Les puroindolines sont des protéines présentes dans le grain de nombreuses espèces de céréales des tribus Triticeae et Aveneae. Elles ont été initialement isolées à partir de Triticum aestivum (BLOCHET et al., FEBS Lett, 329, 336-40,1993).

Deux protéines, respectivement dénommées puroindoline-a et puroindoline-b, et présentant entre elles environ 55% d'identité ont été caractérisées chez T. aestivum (GAUTIER et al., Plant. Mol. Biol., 25,43-57, 1994). Il s'agit de protéines basiques (pI-10), de faible poids moléculaire (13 kDa environ), qui comprennent 10 résidus cystéine, formant 5 ponts disulfures, et un domaine riche en résidus tryptophane.

Les études effectuées sur l'expression des gènes de puroindolines ont montré que celle-ci était limitée aux grains. GAUTIER et al. (1994, précité) ont ainsi observé que l'accumulation des transcrits des gènes PinA et PinB n'était détectée que dans les grains et qu'elle était régulée au cours de leur maturation. DUBREIL et al. (Plant. Science, 138, 121- 135, 1998) ont rapporté que la puroindoline-b est présente à la fois dans l'albumen amylacé et la couche à aleurone, et la puroindoline-a uniquement dans l'albumen.

DIGEON et al, (Plant. Mol. Biol., 39,1101-1112, 1999) ont analysé le profil d'expression du gène rapporteur uidA (GUS) sous le contrôle du promoteur du gène PinB ou de fragments de celui-ci, dans des riz transgéniques. Ils ont montré que dans tous les cas, l'expression intervenait uniquement dans le grain ; lorsque le promoteur complet (1068 pb) ou un fragment de 388 pb de celui-ci étaient utilisés, l'expression du gène uidA était localisée dans l'albumen, la couche à aleurone et l'épiderme des grains ; dans le cas d'un fragment plus court (210 pb), l'expression était limitée à l'épithélium du scutellum.

LILLEMO et al. (Euphytica., 126,321-331, 2002) ont comparé les séquences des gènes PinA et PinB du blé hexaploïde T. aestivum et de blés ancestraux diploïdes (T. urartu, T. monococcum, A. speltoides, A. tauschii) qui codent également pour ces puroindolines. Ils ont observé de très fortes homologies de séquences (>95%) des promoteurs pinA entre eux, et des promoteurs pinB entre eux, et une homologie plus faible, mais demeurant toutefois importante, entre le promoteur PinA et le promoteur PinB de T. aestivum (78, 4% sur les 400 pb en amont du codon d'initiation de la traduction, 54,8% sur les 400 pb suivantes. Ils ont également identifié des éléments régulateurs putatifs associés à la spécificité d'expression dans le grain, communs aux promoteurs PinA et PinB.

Les Inventeurs ont maintenant isolé le promoteur du gène pinA de Triticum aestivum, et ont exprimé le gène rapporteur uidA (GUS) dans des riz transgéniques sous contrôle de ce promoteur.

Ils ont alors constaté que, contrairement à ce qui était attendu au vu des résultats rapportés dans l'art antérieur, l'expression du gène rapporteur n'était pas limitée au grain, mais qu'elle intervenait également dans les organes végétatifs aériens et racinaires ainsi que dans les fleurs.

Ils ont également constaté que l'expression observée dans le grain était régulée au cours du développement. Ils ont en outre observé, de manière inattendue, une expression inductible par un stress (tel qu'une blessure ou une attaque par un pathogène), se manifestant principalement au niveau des organes végétatifs et des hampes florales, et semblant également décelable, dans une moindre mesure, au niveau du grain.

Ils ont localisé la portion du promoteur pinA essentielle à l'obtention de ce profil d'expression dans la région-390/-214 du gène PinA de Triticum aestivum (les positions sont définies par rapport au codon d'initiation de la traduction). En analysant cette région du promoteur, les Inventeurs ont identifié des éléments putatifs de régulation par blessure, et notamment une boîte de type WUN (PASTUGLIA et

al., Plant. Cell., 9,49-60, 1997), une boîte de type : « boîte de réponse au jasmonate de méthyle » (ROUSTER et al (Plant. J., 11, 513-23, 1997), et deux boîtes de type « boîte de réponse à l'acide salicylique » (boîte TCA ; PASTUGLIA et al., précité).

La région-390/-1 du gène PinA de Triticum aestivum est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 ; la région-390/-215 dudit gène est représentée sous le numéro SEQ ID NO : 2.

