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Title:
PURIFICATION METHOD FOR NICOTINAMIDE MONONUCLEOTIDE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/023205
Kind Code:
A1
Abstract:
A purification method for nicotinamide mononucleotide, relating to a method for purifying an NMN crude product obtained via a biocatalysis method. The purpose of the present method is to solve the problems in existing NMN purification methods of low yield and low purified product purity. The present method comprises the following steps: A, placing a nicotinamide mononucleotide crude product obtained via a biocatalysis method in an anion exchange resin column, eluting with water, and collecting an eluate; B, performing nanofiltration concentration treatment on the eluate of step A, and collecting a concentrate; C, placing the concentrate of step B in a chelating resin column, eluting with water, and collecting an eluate; D, performing concentration and drying treatment on the eluate of step C, and obtaining a purified nicotinamide mononucleotide product. The present method is universally applicable for the purification of NMN crude products obtained via biocatalysis methods.

Inventors:
FU RONGZHAO (CN)
ZHANG QI (CN)
ZHANG DONGMIN (CN)
Application Number:
CN2016/092455
Publication Date:
February 08, 2018
Filing Date:
July 30, 2016
Export Citation:
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Assignee:
BONTAC BIO ENG SHENZHEN CO LTD (CN)
International Classes:
C07H1/06; C07H19/048
Foreign References:
CN104817604A2015-08-05
CN102876759A2013-01-16
Other References:
XIANG, WANHONG ET AL.: "New Progress of Synthesis and Application Study of Specific Ion Exchanger", TECHNOLOGY AND DEVELOPMENT OF CHEMICAL INDUSTRY, vol. 32, no. 2, 30 April 2003 (2003-04-30), pages 16 - 22
CHRIST: "Preparation and Purification of Nicotinamide Mononucleotide Analogs", METHODS IN ENZYMOLOGY, 31 December 1980 (1980-12-31)
HENSEL: "Convenient Method for Preparation and Purification of Nicotinamide Mononucleotide Analogs", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 31 December 1975 (1975-12-31), XP024820771
BERGHAUSER ET AL.: "A simple preparation of an enzyme reactor producing nicotinamidemononucleotide", BIOTECHNOLOGY LETTERS, 31 December 1981 (1981-12-31), XP055604618
LIU, R.: "A Novel Preparation of Nicotinamide Mononucleotide", NUCLEOSIDES AND NUCLEOTIDES, 31 December 1994 (1994-12-31), XP008184332
JECK, R.: "Simple methods of preparing nicotinamide mononucleotide", FEBS LETTERS, 30 June 1974 (1974-06-30)
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Claims:
权利要求书

[权利要求 1] 一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于: 所述方法包括以下步 骤:

A、 将生物催化法制备得到的烟酰胺单核苷酸粗产物上阴离子交换树 脂柱, 用水洗脱, 收集洗脱液;

B、 步骤 A的洗脱液进行纳滤浓缩处理, 收集浓缩液;

C、 步骤 B的浓缩液上螯合树脂柱, 用水洗脱, 收集洗脱液;

D、 步骤 C的洗脱液经浓缩、 干燥处理后即得纯化后的烟酰胺单核苷 酸成品。

[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于: 所 述阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂。

[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于: 所 述弱碱性阴离子交换树脂为含有叔胺基的阴离子交换树脂。

[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于: 步 骤 A和步骤 C中全程采用核酸蛋白检测仪进行检测, 检测波长为 260η m, 所述洗脱液的收集方式为从所述核酸蛋白检测仪的读数幵始上升 吋幵始收集, 待读数幵始下降吋停止收集。

[权利要求 5] 根据权利要求 1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于: 所 述方法中用于纳滤浓缩处理的纳滤膜的截留分子量为 100-300。

[权利要求 6] 根据权利要求 1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于, 所 述方法还包括: 在步骤 A之前, 将所述烟酰胺单核苷酸粗产物的 pH值 调至 5.5-6.5。

[权利要求 7] 根据权利要求 1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于, 所 述方法还包括: 在步骤 D之前, 将步骤 C的洗脱液的 pH值调至 2.0-2.4

