DE ALTA VISCOSIDAD

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un protocolo de criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad tales como las muestras espermáticas de invertebrados y más particularmente a un novedoso protocolo que permite la criopreservación de muestras espermáticas de muy alta viscosidad tales como por ejemplo las muestras espermáticas de crustáceos, conservando de manera integra la viabilidad del paquete celular contenido en dichas muestras.

Antecedentes de la Invención

La criopreservación de muestras de tejidos y fluidos biológicos, es una de las técnicas de preservación más utilizadas en bilogía para mantener la células vivas y en buen estado durante periodos de tiempo prolongado, sin apenas alterar su fisionomía ni actividad metabólica, pare ello la criopreservación mantiene el tejido y/o fluido en un estado de estasis en el cual las actividades metabólicas celulares se detienen por completo evitando que los procesos degradativos enzimáticos se lleven a cabo.

Para lograr lo anterior las muestras de tejido y/o fluidos biológicos se deben someter a un tratamiento previo que disminuya la probabilidad de formación de cristales debido al descenso tan brusco de temperatura, esto se logra mediante la adición de sustancias crioprotectoras , que evitan la formación de cristales durante el proceso de congelación ya sea disminuyendo la cantidad de agua intracelular y/o modificando el comportamiento de la mismas al modificar las fuerzas atractivas entre las moléculas de agua, por ejemplo al romper los puentes de hidrógeno.

Sin embargo aun cuando en la actualidad, es posible criopreservar diversos tipos de muestras por periodos de tiempo prolongados, es en el campo de la fertilización in- vitro en el que se han tenido más contratiempos, ya que no solo es necesario mantener viables las células, sino que también es importante mantener intacta su morfología celular y propiedades fisiológicas en vista de que en muchas especies animales, la pérdida de por ejemplo el poder adherente de los espermatozoides, evita la fertilización y producción de embriones viables.

Para tratar de superar dichos inconvenientes se han desarrollado diversos protocolos de criopreservación tales como por ejemplo los citados en la patente CN 101703039 A, la cual describe una solución dilutora para material espermático del crustáceo Charybdis japónica, cuya función es la de permitir una homogenización del tejido antes de ponerlo en contacto con los agentes de crioprotección a ser usados para su conservación en tanques de nitrógeno líquido, esto con el fin de que el paquete celular quede en contacto directo con las soluciones utilizadas. Sin embargo, el protocolo de criopreservación descrito diluye por completo la muestra y por lo tanto se pierden las propiedades físicas de la misma, lo que va en detrimento del poder fertilizante de los espermatozoides. Asimismo en dicho protocolo solo se usa DMSO como agente crioprotector y no se describe la combinación del mismo con otro compuesto que mantenga el equilibrio osmótico celular. La patente EP 2641966 Al, describe una composición para procesos de vitrificación de muestras biológicas, que comprende un compuesto crioprotector permeable a la membrana celular y un compuesto crioprotector no permeable a la membrana celular, estando el contenido del crioprotector permeable a la membrana celular del orden del 30% a 50% con respecto al volumen total de la composición. Sin embargo, para usar la solución propuesta es necesario disgregar por completo las muestras celulares y por lo tanto se pierden las propiedades físicas originales de las muestras tratadas.

La Solicitud de Patente WO 2015057641 Al, protege un sistema para la criopreservación de tejidos y el método para llevar acabo la vitrificación de muestras biológicas. Lo relevante de dicha solicitud radica en el hecho de que describe que la solución de vitrificación utilizada contiene un agente crioprotector permeable (DMSO) y un agente crioprotector no permeable (Trehalosa) . Sin embargo, no se menciona el uso de otras soluciones ni se indica de forma directa la concentración en la que son usados los agentes de crioprotección . Asimismo, las muestras tratadas deben ser completamente disgregadas y suspendidas para poder entrar en contacto con la solución crioprotectora, por lo que se perderían por completo las propiedades físicas originales de la muestra tratada. Ninguno de los protocolos de criopreservación disponibles, permite tratar muestras biológicas de alta viscosidad sin que para ello sea necesario la disgregación total de las mismas. Asimismo, en todos los casos es necesario suspender y homogenizar por completo las muestras para que éstas entren en contacto estrecho con el agente crioprotector utilizado, por lo que no serian susceptibles de ser usados cuando lo que se pretende es conservar las propiedades físicas originales del paquete celular.

En vista de la problemática anterior, es necesario proveer un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que permita mantener las propiedades físicas originales de las muestras, sin necesidad de diluir las mismas para ser criopreservada y, que además conserve intacta la viabilidad del paquete celular. Aunado a ello, es necesario proveer un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que en caso de contener gametos conserve la capacidad fertilizante de los mismos.

Sumario de la Invención

La presente invención tiene como objetivo el proporcionar un novedoso protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad.

Un objeto adicional de la presente invención, es proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que pueda conservar la viabilidad celular de las mismas.

También es un objeto de la invención el proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que permita la criopreservación de muestras de esperma de invertebrados en especial muestras de esperma de crustáceos, abejas, mariposas u otro invertebrado cuyo esperma tenga características de alta viscosidad.

Un objetivo más de la presente invención es proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad, que permita mantener una alta viabilidad celular en muestras de invertebrados.

Otro objetivo de la presente invención es brindar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad, que permita conservar las propiedades físicas iniciales de las muestras originalmente tratadas.

Un objetivo adicional de la presente invención es el proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que permita conservar la fertilidad de los espermatozoides de invertebrados tales como por ejemplo de los espermatozoides de crustáceos e insectos .

Los objetivos antes citados, así como otros y las ventajas de la presente invención, vendrán a ser aparentes de la siguiente descripción detallada de la misma.

Descripción de las figuras de la Invención

La Figura 1 muestra un corte histológico de la masa espermática antes de vitrificar (en fresco) mostrando estructuras eosinófilas posiblemente de origen proteico (flechas negras), incluidas entre los espermatozoides (estructuras basófilas redondas -flechas blancas-) . Aumento de 200 veces. La figura 2 muestra un corte histológico de la masa espermática descongelada (después de la vitrificación) del tratamiento B, mostrando pocas estructuras eosinófilas (circuios) . Dichas estructuras se pierden en el proceso de vitrificación posiblemente debido a que son de origen proteico y son desnaturalizadas por frió, mientras que los espermatozoides quedan intactos (flechas negras) . Aumento de 200 veces.

La figura 3 muestra la comparación de un corte histológico de masa espermática antes de congelar o muestra fresca (a) y una muestra espermática descongelada del tratamiento B (b) en donde se observan espermatozoides intactos (flechas) y algunas estructuras eosinófilas (en circuios) mostradas anteriormente en las figuras 1 y 2.

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención proporciona un novedoso protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad, que permite conservar las propiedades físicas originales de las muestras tratadas, sin pérdida de la viabilidad del paquete celular. El presente protocolo es especialmente útil para lograr la criopreservación de muestras espermáticas de invertebrados tales como crustáceos e insectos y ha demostrado ser especialmente útil para la muestras de esperma de camarón.

Para lograr lo anterior, el protocolo de la presente invención comprende los pasos de: a) colocar una muestra de material biológico de alta viscosidad, cargada en un dispositivo adecuado, en un tubo o criovial que contiene una solución extensora acuosa constituida preferentemente por 2.125 g/kg de NaCl, 0.110 g/kg de KC1, 0.052 g/kg de H3B04, 0.019 g/kg de NaOH, 0.484 g/kg de MgS04«7H20 y 20μ1 por cada 100ml de solución extensora de una solución que contiene 10000 UI de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25μg de anfotericina B, por un periodo de tiempo de entre 18 a 22 minutos a una temperatura de 21 a 25 °C sin que la muestra entre en contacto con la solución ni con las paredes del tubo, utilizando para ello un dispositivo de toma de muestra adecuado;

b) sumergir la muestra en trehalosa al 0.25-0.5M por un periodo de tiempo de entre 18 a 22 minutos;

c) transferir la muestra a una solución crioprotectora/vitrificarte constituida por 0.25-0.5 M de

Trehalosa y 10-20 % de DMSO en solución extensora, sumergiendo solo 2/3 de la misma por un periodo de tiempo de entra 2 a 4 minutos;

d) sacar la muestra de la solución crioprotectora y colocarla inmediatamente en nitrógeno liquido;

e) colocar la muestra en un criovial y almacenarla definitivamente en nitrógeno liquido entre -196 y -200 °C.

La descongelación de la muestra se lleva a cabo extrayendo la muestra del nitrógeno liquido y sumergiéndola en un baño de agua a una temperatura de 35°C a 39°C por un periodo de tiempo de 4 a 9 minutos, para posteriormente sacarla del criovial y colocarla por un periodo de tiempo de entre 15 a 25 minutos en una solución de equilibrio que contiene 0.25-0.5 M de trehalosa. Con el protocolo antes descrito es posible mantener la consistencia original de la muestra sin apenas perder viabilidad de la masa celular y ha demostrado ser especialmente útil en la criopreservacion de muestras espermáticas de invertebrados tales como crustáceos e insectos, mostrando ser particularmente útil en la criopreservacion de espermatóforos de camarones.

Ejemplo. Criopreservacion de muestras de esperma de camarón.

Para probar el protocolo de vitrificación de la presente invención en comparación con otros protocolos evaluados, se trataron muestras de espermatóforos de camarón obtenidas manualmente presionando suavemente la base del poro genital ubicado entre el quinto par de pereiópodos y el petasma. A dichas muestras se les separo el esperma presionando la región anterior del espermatóforo entre los dedos índice y pulgar .

Las soluciones evaluadas para criopreservar los espermatozoides del camarón blanco P. vannamei fueron trehalosa, sulfóxido de dimetilo (DMSO) y Poliet ilenglicol (PEG) . La combinación y concentración de los agentes vitrificantes previamente mencionados (trehalosa, DMSO y PEG) fueron asignados a los siguientes tratamientos: A) PEG al 6% y DMSO al 15%; B) Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 10- 15%; y C) Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 16-20%. Una vez preparados los tratamientos, éstos se almacenaron a 5°C hasta su uso. Todas las concentraciones de agentes crioprotectores se prepararon en la solución extensora mencionada en el paso a) del protocolo de la presente invención. Las muestras de esperma de cada espermatóforo se colocaron en un dispositivo de carga diseñado específicamente para este tipo de muestras y se introdujeron en posición vertical dentro de un criovial de 2 mililitros que contenía 100 μΐ de solución extensora. En este proceso se cuidó que la muestra no hiciera contacto con las paredes interiores del criovial ni con la solución; la muestra se almacenó por 20 minutos a temperatura ambiente (23°C) . Posteriormente se procedió a introducir el dispositivo de carga en los diferentes tratamientos dejando que solo dos tercios de la muestra de esperma estuvieran en contacto con las soluciones crioprotectoras . Dicho paso fue crucial en la valoración, ya que al introducir más de 2/3 de la muestra en la solución se causaba su desprendimiento del dispositivo de carga, e introducirla menos no permitía la correcta penetración de los agentes crioprotectores a la muestra.

Las soluciones criopreservadoras se añadieron en dos pasos: para el tratamiento A en el paso 1, la muestra de esperma se sumergió en una solución que contenía la mitad de la concentración total del agente crioprotector (PEG 3% y 7.5% DMSO) por un minuto. El paso 2 consistió en sumergir la muestra en la concentración total del agente crioprotector (PEG 6% y DMSO 15%) por 20 segundos; el paso 1 para los tratamientos B y C consistió en sumergir las muestras en trehalosa por 20 minutos para luego, en el paso 2, sumergir solo 2/3 en la solución vitrificante B (Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 10-15%) o C (Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 16- 20%) . Luego de la incorporación de los agentes crioprotectores , el dispositivo de carga conteniendo la muestra de esperma, se introdujo rápidamente en nitrógeno liquido y se colocó en un criovial de 2 mL . Posteriormente, el criovial se almacenó por 24 horas en un tanque de nitrógeno liquido entre -196°C y -200 °C.

Para probar la eficiencia de estos protocolos, se realizaron experimentos utilizando 96 espermatóforos provenientes de 48 machos. Los espermatóforos recolectados cada día fueron asignados al azar a los distintos tratamientos. La mitad de las muestras fueron asignadas para fertilizar a las hembras y la otra mitad para su traslado a las instalaciones del CICESE, en Ensenada, Baja California donde se llevaría a cabo la verificación de la calidad de esperma criopreservado .

