L'invention est également relative aux polymères électroactifs ainsi obtenus, ainsi qu'à leurs procédés d'utilisation pour la détection, l'identification et le dosage d'analytes dans un échantillon.

Les polymères conjugués, tels que les polypyrroles et leurs dérivés, sont bien connus pour leur caractère conducteur et électroactif. Il est également connu que les polypyrroles conservent leur conductivité et leur électroactivité lorsque certains cycles pyrrole sont substitués en position 3 ou 4 avec des groupements fonctionnels.

Des polymères portant ce type de groupements fonctionnels sont décrits dans WO-A1- 95/29199, Garnier et al. (Synthetic Metals, 100 : 89-94,1999) Ho-Hoang et al.

(Synthetic Metals, 62 : 277-280,1994), Ho-Hoang et al. (J. Mater. Chem., 6 (7), 1107- 1112,1996), et Korri-Youssoufi et al. (Materials Science and Engineering, Cl 5, 265- 268,2001). Différents anti-ligands peuvent ensuite être greffés sur les groupements fonctionnels portés par les polypyrroles.

Ainsi, WO-A1-95/29199 décrit la synthèse d'un polypyrrole précurseur à partir de la polymérisation électrochimique de pyrroles substitués en position 3 du noyau pyrrole avec des groupements fonctionnels. Ce polymère précurseur est déposé par polymérisation électrochimique sur un substrat conducteur ou sous la forme d'un film auto-supporté. Dans une deuxième étape, un anti-ligand tel qu'un polynucléotide ou un peptide est greffé chimiquement sur les groupements fonctionnels du polymère précurseur. Le polymère ainsi obtenu conserve ses propriétés conductrices et électroactives. Ces polymères peuvent donc être utilisés pour détecter un analyte interagissant spécifiquement avec l'anti-ligand greffé sur le polymère par la mesure d'une différence de potentiel ou d'une variation de courant. WO-A1-00/77523 décrit également le greffage chimique d'un anti-ligand, tel qu'un oligonucléotide, sur un polymère précurseur portant des groupements fonctionnels.

Les polymères ainsi obtenus peuvent être utilisés comme des capteurs biologiques ou des « biocapteurs » pour la capture et la détection d'un analyte. La possibilité de détecter un analyte, tel qu'une molécule d'intérêt biologique, dans un échantillon par une simple mesure électrique constitue le principal avantage de ces polymères. Toutefois, les procédés de préparation de ces polymères font intervenir un greffage chimique qui ne permet pas la synthèse en parallèle d'un grand nombre de polymères portant des anti-ligands différents. Or, la préparation de matrices d'anti-

ligands nécessite l'immobilisation et l'adressage d'un grand nombre d'anti-ligands différents. La fabrication des « biopuces » ou des puces à ADN fait ainsi intervenir l'immobilisation et l'adressage de matrices d'oligonucléotides sur des supports solides.

Les procédés de greffage chimique d'oligonucléotides sur un polymère précurseur ne permettent pas d'obtenir des matrices ordonnées d'oligonucléotides.

Par ailleurs, il est connu d'effectuer l'adressage et l'immobilisation d'oligonucléotides de façon simultanée par copolymérisation électrochimique directe d'un mélange de pyrroles non substitués et de pyrroles substitués sur l'atome d'azote avec un groupement portant un oligonucléotide. Livache et al. (Analytical Biochemistry, 255 : 188-194,1998) décrivent ainsi la synthèse de pyrroles substitués dans lesquels un groupement portant un oligonucléotide est substitué sur l'atome d'azote du cycle pyrrole. Ces pyrroles substitués portant un oligonucléotide sont copolymérisés électrochimiquement avec du pyrrole. Des réactions de copolymérisations électrochimiques successives permettent l'adressage et l'immobilisation de matrices d'oligonucléotides différents sur des électrodes différentes. Par électropolymérisation, on obtient des copolymères portant des oligonucléotides et pouvant être utilisés pour des réactions d'hybridation pour la détection d'ADN ou d'ARN spécifiques. Cependant, ces copolymères ont de faibles propriétés conductrices et électroactives. L'inconvénient de ces polymères est donc que la détection de l'hybridation est effectuée par l'intermédiaire d'un marquage supplémentaire et non par l'intermédiaire d'une mesure électrique directe.

EP-B1-0691 978 et EP-B1-0912 593 décrivent également des pyrroles substitués sur lesquels différents ligands, tel que des oligonucléotides, sont greffés sur l'azote du noyau pyrrole. Ces pyrroles substitués, utilisés comme monomères, sont copolymérisés électrochimiquement avec du pyrrole non substitué. Toutefois, les copolymères obtenus présentent également l'inconvénient d'avoir des propriétés conductrices et électroactives faibles.

Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose de nouveaux pyrroles substitués ailleurs que sur l'atome d'azote par des groupements portant des oligonucléotides. Ces nouveaux pyrroles substitués permettent la synthèse de copolymères par polymérisation électrochimique lorsqu'ils sont utilisés comme monomères, seuls ou en mélange avec d'autres monomères. Les polymères ou copolymères obtenus sont conducteurs et électroactifs. Les pyrroles substitués avec des oligonucléotides selon l'invention offrent la possibilité d'adresser et d'immobiliser en une seule étape des oligonucléotides par polymérisation

électrochimique. Les pyrroles substitués avec des oligonucléotides et les copolymères selon l'invention permettent donc de procéder à la préparation de matrices ordonnées d'oligonucléotides. Ces matrices constituent des outils particulièrement intéressants pour le diagnostic et pour le criblage en série de molécules. En outre, les copolymères selon l'invention possèdent des propriétés électroactives pour la détection par une mesure électrique d'un analyte susceptible d'interagir spécifiquement avec les oligonucléotides portés par le copolymère.

Description de l'invention La présente invention concerne des pyrroles substitués avec des groupements portant un oligonucléotide. Ces pyrroles substitués selon l'invention sont définis ci-après comme « pyrrole substitué avec un oligonucléotide » ou « pyrrole substitué selon l'invention ».

