Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein verbesserter Enhancer des Gentransfers, Protransduzin D (PTD-D), eine Verbesserung der Transductionsenhancer PTD-A und PTD-B, sein Polypeptid, ein N-terminal geschütztes Polypeptid, ein Arz- neimittel enthaltend das Polypeptid, das Polypeptid zur Verwendung in der Gentherapie, ein Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem gentechnischen Viruskonstrukt, eine Verwendung des Polypeptids zur Amplifizierung zur Transfection bzw. Transduction.

Die Einschleusung von Genmaterial zur Veränderung spezifischer Zellfunktionen ist seit der Klonierung der ersten humanen Gene und der rekombinanten Produktion ein unverzichtbares Tool der biologisch-medizinischen Grundlagen- und Anwendungsforschung geworden. Dabei gibt sich ein ständiger Fortschritt der Methoden der Gen- einschleußung, der zu einer Optimierung des Gentransfers führt.

Untersuchungen zur Entwicklung von Transduktionsenhancern führten zur Entde- ckung von Protransduzin-A, ein Peptid aus einem viralen Hüllprotein des HIV-Virus, das überraschenderweise geeignet war, die lentivirale Transduktion von Genmaterial in den Zellkern über ein bis dahin nicht gekanntes Mass zu verbessern (Yolamanova et al Nature Nanotechnology). So konnte z. B. gezeigt werden, dass HI-Viren, welche mit verschiedenen Konzentrationen (1-100 pg/ml) Protransduzin-A (Synonym : EF- C) vorinkubiert wurden, eine um mehrere log-Stufen stärkere Infektionsrate bei Reporterzellen gegenüber dem Goldstandard„Retronectin" aufweisen. Als Wirkmechanismus wurde angenommen, dass EF-C fibrilläre Strukturen ausbildet, die in der Lage sind, Viren zu binden, zu konzentrieren und entprechend den Zelleintritt der Viren zu vervielfachen. EF-C verstärkt neben der Infektion von Viruspartikeln mit hoher Effizienz die Transduction von lentiviralen und retroviralen Partikeln in verschiedensten humanen Zelltypen (T-Zellen, Gliazellen, Fibroblasten, hämatopoietische

Stammzellen), welche in der Gentherapie Anwendung finden (Jan Münch et at. , Nature Nanotechnology, Bd . 8, Nr. 2, S. 130-136). Protransduzin-A ist auch Gegenstand der EP 2 452 947 AI . Cystein rechnet man zu der Gruppe der polaren neutralen Aminosäuren. Weiterhin stellt das Cystein, aufgrund seiner einzigartigen funktionellen Thiolgruppe, eine Aminosäure dar, deren Modifikation oder gar Ersetzung durch eine andere Aminosäure, insbesondere aus einer anderen Gruppe von Aminosäuren nicht in Betracht gezogen wird . Wie Cys werden die Aminosäuren Tyr, Asp, Ser, Gly, Gin, Thr zu der Gruppe der polaren aber neutralen Aminosäuren gerechnet. Von einem Austausch mit Aminosäuren aus anderen Gruppen würde der Fachmann aber zurückschrecken, weil die Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des durch Austausch modifizierten Peptids nicht ohne weiteres abzuschätzen sind. So würde der Fachmann nicht einen Austausch des Cys des Protransduzins gegen Aminosäuren aus der Gruppe der unpolar hydrophoben Aminosäuren in Betracht ziehen.

Überraschenderweise wurde aber gefunden, dass die Aminosäure Cys im Protrans- duzin durch Alanin ersetzt werden kann, ohne dass es zu einer signifikanten Veränderung der Wirksamkeit des modifizierten Polypeptids als Transduktionsenhancer kommt.

Erfindungsgemäß wird ein modifiziertes Protransduzin bereitgestellt, das auf der einen Seite eine vergleichbare Wirksamkeit wie das PTD-A als Transduktionsenhancer besitzt, bei Lagerung stabiler ist und eine einfachere Handhabung bei der Anwendung als Transduktionsenhancer gewährleistet, was einen gravierenden Vorteil für eine GMP Produktion darstellt.