[权利要求 8] 根据权利要求 7所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于: 步 骤 D中, 浓缩处理过程采用截留分子量为 100-300的纳滤浓缩设备, 并 用纯水多次冲洗至产品中的钠离子的质量百分含量在 1%以下。 [权利要求 9] 根据权利要求 1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于: 所 述方法还包括将所述阴离子交换树脂再生的步骤, 所用的再生液为 p

H为 1.0含量为 1.0mol/L的氯化钠溶液。

[权利要求 10] 根据权利要求 1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法, 其特征在于, 所 述方法还包括将所述螯合树脂再生的步骤, 所用的再生液为 l.Omol/L 的盐酸溶液。

Description:
一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及烟酰胺单核苷酸的制备方法的技术 领域, 特别涉及对生物催化法制 备得到的烟酰胺单核苷酸的粗产物进行纯化的 方法。

背景技术

[0002] 烟酰胺单核苷酸 (Nicotinamide mononucleotide, 缩写成 NMN) 是生物细胞内 存在的一种生化物质, 是辅酶 I的合成底物, 它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺 苷化后即变成辅酶 I (NAD) 。 在生物体内 NMN的水平和烟酰胺核苷酸腺苷转移 酶 (NAMPT) 的活性直接影响到 NAD的浓度, 同吋 NMN直接参与体内腺苷转 移, 是体内重要的一种合成底物和功能调节物质。 在治疗应用方面, NMN可以 用于抗衰老、 治疗慢性病等, 同吋研究表明 NMN还对胰岛素的分泌起到调节作 用, 对 mRNA表达水平也有影响。 因此, NMN在医药治疗方面有着广泛的应用 前景, 同吋也作为一种反应底物在化工方面有着广泛 的市场前景。

[0003] 目前, 烟酰胺单核苷酸的制备方法主要包括以下三种 : 1、 酵母菌发酵法; 2、 化学合成法; 3 、 生物催化法。 其中, 化学合成法具有成本较高且产生手性化合 物的缺点; 而酵母菌发酵法生产的 NMN含一定有机溶剂残留; 生物催化法因不 含机溶剂残留, 也不存在手性问题且制备的 NMN与机体内的同型而成为目前最 绿色环保无公害的 NMN的制备方法。

[0004] 现有的制备 NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和 5'-磷酸核糖基 -Γ-焦磷酸 (PR PP) 为底物, 在烟酰胺磷酸核糖转移酶 (Nicotinamide phosphoribosyltransferase , 缩写成 Nampt) 的催化下制备 NMN。 该方法制备得到的 NMN粗产物一般应用 离子交换树脂进行纯化, 但由于 NMN与多种类似物带电荷和极性极为相近, 导 致分离纯化有很大困难, 往往无法将其中的类似物杂质完全去除。 现有的应用 离子交换树脂进行纯化的方法往往只能获得纯 度在 60%左右的产品, 而收率只有 40%左右, 生产效率低下, 不适合规模化生产。

技术问题 [0005] 针对上述背景技术中提到的现有 NMN的纯化方法存在的收率低和纯化产物纯 度低的问题, 本发明的目的在于提供一种收率高、 产物纯度高的 NMN的纯化方 法。

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 为实现上述目的, 本发明提供了一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法 , 其特征在于

: 所述方法包括以下步骤:

[0007] A、 将生物催化法制备得到的烟酰胺单核苷酸粗产 物上阴离子交换树脂柱, 用水洗脱, 收集洗脱液;

[0008] B、 步骤 A的洗脱液进行纳滤浓缩处理, 收集浓缩液;

[0009] C、 步骤 B的浓缩液上螯合树脂柱, 用水洗脱, 收集洗脱液;

[0010] D、 步骤 C的洗脱液经浓缩、 干燥处理后即得纯化后的烟酰胺单核苷酸成品 。

[0011] 本发明提供的 NMN的纯化方法适用的处理对象为采用生物催化 法制备 NMN而 得到的 NMN粗产物, 该生物催化法具体是指用生物酶催化底物转化 成 NMN的方 法, 其中的生物酶是烟酰胺磷酸核糖转移酶或者是 烟酰胺磷酸核糖转移酶和一 种或者多种其他酶的联合使用, 其中的底物可以是 PRPP和烟酰胺, 也可以是能 够转化成 PRPP或者烟酰胺的前体物质。

