger Stickstoffquelle plattiert, die Transformanten werden von den Regenerationsplatten isoliert, gereinigt und in Schüttelversuchen unter Verwendung der fol- genden Nährlösung Maltodextrin 3, 75 % Maisquellpulver 3, 0 % (NH4) 2HP04 0, 5 % Triton X-100 0, 10 % in Leitungswasser, 30 min bei 121°C sterilisiert, auf Produktion von PL geprüft.

Transformanten von A. sojae und A. phoenicis Die Stämme-A. sojae RH 3782 niaD22 und A. phoenicis RH 3828 niaD, beides nach Cove (1976) hergestellte Mutanten von A. sojae RH 3782 und A. phoenicis RH 3828, werden in der nach- folgenden Nährlösung aus Glucose (MERCK) 2 % Malzextrakt (OXOID) 0, 5 % Bacto-Pepton (DIFCO) 0, 025 % deionisiertes Wasser pH-Wert auf 5, 0 einstellen ; Sterilisation : 30 min bei 121°C angezogen. Aus dem Mycel werden nach der in Beispiel 1 be- schriebenen Methodik Protoplasten gewonnen und diese mit pSTA10 als Selektionsplasmid und jeweils einem der Plasmide pKC3, pKC9 oder pKC12 cotransformiert. Zur Regeneration der Protoplasten wird der Transformationsansatz mit 9 ml Weich- agar (osmotisch stabilisierend) bestehend aus 0, 1 M Na-Phosphat-Puffer pH 6, 0 15 ml 1 M Saccharose (MERCK) 10, 28 g Millipore-Wasser auf 29, 1 ml Agar (OXOID) 0, 18 g (= 0, 6 %) 30 min Sterilisation bei 121°C, anschließend sterile Zugabe von : Salzlösung (7. 14. 2) 0, 6 ml 1 M NaN03-Lösung 0, 3 ml gemischt und auf vier Agarplatten der gleichen Zusammenset- zung, jedoch mit 1 % Agar hergestellt, verteilt. Nach etwa 6 bis 10 Tagen Inkubation bei 37°C werden die Transformanten von den Agarplatten isoliert, auf Nitrat-Saccharose-Agar durch Ausstrich gereinigt. Es wurde eine Vielzahl Transfor- manten durch Selektion und anschließender Reinigung auf einem Nährboden mit Nitrat als einziger N-Quelle erhalten und in Schüttelkolben unter Verwendung der folgenden Nährlösung Maltodextrin 3, 75 % Maisquellpulver 3, 0 % KH2PO4 1, 0 % K2HPO4 0, 7 % Triton X-100 1, 0 % in Leitungswasser, 30 min bei 121°C sterilisiert, auf Produktion von PL geprüft.

Neben Transformanten, die keine oder nur geringe Mengen von PL produzieren, sowie die nicht transformierten Wirtsstämme, werden auch solche Transformanten gefunden, die deutlich er- höhte PL-Aktivität im Kulturfiltrat aufweisen. Diese als Cotransformanten bezeichneten Stämme eignen sich zur Her- stellung des Enzyms. In der Tabelle 2 sind typische Ergeb- nisse der PL-Bildung durch Transformanten und durch die nicht transformierten Wirte gegenübergestellt.

Tabelle 2 : Vergleich der PL-Bildung von Wirtsstämmen und Transformanten.

Stamm bzw.-Transformante relative PL-Aktivität A. oryzae RH 3745 100 A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKC9 3000-4000 A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKCN2 2000-2500 A. sojae RH 3782 niaD22 100 A. sojae RH 3782 niaD22 pSTA10 pKC9 500-700 A. foetidus RH 3046 100 A. foetidus RH 3046 pAN7-1 pKC9 1000-1500 A. phoenicis RH 3828 niaD 100 A. phoenicis RH 3828 niaD pSTA10 pKC9 400-600 A. ellipticus 100 A. ellipticus pAN7-1 pKC12 800-900 A. heteromorphus niaD 100 A. heteromorphus niaD pSTA10 pKC9 900-1000 A. carbonarius 100 A. carbonarius pAN7-1 pKC9 400-600 A. aculeatus 100 A. aculeatus p3SR2 pKC9 900-1200 A. niger 100 A. niger pAN7-1 pKC12 700-1000 A. awamori 100 A. awamori pAN7-1 pKC12 600-800 Beispiel 4 Reinigung der PL aus A. foetidus 2080 ml Kulturretentat von A. foetidus RH 3788 wurden, um die elektrische Leitfähigkeit herabzusetzen, mit 3520 ml destil- liertem Wasser verdünnt und mit 160 ml 1 M NaOH auf pH 7, 0 eingestellt. Die Probe hatte ein Volumen von 5760 ml und eine Leitfähigkeit von 7, 8 mS/cm.

In einem weiteren Schritt wurde eine Ionenaustauschchromato- graphie an DEAE-Fractogel (MERCK) vorgenommen. Dazu wurden 5760 ml der Enzymlösung in vier Ansätzen (a 1440 ml) auf eine DEAE-Fractogel-Säule (Höhe 278 mm, Durchmesser 100 mm) aufge- tragen. Die Säule wurde mit Puffer A (20 mM Phosphatpuffer aus Na2HP04/KH2PO4, pH 7, 0 + 15 mM NaCl) gespült. Die Elution erfolgte in einem kontinuierlichen Gradienten von Puffer A zu Puffer B (Puffer A + 1 M NaCl). Es wurde bei einer Elutions- geschwindigkeit von 70 ml/min eluiert und Fraktionen zu je 350 ml aufgefangen.

Die Fraktionen wurden auf Anwesenheit der PL getestet. Dies geschah durch Messung der PL-Aktivität. Eine PL-Einheit ist danach definiert als die Enzymmenge, die in einer wäßrigen Lösung von Lecithin bei pH 3, 5 und 40°C eine Hydrolysege- schwindigkeit von 1 UM/min bewirkt.

Die Messung der PL-Aktivität wurde wie folgt ausgeführt : Substrat : 1 g Epikuron 200 (Phosphatidylcholin von Fa. Lucas Meyer) + 100 g destilliertes Wasser + 5 ml 0, 32 M CaCl2-Lö- sung wurden mit dem Ultra Turrax homogenisiert.