Das erfindungsgemäße Polypeptid weist eine mindestens 80 % oder 90 % Sequenzübereinstimmung, insbesondere 95 % Sequenzübereinstimmung zu der Sequenz Z^Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z ² auf.

Dabei sind Z ¹ jeweils unabhängig voneinander das N-terminale Ende des Polypeptids oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Leu oder Ser oder die folgenden Peptide Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn-Ile-Thr, Thr-Leu, Ile-Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, oder Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu,

Z ² jeweils unabhängig voneinander das C-terminale Ende des Polypeptids darstellen oder unabhängig voneinander die Aminosäuren Gly oder Glu oder die folgenden Peptide Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala- Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu, Glu-Val-Gly- Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Glu-Gly, Ile-Glu-Gly, Pro-Ile-Glu-Gly, Pro- Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Met-Tyr-Ala- Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro- Pro-Ile-Glu-Gly, Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Val-Gly-Lys-Ala-Met- Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, oder Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu- Gly.

Die durch das erfindungsgemäße Polypeptid erzielbare Verbesserung geht mit einer erhöhten Stabilität des Transduktionsenhancers einher, der zu therapeutischen Zwecken eingesetzt werden kann. Eine effiziente Gentransduktion in Zellen zur therapeutischen Anwendung kann z. B. die benötigte Menge an viralen Partikeln, die zur Gentransduktion verwendet werden, reduzieren. Weiterhin kann die Anzahl der Infektionzyklen, die für eine effiziente Transduktion notwendig sind, reduziert werden. Durch das erfindungsgemäße Polypeptid als Transduktionsverstärker kann die Dauer der in vitro Kultivierung zur Vermehrung der genmodifizierten Zellen, die Menge der vom Patienten zu entnehmenden Zellen (z. B. durch Leukapherese) reduziert und ggf. eine effiziente und nicht toxische in vivo Gentransduktion - durch Reduktion der Virusbelastung in vivo - ermöglicht werden. Weiterhin reduziert die schnelle Handhabung eines effizienten Transduktionsverstärkers die Belastung der zu transduzie- renden Zellen.

Das erfindungsgemäße Polypeptid erlaubt aufgrund der besseren Stabilität eine bes- sere Vorhersage der Wirksamkeit als Transduktionsenhencers auch nach längerer Lagerung der Substanz.

Aufgrund der höheren Stabilität erlaubt das erfindungsgemäße Polypeptid im Vergleich zu PTD-A auch die Produktion größerer Peptidchargen, die länger gelagert werden können. Die geringere Reaktivität des erfindungsgemäßen Peptids im Ver- gleich zu PTD-A für zu dessen geringeren zytotoxischen Wirkung . Dies führt bei der Transduktions zu einer besseren Ausbeute an transduzierten Zellen. Insbesondere ist das Polypeptid mit einer mindestens 80 % Sequenzübereinstimmung, insbesondere 90 % Sequenzübereinstimmung zu der Sequenz

Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln

Gegenstand der Erfindung . Erfindungsgemäß werden unter der Bezeichnung erfindungsgemäßes Polypeptid auch solche verwandten Polypeptide verstanden, die durch Variation der Aminosäuren in der Polypeptidkette des erfindungsgemäßen Polypeptids entstehen, aber noch eine vergleichbare und hinreichende Wirksamkeit aufweisen, die sich beispielsweise in folgendem Bioassay bestimmen lässt. Die Transduktionseffizienz kann z. B. unter Verwendung von primären, aktivierten CD4 ⁺ /CD8 ⁺ angereicherten T Zellen, die für 3 Tage mit CD3/CD28 Beats kultiviert werden als Targetzellen und lentiviralen und retroviralen Vektoren, die Green Fluoreszenz Protein (GFP) kodieren, getestet werden. PTD-D kann z. B. gegen PTD-A und Retronektin als Goldstandard der Transduktionsenhencer getestet werden. PTD-A und -D wird in einem Assay z. B. in einer Konzentration von 25 pg/ml eingesetzt. Die Targetzellen werden insbesondere in einer Konzentration von 10 ³ bis 10 ⁶ Zellen/ml eingesetzt. Für 8 bis 16 Stunden wird der Ansatz inkubiert und anschließend werden die Zellen gewaschen. Dann werden die Zellen z. B. für weitere 4 Tage kultiviert. An Tag 7 wird dann der Anteil der GFP ⁺ T-Zellen mittels Durchflusszentri- fugation sowie die Zellzahl und die Vitalität bestimmt.