Para la descongelación, los crioviales fueron extraídos del tanque de nitrógeno líquido y cada muestra fue rápidamente sumergida en un baño de agua a aproximadamente a 37 °C durante 6 segundos. Posteriormente se colocaron por 15-25 minutos en la solución de equilibrio (0.25-0.5 M de trehalosa) y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso en la fertilización artificial o evaluación de viabilidad. Tanto la fertilización como la evaluación de viabilidad en microscopio de luz fueron llevadas a cabo en instalaciones de Maricultura del Pacífico, S.A. de C.V. La verificación de la viabilidad utilizando sondas fluorescentes e histología fue realizada en las instalaciones del Subsistema de Recursos Genéticos Acuáticos (SUBNARGENA) ubicado en el CICESE. Para llevar a cabo la fertilización, las muestras descongeladas fueron suspendidas en la solución extensora descrita en el paso a) del protocolo de la presente invención y su viabilidad evaluada. Diez muestras de esperma por tratamiento fueron asignadas para la inseminación artificial de 10 hembras listas para ovular. El único tratamiento que produjo nauplios después de la inseminación artificial fue el tratamiento B (Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 10-15%) .

Por otra parte, de las muestras trasladadas al CICESE, siete de ellas fueron utilizadas para valorar su viabilidad. Las muestras descongeladas fueron transferidas a un tubo que contenia 1 mL de solución extensora para ser disgregadas con un homogeneizador de tejidos por 30 segundos. Una vez realizada la suspensión, las células fueron teñidas con el kit de tinción para espermatozoides Live/Dead (Life Technologies, Eugene, OR, USA) de la siguiente forma: 5 μL del colorante SYBR 14 fue agregado a un mililitro de la suspensión de células (concentración final 100 nM) y fueron incubadas por 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (23°C) ; posteriormente, se agregaron 5 μL del colorante yoduro de propidio (YP, concentración final 12μΜ) dejándose incubar por otros 10 minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente. Una vez terminada la tinción, una alícuota de 20 μL fue colocada en un porta objetos y las células fueron visualizadas en un microscopio de fluorescencia (Nikon Elipse 80i), con un filtro de excitación azul para fluorescencia verde. Las células teñidas con el colorante SYBR 14 (verde) fueron consideradas como células con membrana celular intacta mientras que las células teñidas con YP (rojo) fueron consideradas células con membrana celular dañada. Se evaluaron un total de 100 células por laminilla y al finalizar se determinó el porcentaje de células con membrana celular intacta, presentando las muestras tratadas un porcentaje de 100% de células con la membrana celular intacta, según la histología.

Tres muestras de esperma descongeladas y equilibradas fueron cuidadosamente envueltas en papel de arroz por separado y cada una colocada dentro de un cásete de histología para ser fijadas por aproximadamente 48 horas en solución Davidson modificada. Posteriormente, las muestras fueron deshidratadas en tren de alcoholes, incluidas en parafina, cortadas (8 mieras de espesor) y teñidas con Hematoxilina/Eosina . Las laminillas fueron observadas en un microscopio de luz y las características morfológicas de los espermatozoides fueron evaluadas. Tras su análisis histológico, no se observaron diferencias en la estructura de los espermatozoides entre las muestras descongeladas provenientes de los tratamientos B, C y las muestras frescas sin tratar (Figuras 1 a 3) . El resto de los tratamientos no mostraron presencia de espermatozoides.

Para la valoración de viabilidad mediante observación con microscopio óptico, las muestras de esperma en la solución de equilibrio (trehalosa 0.25-0.5 M por 15 a 20 min) , fueron homogenizadas con 1.5 mL de solución extensora. Una alícuota de 20 i fue examinada con un aumento de 400X después de haber teñido las alícuotas con nigrosina al 10% y se procedió a evaluar y registrar los cambios morfológicos presentes. Aquellos espermas que mantuvieron las características morfológicas intactas (cuerpos esféricos y espinas completas) fueron considerados viables en tanto que aquellos con cuerpos celulares irregulares o espinas deformes o ausentes fueron considerados no viables. Para determinar el porcentaje de viabilidad se contaron 100 espermatozoides, por triplicado, en por lo menos cinco campos de visión por lámina examinada, encontrándose en todos los casos un porcentaje de 100% de viabilidad.

Los resultados antes mencionados, muestran que con el protocolo de la presente invención se puede mantener la viabilidad de la masa celular de muestras biológicas de alta viscosidad sin afectar sus propiedades morfológicas originales; asimismo, el protocolo de la presente invención permite conservar la funcionalidad de las células criopreservadas .

La presente invención se ha descrito de acuerdo a una modalidad preferida; sin embargo, será aparente para un técnico con conocimientos medios en la materia, que podrán hacerse modificaciones a la invención, sin apartarse de su espíritu y alcance.