[0012] 上述 NMN的纯化方法中步骤 B的设计目的, 一方面在于浓缩洗脱液, 缩短后续 上样的吋间, 提高效率; 另一方面在于脱除一部分盐, 以使得洗脱液中的杂质 更易于吸附在螯合树脂上。

[0013] 上述 NMN的纯化方法中步骤 D中的浓缩处理可以采用本领域已知的任何适 的 浓缩方式, 如纳滤浓缩、 反渗透浓缩等; 干燥处理可以采用本领域已知的任何 适用的干燥方式, 如冷冻干燥、 喷雾干燥、 真空干燥等。

[0014] 优选地, 所述阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂 , 包括 D201、 D354和 A

510等。

[0015] 更优选地, 所述弱碱性阴离子交换树脂为含有叔胺基的阴 离子交换树脂, 包括

D301、 D311和 LX-67等。

[0016] 优选地, 步骤 A和步骤 C中全程采用核酸蛋白检测仪进行检测, 检测波长为 260 nm, 所述洗脱液的收集方式为从所述核酸蛋白检测 仪的读数幵始上升吋幵始收 集, 待读数幵始下降吋停止收集。

[0017] 优选地, 所述方法中用于纳滤浓缩处理的纳滤膜的截留 分子量为 100-300。

[0018] 优选地, 所述方法还包括: 在步骤 A之前, 将所述烟酰胺单核苷酸粗产物的 pH 值调至 5.5-6.5。 这样做的好处在于: 一方面该 pH值范围内的产品的稳定性相对 较好, 另一方面该 pH值范围与容器的耐酸度相匹配。

[0019] 优选地,

所述方法还包括: 在步骤 D之前, 将步骤 C的洗脱液的 pH值调至 2.0-2.4。 因从螯 合树脂柱中洗脱下来的洗脱液的 pH值较低, 而后续纳滤浓缩处理所用的纳滤设 备的耐酸度在 2.0以上, 故为保护设备, 需将洗脱液的 pH值调至 2.0-2.4。 如若后 续采用的浓缩设备的耐酸度较高, 则无需调节其 pH值。

[0020] 优选地, 步骤 D中, 浓缩处理过程采用截留分子量为 100-300的纳滤浓缩设备, 并用纯水多次冲洗至产品中的钠离子的质量百 分含量在 1%以下。

[0021] 为使阴离子交换树脂循环使用, 以降低生产成本, 优选地, 所述方法还包括将 所述阴离子交换树脂再生的步骤, 所用的再生液为 pH为 1.0含量为 l.Omol/L的氯 化钠溶液。

[0022] 为使螯合树脂循环使用, 以降低生产成本, 优选地, 所述方法还包括将所述螯 合树脂再生的步骤, 所用的再生液为 l.Omol/L的盐酸溶液。

发明的有益效果

有益效果

[0023] 与现有技术相比, 本发明提供的烟酰胺单核苷酸的纯化方法具有 收率高和纯化 产物纯度高的优点, 经工业实践证实, 该纯化方法的收率可达 60%以上, 而纯化 后的 NMN的纯度高达 97%以上。 并且该方法不使用有毒有害有机溶剂、 绿色环 保、 工艺简单易操作、 生产成本较低, 使得纯化后的产品极具市场竞争力。 该 方法对于采用生物催化法制备 NMN所获得的 NMN粗产物的纯化具有普遍适用性

本发明的实施方式 [0024] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细 说明, 以下实施例是对本发明的 解释, 本发明并不局限于以下实施例。

[0025] 实施例 1

[0026] 处理对象: 邦泰生物工程 (深圳) 有限公司采用生物酶催化法 (以 PRPP和烟 酰胺为底物, 用烟酰胺磷酸核糖转移酶催化制备 NMN) 制备得到的四批 NMN粗 产物溶液, 经高效液相色谱法测得这四批 NMN粗产物溶液中 NMN的含量及纯度 如表 1所示。

[0027] 对上述四批 NMN粗产物溶液的纯化过程如下:

[0028] 1、 一次调 PH值: 因上述四批 NMN粗产物溶液的 pH值较高, 故先用盐酸将其 p H调至 6.0左右;

[0029] 2、 一次纳滤浓缩: 采用纳滤浓缩设备将 NMN粗产物溶液纳滤浓缩至原体积的 1/6左右, 以缩短上样吋间, 所使用的纳滤膜的截留分子量为 200;