Analyse : 10 ml Substrat wurden mit 10 ml 1 % iger Triton X-100 Lösung (Fa. Fluka) und 5 ml 0, 0033 M Zitronensäure-Monohy- dratlösung versetzt und 10 min bei 40°C temperiert ; der pH stellt sich auf 3, 4 bis 3, 5 ein. 0, 1 ml Enzymlösung wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 10 min bei 40°C inkubiert.

Die Enzymkonzentration im Analysenansatz sollte nicht über 2, 5 U/g liegen. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde mit 0, 01 M KOH auf pH 10, 0 zurücktitriert, wobei die ersten 5 ml zügig zugegeben wurden und dann die Titriergeschwindigkeit verringert wurde, um ein Übertitrieren zu vermeiden.

Für den Blindwert (BW) wurde das Enzym 15 min auf ca. 95°C erhitzt und inaktiviert. Nach dem Abkühlen verdünnte man es wie für den Hauptwert (HW) und verfuhr weiter wie mit dem Hautpwert.

Berechnung : = PLU/g, pH 3, 5 = HW (ml)-BW (ml) * 0, 01 M * 1000 10 min * 0, 1 ml * Enzymkonz. g/ml In der Patentanmeldung 195 27 274. 9 vom 26. 07. 1995 wird die Phospholipase in Lecithase-Units, LU/g angegeben. 1 Leci- thase-Unit ist dabei jene Enzymmenge, die bei 40°C, pH 8 aus Eigelb in einer Minute 1 UM Fettsäure freisetzt. 1 LU/g, pH 8 entsprechen 108 PLU/g, pH 3, 5.

Die Elution der PL setzte bei ca. 0, 11 M NaCl ein. Die PL- haltigen Fraktionen aus vier Läufen wurden vereinigt (8950 ml) und aber einen CH2A-Konzentrator der Fa. Amicon, Hollow-Fiber Patrone MG10. 000 auf ein Volumen von 2570 ml eingeengt. Diese Probe wurde mit 782 ml 3 M Ammoniumsulfat- lösung unter Rühren versetzt (Probe enthält jetzt 0, 7 M Ammo- niumsulfat).

Im nächsten Schritt wurden 3352 ml der Probe auf eine Phenyl- Sepharose 6 Fast Flow, Low Substitution-Saule (Pharmacia, Höhe 215 mm, Durchmesser 100 mm) aufgetragen. Die Säule wur- de mit Puffer C (20 mM Phosphatpuffer, pH 7, 0 + 0, 5 M Ammo- niumsulfat) nachgewaschen und mit einem kontinuierlichen fal- lenden Gradienten von Puffer C nach Puffer D (20 mM Phosphat- puffer, pH 7, 0) eluiert. Die PL-haltigen Fraktionen wurden vereint (790 ml) und mit dem Konzentrator (siehe oben) ein- geengt und gegen Puffer D dialysiert ; es wurden 150 ml Probe erhalten.

In einem weiteren Schritt wurden je 30 ml der Probe in 5 An- sätzen auf eine Mono Q- (Pharmacia, 6, 3 ml)-Anionenaustausch- Chromatographie-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit Puf- fer D gespült, und die Elution erfolgte in einem kontinuier- lichen Gradienten von Puffer D zu Puffer B und setzte dabei für die PL bei ca. 200 mM NaCl ein.

Die PL-haltigen Fraktionen wurden vereint und aber PD-10-Säu- len (Pharmacia) gegen Puffer E (20 mM Phosphatpuffer, pH 7, 1) dialysiert. Die Probe hatte ein Volumen von 24 ml.

Endreinigung der PL über Mono P HR5/20 (Chromatofokussierung) Die 24 ml (siehe oben) wurden auf die MONO P-Säule (Höhe 200 mm, Durchmesser 5 mm) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer E nachgewaschen. Die Probe'wurde mit Puffer F (Poly- buffer 74 von Pharmacia 1 : 10 mit destilliertem Wasser ver- dünnt und auf pH 4, 0 mit 1 M HC1 eingestellt) eluiert. Die PL eluierte, nachdem das 13fache Säulenvolumen an Puffer F die Säule passiert hatte.

Das gereinigte Protein zeigt in der SDS-Gelelektrophorese eine einheitliche Bande mit einem Molekulargewicht von ca.

31000 Dalton. Der isoelektrische Punkt liegt bei ca. pH 4, 3.

Das auf diese Weise gereinigte Protein wurde zur Sequenzie- rung verwendet. Die so isolierte Phospholipase wurde zur Ge- winnung von Antikörpern in Kaninchen verwendet. Die Immuni- sierung wurde mit dem bei Harlowe und Lane (Lit : Ed Harlowe und David Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) beschriebenen Standardverfahren durchgeführt. Das er- haltene Antiserum konnte direkt für Western blots (wie eben- falls bei Harlowe und Lane beschrieben) eingesetzt werden, wo es spezifisch die Phospholipasebande markierte.

Beispiel 5 Entschleimung von Sojaöl 200 g naßentschleimtes Sojaöl mit einem Rest-Phosphatgehalt von 160 ppm wird in einem Rundkolben auf 40°C erwärmt. Dazu gibt man 10 g Wasser, in dem 20 mg Zitronensäure und 100 Units Phospholipase enthalten sind. Das Enzym stammt aus der Fermentation einer Aspergillus niger-Transformante, die das Phospholipase-Konstrukt enthält. Die Aktivitätsbestimmung erfolgt bei pH 3, 5. Dazu werden 10 ml 1 % iges Phosphatidyl- cholin (Epikuron 200 von Lucas Meyer), das 0, 5 ml 0, 32 M CaCl2 enthält, mit 10 ml Triton X-100 Lösung und 5 ml 0, 0033 M Zitronensäure-Monohydrat versetzt und 10 Minuten bei 40°C temperiert. 0, 1 ml entsprechend verdünnter Enzymlösung werden zugegeben und 10 Minuten bei 40°C inkubiert. Mit 0, 01 M KOH-Lösung wird auf pH 10 titriert. Der Blindwert (bei 95°C für 15 Minuten erhitzte Enzymlösung im Ansatz) wird abgezogen und die Berechnung gemäß Beispiel 3 vorgenommen.