Un premier objet de la présente invention est un pyrrole substitué avec un oligonucléotide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (I) : dans laquelle Ri représente un oligonucléotide, Y représente S ou O, X représente un bras espaceur.

On entend par « bras espaceur », un groupement chimique qui permet l'éloignement de l'oligonucléotide par rapport au noyau pyrrole. Les bras espaceurs sont bien connus de l'homme du métier, tout bras espaceur permettant de conserver les propriétés conductrices et électroactives du polymère peut être utilisé dans les pyrroles substitués selon l'invention. Avantageusement le bras espaceur représente un encombrement réduit pour ne pas interférer avec la polymérisation du pyrrole substitué.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente un bras espaceur choisi parmi- (CH2) n-O-,- (CH2) p-O- [ (CH2) 2-O] q-,- (CH2) r CO-NR'- (CH2) r- <BR> <BR> <BR> <BR> O-,- (CH2) r-NCH3- (CH2) r-0-,- (CH2) r-CO-NR'- [ (CH2) 2-0],-,- (CH2) r-NCH3- [ (CH2) 2-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 0] s-, R'représente-H ou-CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r'est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r'et s sont identiques ou différents, le cycle pyrrole est substitué en position 2,3, 4 ou 5.

Le terme « oligonucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléoside, on entend un composé organique consistant en une base purine ou pyrimidine liée à un ose (ribose ou deoxyribose). Par nucléotide, on entend un composé organique consistant en une base purine ou pyrimidine liée à un ose (ribose ou deoxyribose) et à un groupe phosphate. Par nucléotide modifié, on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, N- alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphotriester. Les alpha- oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507 et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al. (J. Am. Chem. Soc., 114,1895-1897, 1992), sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié.

L'oligonucléotide est lié au bras espaceur par une liaison phosphodiester.

De façon plus spécifique, le 3'-OH ou le 5'-OH de l'oligonucléotide est lié à l'atome

d'oxygène du bras espaceur par l'intermédiaire d'un groupe phosphorylé.

Avantageusement, l'oligonucléotide comprend 2-70 nucléotides, préférentiellement 20 nucléotides.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'oligonucléotide comprend, à l'extrémité liée au bras espaceur, un polynucléotide de séquence TTTTT comprenant de 5 à 10 T, préférentiellement 10 T. Ce polyT permet l'éloignement de la partie de l'oligonucléotide spécifique de l'analyte à détecter du cycle pyrrole.

La présente invention concerne également un pyrrole substitué avec un oligonucléotide de formule générale (II) :

dans laquelle Rl, Y et X, sont tels que décrits précédemment.

De préférence, X est-(CH2) n-O-et n est égal à 2.

La présente invention concerne également un pyrrole substitué avec un oligonucléotide de formule générale (III) :

dans laquelle Rl, Y et X, sont tels que décrits précédemment.

De préférence, X est- (CH2) n-O-et n est égal à 2.

Un autre objet de la présente invention consiste en des procédés de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes :

a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucléotide selon l'invention de formule générale (II), b) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de copolymériser avec d'autres pyrroles, c) on copolymérise électrochimiquement le monomère de l'étape a) avec le monomère de l'étape b).

Avantageusement, X est- (CH2) n-O-et n est égal à 2 dans le pyrrole substitué avec un oligonucléotide de formule générale (II).

Dans un autre mode de réalisation avantageux, le rapport molaire entre le pyrrole substitué avec un oligonucléotide de formule générale (II) selon l'invention et le pyrrole substitué de l'étape b) est de 1/1000 à 1/100000. Préférentiellement, ce rapport molaire est de 1/5000 à 1/20000. Encore plus préférentiellement, ce rapport molaire est de 1/20000.

On entend par « monomère » une unité chimique susceptible d'une réaction de polymérisation chimique ou électrochimique avec d'autres monomères pour former un polymère.

On entend par"polymérisation"une réaction par voie chimique ou électrochimique d'unités de même nature chimique permettant l'assemblage d'un certain nombre de monomères pour former une macromolécule (n x M-> (M) n). Il s'agit typiquement de la condensation d'unités pyrrole pour former le polypyrrole. On entend par"copolymérisation"la polymérisation simultanée d'unités différentes, tel que, par exemple, la polymérisation simultanée d'un mélange de pyrrole substitués par des groupements ne comportant pas d'oligonucléotides et de pyrroles substitués selon l'invention.

Les termes « électropolymérisation », « électrocopolymérisation », « copolymérisation électrochimique » et « polymérisation électrochimique » désignent une polymérisation par voie électrochimique. Les procédés d'électropolymérisation sont bien connus de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques de la voltampèrométrie cyclique, la chronopotentiométrie (courant imposé) et la chronoampérométrie (potentiel imposé). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les dépôts sont réalisés par chronoampérométrie ou dépôt à potentiel contrôlé. Cette méthode consiste à imposer un saut de potentiel à partir du potentiel

d'équilibre (courant nul) jusqu'à une valeur fixe à laquelle s'effectue la réaction à l'électrode et à mesurer le courant en fonction du temps.

L'électropolymérisation du pyrrole par le mécanisme de Diaz (Sadki et al., Chem. Soc. Rev., 29 : 283-293,2000) conduit à la formation du polypyrrole. Cette polymerisation s'effectue au niveau des positions 2 et 5 des monomères pyrrole.