Ein homologes Polypeptid ist insbesondere ein mit der Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids verwandtes Polypeptid, bei dem im genannten Umfang Austausche oder Deletionen von Aminosäuren vorgenommen wurden. Insbesondere sind Austausche von Aminosäuren, die ähnliche Eigenschaften haben, beispielsweise ähn- liehe Polaritäten, möglich . So sind Austausche von Arginin und Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure, Glutamin, Asparagin und Threonin, Glycin, Alanin und Prolin, Leucin, Isoleucin und Valin, Thyrosin, Phenylalanin und Tryptophan sowie Serin und Threonin weit verbreitet.

In Position 1 der Sequenz findet sich bevorzugt die Aminosäure Glutamin. In Position 3 und 5 finden sich bevorzugt basische Aminosäuren, bevorzugt Lysin. In den Positionen 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, und 12 finden sich zumeist neutrale Aminosäuren. N- und/oder C-terminal kann die Sequenz verlängert oder verkürzt sein. N-terminal kann die Sequenz des Monomers um C-terminale Teile oder die gesamte Aminosäuresequenz N H2-Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu-COOH verlängert sein. C-terminal kann die Sequenz des Monomers um N-terminale Teile oder die gesamte Aminosäuresequenz NH ₂ -Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly-C OOH verlängert sein. Den erfindungsgemäßen Polypeptiden ist gemein, dass sie in wässrigen Lösungen unlösliche Aggregate bilden. Die Monomere bestehen aus 4 bis 25 Aminosäuren, bevorzugt aber aus 10 bis 20 Aminosäuren.

Weiterhin ist den homologen Molekülen gemein, dass sie in wässrigen Lösungen un- löslichen Aggregate bilden und die Transduktion von Targetzellen mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren steigern.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist das N-terminale Ende der das erfindungsgemäße Polypeptid bildenden Aminosäurekette mit einer chemischen Gruppe modifiziert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer oder zwei Alkyl- gruppen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppen, eine Acylgruppe, wie eine Acetyl- oder Propionylgruppe oder der Aminosäure Pyroglutaminsäure, die das N-terminale Ende bildet.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfin- dungsgemäßes Polypeptid .

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Polypeptid zur Verwendung in der Gentherapie zur Behandlung von mit Gentherapie behandelbar Erkrankungen.

Ebenfalls ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus mit den Schritten :

- Bereitstellen des Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2 gelöst in einem organischen Lösungsmittel,

Zugabe des Polypeptids zu einer wässrigen Lösung, unter Bildung von unlösbaren Aggregaten des Polypeptids,

Vermischen der Lösung aus dem vorhergehenden Schritt und Kultivieren von Zellen in Anwesenheit mindestens eines erfindungsgemäßen Polypeptids.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Verstärkung der Infektion einer Zelle mit einem Virus. Eine Zusammenstellung enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann beispielsweise mit der Methode nach Merrifi- eld mit Fmoc geschützten Aminosäuren durchgeführt werden.

Dabei wird mit Fmoc-geschützten Derivaten gearbeitet, also mit (9- fluorenylmethoxycarbonyl) -geschützten Aminosäuren in einer schrittweisen Festphasensynthese nach dem Merrifield-Prinzip, insbesondere auf einem mit Fmoc-L- Glutamin vorbeladenem Wang-Harz (0,59 mmol/g, 100 - 200 mesh) als festem Träger am Synthesizer ABI-433.