Der Inhalt des Rundkolbens wird mittels einer externen Krei- selpumpe intensiv dispergiert. Dabei wird der Inhalt des Kolbens etwa einmal pro Minute durchgesetzt. Die Wasserphase liegt dabei in einer Teilchengröße von unter 1 . In Zeitab- ständen von zwei Stunden werden Proben genommen und auf Phos- phorgehalt untersucht. Dabei ergaben sich folgende Werte : Zeit in Stunden 0 2 4 6 8 Phosphorgehalt in ppm 160 24 12 7 3 Versuche, bei denen wie beschrieben verfahren wurde, aber an- stelle des Enzympräparats eine entsprechende Menge Molkenpro- tein, also nichtenzymatisches Protein oder Lysophospholipase des Handels (G-Zyme von Enzyme Biosystems, USA, 1000 Lyso- phospholipase Units pro 200 ml Sojaöl) zugesetzt wurden, konnte der Phosphorgehalt nicht unter 80 ppm gesenkt werden.

Beispiel 6 Verbesserung der Teigqualität Der folgende Backversuch wurde mit der erfindungsgemäßen Phospholipase durchgeführt. Aus 100 Gew. Tln. Mehl, 2 Gew.

Tln. Salz, 3 Gew. Tln. Backhefe, 58 bis 60 Gew. Tln. Wasser und 40 bis 50 ppm Ascorbinsäure (bezogen auf das Teiggewicht) wurde in einem Spiralkneter (Fabrikat Kemper) 2 min auf niedriger Stufe 1 und 6 min auf höherer Stufe 2 ein Teig bereitet. Dem Wasser wurden vor Beginn des Knetvorgangs die Enzyme und anderen Zusätze zugegeben. Die Teigtemperatur be- trug 23° bis 25°C. Nach einer Teigruhe von 20 min wurde der Teig zur Herstellung von freigeschobenem Weißbrot in 350 g- Stücke geteilt, geformt, 70 min bzw. 90 min bei 32°C und 80 % relativer Luftfeuchte gegart und 32 min bei 230°C gebacken.

In der Tabelle 3 ist das Brotvolumen bei verschiedenen Enzym- zusätzen angegeben. Die Backergebnisse zeigen, daß durch Zusatz von Phospholipase das Backvolumen und die Krumstruktur verbessert werden. Die stabilisierende Wirkung auf den Teig zeigt sich in den guten Backergebnissen bei verlängerter Garzeit (90 min).