On entend par « pyrrole substitué susceptible de polymériser avec d'autres pyrroles », un pyrrole substitué en position 3 ou 4 du noyau pyrrole qui est susceptible de polymériser ou de copolymériser avec d'autres pyrroles au niveau des positions 2 et 5 et plus particulièrement de copolymériser avec des pyrroles substitués avec des oligonucléotides selon l'invention. Ces pyrroles substitués, susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, portent des groupements représentant un encombrement moléculaire suffisamment faible pour ne pas interférer dans une réaction de polymérisation ou de copolymérisation. Typiquement, ces pyrroles substitués ne portent pas de groupements substituants comportant des oligonucléotides. Par ailleurs, ces pyrroles substitués en position 3 ou 4 du cycle pyrrole avec des groupements de faible encombrement permettent, après polymérisation ou copolymérisation avec d'autres pyrroles, d'obtenir des polymères conducteurs et électroactifs. Des pyrroles substitués susceptible de polymériser avec d'autres pyrroles pour former des polymères conducteurs sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. On citera notamment WO-A1-95/29199, Garnier et al. (Synthetic Metals, 100 : 89-94,1999) Ho-Hoang et al. (Synthetic Metals, 62 : 277-280,1994), Ho-Hoang et al. (J. Mater. Chem., 6 (7), 1107-1112,1996), et Korri-Youssoufi et al. (Materials Science and Engineering, C15, 265-268,2001). La copolymérisation de pyrroles substitués avec un oligonucléotide selon l'invention avec des pyrroles substitués avec des groupements ne portant pas d'oligonucléotides permet de diminuer l'encombrement lors de la réaction de copolymérisation.

Ainsi, lorsque les pyrroles substitués avec un oligonucléotide de la présente invention sont substitués en position 3 et 4 du noyau pyrrole, un mélange de ces pyrroles selon l'invention avec des pyrroles substitués peut être copolymérisé directement.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les pyrroles substitués avec un oligonucléotide (ODN) selon l'invention sont copolymérisés avec le

3- (hydroxyéthyl) pyrrole. Dans ce mode de réalisation, le pyrrole substitué susceptible de polymériser avec d'autres pyrroles est donc le 3- (hydroxyéthyl) pyrrole. Le copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides résultant de cette copolymérisation est représenté ci-dessous.

Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le copolymère fonctionalisé avec des oligonucléotides est déposé ou formé sur un premier polymère conducteur et électroactif. Dans ces procédés, on polymérise ou coploymérise un premier pyrrole substitué pour former un préfilm ou une fine sous-couche de polymère conducteur et électroactif. Ensuite une deuxième couche est réalisée avec le copolymère fonctionnalisé avec des oligonucléotides.

La présente invention se rapporte donc aussi à un procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucléotide de formule générale (II), d) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, e) on copolymérise électrochimiquement le monomère de l'étape c) avec le monomère de l'étape d) sur ledit premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides.

Les pyrroles substitués utilisés à l'étape a) et à l'étape d) sont identiques ou différents.

De préférence, le rapport molaire entre le pyrrole substitué de l'étape c) et le pyrrole substitué de l'étape d) est de 1/20000.

Avantageusement, le pyrrole substitué de l'étape a) et de l'étape d) est le 3-(hydroxyéthyl) pyrrole.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucléotide de formule générale (II), d) on polymérise électrochimiquement le monomère de l'étape c) sur ledit premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un polymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides.

Avantageusement, le pyrrole substitué de l'étape a) est le 3- (hydroxyéthyl) pyrrole.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un pyrrole substitué avec un oligonucléotide selon la formule générale (III), d) on couple électrochimiquement le pyrrole substitué de l'étape c) sur le premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir

un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides.

Avantageusement, le pyrrole substitué de l'étape a) est le 3- (hydroxyéthyl) pyrrole.

Lorsque le pyrrole substitué avec un oligonucléotide selon l'invention est substitué en position 2 ou 5 du cycle pyrrole il n'est pas susceptible de polymériser ou de copolymériser avec d'autres pyrroles. Pour préparer un copolymère conducteur électroactif fonctionalisé avec des oligonucléotides à partir de pyrroles substitués avec un oligonucléotide de formule générale (III), il est donc nécessaire de préparer un premier polymère conducteur électroactif sur lequel est ensuite couplé électrochimiquement le pyrrole substitué avec un oligonucléotide en position 2 ou 5 selon l'invention.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les pyrroles substitués avec un oligonucléotide (ODN) de formule générale (III) sont donc couplés électrochimiquement sur un premier polymère conducteur électroactif de poly [3- (hydroxyéthyl) pyrrole]. Dans ce mode de réalisation, le pyrrole substitué avec un oligonucléotide selon l'invention se retrouve donc à l'extrémité de la chaîne polymérique. Le copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides résultant de cette copolymérisation est représenté ci-dessous.

Un autre objet de la présente invention consiste en des copolymères conducteurs électroactifs fonctionnalisés avec des oligonucléotides susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'invention.

Les copolymères selon l'invention sont fonctionnalisés avec des oligonucléotides. Ces oligonucléotides sont greffés de manière covalente sur certaines unités monomères (noyaux pyrrole) formant le polymère apportant ainsi une fonction supplémentaire à ces polymères conducteurs électroactifs. Les copolymères

fonctionnalisés avec des oligonucléotides sont par exemple appropriés pour la capture et la détection d'analytes.

On entend par « polymère conducteur », un polymère dont les électrons sont fortement délocalisés, le plus souvent le long d'un enchaînement de liaisons simples et doubles (liaisons conjuguées), ce qui le conduit à se comporter comme un semi-conducteur micro-électronique.

On entend par « polymère électroactif », un polymère dont la réponse électrochimique, est modifiée lorsqu'un analyte interagit de manière spécifique avec les oligonucléotides portés par le polymère. Ainsi, on observe une modification du signal électrochimique suite à l'interaction spécifique avec l'analyte. Le copolymère conducteur électroactif traduit donc l'interaction avec l'analyte en un signal électrochimique modifié.

Les copolymères selon l'invention peuvent être utilisés dans toutes les applications dans lesquelles des oligonucléotides sont adressés et immobilisés sur un support solide.

Plus particulièrement, les polymères selon l'invention sont obtenus sous forme de films auto-supportés ou sous forme de film sur électrode. L'électrode permet en effet de contrôler, par mesure du courant délivré au cours de la réaction, l'évolution de la réaction de polymérisation. L'électrode permet également de mesurer les réponses électrochimiques ultérieures du copolymère. La présente invention se rapporte donc également à une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'au moins un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon l'invention.