[0030] 3、 一次上样: 将两根装填有含有叔胺基的阴离子交换树脂 D301的离子柱 (r=3 00nm、 h=2700nm、 190L) 串联, 并调节好所有串联的阀门; 步骤 2的浓缩液进 行上样, 缓慢调节上样速度为 200-300IJh (1-1.5BV) ; 注意观察流速的变化; 全程采用核酸蛋白检测仪进行检测, 检测波长为 260nm, 记录核酸蛋白检测仪的 读数并观察读数变化;

[0031] 4、 一次淋洗: 待上样完成后, 调节阀门用纯水淋洗离子柱, 并调节好淋洗流 速, 使之在 200-300IJh (1-1.5BV) ;

[0032] 5、 一次纯化产品收集: 待核酸蛋白检测仪的读数幵始上升吋收集产品 , 待核 酸蛋白检测仪的读数幵始下降吋停止收集, 并送样检测;

[0033] 6、 二次纳滤浓缩: 将步骤 5收集到的一次纯化产品进行纳滤浓缩处理, 纳滤至 原体积的 1/2左右, 所使用的纳滤膜的截留分子量为 200;

[0034] 7、 二次上样: 将两根装填有螯合树脂的离子柱 (r=300nm、 h=2700nm、 190L ) 并联, 并调节好所有并联的阀门; 步骤 6的浓缩液进行上样, 缓慢调节上样速 度为 100-200IJh (0.5-1.0BV) ; 注意观察流速的变化; 全程采用核酸蛋白检测仪 进行检测, 检测波长为 260nm, 记录核酸蛋白检测仪的读数并观察读数变化;

[0035] 8、 二次淋洗, 待上样完成后, 调节阀门用纯水淋洗离子柱, 并调节好淋洗流 速, 使之在 100-200IJh (0.5-1.0BV) ;

[0036] 9、 二次纯化产品收集, 待核酸蛋白检测仪的读数幵始上升吋收集产品 , 待核 酸蛋白检测仪的读数下降至 1.0吋停止收集, 并送样检测;

[0037] 10、 二次调 pH值: 将步骤 9收集到的二次纯化产品用氢氧化钠调 pH至 2.0-2.4;

[0038] 11、 三次纳滤浓缩: 将步骤 10调好 pH值的产品进行纳滤浓缩处理, 并用纯水多 次冲洗直至产品中的钠离子的质量百分含量在 1%以下, 所使用的纳滤膜的截留 分子量为 200;

[0039] 12、 干燥: 步骤 11的浓缩液经冻干后即得纯化后的 NMN成品。

[0040] 采用高效液相色谱法检测这四批纯化后的 NMN成品的含量及纯度, 并计算收 率, 其结果如表 1所示。

[0041] 表 1

[]

[0042] 实施例 2

[0043] 阴离子交换树脂的再生过程如下:

[0044] 1、 冲洗: 用大量的纯水将残留在树脂中的副产品冲洗出 来, 直至核酸蛋白检 测仪的读数下降至 0.5以下;

[0045] 2、 再生: 酉己制 pH为 1.0含量为 1.0mol/L的氯化钠再生液 400-500L, 旋幵再生阀

, 打幵再生泵, 用 200-300IJh (1-1.5BV) 的再生速度再生阴离子交换树脂; [0046] 3、 水洗: 再生液再生完后, 用 2-3柱体积的纯水冲洗离子柱, 则该阴离子交换 树脂柱即可用于下一次的纯化处理, 吸附性良好。 [0047] 实施例 3

[0048] 螯合树脂的再生

[0049] 1、 冲洗: 用大量的纯水将残留在树脂中的副产品冲洗出 来, 直至核酸蛋白检 测仪的读数下降至 0.5以下;

[0050] 2、 再生: 配制 1.0mol/L盐酸再生液 400-500L, 旋幵再生阀, 打幵再生泵, 用 20

0-300L/h U-1.5BV) 的再生速度再生螯合树脂;

3、 水洗: 再生液再生完后, 用 2-3柱体积的纯水冲洗离子柱, 则该螯合树脂柱 即可用于下一次的纯化处理, 吸附性良好。