Die Aktivierung der Fmoc-L-Aminosäuren, die typischerweise in 10-fachem molaren Überschuss eingesetzt wurden, werden mit [(2-(lH-Benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3- tetramethyluronium-hexafluorophosphat] (HBTU, 100 mmol/1) unter Zusatz von 0.5 M 1-Hydroxy-benzotriazol (HOBt) und 2M Diisopropylethylamin (DIEA) in N-Methyl- 2-pyrrolidinon (NMP) bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Acylierungsreaktionen dauern im einzelnen 45 Minuten, die Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppe mit 20 %igem Piperidin dauert 15 Minuten.

Folgende Aminosäurederivate sowie dazugehörige orthogonal-säurelabile Seitenket- tenschutzgruppen werden zur Synthese eingesetzt:

Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Ala(Trt), L-pGlu, Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Ile, Fmoc-L- Lys(Boc), Fmoc-L-Met und Fmoc-L-Trp(Boc). Nach Abspaltung des Harzträgers vom Peptidylharz mit 94 %iger Trifluoressigsäure (TFA); 3%igem Ethandithiol (EDT) und 3 %igem entmineralisiertem Wasser wird das Rohpeptid in kaltem tert. Butylmethylether ausgefällt, das Rohpeptid als Sediment abzentrifugiert, der Überstand verworfen. Die anschließende chromatographische Aufreinigung des Rohpeptides erfolgt präpe- rativ per Gradientenelution.

Der Unterschied von Protransduzin-A gemäß EP 2 452 947 AI zu Protransduzin-D ist der, dass bei Protransduzin-D erfindungsgemäß Cys2 durch Alanin substituiert ist. Der Unterschied von Protransduzin-B gemäß WO 2014/177635 AI zu Protransduzin- D ist der, dass Protransduzin-D erfindungsgemäß Cys2 durch Alanin substituiert ist und N-terminal im Austausch zum synthetischen L-Glutamin (Gin), die synthetische L-Pyroglutaminsäure (pGlu) eingefügt wird . Das ursprüngliche Glutamin ist dabei durch einen Ringschluss, dem Lactam modifiziert. Beispiel :

Die Transduktionseffizienz wurde an aktivierten CD3+ T Zellen untersucht. Es wurden 5 verschiedene PTD Batche gegen verschiedene Kontrollen und gegen Retro- nektin getestet.

Zur Transduktion wurden kryokonservierte, CD4+/CD8+ angereicherte T-Zellen verwendet. Diese wurden aufgetaut, und für 3 Tage mit CD3/CD28 Beats kultiviert. Nach der Entfernung der Beats nach 3 Tagen wurden die T-Zellen mit einem GFP Vektor, der Mittels der Produzenten Zelllinie HG820#4E912#4.3 gewonnen wurde, transduziert. Es wurden 2 verschiedene MOIs verwendet. Die Zellen wurden dann für weitere 4 Tage kultiviert. An Tag 7 wurde die Zellzahl und die Vitalität der Zellen an einem Nucleo counter NC-200 bestimmt. Der Anteil der GFP+ T-Zellen wurde mittels Durchflusszentrifugation bestimmt.

Prästimulation, Entfernung der Beads, Transduktion, Expansion

Die CD4 ⁺ /CD8 ⁺ T Zellen wurden mit einem Barkey Plasmatherm Gerät an Tag 0 aufgetaut und einmal mit 1 x PBS gewaschen. Die Zellen wurden unter Zugabe von Zellkuturmedium X-vivo 15 + 2 mM Glutamax + 5% CTS„Immune Cell Serum Re- placement" unter Zugabe von 450 IU/ml IL-7 und 50 IU/ml IL-15 bei einer Dichte von 1 X 10 ⁶ viablen Zellen / ml resuspendiert. Zur Aktivierung der Zellen wurden pro Zelle 3 (drei) CD3/CD28 Dynabeads hinzugegeben und bis zum Tag 3 kultiviert.