Tabelle 3 : Backversuche Zusätze/Backvolumen % 90 min Gare % Poren- 100 kg Mehl 70 min Gare struktur ohne Zusatz 1000 ccm 100 1050 ccm 100 ungleich- mäßig Pilzamylase 1050 ccm 105 1130 ccm 107 ungleich- 10000 SKB mäßig Pilzamylase 10000 SKB + 1100 ccm 110 1225 ccm 117 ungleich- Phospholipase mäßig 2500 PLU Pilzamylase 1225 ccm 122 1275 ccm 121 ungleich- 50000 SKB mäßig Pilzamylase 50000 SKB + 1275 ccm 128 1365 ccm 130 gleich- Phospholipase mäßig 12500 PLU Pilz-Xylanase 1325 ccm 133 1375 ccm 131 gleich- 12000 UXYL mäßig Pilz-Xylanase 1200 UXYL + 1375 ccm 138 1475 ccm 140 gleich- Phospholipase mäßig 12500 PLU SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE ANGABEN : (i) ANMELDER : (A) NAME : ROEHM GMBH (B) STRASSE : Kirschenallee (C) ORT : Darmstadt (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 64293 (A) NAME : LOEFFLER, Fridolin (B) STRASSE : Karl-Henkelmann-Weg 4 (C) ORT : Bensheim (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 64625 (A) NAME : JUNGSCHAFFER, Gerald (B) STRASSE : Haehnleiner Strasse 1A (C) ORT : Alsbach-Haehnlein (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 64665 (A) NAME : KHANH, Quoc Nguyen (B) STRASSE : Am Tannenberg 9 (C) ORT : Reichelsheim (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 64385 (A) NAME : SCHUSTER, Erwin (B) STRASSE : Darmstaedter Str. 237 (C) ORT : Bensheim-Auerbach (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 64625 (A) NAME : SPROESSLER, Bruno (B) STRASSE : Auf der Schmelz 93 (C) ORT : Rossdorf (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 64380 (A) NAME : WOLF, Sabine (B) STRASSE : Otzbergstrasse 44 (C) ORT : Otzberg (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 64853 (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG : Protein mit Phospholipaseaktivitaet (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN : 4 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG : (A) DATENTRÄGER : Floppy disk (B) COMPUTER : IBM PC compatible (C) BETRIEBSSYSTEM : PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE : PatentIn Release #1. 0, Version #1. 30 (EPA) (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LANGE : 1368 Basenpaare (B) ART : Nucleotid (C) STRANGFORM : Doppelstrang (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA (iii) HYPOTHETISCH : NEIN (iv) ANTISENSE : NEIN (ix) MERKMAL : (A) NAME/SCHLÜSSEL : intron (B) LAGE : 222.. 275 (ix) MERKMAL : (A) NAME/SCHLÜSSEL : intron (B) LAGE : 442.. 486 (ix) MERKMAL : (A) NAME/SCHLÜSSEL : intron (B) LAGE : 824.. 874 (ix) MERKMAL : (A) NAME/SCHLÜSSEL : CDS (B) LAGE : join (140.. 221, 276.. 441, 487.. 823, 875.. 1180) (ix) MERKMAL : (A) NAME/SCHLUSSEL : mat_peptide (B) LAGE : 221.. 1180 (ix) MERKMAL : (A) NAME/SCHLÜSSEL : sig_peptide (B) LAGE : 140.. 220 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 1 : ATGGGGAATT GGGGTGGGTA ATATGATACA GGTATAAAAG GGGGCTCGGA GGTGCAGTTG 60 GATAGAAGCA TTGTGTGTGC ATTGCAGCAG TCCGTTGGTC TCACGTCTCT GGTTGCCTCG 120 ATTGTATATA TACTGCAGG ATG TTC TCT GGA CGG TTT GGA GTG CTT TTG ACA 172 Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr -27-25-20 GCG CTT GCT GCG CTG TGT GCT GCG GCA CCG ACA CCA CTT GAT GTG CGG A 221 Ala Leu Ala Ala Leu Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg -15-10-5 GTAGGTGTGC CTGATTTGAA GTGGCTGGAT AGCACTGATG AAGGTTTTGA ATAG GT 277 Ser 1 GTC TCG ACT TCC ACG TTG GAT GAG CTG CAA TTG TTC TCG CAA TGG TCT 325 Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp Ser 5 10 15 GCC GCA GCT TAT TGC TCG AAC AAT ATC GAC TCG GAC GAC TCT AAC GTG 373 Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val 20 25 30 ACA TGC ACG GCC GAC GCC TGT CCA TCA GTC GAG GAG GCG AGC ACC AAG 421 Thr Cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Lys 35 40. 45 ATG CTG CTG GAG TTT GAC CT GTATGTTGCT CCAGTGAAAT GGATAGAACA 471 Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu 50 55 CAGCTGATTG AATAG G ACA AAT AAC TTT GGA GGC ACA GCC GGT TTC CTG 520 Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu 60 65 GCC GCG GAC AAC ACC AAC AAG CGG CTC GTG GTC GCC TTC CGA GGC AGT 568 Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser 70 75 80 AGC ACC ATC AAG AAC TGG ATT GCT GAT CTC GAC TTC ATC CTG CAA GAT 616 Ser Thr Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile Leu Gln Asp 85 90 95 AAC GAT GAC CTC TGT ACT GGC TGC AAG GTT CAC ACT GGA TTC TGG AAG 664 Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys 100 105 110 115 GCA TGG GAA GCC GCT GCA GAC AAT CTG ACG AGC AAG ATC AAG TCC GCG 712 Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile Lys Ser Ala 120 125 130 ATG AGC ACG TAT TCG GGC TAT ACC CTC TAC TTC ACC GGG CAC AGC TTG 760 Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu 135 140 145 GGC GGC GCA TTG GCT ACA CTG GGA GCA ACG GTC TTG CGA AAT GAC GGT 808 Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly 150 155 160 TAT AGC GTT GAA CTG GTGAGTGCTT CAGAGGGTGA TCATTAAACA GCCGGTTCTG 863 Tyr Ser Val Glu Leu 165 ACAGTCAATA G TAC ACC TAT GGA TGT CCT CGA GTC GGA AAC TAT GCG CTG 913 Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu 170 175 180 GCC GAG CAC ATC ACC AGC CAG GGA TCT GGA GCG AAC TTC CCT GTT ACA 961 Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala Asn Phe Pro Val Thr 185 190 195 CAC TTG AAC GAC ATC GTC CCC CGG GTG CCA CCC ATG GAC TTT GGA TTC 1009 His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 200 205 210 AGC CAG CCA AGT CCA GAA TAC TGG ATC ACC AGT GGC ACC GGA GCC AGT 1057 Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser 215 220 225 GTC ACG GCG TCG GAT ATT GAA CTC ATC GAG GGA ATC AAT TCG ACG GCG 1105 Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ala 230 235 240 245 GGG AAT GCA GGC GAA GCA ACG GTG GAC GTT TTG GCT CAC TTG TGG TAC 1153 Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr 250 255 260 TTT TTC GCA ATT TCA GAG TGT CTG CTA TAGCTTGGAC AGTCCGATGA 1200 Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 265 270 AATAAGTGCG GAGAGAAAGT GTAAATAGTA ATTAAGTATA TATCAGGCAG AGAAGCAGTG 1260 GTGGTCAGAG AAGAAAGAGT GAGTCCCATT ACGTAGCAGA TAACCACGTG TGGAGGCGCT 1320 GTTCCTCCAC TTGCAGTTGC GGCCATCAAT CATATTCTTC TCCTTACT 1368 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LANGE : 297 Aminosäuren (B) ART : Aminosäure (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 2 : Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu -27-25-20-15 Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg Ser Val Ser Thr Ser -10-5 1 5 Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp Ser Ala Ala Ala Tyr 10 15 20 Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val Thr Cys Thr Ala 25 30 35 Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Lys Met Leu Leu Glu 40 45 50 Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala 55 60 65 Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr 70 75 80 85 Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile Leu Gln Asp Asn Asp 90 95 100 Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp 105 110 115 Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile Lys Ser Ala Met Ser 120 125 130 Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly 135 140 145 Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser 150 155 160 165 Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu 170 175 180 Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala Asn Phe Pro Val Thr 185 190 195 His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 200 205 210 Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser 215 220 225 Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ala 230 235 240 245 Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr 250 255 260 Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 265 270 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LANGE : 42 Basenpaare (B) ART : Nucleotid (C) STRANGFORM : Einzelstrang (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA (iii) HYPOTHETISCH : NEIN (iv) ANTISENSE : NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 3 : GGAATTCACC TGCTAACCAT GTTCTCTGGA CGGTTTGGAG TG 42 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LANGE : 34 Basenpaare (B) ART : Nucleotid (C) STRANGFORM : Einzelstrang (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA (iii) HYPOTHETISCH : NEIN (iv) ANTISENSE : NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 4 : CGGGATCCAA GCTATAGCAG ACACTCTGAA ATTG 34 BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORCANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN [NTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 64293 Darmstadt EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemä# Regel 7. 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER : RH 3745 DSM 11283 II. WtSSENSCHAFTUCHE BESCHREIBUNG UNDIODER VoRGEscl {LAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter) bezeichneten Mikroorganismus wurde () eine wissenschaflliche Beschreibung (X) eine vorgcschlaacne taxonomische Bezeichnung cinsere) d) t. (Zutretfendes ankreuzenl, 111. EINGANG UND ANNAHME Diese intemationale Hinterlegungssteile nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an. der bei ihr am 19 9 6-11-11 (Datum der Ersthinteriegung) 'eingegangen ist. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser lntemationalen Hinterlegungsstcile am eingegangen (Datum der Erst- hintertegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in cine Hinterlegung gemaß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags aut Umwandlung) V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschritt (en) der zur Vertretung der intemationafen Hintertegungsstette MiKROORGANtSMEN UND ZELLKULTUREN C ! nbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten : Xnschrlti : \lascheroder Weg Ib D-38123 (3raunschwei jazz - Datum : 1996-11-15 'Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt. zu dem der Status emer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.

BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 64293 Darmstadt LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gema# Regel 10. 2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE F 1. HINTERLEGER li. KENNZEICIFNUNG DES NUKROORGANISMUS Name : Röhm GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee 42 zugeteilte EiNGANGSNUMMER : Anschrift : DSM 11283 64293 Darmstadt Datum der Hinterlegung oder Weiterieitung' : 1996-11-11 111. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG Die Lebcnstahiskcit des unter fi genannten Mikroorganismus ist am 19 9 6-1 -12 = gepruft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus X)'tcbenstahig () nicht mehr lebensfahig IV. DEDI\GUNCiEN. UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFUHRT WORDEN IS1" V INTERNAI IONALE HiNTERLEGUNGSSTELLE Namc : DSMZ-DEUTSCliE SAMMLUNG VON Unterschritt (en) der zur Vertretung der intemationalen Hinterle2ungsstelle . MliiROORGANISMEN UND ZELLI ; ULTUREN GmbH betugten l ersonten oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten : Anschriit : Niascheroder Wer ! lb.. D-38124 Braunschwet2 ez" L Datum : 1996-11-15 Angabe des Datums der Ersthintertegung. Wenn eme erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Angabe des Datums der jeweils letzten emeuten Hinterlegung oder Weiterleitung In den in Regel 10. 2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprung.

Zutreffendes ankreuzen.

Ausfullen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prfung negativ waren.

BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORCANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES PFORMABLATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 <BR> <BR> 64293 Darmstadt : EMPFANGSBESTATIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gema# Regel 7. 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES tvtIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zueeteiltes Bezugszeichen : Von der MTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteiite EFNGANGSNUMMER : RH 3886 DSM 11284 II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter 1. bezeichneten Mikroorganismus wurde () eine wissenschaftliche Beschreibung (X) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutrettendes ankreuzen) 111. EINGANG UND ANNAHME Diese intemationale Hinterleeungsstelie nimmt den unter 1 bezeichneten Mikroorganismus an. der bei ihr am _ 996-l (Datum der Ersthinterlegung) ist. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter I bezeichncte Mikroorganismus ist bei dieser lntcrnauonalen Hinterlegungsstelle am emgegangen (Damm der Erst- hinteriecung) und ein Antrag auf Umwandlune dieser Ersthinteriegung in eine Hinterlegung gemaß Budapester \ enraya ist am eingegansen (Datum des Eingangs des Antrags aut Umwandlung) V. INTERNATIONALE HINTF. RLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrit'Ken) der zur Vertreruns der intemauona ! en Hintertegungssteite VffKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befueten l ersomen} oder des t der) von ihr ermächtigten Bediensteten : \nschrilt \tascheroder Wert lb D-3812t Braunschxveig X Ct Datum : ; 996-il-5 1 Falls Regel 6. 4 Buchstabe d zutrifft. ist dies der Zeitpunkt. zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.

BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROOPGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHRZN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 64293 Darmstadt LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemma0 Regel 10. 2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. HINTERLEGER II. KENNZEICIiNUNG DES IvIIIKROORGANISMUS Name : P, (5hm GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee 42 zugeteilte EINGANGSNUMMER : Anschrift : DSM 11284 64293 Darmstadt Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung' : 1996-11-11 111. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG Die Lebensfähigkeit des unter If genannten Mikroorganismus ist am 19 9 6-11-12'gepruft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorgamsmus (X)'lebensfahig ()'nicht mehr lebenstahie IV. BEDtNGUNGEN. UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFUHRT WORDEN IST' V INTERNA'fIONALE fiiNTERLEGUNGSSTELLE Name DSMZ-DEUTSCliE SAMMLUNG VON Unterschritt (en) der zur Vertretung der internauonalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTURCN GmbH befugten Personlen) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten : Anschril't : Ntaschcroder Wc2 lb D-38124 Braunschxveig) L dL ! Datum : 1996-li-15 Aneabe des Datums der Ersthinteregung. Wenn eine erneute Hinteriegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Angabe des Datums der jeweils tetzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprutung Zutreffendes ankreuzen.

Ausfüllen. wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.

BUDAPESTER VERTRAG ÜDER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmstadt EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG. ausgestellt gemä# Regel 7.1 von der unter angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMTJS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EfNGANGSNUMMER : RH 3046 DSM 10652 X 1VISSENSCI (AITLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICIMUNG Mit dem unter) bezeichneten Mikroorganismus wurde () eine wissenschaftlichc Besclocibung (X) eine vorgeschlagene taxonomische Dczeichnung cingcrcich. (Zutrcttendcs inkreuzcn) 111. EINGANG UND ANNAHN1E Diese intcmationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1996*04-24 (Datum der Ersthintcrlcgung) ist. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen liintcrlegungsstelle am cingegangen (Datum der Erst- hinter ! cgung) und ein Antrag auf Umwandjung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemaß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). V. INTERNATIONALE HtNTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DGUTSCHG SAMMLUNG VON Unterschriften) der zur Vcrtrctung der internationalen Hintcrtegungsstette MIKROORGANISVtEN UND ZELLiiULTUREN GmbH befugten l crsonlen) oder des (der) von ihr ermachtigtcn Bediensteten : , Xnschriíl N ascheroder Weg lb t) D-38124 Dr : unschwci^ % > ì Datum : 19 96-04-26 . alls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.

BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HlNrERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFA@REN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmstadt LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemaß Regel 10. 2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE I IIINTERLEGER ii. KENNZEICHNUNG DES MiKROORGANISMUS Name : Röhm GmbH Von der INTERNATIONALEN HMTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee zugettilte EiNGANGSNUMM£R : Anschrift : DSM 10652 64293 Darmstadt Datum der Hintcrlceung oder Weiterleitung'. 1996-04-24 Ill. LEDENSFAHIGKEITSBESCHiINIGUNG Die l. cbcnstahi ; keit dcs untc II gennnten Mikroorganlsmus ist am 19 9 6-04-2 4'ecprufi worden. Zu dicscm l. citpunkt var der Mikroorganisnws (X)'khenstahn ()'nicht mehr lebensfähig IV. OEDINGUNGGN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCIIGEFUIiRT WORDEN IST' V IN'ILRNn'TIONALE I1INTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCIIE SAMMLUNG VON Unterschri (l (cnl dcr zur Vertrctung der internationnlen I lintcrtcgungsstcll MIKROORGANtSMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ennachtigten Lediensteten : Anschrift : Mascherodcr lVc lb D-38124-3rallnschwei5 Ct » Ci Datum : n996-û4-26 Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Angabe des Datu@ der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgeschenen Fallen Angabe der letzten Lebenstahigkeitsprufung Gutrctlcndcs ankrcu2cn.

Ausfullen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebmsse der Prutung negativ waren.

BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmstadt EMPFANGSDESTATIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt rcmab Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES M) KROORGAN ! SMUS Vom IiINTERLEGER zugcteWtcs Bczugszcchcn : Von der INTERNATIONALEN fiflTERLEGUNGSSTELLE zugeteiltc EfNGANGSNUMMER : pKC3 DSM 10653 li. wISSENSCIIAIf'T'LICliE BESCHREit3UNG UNDIODER VORGESCILAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter I bc elchneten Mlkroorgants nus wurde (X) cn, e wssenschaftlichc Ocschrcibung (X 1 cmc vorecschlascne taxononuschc Dezeichnun emscreic ! (Zmrctrcdc'. nnrcuzc'T 111. EINGANG t ; ND nNNAI i. ME Dicsc mtcrnaoonalc H : n : e. iegungsstelle nimmì den unter I bezeichncten Mlkroorganlsmus an der bei ihr am 19 9 6-04-2 X (Datum úcr Ersthintcricgung) eintgansen ist. IV. EINGANG DES ANrRAGS AUF UMWANDLUNG Der umer | bexctcllnctc Nllkroorgamsmtls ist bei dieser Intcmationalcn Hinterlcgungsstcllc nm cmgegangen (Datum der Erst- hintertccuns) und on Arurn : au) Unuvandtuns dieser Ersthintcrtcgung tn eine Hintericgung gemäß Budapester Vertrag ist am eingcgan, cn iUauun dcs Eingans des Antrags nut Umwandlung). V INTERNA IIONALE IIINTERLEGUNGSSTELLE Name DSMZDEUTSCI iE SAMMLUNG VON UntcrschriRíen) der zilr Vcnrenmr ! dc. mternanonalen U imcrlet ungsstellc '. KROORGANLS\tEN UND ZELLKULTUREN GmhH befugten t'ersnntcu) oder des (der) von d) r crmachnen Bedensten Anscilrlll . hlscherodcr \\c-lb D. 3) !) 2. Uiraun<. ci) wet ! ! L-'-. Datum i ? 96- :-i-26 1) ; 1lilill i 9 1 alls Regel 64 Buzhstabe e zutr@@@ ist dies der Zeipunkt, zu dem der Status emer mternationaien Hinterlegungsstetle erworben worden ist BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROOPGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAiiRLN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmstadt LEBENSFÄHICKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gcmaß Rcgel 10. 2 von dcr unten nngegebencn RNTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. HINTERLEGER 11. KENNZEICfiNUNG DES MIKROORGANISMUS Name : ohm GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee zugeteilte EINGANGSNUMMER : Anschrifv DSM 10653 64293 Darmstadt Datum der Hinterieguns oder Weitcrleimna 1996-04-24 111. LEDENSFAHIGKGITSD3ESCIIEINIGUNG Die Lcbcnslahigkcit dcs unter II gcnanntcn Mikroor_amsmus ist am 1996-04-24'geprutt worden Zu diesen) Zeitpunkt war der Mjkroorgamsnua (X) Icbenslàhi )'aicht mchr lcbcnsl'nhy IV. DED (NGUNGEN, ll'TER DENEN DIE LEDENSFniiIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFUHRT WORDEN IST' V. INTERN A TIONALL I ilN I ERLLGUNGSS I ELLL Nnmc : DSMZ-DEUTSCliE S, \NMLUNG xOi Untcrschrill (cn) dcr zur Venretung der mternonaienHinteHcgungssteUe \UKROORGAN) S\fEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten I erson (en) oder des (der) von mr ermächtigten Uediensteten : Anschrift : Maselleroder Wco lb D-38124 Drunschwcy Datum - 1996-04-25 Angabe des Datums der Ersthinterlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Angabe des Datum der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weitericitung.

In den in Regel 10.2 Buchstabe a Zitfer a und iii vorgeschenen Fallen Angabe der letzten Lebenstahigkeisprutung Zutreffendes ankreuzen Ausfullen, wenn die Angaben beamtragt worden sind und wenn die Ergebnisse der prufung negativ waren BUDAPESTER VERTRAG UDGR DIE INTERNATIONAL ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFARREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmsnadt : EMPFANGSBESTATIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gema# Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE I iiENNZEICIINUNC DES MiixROORGANtSMUS Vom HINTERLEGER zugcteiftcs Uezugszeichen : Von der INTERNATIONALEN HfNTERLEGUNGSSTELLE zugctciltc E1NGANGSNUMMER : pKC9 DSM 10654 li. WtSSENSCHAfTUCHE ÜESCHREIBUNG UD/ODER. VORGESCHLAGENE TAXONOMtSCHE QEZEtCHNUNG Mit dem unter I bczciclmeen Mikrooreamsmus wurde (X) cme wnSStnSClttllichc l3cschrcbung (X) eine %-nr-, c chlogcnc taxononuschc liczeichnung ongereteiu (Zuucilcndes an ; rcuzcm i lti. EINGANG UND ANN.-iiiME Diese tntcrnationale Hmtcrlcgungsstclli n mmt dcn untcr I bezctcitncten Mlxroorganismus an dcr bei illr am 9 9 6-Ü 4-2 4 (Datum dcr Ershinterte ; ung cm : iesen ist. IV. EtNGANG DES ANTRAGS AUI UhlWANI) LUNG Der untcr I bczelchnctc iílkroorganismlls 1st bcl dicscr Intcrnationalen Hintcricgunósstcll : am cmzcgangen (Datum der Erst- hinterle_unepnd cin \ntri= auf Umwanuhung diescr Erstlintcrlcgung in cinc Hinterlcun gcma0 Dudapcstcr Venrag ist am etngegangen (Datum des eingangs des Antrags aut Umwandtung) V INTERN, '1'IONALE ! : : TERLEGUNGSSTELLE Name DSMZ-DEU TS IIE SAMitLUNG VO ; Untcrschnrtícn) dcr zur 'crtrctung der intcrnauomlcn limcrlcungsstcile vlIKROORG : \ ; : IW tI : N L'vU ZCLLI : L'1.'1'URI : N Gmhll bcfugten I crsoncy odcr dcs Idcr) von ilvr crmacnucicn licclcnstctcn Anschrift'. ! I'. CiicroL :-r lb 1) ; tttitil. I) ; ut ? 5-,-2 i @ Falls Regel 6.4 Buchsta@@ e zutr@@@, ist dies der Zetpunkt, zu dem der Status einer internationaten Hintertegungsstelle erworben worden ist BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER IIINTERLEGUNG VON MIKRCORCAN:SMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERrAF N INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmstadt LEBENSFAHtGKEITSBESCHEfNtGUNG ausgestellt gema# Regel 10. 2 von der unten angegebenen <BR> fNTERNATfONALEN litNTERLEGUNGSSTELLE 1. HINTERLEGER 11 KEbfNZEtCHNUNG DES MtKROORGANISMUS Namc : Rohm GmbH Von der INTERNATtONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee zugcteitte EINGANGSNUMMER : Anschnft DSM 10654 64293 Darmstadt Datum der liimerlcgung oder Wciterleitung' : 1996-04-24 111. LEflENSFAIIlGKEITSDESCI GINIGUNG Die t. cbcnslahikeU des umcr I I gcnanntcn Mikroorgamsmus ist am 19 9 6-0 4-24'gcpruft wordcn. Zu diesen) Zeitpunkt w. ir der Mikroorganismus () Icb nslahig I) niclo mclm Icbcnslaly IV EEDINGUNGEN. UNTER DENEN DIE LEEENSFAillGiiEITSPRUFtlNG DURCiiGEFUIIRT WORDEN IST V tNTERNA'nUNALL mN)'GRLEGUNüSSTELLE Name'3SMZ-DEUTSC) ! E SAMMLUNG VON Unterschriftfen) der zur Venretung der internationalen Hinterkgungsstette MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN Gmbhi befugtcn Hcrsonc(en) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten : Anschrifì \tuseheroder Wcg lb v 9 v/ D-38124 l3raunschwcig ! r D. num :- ? 96-04-26 , ktip, nbc (le% 1) ; ittiiii. % der I : rstliiiitcriefititi,, venn citic criietite I lititcrleltiii,, odur cille \ eltericittiti !,, v (ir., zeiioiiiiiieti % v (ir (leii iNt.-% ii, ; ihc (1"I) ititillis ( der jeweils tetzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe deer @etzten Lebensfahigkeitsprufung.

Zutreffendes ankreuzen.

@ Ausfüllen. wcnnd) die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergeb@sse der Prufung negativ waren.

BUDAPESTS VERTRAG UUER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmstadt EMPFANGSBESTÄTIGUNG DE1 ERSTHINTERLEGUNG. ausgestellt gemma0 Regel 7. 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN IIINTERLEGUNGSSTELLE I KENNZEICIINUNG DES MtKROORGANISMUS Vom l-IINTERLEGER zugetclltes Bezugszcicilen : Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGLNGSSTELLE zugeteilte ERNGANGSNUMMER : pKC12 DSM 10655 11. WISSENSCIIAFTLICI3E BESCHRLIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICl4NUNG Mit dem unter I bczeichncten Mikroorgnnismus wurde (X) cme svlssenschaftlicle Bcschreibung (X) eue vorgeschlagene twonomische Dezeiehnun ; cln ; erciclu (Zutrcllcndcs inkreuzcn) I11. EINGAN (i UND ANNAIiME Diese mternanonak Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezcichnctcn vtikroorgnmsmus an, der bei ihr am 1996-C4-24 (Datum der Ersthimertegung)'eingegangen ts'. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der ulncr I bczzichnctc Mikroorganismus ist bei dicser fntcrnanonalen I lintcrlc ; ungssiclle am cmgegnngen (Datum der E rst- hintcrlcguno) und cin Antrag auf Umwandlung dicscr Grsthintcricgung m cinc I limcrlegung gcma0 Dudapestcr Venrag ist am cingcgnngen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung) V tNTERNA'HONALE H ! NTERLEGUNGSSTELLC Name : DSMZ-DEUTSCSCME SAMMLUNG VON Untcrschrifl (cn) der zur Venrctung der intcrnationalcn Hinterlceungsstcllc MlliROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN G i"nn mfu tcn I'crsonicn) odcr des (dcr) von ihr crmaclUiycn ficclicnstetcn Ansehe))'. tasehernder Weg) b ) Anschritl Mascheroder Wcg ib D-38124 Drunschwci U : uum 1996-U4-2o ')atkUe'ct6.4HuchstKbc d zutrifft, ist dics der Zcitpunkt, zu dem der Status emer internationaten Hinterlegungsstelle erworben worden ist BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER IIIN'fERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 64293 Darmstadt LEBENSFAHICKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemaa Rcgcl 10. 2 von dcr unten angegebenen <BR> INTERNATfONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. IIINTERLEGER Il. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Namc Röhm GmbH Von der INTERNATIONALEN H (NTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee zugeteilte EiNGANGSNUMMER : Ansci. r. tt : DSM 10655 64293 Darmstadt : Datum der Hinterlcgung oder Wcilerleitllng : 1996-04-24 Ill. LEBENSFAIIIGKEITSBESCIIETNIGUNG Dic Lebcnsfhhigkeit des unter H genannten Mikroorg. imsmus istnm 1996-04-24'geprutt worden Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus í X) Icbensfahig () nicht mehr Icbcnsfahig IV EEDINGUNGEN UNTER DENEN DIE LEBENSFAillGi ; EITSPRUFUNG DURCHGEFUHRT NVORDEN ISt v IN I I RNA I IONALE I IINTERLEGUNGSSTELLE I Name : DSMZ-DEUTSCIIE SAMMLUNG VON Untcrschritt (en) der zur Vertretung der intcrnationalcn I lintcrlegungsstelle MlKROORGANiSMEN UND ZELLtsULTUREN Gmbli befueten I'erson (en) oder des (dcr) von ihr ermächtigten üediensteten : Anschrifi : Nlascheroder Weg lb r D-38124 Draunschwcig Datum : 1996-04-26 @ Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erncute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Anxabcdcs Datum der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung. ndcninHegc!)0.2HuchstabcaXiff'crnundH!'or[;csehcncn)'\d!enA[ )!;.ibcder!:t7tcnLcbcnstiifkt:iL',runnf' Zutreffendes ankreuzen.

Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HfNTERLEGUNG VON MIKRCCRGANSMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBALATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 64293 Darmstadt EMPFANGSBESTATIGUNG BEI ERSTHNTERLEGUNG. ausgestellt semais Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE i. KENNZEICIINUNG DES MIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNAT'IONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER : pKCN2 DSM 11352 1I. WISSENSCHAFTLICf-fE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter) bezeichneten Mikroorganismus wurde (X) eine wissenschaftliche Bcschreibung (X) eine vorgeschlagcne taxonomische Bczeichnung eingereicht. (Zutrettendcs ankreuzen) tU. EINGANG UND ANNAHME Diese imernationale Hinterlegungssteile nimmt den unter t bezeichneten Mikroorganismus an. der bei ihr am 1996-12-23 (Datum der Ersthinteriegungy eingegangcn ist. IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der untcr I bezeichncte Mikroorganismus ist bei dieser Intcrnauonalen Hintcrlegungsstelle am eineegangen (Datum der Erst- hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinteriegung m eine Hinterlegung gemati Budapester Vertras ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung) V. INTERNATIONALE H1NTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAhIIILUNG VON Unterschntt(cn) der zur Venrctun_ der internauonalcn Hintcrlegungsstelle MIKROORGANISMEN UD ZELLKULTUREN G ! b befugten)'erson (en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bedicnsteten : Anschrift : \lascheroder \\eg lb 7 D-38124 Braunschvcci_ Datum : 1997-01-09 @ Falls REgel 6.4 Buchstabe d zutrifft. ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status emer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.

BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 64293 Darmstadt LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestelit gemäß Regel 10. 2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. liINTERLEGER ! 1. KENNZEICHNUNG DES MKROORCANISMUS Name : Röhm GmbH Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee 42 zugeteilte EINGANGSNUMMER : Anschrift : DSM 11352 64293 Darmstadt Datum der Hinteriegung oder Weiterieitung : 1996-12-23 If (. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG Die Lebenstähiskcit des unter 11 genanmen Mikroorganismus ist am 19 9 6-12-23 gcprutt svorden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X)'lcbenstahig ()'nicht mehr tebensfahig IV. BEDINGUNGEN. UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFUHRT WORDEN IST' V. INTERNA I IONALE I IINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der internauonalcn HinteriesungssteHe MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Personten) odcr des tder) von ihr ermachtigtcn Bediensteten : Ansehriti : ! tascheroder lGee Ib D-38124 Draunschmcie Datum : 1997-01-09 Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weinterleigung vorgenommen worden ist. Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

In den in Regel 10. 2 Buchstabe a Tiller ii und iii vorgeschenen Fallen Angabe der letztcn Lebensfahigkeitsprutung.

Zutrettendes ankreuzen.

Ausfüllen. wenn die Ansaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.

BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKRCORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 64293 Darmstadt EMPFANGSBESTATIGUNG BEIERSTHINTERLEGUNG. ausgestellt sema0 Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER : RH 3909 DSM 11353 11. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde () eine wissenschaftliche Beschreibung (X) eine vorgeschiagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutrettendes ankreuzen). Ill. EFNGANG UND ANNAHME Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter t bezeichneten Mikroorganismus an. der bei ihr am 19 9 6-12-2 3 (Datum der Ersthinterlegung) : eingegangen IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser intemationalcn Hinterleeungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hinterlegung) und ein Antre auf Umwandlung dieser Ersthinlerlegung in eine Hinterlegung gemaß Budapester Vertrae ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON N Untersehriiuen) der zur Vertretun2 der intemauonalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befueten I'crsonfen) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten : Anschritt : vlascheroder Weg ib g rZ D-38124 Braunschweie Datum : 1997-01-09 1 Falls Regel 6. 4 Buchstabe d zutrifft. ist dies der Zeitpunkt. zu den) der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle ervorben worden ist.

BUDAPESTER VERTRAG TUBER DIE INTERNATiONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Röhm GmbH Kirschenallee 42 64293 Darmstadt LEBENSFÅHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemma Regel 10. 2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1, HMTERLEGER Ii. KENNZEICHNUNG DES iMiKROORGANISMUS Name : Röhm GmbH Von der fNTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Kirschenallee 42 zugeteiiteEINGANGSNUMIvER : Anschrift : DSM 11353 64293 Darmstadt : Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung' : 1996-12-23 Ifl. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG Die Lebenstahiekeit des unter U genannten Mikroorgantsmus ist am 1 9 96-12-27'geprufl worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X) lebenstàhig () nicht mehr lebenstàhig IV. BEDMNGUNGEN. UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFUHRT WORDEN IST' V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der intemationalen Hintericlunpsstelle MIf : ROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten 1'erson (en) oder des (der) von ihr ermachtieten Bediensteten : Anseitritt : Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig Datum : 1997-01-09 Angabe des Datums der Ersthinterlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Angabe des l) arums der jeweils letzten emeuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

In den in Regel t0. 2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebenstahigkeitsprutung.

Zutreffendes ankreuzen.

Ausfüllen. wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnissc der Prüfung negativ waren.