La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé utilisable pour la construction d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale, lequel polynucléotide est caractérisé en ce que : - il possède au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, ou avec un fragment de celle-ci comprenant au moins la séquence SEQ ID NO : 2 ; - il contient une boîte WUN comprenant la séquence TAATTTCCT, une boîte TCA comprenant la séquence TAGAAAAATA, une boîte TCA comprenant la séquence CGAAAAAGCA et une boîte de réponse au jasmonate de méthyle, comprenant un motif de séquence TGACG/GCAGT.

Ledit polynucléotide est utilisable notamment pour la construction d'un promoteur inductible par une blessure ou par une infection par un pathogène.

Avantageusement, ledit polynucléotide peut en outre contenir un ou plusieurs des motifs suivants : - un motif de séquence TTACTTAT, - un motif de séquence TGACG, - un motif de séquence CAACA, - un motif de séquence AAAG, - un motif de séquence AACA, - un motif de séquence GATGACG et - un motif de séquence GTCAT.

Selon un mode de réalisation préféré d'un polynucléotide conforme à l'invention, il présente au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 (-390/-193), et contient une boîte TCA comprenant la séquence GAGAAAAGGT.

Un polynucléotide conforme à l'invention peut facilement être obtenu par l'homme du métier à partir du promoteur du gène PinA d'une Triticeae ou d'une Aveneae possédant ce gène (cf. par exemple GAUTIER et al., Plant.

Science., 153,81-91, 2000).

A titre d'exemples non limitatifs, un polynucléotide conforme à l'invention peut être isolé à partir des séquences en amont de l'ATG du gene pinA de Triticum / aestivum décrites ci-après dans l'exposé de la présente invention, ou disponibles dans les bases de données (AJ302091), ainsi qu'à partir des séquences correspondantes d'autres espèces de blés, également accessibles dans les bases de données (Triticum monococcum, AJ302092 et AJ302093 ; Triticum urartu, AJ302094 et AJ302095 ; Aegilops speltoides, AJ302096 et AJ302097 ; Aegilops tauschii, AJ302098 et AJ302099).

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un promoteur comprenant un polynucléotide conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus, pour induire chez une plante l'expression d'un gène hétérologue placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, en réponse à une blessure ou à une infection par un pathogène.

On peut utiliser, conformément à l'invention, le promoteur naturel d'un gène PinA.

On peut également utiliser un promoteur chimérique, dans lequel un polynucléotide conforme à l'invention est associé à un promoteur minimal, et le cas échéant à des éléments de régulation en cis de la transcription autres que ceux du promoteur naturel PinA.

La construction de promoteurs chimériques fonctionnels chez les plantes est connue en elle-même ; on associe un promoteur minimal avec des éléments hétérologues de

régulation, choisis en fonction des caractéristiques d'expression (spécificité, inductibilité, niveau d'expression) que l'on souhaite obtenir. Un promoteur minimal comprend au moins les séquences permettant la fixation de l'ARN polymérase et l'initiation de la transcription. Par exemple, un promoteur minimal pour la transcription par la polymérase II comprend, généralement, outre un site d'initiation de la transcription, au moins une boite TATA située à environ 20 à 40pb en amont du site d'initiation de la transcription, et/ou au moins un élément INR (INitiatoR) localisé au niveau du site d'initiation de la transcription.

La construction de promoteurs chimériques fonctionnels chez les plantes, par association d'un promoteur minimal avec divers éléments de régulation en cis est décrite par exemple dans le Brevet US 6555673, ou bien dans les publications de RUSHTON et al (Plant. Cell., 14,749-762, 2002) ou de BHULLAR et al (Plant. Physiology., 132,988-998, 2003).

La présente invention englobe également un promoteur chimérique fonctionnel dans une cellule végétale, contenant un promoteur minimal associé à des éléments hétérologues de régulation en cis de la transcription, caractérisé en ce que lesdits éléments de régulation en cis comprennent un polynucléotide conforme à l'invention.

La présente invention a également pour objet une cassette d'expression recombinante comprenant un promoteur contenant un polynucléotide conforme à l'invention, et un gène hétérologue d'intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.

Avantageusement, ledit gène hétérologue d'intérêt est un gène impliqué dans un mécanisme de défense chez les plantes. A titre d'exemples, on citera : des gènes de résistance (R),, dont les produits sont impliqués dans la réponse gène pour gène (spécifique d'un couple plante/pathogène), par interaction spécifique avec le produit du gène d'avirulence (avr) correspondant du pathogène concerné ; des gènes codant pour des protéines de défense à spectre plus large (protéines PR pour « Pathogenesis

Related », telles que les défensines, les thionines, les protéines de transfert de lipides (LTP), les chitinases, les protéines thaumatine-like, etc Il est également possible de placer sous le contrôle d'un promoteur contenant un polynucléotide conforme à l'invention un gène dont on veut évaluer le bénéfice pour la plante consécutivement à une infection par un parasite ou à une blessure mécanique.