An Tag 3 wurden die Beats mit einem MixMate von Eppendorf und einem MaxSep Magneten von Baxter entfernt. Nach der Aufkonzentrierung durch Zentrifugation wurden die Zellen mit einem GFP Vektor bei einer Konzentration von MOI 2 oder MOI 4 transduziert. Für die Kontrollen wurde eine Transduktion mit Retronectin und mit Virus ohne Zusatz durchgeführt. Eine nicht-transduzierte Kontrolle wurde als Negativkontrolle verwendet. Die verschiedenen Protransduzin Peptide wurden mit DMSO auf 10 mg/ml gelöst (Stock Lösung). Die Stock Lösung wurden mit 1 x PBS auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt und für mindestens 10 min inkubiert, damit sich PTD Fibrillen ausbilden können. Der virale Überstand wurde mit dem Medium und Serum Replace- ment gemischt, um die notwendige Konzentration zu erhalten. Anschließend wurden die verschiedenen PTDs hinzugegeben, sodass eine Konzentration von 50 pg/ml erhalten wurde. Die Mixtur wurde für eine Minimum von 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen hinzugegeben, sodass eine Zelldichte von 5 x 10 ⁵ Zellen/ml und eine finale PTD Konzentration von 25 μΙ/ml vorhanden war. Die Zellen wurden in 6 - Well Platten bei 37°C, 5% C02 und bei hoher Luftfeuchtigkeit für 16 +/-4 Stunden bis zum Tag 4 inkubiert.

An Tag 4 wurden Zellzahl und Viabilität bestimmt was bei den PTD ^' s verbesserte Ergebnisse gegenüber bisheriger Analoga ergibt. Die Zellen wurden in T-25 Kulturflaschen mit 5 mL Zell Kulturmedium überführt und bei 37°C, 5% C02 und bei hoher Luftfeuchtigkeit inkubiert. An Tag 5 wurden 10 ml frisches Zellkulturmedium hinzugegeben.

An Tag 7 wurde das Volumen des Kulturmediums jeder Kulturflasche bestimmt. Anschließend wurde die Zellzahl, die Viabilität und die Transduktionsrate mittels FACS Analyse bestimmt.

Bestimmen der Zellzahl und der Viabilität

Die Zellzahl und die Viabilität wurde mittels eines NucleoCounter NC-200 unter Verwendung von einmal verwendbaren Vial-Kassetten bestimmt.

Bestimmung der GFP Expression durch Durchflusszytometrie Die Anzahl der GFP ⁺ T-Zellen (CD3 ⁺ ) wurde mittels eines FACSVerse Flow Cytome- ters bestimmt. Zur Messung wurden l,5xl0 ⁶ viable Zellen mit 1 x PBS gewaschen. Nach Zentrifugation wurde das Zellpellet in 300 μΙ 1 x PBS und 3 μΙ FVS780 Lösung aufgenommen. Pro Test wurden zwei FACS Tubes angefärbt: Tube 1 : GFP/FVS 780/ BV421-ungefärbt (FMO Kontrolle für CD3-BV421)

Tube 2 : GFP/FVS 780/ CD3-BV421 [5μΙ]

Je Tube werden 1 x 106 Zellen hinzugefügt und für 15 min bei RT in der Dunkelheit inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen mit Färbepuffer BSA versetzt und zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in 350μΙ Färbepuffer BSA aufgenom- men und innerhalb von 180 min mittels Durchflusszytometrie analysiert. Für die Kalkulation der absoluten Zahl an GFP ⁺ Zellen in einer T-25 Kulturflasche wurden die Ergebnisse gegen die nicht-transduzierte Kontrolle korrigiert.

Sequenzprotokoll

<110> Pharis Biotec GmbH

<120> Protransduzin-D - verbesserter Enhancer des Gentransfers

<130> 182448WO

<150> EP17188384.6

<151> 2017-08-29

<160> 26

<170> Patentin version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> human

<400> 1

Gin Ala Lys Ile Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin

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Ser Asn Asn Ile

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<212> PRT

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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr

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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro

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<213> human

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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro <210> 14

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<212> PRT

<213> human

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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile

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<213> human

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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu <210> 16

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<213> human

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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

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Pro Ile Glu Gly

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Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

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Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly <210> 23

<211 > 10

<212> PRT

<213> human

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<212> PRT

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Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly <210> 25

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<212> PRT

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Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

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<212> PRT

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Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly