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Patent Searching and Data


Title:
PROTRANSDUCINE-C: GENE TRANSFER ACTIVATOR
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/087146
Kind Code:
A1
Abstract:
Polypeptide having the sequence (AA).

Inventors:
FORSSMANN, Wolf-georg (Feodor-Lynen-Str. 31, Hannover, 30625, DE)
RICHTER, Rudolf (Feodor-Lynen-Str. 31, Hannover, 30625, DE)
Application Number:
EP2017/078600
Publication Date:
May 17, 2018
Filing Date:
November 08, 2017
Export Citation:
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Assignee:
PHARIS BIOTEC GMBH (Feodor-Lynen-Str. 31, Hannover, 30625, DE)
International Classes:
C07K14/16; A61K38/00; A61K38/16
Domestic Patent References:
WO2014177635A12014-11-06
WO2014177635A12014-11-06
Foreign References:
EP2452947A12012-05-16
EP2452947A12012-05-16
Other References:
MARAL YOLAMANOVA ET AL: "Peptide nanofibrils boost retroviral gene transfer and provide a rapid means for concentrating viruses", NATURE NANOTECHNOLOGY, vol. 8, no. 2, 1 February 2013 (2013-02-01), pages 130 - 136, XP055086479, ISSN: 1748-3387, DOI: 10.1038/nnano.2012.248
WURM ET AL., J GENE MED., vol. 12, 2010, pages 137 - 46
WURM ET AL., BIOL CHEM., vol. 392, 2011, pages 887 - 95
MARAL YOLAMANOVA ET AL., NATURE NANOTECHNOLOGY, vol. 8, no. 2, pages 130 - 136
Attorney, Agent or Firm:
DOMPATENT VON KREISLER SELTING WERNER - PARTNERSCHAFT VON PATENTANWÄLTEN UND RECHTSANWÄLTEN MBB (Deichmannhaus am Dom, Bahnhofsvorplatz 1, Köln, 50667, DE)
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Claims:
Patentansprüche

Polypeptid mit einer Sequenzähnlichkeit von mindestens 80 %, insbesondere 90 % zu der Sequenz

Z^Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2 Z3-Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z4, wobei

Z1 oder Z3 dieselbe Bedeutung haben oder jeweils unabhängig voneinander das N-terminale Ende des Polypeptids darstellen oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Leu oder Ser oder die folgenden Peptide

Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn-Ile-Thr, Thr-Leu, Ile- Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, oder Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu sind,

Z2 oder Z4 dieselbe Bedeutung haben oder jeweils unabhängig voneinander das C-terminale Ende des Polypeptids darstellen oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Gly oder Glu oder die folgenden Peptide

Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys- Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu- Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala- Pro-Pro-Ile-Glu, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Glu-Gly, Ile-Glu-Gly, Pro-Ile-Glu-Gly, Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Tyr- Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Met-Tyr-Ala-Pro- Pro-Ile-Glu-Gly, Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, oder Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly sind.

Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei das Dimere aus homologen oder hetero- logen Monomeren gebildet wird.

Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, mit der Aminosäuresequenz Z^Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2 Z^Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z2 wobei die Reste Z1 und Z2 die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen haben.

Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Sequenzähnlichkeit von mindestens 80 %, insbesondere 90 % zu der Sequenz

Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln.

Polypeptid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens ein N-terminales Ende der beiden das Polypeptid bildenden Aminosäureketten mit einer chemischen Gruppe modifiziert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer oder zwei Alkylgruppen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppen, eine Acylgruppe, wie eine Acetyl- oder Propionylgruppe oder die Aminosäure Pyroglutaminsäure das N-terminale Ende bildet.

Hilfsstoff zur Präzipitation von Viren enthaltend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5.

Arzneimittel enthaltend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5.

Polypeptid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in der Gentherapie zur Behandlung von genetisch bedingten Erkrankungen.

Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus mit den Schritten :

Bereitstellen des Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 gelöst in einem organischen Lösungsmittel,

Zugabe des Polypeptids zu einer wässrigen Lösung, unter Bildung von unlösbaren Aggregaten des Polypeptids,

Vermischen der Lösung aus dem vorhergehenden Schritt und

Kultivieren von Zellen in Anwesenheit des Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5.

10. Verwendung, insbesondere in vitro Verwendung, des Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus.

11. Zusammensetzung enthaltend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5.

Description:
Protransduzin-C - ein Enhancer des Gentransfers

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Polypeptid, ein N-terminal geschütztes Polypeptid, ein Arzneimittel enthaltend das Polypeptid, das Polypeptid zur Verwendung in der Gentherapie, ein Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem gentechnischen Viruskonstrukt, eine Verwendung des Polypeptids zur Amplifizierung zur Transfektion bzw. Transduktion.

Die Bedeutung der Gentechnologie hat in den letzten Jahren durch enorme Fortschritte in den angewandten Methoden zugenommen, da nicht nur die Herstellung von Protein-Peptid-Wirkstoffen sondern auch die Transfektion von Zellen mit stabilen Genen als Labortool und zuletzt der Einschleusung von Genen in Zellen als Ersatz für Gendefekte von grosser Tragweite für die Therapie von zahlreichen Erkrankungen absehbar ist.

Die Einschleusung von Genmaterial zur Veränderung spezifischer Zellfunktionen ist seit der Klonierung der ersten humanen Gene und der rekombinanten Produktion ein unverzichtbares Werkzeug der biologisch-medizinischen Grundlagen- und Anwendungsforschung geworden. Dabei gibt sich ein ständiger Fortschritt der Methoden der Geneinschleusung, der zu einer Optimierung des Gentransfers führt. Erfahrungen, die über eine langjährige, zunächst sehr langsame Geschichte gesammelt wurden. Schon vor der Aufklärung der Funktion von Desoxyribonukleinsäure (DNS) 1953 durch F. Crick und J. Watson, war es Ende der 1920 ' er Jahre F. Griffith in Experimenten gelungen, apathogene Pneumokokken-Stämme in Pathogene zu transformieren. Diese Transformation war einem glücklichen Umstand zu verdanken, da die Pneumokokken über eine seltene natürliche Kompetenz der DNS Aufnahme verfüg- ten. Ein gezieltes Einschleusen der DNS in Prokaryonten gelang u.a. J. Lederberg, M. Delbrück und S. Luria mithilfe von Phagen, die so genannte Transduktion. Mit der Etablierung der Zellkultur, dem Kultivieren von Eukaryonten Zellen unter in vitro Bedingungen, wurden eine Reihe von physikalischen und chemischen Verfahren zur Transfektion entwickelt. Zu den häufiger genutzten, aber apparativ aufwendigeren, physikalischen Methoden gehören die Elektroporation und die Mikroinjektion, die mit den von der Anwendung einfacheren chemischen Verfahren konkurierten, wie die in den 80 ' er Jahren und auch noch heute übliche Calcium-Phosphat-Präzipitation Methode oder die in den frühen 90 ' er Jahren weit verbreiteten Methoden, die auf kationische Lipide bzw. kationische Polymere basierten. Der Einsatz dieser Verfahren war aber immer von den Zellen bzw. der DNS abhängig. Auch lag die in die Zellen eingeschleuste DNS im Allgemeinen extrachromosomal vor (transiente Transfektion) und wurde so nicht an die Tochterzellen weitergegeben. Von Phagen (z. B. Lambda Phage) wusste man aber, dass diese auch ihre DNS ins Wirtsgenom integrieren können (Prophage, lysogener Infektionsweg). Von hier aus war es nur noch ein kleiner Schritt zur (1981/1982) „Etablierung von Retroviren als Genvektoren" (durch Doehmer et al. und Tabin et al.). Viren sind Spezies- und Organ-/Gewebe- spezifisch, weshalb nicht alle Viren alle (Eukaryonten) Zellen infizieren. Veränderungen der Virus Hülle (Austausch von Glykoproteinen, sogenannte Pseudo-typed Viren) sowie Zusätze von meist kationischen Peptiden soll die Transduktionseffizienz steigern. Erste Verstärker der Aufnahme von Viruspartikeln sind bei der Untersuchung von HIV aufgefallen. Bei Analysen der in vitro Infektion mittels eines spezifischen Zelltests wurde die Hemmung der Fusion von HIV durch Blutfiltratpeptide beobachtet. (Münch et al, VIRIP).

Es wurde gezeigt, dass diese überraschenderweise natürlich vorkommenden Frag- mente von Proteinen im menschlichen Sperma faserartige Strukturen als enhancer - „Semen derived Enhancer of Virus Infection" (SEVI) ausbilden, die als Amyloidfibrillen gekennzeichnet sind. Diese Nanofibrillen verstärken das Andocken von Viren an ihre Zielzellen und erhöhen die Rate der Virusinfektion um mehrere log- Stufen. Dies wurde genutzt, um einen retroviralen Gentransfer für die Grundlagenforschung und mögliche zukünftige therapeutische Anwendungen zu verbessern. So konnte gezeigt werden, dass lentivirale und gamma-retrovirale Vektoren, die für die Gentherapie verwendet werden, in der Anwesenheit des SEVI - Proteins eine vielfach höhere Gen -Transfer rate bei unterschiedlichen Zelltypen aufweisen, wie z.B. huma- nen T-Zellen, Zervixkarzinomzellen, Leukämiezellen, hämatopoietischen Stammzellen und embryonalen Stammzellen (Wurm et al., J Gene Med. 2010, 12, 137-46; Wurm et al., Biol Chem . 2011, 392, 887-95). Untersuchungen zur Entwicklung weiterer Enhancer wie z. B. dem SEVI und Seminogelin führten zu der Annahme, dass Peptide aus viralen Hüllproteinen auch als Enhancer der Transfektion geeignet sein könnten, was überraschenderweise von unerwartet gutem Erfolg war (Maral Yolamanova et al., Nature Nanotechnology, Bd. 8, Nr. 2, S. 130-136). So konnte z. B. gezeigt werden, dass HI-Viren, welche mit verschiedenen Konzentrationen (1-100 Mg/ml) Protransduzin-A (Synonym : EF-C) vorinkubiert wurden, eine um mehrere log-Stufen stärkere Infektionsrate bei Reporterzellen aufweisen. Als Wirkmechanismus wurde angenommen, dass EF-C fibrilläre Strukturen ausbildet, die in der Lage sind, Viren zu binden, zu konzentrieren und entprechend den Zelleintritt der Viren zu vervielfachen. EF-C verstärkt neben der Infektion von Viruspartikeln mit hoher Effizienz die Transduktion von lentiviralen und retroviralen Partikeln in verschiedensten humanen Zelltypen (T-Zellen, Gliazellen, Fibroblasten, hämatopoietische Stammzellen), welche in der Gentherapie Anwendung finden (Maral Yolamanova et al., Nature Nanotechnology, Bd. 8, Nr. 2, S. 130- 136). Protransduzin-A ist auch Gegenstand der EP 2 452 947 AI .

Aufgrund der oben dargestellten zunehmenden Bedeutung der Gentechnologie sind effektivere Verstärker des Gentransfers wünschenswert. Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem ist die Bereitstellung eines verbesserten Verstärkers des Gentransfers. Überraschenderweise wurde gefunden, dass Polypeptide mit einer Sequenzähnlichkeit von mindestens 80 % oder 90 %, insbesondere 95 % zu der Sequenz

Z^Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z 2

Z 3 -Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z 4 , wobei

Z 1 oder Z 3 jeweils unabhängig voneinander das N-terminale Ende des Polypeptids darstellen oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Leu oder Ser oder die folgenden Peptide Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn-Ile-Thr, Thr-Leu, Ile-Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, oder Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu sind, Z 2 oder Z 4 jeweils unabhängig voneinander das C-terminale Ende des Polypeptids darstellen oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Gly oder Glu oder die folgenden Peptide

Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala- Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu, Glu-Val-Gly- Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Glu-Gly, Ile-Glu-Gly, Pro-Ile-Glu-Gly, Pro- Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Met-Tyr-Ala- Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro- Pro-Ile-Glu-Gly, Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Val-Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, oder Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu- Gly sind, das der Erfindung zu Grunde liegende Problem lösen.

Unter dem Begriff Sequenzähnlichkeit wird hier die Ähnlichkeit zwischen Proteinen (Aminosäuresequenzhomologie) aufgrund identischer Bausteinsequenzen in mehr oder weniger ausgedehnten Teilbereichen des Proteins verstanden. Die Sequenzähnlichkeit wird in Prozent identischer Positionen beim Vergleich zweier Peptidketten angegeben, wobei 100% Sequenzähnlichkeit völlige Identität der verglichenen Kettenmoleküle bedeutet. Bei Proteinen entsprechen 5% (100/20) identische Positionen der Zufallserwartung und entfallen damit zur Ableitung verwandtschaftlicher Beziehungen.

Die durch das erfindungsgemäße Polypeptid erzielbare Verbesserung geht mit einer erhöhten Effizienz der Gentransduktion in Zellen einher, die zu therapeutischen Zwecken eingesetzt werden können. Eine effizientere Gentransduktion in Zellen zur the- rapeutischen Anwendung kann z. B. die Menge an viralen Partikeln, die zur Gentransduktion verwendet werden, reduzieren. Weiterhin kann die Anzahl der Infektionzyklen, die für eine effiziente Transduktion notwendig sind, reduziert werden. Durch das erfindungsgemäße Polypeptid als Transduktionsverstärker kann die Dauer der in vitro Kultivierung zur Vermehrung der genmodifizierten Zellen, die Menge der vom Patienten zu entnehmenden Zellen (z.B. durch Leukapherese) reduziert und ggf. eine effiziente und nicht toxische in vivo Gentransduktion - durch Reduktion der Virusbelastung in vivo - ermöglicht werden. Weiterhin reduziert die schnelle Handhabung eines effizienten Transduktionsverstärkers die Belastung der zu transduzierenden Zellen .

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann aus homologen oder heterologen Monomeren gebildet werden. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Polypeptid ein aus zwei gleichen Monomeren über eine Disulfidbrücke verbundenes Dimere.

In einer Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Polypeptid die folgende Struktur auf:

Z^Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z 2 Z^Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z 2 , wobei Z 1 und Z 2 die oben genannten Bedeutungen haben.

Insbesondere ist auch das Polypeptid mit einer Sequenzähnlichkeit von mindestens 40 %, insbesondere 90 % zu der Sequenz

Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln

I

Gln-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln

Gegenstand der Erfindung.

Erfindungsgemäß werden unter der Bezeichnung erfindungsgemäßes Polypeptid auch solche verwandten Polypeptide verstanden, die durch Variation der Aminosäuren in der Polypeptidkette des erfindungsgemäßen Polypeptids entstehen, aber noch eine vergleichbare und hinreichende Wirksamkeit aufweisen, die sich beispielsweise in folgendem Bioassay bestimmen lässt.

Die Transduktionseffizienz kann unter Verwendung von 293T Zellen als Targetzellen und lentiviralen und retroviralen Vektoren, die Green Fluoreszenz Protein (GFP) kodieren, getestet werden. Protransduzin-C wird in einem Assay in einer Konzentrationsreihe, z. B. in einer Konzentration von 0,01 bis 1000 pg/ml dem Assay eingesetzt. Die Targetzellen werden insbesondere in einer Konzentration von 10 3 bis 10 7 Zellen/ml eingesetzt. Für 8 bis 16 Stunden wird der Ansatz inkubiert und anschlie- ßend werden die Zellen gewaschen. Die Transduktionseffizienz wird anschließend anhand der GFP positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie. Ein sequenzähnliches (homologes) Polypeptid ist insbesondere ein mit der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids verwandtes Polypeptid, bei dem im genannten Umfang Austausche oder Deletionen von Aminosäuren in der Aminosäurenkette vorgenommen wurden. Insbesondere sind Austausche von Ami- nosäuren, die ähnliche Eigenschaften haben, beispielsweise ähnliche Polaritäten, möglich. So sind Austausche von Arginin und Lysin, Glutaminsäure und Asparagin- säure, Glutamin, Asparagin und Threonin, Glycin, Alanin und Prolin, Leucin, Isoleucin und Valin, Thyrosin, Phenylalanin und Tryptophan sowie Serin und Threonin weit verbreitet. Unter Sequenzhomologie wird hier auch folgendes verstanden : das erfindungsgemäße Polypeptid besteht aus zwei sequenzähnlichen oder identischen Monomeren, die jeweils die Aminosäure Cystein enthalten, über die die beiden Monomere über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft sind. Insbesondere besetzt die Aminosäure Cystein die Position 2 des Monomers. Alternativ können zur Verbrückung der Mono- mere auch andere kovalente Bindungen zwischen zwei Aminosäuren verwendet werden.

In Position 1 der Sequenz findet sich bevorzugt die Aminosäure Glutamin. In Position 3 und 5 finden sich bevorzugt basische Aminosäuren, bevorzugt Lysin. In den Positi- onen 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, und 12 finden sich zumeist neutrale Aminosäuren. N- und/oder C-terminal kann die Sequenz verlängert oder verkürzt sein. N-terminal kann die Sequenz des Monomers um C-terminale Teile oder die gesamte Aminosäuresequenz NH 2 -Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu-COOH verlängert sein. C-terminal kann die Sequenz des Monomers um N-terminale Teile oder die gesamte Aminosäuresequenz NH 2 -Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly-C OOH verlängert sein. Den Peptiddimeren ist gemein, dass sie in wässrigen Lösungen unlösliche Aggregate bilden. Die Monomere bestehen aus 4 bis 25 Aminosäuren, bevorzugt aber aus 10 bis 20 Aminosäuren. Sequenzähnliche Polypeptide weisen eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 40% auf, vorzugsweise 50%, noch bevorzugter eine Sequenzähnlichkeitvon 60%-70% oder 80%, insbesondere 90% oder 95% auf. Strukturell sind bei den sequenzähnlichen Molekülen die Dimerisierung und mindestens zwei basische Aminosäuren zu finden. Weiterhin ist den sequenzähnlichen Molekülen gemein, dass sie in wässrigen Lösungen unlösliche Aggregate bilden und die Transduktion von Targetzellen mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren steigern. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein N-terminales Ende der beiden das erfindungsgemäße Polypeptid bildenden Aminosäureketten mit einer chemischen Gruppe modifiziert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer oder zwei Alkylgruppen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppen, eine Acylgruppe, wie eine Acetyl- oder Propionylgruppe. Alternativ kann die N- terminale Aminosäure durch eine Pyroglutaminsäure ausgetauscht sein, so dass die Pyroglutaminsäure das N-terminale Ende bildet.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Hilfsstoff zur Präzipitation von Viren enthal- tend mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid. Durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Polypeptids als Präzipitationshilfsstoff kann die Isolierung von Viren durch Zentrifugation erheblich erleichtert werden, weil die anzuwendenden Zentrifugationszeiten deutlich verkürzt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfin- dungsgemäßes Polypeptid.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptides in der Gentherapie zur Behandlung von genetisch bedingten Erkrankungen. Als Gentherapie bezeichnet man in der Medizin das Einfügen von Genen in Zellen oder Gewebe eines Menschen, um Erbkrankheiten oder Gendefekte zu behan- dein.

Ebenfalls ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus mit den Schritten :

Bereitstellen des Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2 gelöst in einem organischen Lösungsmittel, Zugabe des Polypeptids zu einer wässrigen Lösung, unter Bildung von unlösbaren Aggregaten des Polypeptids,

Vermischen der Lösung aus dem vorhergehenden Schritt und Kultivieren von Zellen in Anwesenheit mindestens eines erfindungsge- mäßen Polypeptids.

Gegenstand der Erindung ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Verstärkung der Infektion von Zellen mit einem Virus.

Eine Zusammensetzung enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann beispielsweise mit der Methode nach Merri- field mit Fmoc geschützten Aminosäuren synthetisiert werden.

Dabei wird mit Fmoc-geschützten Derivaten gearbeitet, also mit (9- fluorenylmethoxycarbonyl) -geschützten Aminosäuren in einer schrittweisen Festphasensynthese nach dem Merrifield-Prinzip, insbesondere auf einem mit Fmoc-L- Glutamin vorbeladenem Wang-Harz (0,59 mmol/g, 100 - 200 mesh) als festem Träger am Synthesizer ABI-433.

Die Aktivierung der Fmoc-L-Aminosäuren, die typischerweise in 10-fachem molaren Überschuss eingesetzt wurden, werden mit [(2-(lH-Benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3- tetramethyluronium-hexafluorophosphat] (HBTU, 100 mmol/1) unter Zusatz von 0.5 M 1-Hydroxy-benzotriazol (HOBt) und 2M Diisopropylethylamin (DIEA) in N-Methyl- 2-pyrrolidinon (N MP) bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Acylierungsreaktionen dauern im einzelnen 45 Minuten, die Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppe mit 20 %igem Piperidin dauert 15 Minuten.

Folgende Aminosäurederivate sowie dazugehörige orthogonal-säurelabile Seitenket- tenschutzgruppen werden zur Synthese eingesetzt:

Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Cys(Trt), L-pGlu, Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Ile, Fmoc-L- Lys(Boc), Fmoc-L-Met und Fmoc-L-Trp(Boc).

Nach Abspaltung des Harzträgers vom Peptidylharz mit 94 %iger Trifluoressigsäure (TFA); 3%igem Ethandithiol (EDT) und 3 %igem entmineralisiertem Wasser wird das Rohpeptid in kaltem tert. Butylmethylether ausgefällt, das Rohpeptid als Sediment abzentrifugiert, der Überstand verworfen.

Die anschließende chromatographische Aufreinigung des Rohpeptides erfolgt präperativ per Gradientenelution. Der Unterschied von Protransduzin-A gemäß EP 2 452 947 AI und Protransduzin-B gemäß WO 2014/177635 AI zu Protransduzin-C ist der, dass Protransduzin-C erfindungsgemäß aus zwei Peptidmonomeren besteht, die über eine Disulfidbrücke kova- lent zu einem Peptiddimer verknüpft sind.

Beispiel : Transduktion von 293 T Zellen mit Protransduzin-C

293T Zellen werden in 12 Well Kulturplatten ausgesäht und für 16 h kultiviert. Je Well werden 200.000 293T Zellen eingesetzt. Nach 16 Stunden werden ein Vial mit 1,0 mg Protransduzin-C und ein Vial mit 1,0 mg Protransduzin-A mit je 100 μΙ DMSO versetzt und Protranduzin-S und Protransduzin-A damit vollständig gelöst. Danach werden in jedes Vial jeweils 900 μΙ PBS zugefügen. Dabei entstehen innerhalb von 3 min. Fibrillen. Anschließend werden Protransduzin-C oder Protransduzin-A in einer Endkonzentration von 25Mg/ml den Kulturwells hinzugegeben. Dann werden verschiedene Mengen an RD114 Virus Stock (10μΙ, 25 μΙ, 50 μΙ, ΙΟΟμΙ) hinzugegeben und das fehlende Volumen mit DMEM auf 500μΙ aufgefüllt. Die verwendeten RD114 Viren kodieren das Green Fluoreszent Protein. Zur Steigerung der Transduktionsrate werden die Ansätze bei 600 g für 1 h bei 25°C zentrifugiert. Nach 6 h werden 500 μΙ Zellkulturmedium hinzugegeben . 24 h nach Transduktion wird das Zellkulturmedium gewechselt. 48 h nach Transduktion wird die Transduktionseffizienz in der Durchflusszytometrie durch Bestimmung der Expression des Green Fluorescence Protein in den 293T Zellen bestimmt. In den Experimenten zeigt sich eine signifikant höhere Potenz von Protransduzin-C zur Verstärkung der Transduktion im Vergleich zu Protransduzin-A und zur Kontrolle (Fig. 1) .

Protransduzin-B weist eine ähnliche Transduktionseffizienz wie das Protransduzin-A auf, sodass die Transduktionseffizienz von Protransduzin-C im Vergleich zu Protrans- duzin-B ebenfalls signifikant erhöht ist, ähnlich zu den Resultaten gemäß Fig. 1.