L'invention englobe également : - les vecteurs recombinants résultant de l'insertion d'un promoteur ou d'une cassette d'expression conforme à l'invention dans un vecteur hôte, - les cellules végétales et les plantes transgéniques, en particulier des monocotylédones, et notamment des céréales, telles que le riz, le blé, le maïs, l'orge, l'avoine, le sorgho, transformées par une cassette d'expression ou un vecteur recombinant conforme à l'invention.

Les inventeurs ont par exemple obtenu des plants de riz transgéniques, dans lesquels un gène hétérologue a été placé sous contrôle transcriptionnel de la région-390/-1 du promoteur et ont observé une expression spécifique de ce gène en réponse à une blessure mécanique chez ces plantes ; en revanche cette expression n'a pas été détectée dans les plantes où le gène hétérologue a été placé sous contrôle de la région-214/-1 du promoteur du gène PinA.

En outre, les Inventeurs ont également constaté qu'un gène rapporteurplacé sous le contrôle du fragment-214/- 1 du promoteur du gène PinA était exprimé spécifiquement dans les grains de pollen, et que cette expression n'était plus observée lorsque le gène rapporteur était placé sous contrôle du fragment-136/-1. L'analyse du fragment-214/-137 a permis aux inventeurs d'identifier les éléments putatifs d'expression au niveau des grains de pollen, et notamment la séquence AGGTCA (Hamilton et al., Plant. Mol. Biol., 38,663-9, 1998) et les séquences AGAAA et TCCACCAGT (BATE and TWELL, Plant.

Mol. Biol., 37,859-869, 1998).

La région-214/-137 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4.

La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé utilisable pour la construction d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale, lequel polynucléotide est caractérisé en ce que : - il possède au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 4 ; - il contient un motif de séquence AGGTCA, un motif de séquence de séquence AGAAA et un motif de séquence TCCACCAGT.

Ledit polynucléotide est utilisable notamment pour la construction d'un promoteur permettant l'expression d'un gène hétérologue au niveau des grains de pollen.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'obtention du promoteur du gène pinA, et son utilisation pour exprimer un gène hétérologue dans des tissus végétaux en réponse à une blessure (ou à une infection par un agent pathogène).

EXEMPLE 1 : ISOLEMENT ET CLONAGE DU PROMOTEUR DU GENE PINA Une fragment d'ADN de 1232 pb en amont du site d'initiation de la traduction du gène pinta a été obtenu à partir d'une banque d'ADN génomique de feuilles de Triticum aestivum. La séquence de ce fragment (SEQ ID NO 5) est représentée sur la Figure 1. Le site d'initiation de la traduction et le codon initiateur sont indiqués par une flèche et par un codon ATG en gras respectivement.

Une partie de cette séquence est identique à un fragment de 875 pb, correspondant également à la séquence en amont de l'ATG du gène PinA chez T. aestivum, décrit par LILLEMO et al (précité ; numéro d'accession AJ302091). Cette séquence présente également une identité importante avec les séquences promotrices du gène pinA déterminées chez d'autres espèces de blés.

La Figure 2 montre le résultat de l'alignement du promoteur du gène PinA de T. aestivum avec les séquences homologues publiées pour ces autres espèces de blés (Triticum

monococcum AJ302093, Triticum urartu AJ302095, Aegilops speltoides AJ302096, Aegilops tauschii AJ302098).

Les séquences identiques sont représentées en grisé.

Le tableau I résume les pourcentages d'identités observés.

Tableau I Espèce Numéro Séquence en Identité avec d'accession amont de l'ATG T. aestivum A. speltoides AJ302096 1000 pb (SEQ ID NO : 6) 79 % A. tauschíi AJ 302098 894 pb (SEQ ID NO : 7) 90 % T. uraffu AJ 302095 873 pb (SEQ ID NO : 8) 86 % T. monococcum AJ302093 957 pb (SEQ ID NO 9) 88% Les résultats montrent une bonne conservation des séquences promotrices du gène pinta entre les espèces, avec un pourcentage d'identité toujours supérieur à 75 %. La séquence promotrice du gène pinA de T. aestivum présente 90% d'identité avec celle de A. tauschii ce qui est en accord avec le fait que cette espèce serait le donneur du génome D des blés tendres.

Toutefois, il existe 4 différences majeures entre les différentes séquences étudiées (cf. figure 2). Les deux premières concernent des insertions de séquences dans les promoteurs des gènes PinA de T. urartu et T. monococcum [- 104/-125 (T. urartu et T. monococcum) ;-416/-446 (T. urartu) ; -416/-448 (T. monococcum)]. La séquence de T. aestivum présente une séquence répétée de type microsatellite (-496/-528) plus longue que celle des promoteurs des autres espèces. Enfin, une insertion de séquence de 72 pb est présente uniquement chez A. speltoides (-643/-725).

EXEMPLE 2 : ANALYSE STRUCTURELLE DU PROMOTEUR DU GENE PINA Une recherche d'homologie est effectuée entre les séquences promotrices des gènes PinA et PinB (AJ000548, SEQ ID NO : 10).

L'alignement entre ces deux séquences est illustré dans la figure 3.

Les codons d'initiation de la traduction pour les deux gènes sont représentés en gras. Les séquences qui sont identiques entre les deux promoteurs sont représentées en

grisé. Les boîtes TATA, CAAT et P-box putatives sont encadrées.

Les résultats révèlent une identité de 48 % entre ces deux séquences, qui passe à 66% lorsqu'on se limite aux 400 pb en amont de l'ATG.

Une analyse plus fine de cet alignement montre que les boîtes TATA putatives sont parfaitement conservées (position-63). En revanche, la boîte CAAT putative (position zu du promoteur du gène PinB (DIGEON et al., précité) ne semble pas conservée pour PinA. Une boîte CAAT putative orientée dans le sens inverse a été suggérée pour le gène PinA (position-120) par LILLEMO et al. (précité).

Dans le but d'identifier les éléments de régulation du gène pinA, les inventeurs ont effectué une recherche des séquences putatives de régulation présentes dans sa séquence promotrice. Dans cette analyse, seules les séquences présentant des identités supérieures à 80 % ont été considérées comme significatives.

Le tableau II synthétise les résultats de ces analyses in silico.

Ces analyses mettent en évidence un nombre important de séquences associées à une expression au niveau du grain. Les inventeurs ont ainsi identifié des séquences potentiellement associées à une expression au niveau de l'albumen (boîtes 02, Skn-1-like et P-box) et plus spécifiquement au cours de la germination du grain (boîtes A- box et TATC-box).

En outre, des séquences potentiellement impliquées dans une expression en réponse à un stress (boîte WUN, boîte de réponse au jasmonate de méthyle TGACG/CGTCA et boîte de réponse à l'acide salicylique TCA), à la lumière (boîtes GAG, GT1, I-box et chs-unit), à l'auxine (Aux-RE), ou à l'éthylène (PERE) ont également été identifiées.

Tableau II Motif Séquence pinta Espèce Gène Réponse Référence Nom consensus TATCCATCCAT TATCCAGCTAT A-Box (SEQ ID NO : Oryza sativa a-amylase germination KIM etal., 1992, Mol. Gen. Genet, vol. 232, p383-93. 11) Hordeum Lipoxygen jasmonate GCAGT TGACG/GCAGT CGTCA/TGACG Hordeum Lse de mjthyle ROUSTER et al., 1997, Plant. J., vo1. 11, p513-23. vulgare ase de méthyle G-Box CACGTG CACCTG Zea mays Bronze2 pigmentatio BODEAU and WALBOT, 1996, Plant. Mol. Biol., vol. 3, n p599-609. 02 GATGAPyPuTGPu GATGACGATA Zea mays Zéine albumen LOHMER etal., 1991, EMBO. J, vol. 10, p617-24. CCTTTTG CCTTTTC Oryza sativa Glutéline albumen WASHIDA et ai., 1999, Plant. Mol. Biol., vo1. 40, p1-12. P-bOX TGAGAA. A. AG TGAGAAAAG Zea mays Zeine albumen MOTTO et al., 1989, Oxford. Surv. Plant. Mol. Cell. Biol., viol. 6, p87-114. TATC-box TATCCCA TATCTCA/TATCCAC Oryza sativa a-amylase germination ROGERS etal., 1994, Plant. Physiol., vol. 105 (1), p151-8. Skn-1-like GTCAT GTCAT Oryza sativa Glutéline albumen WASHIDA et al., 1999, Plant. Mol. Biol., vol. 40, p1-12. CGAAAAAGCA CAGAAAAGGA (SEQ ID NO 14) (SET ID NO : GAGAA. AAGGT Brassica Récepteur acide 13) (SE ID NO : 15) oieracea kinase salicylique - (SEQIDNO : 15) o/eracea ktnase sa) ! cy ! ique' TAGAAAAATA (SEQ ID NO : 16) WUN TAATTTCCT TAATTTCCT Brassica Récepteur blessure PASTUGLIA et al., 1997, Plant. Ce//., vol. 9, p49-60. oleracea kinase GAG GGAGATG GGAGATG Hordeum Rubisco lumière ARGUELLO-ASTORGA et al., 1996, Plant. Physio., vulgare vol. 112 p1151-66. GT1 GGTTAAT GGTTTAT Avena PhyA lumière BRUCE etal., 1991, EMBO. J., vol. 10, p3015-24. sativa !-box AGATAAGG AGATGAGG Triticum rbcS1 lumière ARGUELLO-ASTORGA et a/., 1996, Plant Physio., aestivum vol. 112, p1151-66. chsunit TTACTTAT TTACTTAT Daucus chs2 lumière ARGUELLO-ASTORGAeta/., 1996, Plant. Physio., carota vo1. 112, p1151-66. Aux-RE TGACG TGACG diverses divers auxine BENFEY et al., 1990, EMBO. J., vol. 9, p1685-96. PERE TTCAAAT TTCAAAG Oryza sativa OsEBP-89 éthylène YANG, et a/., 2002, Plant. Mol. Biol., vol. 50, p379-91. AP2 et B3 CACCTG CACCTG Arabidopsis divers divers KAGAYA et al.., 1999, Nucleic. Acid. Res., vol. 27, p470-8 like CAACA CAACA thaliana DOF AAAG AAAG diverses Divers Divers YANAGISAWA et al., Plant J., vol. 17, p209-14 Zn finger AGT (X) nAGT AGT (X) 15AGT diverses divers divers TAKATSUJI et al., 1999, Plant. Mol. Biol., vol. 39, p1073-8

EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION DE PLANTES TRANSGENIQUES EXPRIMANT UN GENE RAPPORTEUR SOUS LE CONTROLE DE DIFFERENTS FRAGMENTS DE LA REGION 5'DU GENE PINA : 1. Construction des vecteurs d'expression : Différents fragments de la région 5'du gène pinA sont amplifiés par PCR à partir d'ADN génomique de Triticum aestivum et à l'aide de la polymérase Pfu (PROMEGA) selon le protocole préconisé par le fournisseur. Les produits d'amplification sont ensuite clonés, après une double digestion enzymatique EcoRI/Sall, dans le vecteur pCAMBIA 1381Xb (CAMBIA) en amont de la séquence codante uidA (GUS) codant pour la P-glucuronidase (JEFFERSON, Ann. N Y Acad.

Sci., 700,53-73, 1993).

A titre de témoin d'expression positif, une séquence de 1067 pb en 5'de l'ATG du gène pins est clonée selon le même protocole dans le vecteur pCAMBIA 1381Xb (CAMBIA). Le profil d'expression de ce fragment de promoteur chez le riz est décrit dans DIGEON et al. (précité). Enfin, le vecteur pCAMBIA 1381Xb a été utilisé comme témoin négatif.

La position des amorces utilisées pour cloner les différents fragments des régions 5'du gène pinA et du gène PinB est indiquée dans la figure 3 par des triangles noirs et gris respectivement. La liste des différentes constructions réalisées et la séquence des amorces correspondantes sont indiquées dans le tableau III ci-après.

Ces différentes constructions sont ensuite transférées dans des bactéries de la souche EHA105 d'Agrobacterium tumefaciens (HOOD et al., Trans. Res., 2, 208-218,1993 ; HELLENS et al., Annu. Rev. Biochem., 59,933- 69,2000).

Tableau 111 Construction Séquence en Amorces Amont de l'ATG utilisées ppal-a : (SEQ ID NO : 17) pinA-A1214 1214 pb 5'-GTTTGAATTCTGATCTGCATGACTGTGTGC-3' IpuroA : (SEQ ID NO : 18) 5'-GTCGACCATGTTGTCAGTGTGTTTTGG-3' ppa2 : (SEQ ID NO : 19) pinA-A390 390 pb 5'-TCTAGAGAATTCACGAAAAAGCAGTGGCTAGAAAGA-3' IpuroA : (SEQ ID NO : 18) 5'-GTCGACCATGTTGTCAGTGTGTTTTGG-3' ppa3 : (SEQ ID NO : 20) pinA-A214 214 pb 5'-ACAAGAATTCATGGTTTATTTTGAGAAAAGGTC-3' IpuroA : (SEQ ID NO : 18) 5'-GTCGACCATGTTGTCAGTGTGTTTTGG-3' ppa4 : (SEQ ID NO : 21) pinA-Al36 136 pb 5'-TTTTGAATTCTTTCAAAGTAACTTTGATTGGTATCC-3' IpuroA : (SEQ ID NO : 18) 5'-GTCGACCATGTTGTCAGTGTGTTTTGG-3' ppbl : (SEQ ID NO : 22) pinB-A1067 1067 pb 5'-CCAAGAATTCAACATCTTATCGCAACATCC-3' IpuroB2 : (SEQ ID NO : 23) 5'-GTCGACCATGTTTTCAATGTTGTTTGGTGGTCC-3'

2. Obtention des plantes transgéniques : La transformation des plants de riz de l'espèce Oryza sativa est réalisée par des cultures de cals en présence des différentes colonies transformées d'Agrobacterium tuefaciens, selon le protocole décrit par HIEI et al. (Plant J., 6 (2), 271-82,1994).

Les transformants primaires sont sélectionnés sur milieu R2S ET NBS (OHIRA et al., Plant. Cell. Physio., 14, 1113-1121,1973 ; CHU, In Proc Symp on Plant Tissue Cult, May 25-30, Beijing, Science Press, China, 43-50,1978 ; GAMBORG et al., Exp. Cell. Res., 50,151-158, 1968) contenant 400 mg/L de céfotaxime (DUCHEFA), 100 mg/L de vancomycine (DUCHEFA) et 50 mg/L dthygromycine (SIGMA). L'ADN des plants isolés est ensuite analysé par la technique de transfert de Southern, en utilisant une sonde marquée correspondant au promoteur de la puroindoline-a.

La sonde utilisée est obtenue par amplification du plasmide pinA-A214, selon le protocole décrit précédemment, et en utilisant les amorces ppa3 et Ipuro A.

Après analyse, seuls les individus présentant une seule copie du transgène sont conservés et repiqués en pot

avant d'être placés dans une serre confinée jusqu'à la floraison.

EXEMPLE 4 : PROFIL D'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA DANS LE GRAIN Les grains ont été récoltés pour toutes les plantes monocopies correspondant à chaque construction, y compris les plasmides témoins, à 8,10, 15,20 et 30 jours après floraison (JAF).

L'activité p-glucuronidase (GUS) est recherchée par analyse histochimique sur des coupes de grains fraîchement récoltés. La détection est effectuée comme décrit par JEFFERSON et al. (EMBO J., 6,3901-3907, 1987), en présence d'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl P-D-glucuronique (XGluc, BIOSYNTH AG), dans du tampon phosphate de potassium 100mM, pH7, contenant 0, 1% de TRITON X-100, ainsi que 10mM de K3Fe (CN) 6 et 10mM de K4Fe (CN) 6 pour éviter la diffusion des produits intermédiaires de la réaction.

Les résultats révèlent une activité du gène rapporteur uidA dans l'albumen des grains PinA-A1214 et PinA- A390 dès le 8ème jour après floraison (JAF), cette activité atteint un maximum à 20 JAF. Ce profil d'expression est similaire à celui obtenu avec la construction PinB-A1067, sauf pour le maximum d'expression (30 JAF ; DIGEON et al, précité).

Aucune expression dans le grain n'est observée avec les autres constructions.

Les résultats obtenus en fonction des différents promoteurs utilisés sont résumés dans le Tableau IV, qui indique pour chaque construction, le nombre de plantes dans lesquelles on détecte une activité (3-glucuronidase dans les grains, par rapport au nombre de plantes testées.

TABLEAUIV Construction Plantes exprimant GUS dans les rains/Plantes testées Nombre % pinA-A1214 11/15 73, 3 pinA-A390 8/12 66, 6 pinA-A214 0/15 0 pinA-A136 0/11 0 pin B-A1067 5/8 62, 5 pCAMBIA 1381Xb 0/10 0 Les résultats de localisation de l'expression de GUS dans le grain, observée avec les différentes constructions au maximum d'expression, sont résumés dans le tableau V.

Tableau V Construction Grain en développement Albumen amylacé aleurone épiderme embryon PinA-A1214 + ++ ++ + PinA-A390 + ++ ++ + PinA-A214 PinA-A136 PinB-Al067++++ pC-1 381Xb

Ces résultats révèlent d'importantes différences entre les promoteurs pinA et pinB. Dans le cas de la construction PinB-A1067, la coloration du grain est localisée au niveau de l'albumen amylacé et dans une moindre mesure, de la couche à aleurone. En revanche, la coloration du grain se localise essentiellement au niveau de la couche à aleurone et de l'enveloppe du grain pour les constructions PinA-A1214 et PinA-A390, avec toutefois une faible coloration de l'albumen amylacé. Pour les constructions PinA-A214 et PinA-d136, on n'observe aucune coloration.

En outre, et de façon inattendue, l'analyse histologique a également mis en évidence une coloration au niveau de l'embryon pour les constructions PinA-41214 et PinA- A390, mais ceci uniquement lorsque celui-ci est sectionné.

Cette coloration n'apparaît pas pour la construction PinB- A1067.

Les séquences impliquées dans le profil d'expression du gène rapporteur uidA au niveau du grain sont donc localisées au niveau du segment-390 à-215 de la région 5'du gène pinA de Triticum aestivum.

Les séquences potentiellement impliquées dans l'expression au niveau du grain dans le fragment-390 à-1 de la région 5'du gène pinA de Triticum aestivum sont représentées dans la figure 4.

Les éléments putatifs de régulation de l'expression au niveau du grain sont soulignés. Les limites des différentes constructions de la région 5'du gène pinA sont indiquées par des rectangles noirs.

La séquence-2o4TTGAGAAAAGG-i94 est une séquence putative d'expression au niveau de l'albumen retrouvée chez de nombreuses autres céréales (MOTTO et al., précité). En outre, la région-390/-215 abrite de nombreux motifs AACA qui sont conservés dans de nombreux promoteurs de gènes codant pour des protéines de réserve de grain de céréales.

EXEMPLE 5 : INDUCTION DE L'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA EN REPONSE A UNE BLESSURE Des tests histochimiques ont été réalisés en réponse à des blessures, et selon le protocole décrit à l'exemple 4, sur les racines, les tiges et les feuilles de plants de riz transgéniques correspondant aux différentes constructions.

Les résultats de l'analyse histologique effectuée sur les plants transgéniques à différents stades de développement sont résumés dans le tableau VI.

Tableau VI Construction Plantules Organes végétatifs embryon Organes aériens/racines aériens racines PinA-A1214 + + + + PinA-A390 + + + + PinA-A214 PinA-A136 PinB-A1067 _ pC-1381 Xb Les résultats montrent une activité GUS au niveau des feuilles, des tiges, et des racines uniquement pour les plantes correspondant aux constructions PinA-A1214 et PinA- A390. En revanche, aucune activité n'a été détectée dans les plantes portant les constructions PinA-A214, PinA-A136, PinB- A1067 ou le plasmide seul.

Dans les différents organes aériens, la coloration est localisée au niveau des sites de coupure des tiges, des tiges florales et des feuilles.

La figure 5 montre le détail d'une coloration obtenue sur un morceau de feuille après cisaillement avec une lame de scalpel.

On observe que le profil de coloration est le même au niveau des sites internes de cisaillement (G et détail F), qu'au niveau des bordures (G et détail H). Une analyse histologique plus fine révèle que la coloration est plus

intense au niveau des tissus vasculaires des feuilles blessées.

En revanche, les racines primaires et secondaires révèlent une coloration même en l'absence de blessure. Cette coloration se localise dans les tissus vasculaires et s'intensifie dans les zones de ramification. Toutefois, cette coloration n'est pas détectée dans les racines primaires au cours du développement, sauf dans le cas où ces dernières sont sectionnées.

Les séquences impliquées dans le profil d'expression du gène rapporteur uidA en réponse à une blessure mécanique sont donc également localisées au niveau du segment - 390 à-215 de la région 5'du gène pinA de Triticum aestivum.

La position, au niveau du fragment-390 à-1 du gène pinA de Triticum aestivum, des séquences potentiellement impliquées dans l'expression du gène uidA en réponse à un stress est illustrée dans la figure 6.

Les éléments putatifs de régulation de l'expression en réponse à une blessure mécanique sont représentés en grisé. Les limites des différentes constructions de la région 5'du gène pinA sont indiquées par des rectangles noirs.

La séquence de la boîte WUN présente dans la séquence promotrice du gène sfr2 (PASTUGLIA et al., précité) est relativement bien conservée dans la région 5'du gène pinA (-309TAATTTCCT-3oo. Cette séquence ne se retrouve pas dans la région 5'du gène pinB et pourrait expliquer l'absence d'induction de ce dernier en réponse à une blessure. En outre, trois boîtes TCA putatives sont également présentes dans la région 5'du gène pinA (-2olGAGAAAAGT 192,-326TAGAAAAATA_317 et _ 389CGAAAAAGCA-380). Toutefois, leur homologie avec la séquence de la boîte TCA du promoteur du gène sfr2 (CAGAAAAGGA) se révèle inférieure à celle de la boîte WUN. Enfin, on note également une séquence palindromique correspondant à une boîte de réponse putative au jasmonate de méthyle (-382GCAGT-378/- 366TGACG-362) inversée par rapport à celle décrite par ROUSTER et al Plant. J., 11,513-23, 1997), mais néanmoins bien conservée.

La totalité de ces séquences est conservée dans les régions 5'des gènes pinA des blés ancêtres.

EXEMPLE 6 : EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA AU NIVEAU DES FLEURS Des tests histochimiques sont également réalisés, selon le protocole décrit à l'exemple 3, sur les hampes florales des riz transgéniques correspondant aux différentes constructions. Ces tests sont réalisés aux 5 étapes successives de développement de la fleur. Le dernier stade de « floraison » est atteint en 15 jours, lorsque les anthères déhiscentes sont sorties des glumelles.

Les résultats de l'analyse histologique effectuée sur les hampes florales des plants transgéniques aux différents stades de développement sont résumés dans le tableau VII.

Tableau VII Fleur Construction base de la fleur glumelles anthères 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 PinA-A1214 + + + PinA-A390--+---+ + + +---+ PinA-A214 + PinA-A136 PinB-A1067 pC-1381Xb - - - - - - - - - - - - - - - Les résultats montrent ainsi que l'activité GUS est détectée dans les glumelles des plantes portant les constructions PinA-A1214 et PinA-A390. La coloration histochimique n'apparaît, au cours du développement floral, qu'au stade 2 et à l'extrémité supérieure des glumelles (par rapport à l'axe de la fleur). L'activité du gène rapporteur progresse ensuite du haut des glumelles vers la base de la fleur, et ceci du stade 2 au stade 5. Ces plantes présentent également une activité au niveau de la base de la fleur, mais uniquement au stade 3.

Les résultats révèlent également une activité GUS au niveau des anthères des plantes portant les constructions PinA-A214, PinA-A1214 et PinA-A390. Toutefois, cette activité n'est visible qu'au stade 4 de développement de la fleur.

Après expulsion de leur pollen, plus aucune coloration n'est détectée au niveau des anthères au stade 5. Une analyse

histologique des anthères fait apparaître une coloration des grains de pollen et de la fente de déhiscence.

Aucune coloration n'est détectée au niveau du pistil et ceci quelle que soit la construction étudiée.

Les résultats montrent donc que le fragment-214 à -137, de la région 5'du gène pinA de Triticum aestivum, possède des séquences impliquées dans l'expression, au niveau des grains de pollen, du gène rapporteur uidA.

Les séquences potentiellement impliquées dans l'expression du gène uidA au niveau des grains de pollen au niveau de la région-390 à-1 du gène pinA de Triticum aestivum sont illustrées dans la figure 7.

Les éléments putatifs de régulation de l'expression au niveau des grains de pollen sont représentés en grisé. Les limites des différentes constructions de la région 5'du gène pinA sont indiquées par des rectangles noirs.

La séquence _196AGGTCA_19o présente dans la séquence promotrice du gène zml3 du maïs (HAMILTON et al., précité) est présente à l'identique dans la région 5'du gène pinA. La séquence correspondante dans la région 5'du gène pinB n'est pas conservée. En outre, deux autres motifs spécifiques de l'expression du gène lat52 dans les grains de pollen de tomate (EYA1 et al. Précité) sont présents dans la région-214/-137 du promoteur du gène pinA (-199AGAAA-195 et-154TCCACCAGT-146).

L'ensemble de ces boîtes putatives est relativement bien conservé dans les gènes pinta des blés ancêtres.

EXEMPLE 7 : INDUCTION DE L'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA EN REPONSE A UNE ATTAQUE PAR UN PATHOGENE ; Des plantules de riz transgéniques correspondant aux constructions PinA-A1214, PinA-A390, PinA-A214, PinA-A136, PinB-A1067 et pCAMBIA-1381Xb sont infectées par le champignon Magnaporthe grisea (souche FR13) selon le protocole suivant : 30 ml d'une solution aqueuse de spores (105 spores/ml) additionnée de 0, 5% (p/v) de gélatine sont pulvérisés sur les plantules au stade 4-5 feuilles.

A titre de contrôle, des plantules témoins sont pulvérisées avec une solution de gélatine 0, 5%.

Les feuilles des plantules témoins et des plantules infectées sont récoltées 36 heures après la pulvérisation et l'activité GUS est recherchée par analyse histochimique, selon le protocole décrit à l'exemple 4.

Les résultats révèlent une activité du gène rapporteur uidA 36 heures après l'infection, uniquement avec les constructions PinA-A1214 et PinA-A390. On observe un marquage localisé au niveau des tissus parenchymateux et des stomates.

Compte tenu des voies parallèles utilisées par les mécanismes de réponse aux blessures mécaniques et aux infections fongiques, il est très probable que les séquences impliquées dans l'expression en réponse à l'infection par Magnaporthe grisea correspondent aux différents éléments de réponse localisés, dans l'exemple 5, au niveau du segment-390 à-215 de la région 5'du gène pinA de Triticum aestivum.