On connaît de l'état de la technique les supports conducteurs pour électrodes, on citera notamment les substrats en métal ou en dérivés de carbone. Pour la fabrication d'une électrode selon l'invention, le copolymère est généralement déposé sur le support conducteur. La copolymérisation électrochimique est effectuée avantageusement en surface de l'électrode pour obtenir une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'un copolymère selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'électrode est obtenue en déposant une couche de copolymère à la surface d'un support en or ou en platine.

Etant donné qu'il est possible de limiter et de contrôler les réactions de polymérisations électrochimiques au niveau d'une électrode, les pyrroles substitués avec un oligonucléotide selon la présente invention permettent l'immobilisation et l'adressage d'oligonucléotides sur de petites surfaces. Cette électrocopolymérisation adressée permet de réaliser une matrice de points miniaturisés et ordonnées, chacun des points portant un oligonucléotide défini. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention se rapporte donc également à une matrice d'électrodes.

L'invention concerne donc également une matrice d'électrodes comprenant au moins une électrode selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux, les différentes électrodes de la matrice portent des oligonucléotides différents. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une pluralité d'électrodes ou de microélectrodes fixées sur un support solide, ces électrodes sont revêtues d'un copolymère selon l'invention et portent avantageusement des oligonucléotides différents. De telles matrices d'électrodes peuvent avantageusement être obtenues par électropolymérisation adressée de pyrroles substitués avec un oligonucléotide selon l'invention.

Les copolymères, les électrodes et les matrices d'électrodes selon l'invention sont notamment utilisables pour la détection d'analytes susceptibles d'être présents dans un échantillon et susceptibles de réagir spécifiquement avec les oligonucléotides portés par le copolymère. L'invention se rapporte donc également à des dispositifs pour la détection d'un analyte dans un échantillon comprenant au moins un copolymère selon l'invention et/ou au moins une électrode selon l'invention.

L'invention concerne également des dispositifs pour la détection d'un analyte dans un échantillon comprenant au moins une matrice d'électrodes selon l'invention.

La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'un analyte dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon l'invention ou d'une électrode comprenant un support conducteur revêtu d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon l'invention,

b) on met en contact le copolymère électroactif ou l'électrode de l'étape a) avec l'échantillon dans des conditions de réaction appropriées pour l'interaction spécifique de l'analyte avec lesdits oligonucléotides ; c) on détecte l'analyte, lié aux dits oligonucléotides, au moyen d'une mesure électrique.

L'invention concerne donc l'utilisation d'un copolymère, d'une électrode ou d'une matrice d'électrodes selon l'invention pour détecter un analyte susceptible d'être présent dans un échantillon et susceptible d'interagir spécifiquement avec les oligonucléotides selon l'invention.

On entend par « analyte », toute molécule susceptible d'interagir spécifiquement avec des oligonucléotides et donc susceptible d'être détecté avec un copolymère selon l'invention. Cet analyte peut être, par exemple, une biomolécule telle que par exemple une protéine, un peptide, un lipide, un stéroïde, un sucre ou encore un acide nucléique. L'oligonucléotide porté par le copolymère est spécifique de l'analyte à détecter. Avantageusement, l'oligonucléotide et l'analyte à détecter forment un couple anti-ligand/ligand (ADN/ADN, ARN/ADN, ARN/ARN ou ADN/protéine par exemple).

La présente invention permet de détecter un analyte dans tout type d'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon est un échantillon biologique. Avantageusement, cet échantillon peut avoir été prélevé sur un patient à des fins de diagnostic. L'échantillon peut être, par exemple, l'urine, le sang, le sérum, le plasma, des extraits cellulaires ou un fluide corporel.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on détecte un ADN et/ou un ARN s'hybridant de manière spécifique aux oligonucléotides du copolymère conducteur électroactif selon l'invention.

Le copolymère de la présente invention est un copolymère électroactif dont la réponse électrochimique sera modifiée lorsqu'un analyte interagit de manière spécifique avec les oligonucléotides portés par le polymère. Le copolymère conducteur électroactif selon l'invention traduit donc l'interaction avec l'analyte en un signal électrochimique. L'interaction spécifique d'un analyte avec les oligonucléotides portés par le copolymère engendre une modification de la réponse électrochimique du

copolymère étudié par rapport à un copolymère de référence. Avantageusement, la détection de l'analyte s'effectue donc par une mesure électrique.

On entend par « mesure électrique », la mesure d'une variation de type potentiométrique comme la variation du potentiel d'oxydation du polymère ou la mesure d'une variation de type ampérométrique par variation du courant d'oxydation observé à un potentiel donné. Ces variations sont mesurées de manière rapide, sensible et quantitative selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure électrique consiste en la mesure d'une variation de potentiel ou d'une variation de courant. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise la voltamétrie cyclique. Il s'agit d'une méthode électroanalytique qui consiste à balayer une gamme de potentiel dans un sens puis dans l'autre, à vitesse constante. Le voltampérogramme obtenu donne la réponse en courant du système électrochimique étudié et permet sa caractérisation.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la détection de l'interaction spécifique entre l'analyte et les oligonucléotides portés par le copolymère peut se faire avec l'électrode qui a servi à l'électropolymérisation du polymère. Par exemple, l'hybridation d'un acide nucléique complémentaire aux oligonucléotides du copolymère peut être détectée par mesure électrique sur l'électrode qui supporte le copolymère selon l'invention.

Les méthodes de détection par une mesure électrique sont préférées avec les copolymères selon l'invention. Cependant, d'autres méthodes traditionnelles de détection connues de l'homme du métier peuvent également être utilisées.

Un autre objet de la présente invention consiste en un pyrrole substitué de formule générale (IV) :

dans laquelle R2 est un groupe protecteur de l'amine. Différents groupes protecteurs de l'amine peuvent être utilisés dans les pyrroles substitués selon l'invention. Ces groupes protecteurs de l'amine sont bien connus de l'homme du métier (Kocienski P. J., Thieme Publishing Group, 1994 ; Hanson J. R., Protecting Groups in Organic Synthesis, Continuum International Publishing Group). De préférence, le groupe protecteur de l'amine est choisi parmi le monométhoxytrityle, le dimethoxytrityle, le tosyle, le triisopopyl silyle, le tert-butoxycarbonyle, le 9-fluorényloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle et l'acétyle.

R3 est un groupe phosphoré susceptible de réagir avec un groupement hydroxyle libre.

De préférence, R3 est choisi parmi un groupement phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite, X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH2)n-O-, - (CH2) p-o-[(cH2) 2-o] q-n- (CH2)r-CO-NR'-(CH2)r'-O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2)r'-O-, -(CH2)r-CO-NR'-[(CH2)2-O]s-, - (CH2) r-NCH3-f ; (CH2) 2-0],-, R'représente-H ou-CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r'est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r'et s sont identiques ou différents, le cycle pyrrole est substitué en position 2,3, 4 ou 5.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention se rapporte à un pyrrole substitué de formule générale (V) :

dans laquelle R2 est un groupe protecteur de l'amine. De préférence, R2 est choisi parmi le monométhoxytrityle, le dimethoxytrityle, le tosyle, le triisopropyl silyle, le tert- butoxycarbonyle, le 9-fluorényloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle et l'acétyle.

R3 est un groupe phosphoré susceptible de réagir avec un groupement hydroxyle libre.

De préférence, R3 est choisi parmi un groupement phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite, X représente un bras espaceur choisi parmi- (CH2) n-O-,- (CH2) p-O- [ (CH2) 2-O] q,- (CH2)r-CO-NR'-(CH2)r'-O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2)r'-O-, -(CH2)r-CO-NR'-[(CH2)2-O]s-, - (CH2) r-NCH3~ [(CH2) 2~0] s~n R'représente-H ou-CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r'est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r'et s sont identiques ou différents.

Préférentiellement, R2 représente le monométhoxytrityle. De préférence, R3 représente un groupement phosporamidite. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente- (CH2) n-0- et n est égal à 2.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le pyrrole substitué répond à la formule générale (VI) :

dans laquelle R2 est un groupe protecteur de l'amine, de préférence, choisi parmi le monométhoxytrityle, le diméthoxytrityle, le tosyle, le triisopropyl silyle, le tert- butoxycarbonyle, le 9-fluorényloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle et l'acétyle, R3 est un groupe phosphoré susceptible de réagir avec un groupement hydroxyle libre.

De préférence, R3 est choisi parmi un groupement phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite, X représente un bras espaceur choisi parmi- (CH2) n-0-,- (CH2) p-0- [ (CH2) 2-0] q-,- (CH2)r-CO-NR'-(CH2)r'-O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2)r'-O-, -(CH2)r-CO-NR'-[(CH2)2-O]s-, - (CH2) r-NCH3- [ (CH2) 2-0] s-, R'représente-H ou-CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r'est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r'et s sont identiques ou différents.

Préférentiellement, R2 représente le monométhoxytrityle. De préférence, R3 représente un groupement phosporamidite. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente- (CH2) n-O- et n est égal à 2.

Un autre objet de la présente invention consiste en un procédé de préparation d'un pyrrole substitué avec un oligonucléotide de formule générale (I)

dans laquelle Ri, X et Y sont tels que définis précédemment, comprenant les étapes suivantes : a) on effectue les cycles de synthèse d'un oligonucléotide, b) on substitue, dans le dernier cycle de synthèse dudit oligonucléotide, un pyrrole substitué de formule générale (IV) dans laquelle R2, R3 et X, sont tels que définis précédemment au dernier nucléotide en 5'ou en 3'dudit oligonucléotide ; c) on clive ledit groupe protecteur R2.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le groupe protecteur R2 est le monométhoxytrityle et à l'étape c) on clive ce groupe protecteur par un traitement en milieu acide.

Dans un mode de réalisation préféré, le groupe protecteur R2 est le monométhoxytrityle et l'oligonucléotide est purifié par chromatographie en phase inverse avant de cliver le groupe protecteur à l'étape c).

La substitution d'un pyrrole substitué de formule générale (IV) est réalisée à la suite des cycles de synthèse de l'oligonucléotide. Dans le dernier cycle de synthèse, on remplace le nucléotide par un pyrrole substitué de formule générale (IV).

Selon un premier exemple, dans le cas du cycle en série « H- phosphonate » tel que représenté sur le schéma ci-dessous, le dernier nucléotide de ce cycle est remplacé par un pyrrole substitué de formule (IV) selon l'invention dans lequel le groupe phosphoré est un H-phosphonate.

Cycle en série « H-phosphonate »

DMTr-O B2 HO Bl DMTr-O BZ O - ou 0 b + 0 CH3 0 1- t 0 ? 0=P-0-, B ; support H CH3 H 3 support, 3 Y- Chlorure de pivaloyl 1, l °

Selon un autre exemple, dans le cas du cycle de condensation phosphoramidite tel que représenté sur le schéma ci-dessous, le dernier nucléotide de cette chaine est remplacé par le pyrrole substitué de formule (IV) selon l'invention dans lequel le groupe phosphoré est un phosphoramidite.

Y=OouS DMTr-O ; DßB2 O \ CNCH2CH20-P-O X bB1 a Y 0 DMTr, 0 0 B1. (4) Oxydation iode (0, 5 % p/v), lutidine (0, 5 % O p/v) dans THF 9/H20 1 P - 1 minute (Y=O) Support ou (1) 5'-0 Détritylation réactif de Beaucage acide trichloroacétique (3H-1, 2-Benzodithiole-3-one-1, 1 2 % dans CH2Ct2 -dioxide), 0, 05 M dans-2 minutes acétonitrile anhydre - 30 secondes (Y=S) H°go B Lavage acétonitrile 0 -30 secondes (3) Cappinq Lavage, séchage Lavaae, séchaae anhydride acétique + DMAP rinçage avec -3 minutes - 3 minutes acétonitrile anhydre lavage-30 secondes acétonitrile (2) Couplage - 30 secondes dans l'acétonitrile anhydre-1 minute/ DMTr-On 2 DMAP-O p B2 0 CNCH2CH20-P-O p BL CNCH2CH20-P-N 0 H O/H NoN N N) N N

De même, selon un autre exemple, dans le cas du cycle de condensation « phosphotriester » tel que représenté sur le schéma ci-dessous, le dernier nucléotide de ce cycle est remplacé par un pyrrole substitué de formule (IV) selon l'invention dans lequel le groupe phosphoré est un phosphodiester.

Cycle de condensation phosphotriester (n-1) cycles pour un oligonucléotide d DMTr-O B1 bases de lone l< el-p0 support X i (1) 5'-O détritylation Lavage acide trichloroacétique - 30 secondes 2% dans CH2C1 -2 minutes (3) Ca in : (acétylation) anhydride acétique + DMAP HO 3 - 3 minutes fob Lava 0 acétonitrile - 30 secondes Lavage, séchage rinçage avec acétonitrile DMTr-O B anhydre-30 secondes 2 O (2) Couplae dans l'acétonitrile anhydre-3 minutes DMTr-p B2 0 C1C6H40-P-O B1 _ 0 il S-cil 0-p-0 (-) Ô C Cl M. S. CI + 4gN CH3 w

A l'issue des cycles de synthèse de l'oligonucléotide, et après déprotection, l'hydroxyle libre à l'extrémité 5'ou 3'de l'oligonucléotide réagit avec le

phospore réactif (phosphodiester, phosphoramidite, H-phosphonate) du pyrrole substitué de formule générale (IV).

Description des figures Figure 1 : Chromatogrames de l'oligonucléotide 5'OH avant et après l'incorporation du 1- [N- (tosyl)]-3- [7-0- (2-cyanoéthyl-N, N diisopropylphosphoramidityl) hydroxyéthyl].

Fig 1 A Séquence de l'oligonucléotide : 5'ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta, temps de rétention (Rt) : 14.87 min.

Fig 1 B Séquence de l'oligonucléotide : 5'Pyrrole Tosyl-ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta, Rt : 16. 35min.

Fig 1 C Co-injection des 2 oligonucléotides (Rt : 15.07 min et 17.40 min).

Figure 2 : Suivi par HPLC du clivage du groupement Tosyle.

Fig 2 A Séquence de l'oligonucléotide : 5'Pyrrole Tosyl-ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta, Rt : 14. 9 min.

Fig 2 B Séquence des oligonucléotides : 5'Pyrrole Tosyl-ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta (20%), Rt : 15.25 min, 5'Pyrrole-ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta (80%), Rt : 13.48 min après 24h dans une solution 0.5 M NaOH à 55°C.

Figure 3 : Chromatograme de l'oligonucléotide purifié portant le pyrrole substitué en 3 et synthétisé à partir du monomère pyrrole portant le MMT.

Séquence de l'oligonucléotide : 5'Pyrrole-at ctc ggg aat ctc aat gtt ag, Ru : 17. 6 min.

Figure 4 : Premier cycle de voltamétrie cyclique d'une solution de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole sur une électrode de platine.

Figure 5 : Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un film polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole transféré dans l'électrolyte exempte de monomères.

Figure 6 : Premier cycle de voltamétrie cyclique dans une solution de 5 uM de pyrrole - ODN en 3 sur une électrode de platine.

Figure 7 : Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un film de pyrrole-ODN en 3 sur un pré-film de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole, transférée dans la solution d'électrolyte exempte de monomères.

Figure 8 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à différents milieux.

Figure 9 : Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un copolymère sur un préfilm transférée dans la solution d'électrolyte exempte de monomères.

Figure 10 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à différents milieux. <BR> <BR> <BR> <P>Figure 11 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée par un copolymère soumis à différents milieux.

Exemples Exemple 1 : Synthèse du 1- (N-tosyD-3- (hydroxyLhyl) pUr ole Le 1-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl)pyrrole peut être obtenu selon la synthèse suivante :

La synthèse du 1-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl) pyrrole a été effectuée comme décrit par Korri-Youssoufi et al., Materials Science and Engineering C15 (2001) 265-268. Dans une première étape, le 1- (N-tosyl) pyrrole a été synthétisé à partir du pyrrole en utilisant du chlorure de tosyle en présence d'une base forte, le tertiobutylate de potassium. Puis, une acylation du 1-(N-tosyl) pyrrole par de l'anhydride acétique a permis d'obtenir le 1- tosyl-3-acétyl-pyrrole, qui a été transformé en 2-[3-(1-N-tosyl-pyrrole)] acétate de méthyle par une transposition oxydative, en utilisant du nitrate de thallium en présence de montmorillonite. Une réduction sous conditions douces par du borane diméthylsulfide a conduit à l'obtention du produit recherché, le 1-(N-tosyl)-3- (hydroxyéthyl) pyrrole. Le rendement global de la réaction a été de 21,8%.

Exemple 2 : Synthèse du 1-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl)pyrrole Le 1- [N- (p-monométhoxytrityl)]-3- (hydroxyéthyl) pyrrole a été obtenu selon la synthèse suivante : OH OH OH /1 2. 5 M NaOH/Methanol/i MMTCI N _ N \ 0-S-0 80% 1 25% OCH3 L'azote du 1-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl) pyrrole est déprotégée de façon classique par une solution de soude (2.5 M NaOH/Méthanol), deux heures à reflux. Puis, après extraction du 3- (hydroxyéthyl) pyrrole par de l'éther éthylique et concentration à sec du produit, une monométhoxytritylation de la fonction amine est effectuée par du chlorure de monométhoxytrityle (1,2 equivalents), dans du dichlorométhane anhydride, en présence de 1 équivalent de TEA. Après purification sur colonne de silice, le produit attendu, le 1-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl) pyrrole a été obtenu avec un rendement de 25%.

RMN'H du 1-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl) pyrrole : # ppm (CDCl3) = 7,28-6, 75 (m, 16 H, Ar MMtr, H-2, H-5) ; 5,88 (t, 1H, H-4) ; 3,79 (s, 3H, OCH3) ; 3,73 (t, 2H, 2xH-7) ; 2,7 (t, 2H, 2xH-6).

Exemple 3 : Synthèse du 1- !]-3-[7-0-(2-cyanoéthyl-N. N diisopropyl- phosphoramidityl)hydroxyéthyl]pyrrole Le 1-[N-(tosyl)]-3-[7-O-(2-cyanoéthyl-N,N diisopropylphosphoramidityl) hydroxyéthyl] pyrrole a été obtenu selon la synthèse suivante :

Le 1-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl) pyrrole (50 mg, 187,5 µmol, leq. ) a été coévaporé 3 fois à l'acétonitrile anhydre, puis il a été dissous dans 1 mL d'acétonitrile. Le ballon a été mis sous atmosphère inerte et 68 uL (48 mg, 375 µmol, 2 eq. ) de DIPEA (diisopropyléthylamine) ont été ajoutés. La chlorophosphine (48 µL, 72 mg, 275 nmol, 1,1 eq. ) a été ajoutée au goutte à goutte et le tout a été laissé sous agitation pendant 5 min. Le mélange réactionnel a ensuite été concentré de moitié à l'évaporateur rotatif et a été déposé sur une colonne de gel de silice coulé dans un mélange cyclohexane/triethylamine (99 : 1) et rincé au cylohexane. Le produit a ensuite été élué avec un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (80 : 20). Puis les bonnes fractions ont été réunies et concentrées. L'huile jaune obtenue a été reprise dans de l'acétonitrile, filtrée sur filtre millex PVDF 0,22 (J. M et reconcentrée pour obtenir 67 mg (144 umol, 77 %) de produit.

C. C. M : Rf= 0,5 cyclohexane/acétate d'éthyle (50 : 50) R M N 31p 148,32 ppm RMN'H : 8 ppm (CD3CN) = 7,75 (d, 2H, J=8Hz, H-o) ; 7,35 (d, 2H, J=8Hz, H-m) ; 7,05 (m, 2H, H-2 + H-5) ; 6,20 (s, 1H, H-4) ; 3,69 (m, 6H, O-CH2-CH2-CN + 2 x NCH (CH3) 2 + 2xH-7) ; 2,60 (m, 4 H, 2xH-6 + O-CH2-CH2-CN) ; 2,37 (s, 3H, CH3-Ph) ; 1,10 (m, 12 H, 2x NCH (CH3) 2).

Exemple 4 : Synthèse du 1-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-[7-O-(2-cyanoéthyl-N,N- diisopropylphosphoramidityhydroxyéthyl] pyrrole La synthèse du 1- [N- (p-monométhoxytrityl) 1-3- [7-0- (2-cyanoéthyl-NN-diisopropyl- phosphoramidityl) hydroxyéthyl] pyrrole a été réalisée selon le schéma suivant :

Le 1-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl) pyrrole (120 mg, 300 j-imol, leq. ) a été coévaporé 3 fois à l'acétonitrile anhydre, puis dissous dans 2 mL d'acétonitrile. Le ballon a été mis sous atmosphère inerte et 160 I1L (114 mg, 600 umol, 2 eq. ) de DIPEA (diisopropyléthylamine) ont été ajoutés. La chlorophosphine (82 u. L, 87 mg, 330 umol, 1,1 eq. ) a été ajoutée au goutte à goutte et le tout a été laissé sous agitation pendant 5 min. Le mélange réactionnel a ensuite été concentré de moitié à l'évaporateur rotatif et a été déposé sur une colonne de gel de silice coulé dans un mélange cyclohexane/triethylamine (99 : 1) et rincé au cyclohexane. Le produit a ensuite été élué avec un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (90 : 10). Puis les bonnes fractions ont été réunies et concentrées. L'huile jaune obtenue a été reprise dans de l'acétonitrile, filtrée sur filtre millex PVDF 0,22 u. M et reconcentrée pour obtenir 120 mg (205 u. mol, 68 %) de produit.

C. C. M : Rf= 0,3 cyclohexane/acétate d'éthyle (50 : 50) RMN 31P : 147, 15 ppm

RMN IH : 8 ppm (CD3CN) = 7,09 (m, 15 H, MMTr + H-5) ; 6,80 (d, 1H, J= 8, 9 Hz, H-2) ; 6,51 (s, 1H, H-4) ; 3,63 (m, 9H, OCH3 + O-CH2-CH2-CN + 2 x NCH (CH3) 2 + 2xH-7) ; 2,67 (m, 4 H, 2xH-6 + O-CH2-CH2-CN) ; 1,10 (m, 12 H, 2x NCH (CH3) 2).

Exemple 5 : Synthèse du 1-(N-tosyl)-3-[2-(triéthyloxy)-hydroxyéthyl !] pyrrole Le 1-(N-tosyl)-3-[2-(triéthyloxy)-hydroxyéthyl)] pyrrole a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant : Oh ber zou . CBr4, PPh3 Triéthylène glycol n N > N 0 N O=S=O O=S=0 AgCO3 o=S=O X Q 88% Q 28% La fonction alcool du 1-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl) pyrrole a été substituée par un brome en présence de CBr4 et de triphénylphosphine, à 0°C dans de l'acétonitrile anhydre. Puis le bras triéthylène glycol a été couplé par substitution nucléophile, en milieu basique. Le rendement global de la réaction a été de 24.6%.

RMN IH du 1-(N-tosyl)-3-[2-(triéthyloxy)-hydroxyéthyl)]pyrrole : # ppm (CDC13) = 7,65 (d, 2H, 2xH Ts) ; 7,20 (d, 2H, 2xH Ts) ; 6,98 (t, 1H, H-5) ; 6,9 (s, 1H, H-2) ; 6,11 (d, 1H, H-4) ; 3,65-3, 5 (m, 14H, 7xCH2-O) ; 2,60 (t, 2H, 2xH-6) ; 2, 33 (s, 3H, CH3 Ts).

Exemple 6 : Synthèse du l-(N-tosyl !-2-(hYdroxyéthyl) pYrrole Le 1-(N-tosyl)-2-(hydroxyéthyl) pyrrole a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant :

Le groupement tosyle a été introduit en position 1 du 2-acétyl pyrrole par réaction avec du chlorure de tosyle, à 0°C dans du dichlorométhane, en présence de sulfate de n- butylammonium et de soude. Puis, le 2-[2-(1-N-tosyl-pyrrole)] acétate de méthyle a été obtenu par transposition oxydative, en utilisant du nitrate de thallium en présence de montmorillonite. Une étape de réduction par LiBH4 conduit au produit recherché, le 1- (N-tosyl)-2- (hydroxyéthyl) pyrrole. Le rendement global de la synthèse a été de 3%.

RMN 1 H du 1- (N-tosyl)-2- (hydroxyéthyl) pyrrole : 8 ppm (CDC13) = 7,64 (d, 2H, 2xH Ts) ; 7,31 (d, 2H, 2xH Ts) ; 7,27 (d, 1H, H-5) ; 6,22 (t, 1H, H-4) ; 6,10 (s, 1H, H-3) ; 3,80 (t, 2H, 2xH-6) ; 2,95 (t, 2H, 2xH-7) ; 2,40 (s, 3H, CH3 Ts).

Exemple 7 : synthèse d'un oligonucléotide sur support solide Un oligonucléotide, a été synthétisé sur support solide (Controlled pore glass, CPG) par la méthode aux phosphoramidites décrite par Beaucage et Lyer, (Tetrahedron, 48,223- 2311,1992).

Le premier nucléoside de la séquence à synthétiser est fixé au support solide (CPG) en position 3', l'extrémité 5'OH du nucléoside étant protégée par un groupement acido labile diméthoxytrityl (DMT).

- Dans une première étape de détritylation, un traitement acide (acide tri ou dichloroacétique) permet d'enlever le groupement DMT afin de générer l'extrémité 5'OH réactive.

- Dans une deuxième étape de « coupling », le phosphoramidite de la base à ajouter est condensé sur ce premier nucléoside afin de générer une liaison phosphite triester. La condensation se fait en présence d'un catalyseur (le tétrazole ou le S-thio ethyl tétrazole, ou le DCI, ou...) - Dans une troisième étape de « capping » les extrémités 5'OH qui n'auraient pas réagit lors de l'étape de condensation précédente sont bloquées par un réactif acylant (anhydride acétique) afin d'éviter des délétions dans la séquence.

- Dans une quatrième étape d'oxydation, la liaison phosphite triester est oxydée en liaison phosphate triester par un traitement oxydant (iode aqueux). La liaison phosphite triester peut également être oxydée par le réactif de Beaucage en solution dans l'acétonitrile pour donner une liaison phosphorothioate triester Les étapes 1 à 4 sont répétées autant de fois qu'il est nécessaire en fonction de la longueur de la séquence à synthétiser. Ces 4 étapes constituent un cycle de synthèse.

Quand la séquence désirée est terminée, le support solide sur lequel se trouve l'oligonucléotide est mis à incuber dans une solution aqueuse d'ammoniaque concentrée afin de cliver l'oligonucléotide du support, de déprotéger les bases et les groupements phosphates.

Exemple 8 : Incorporation de pyrrole substitué en position 3, protégé sur l'azote par un groupement tosvl. à l'extrémité 5'd'un l'oligonucléotide Un dernier cycle de synthèse a été effectué en utilisant le monomère de pyrrole, le 1- [N (tosyl)]-3- [7-0- (2-cyanoéthyl-N, Ndiisopropylphosphoramidityl) hydroxyéthyl] pyrrole, dont la synthèse est décrite à l'exemple 3 ci-dessus. Ce monomère a été utilisé exactement dans les mêmes conditions qu'un synthon nucléotidique classique, à la seule différence du temps de couplage qui est de 15 minutes au lieu de 1.3 minute afin

de tenir compte d'éventuels problèmes d'incorporation. Le schéma réactionnel est représenté ci-dessous. Après déprotection dans l'ammoniaque 30% aqeux (16h à 55°C), l'oligonucléotide brut a été analysé par HPLC échangeuse d'ion (Figure 1). La figure 1 représente la coinjection de l'oligo avec et sans pyrrole pour mettre en évidence l'incorporation. (Gradient de 400 à 640 mM NaCI en 20 min, Colonne Gen Pack Fax (WATERS), 0.75 ml/min). "ouzo cep - (/0-P O nóoss ON O Base n+, O-P O Base n+s O N CN NCO o O=S=O y ase n f-o -1g y ase n Y O o. r" ~O/1/Incorporation du monombre ° n dans le cycle de synthèse NC~O_' O 21 Utilisation du réactif de Beaucage/CH3CN SPky si Y = S au lieu de la solution d'iode aqueuse 0 y \ base, p Base, 0 FIZZ UPS NU _, ? P 6% ü NH3 30%, 6h, 55°C O Base n+, 2/NaOH, 0. 5 M, 55°C, 24h - O Y, 1 ,,, P-o 0 ase n Y pss Y, P.. O 1r=UOUS Y=OouS \ HO Base, zu HO

Exemple 9 : Clivage du groupement tosyle et purification de l'oligonucléotide Le groupement tosyle est éliminé en 4 heures dans une solution d'hydroxyde de sodium 2.5 M à 75°C, mais dans ces conditions l'oligonucléotide se dégrade totalement.

Nous avons donc utilisé des conditions d'hydrolyse plus douces (solution de NaOH 0.5 M à 55°C pendant 24°C) afin d'éviter la dégradation de l'oligonucléotide tout en clivant à 80% le groupement tosyle porté par le pyrrole. Il a alors été possible par HPLC de séparer les 2 oligonucléotides pour isoler l'oligonucléotide totalement déprotégé (Figure 2). La figure 2 représente le clivage du tosyl en milieu NaOH 0. 5M, 55°C (Gradient de 440 à 680 mM NaCl en 20 min. Colonne Gen Pack Fax (WATERS), 0.75 ml/min).

Dans le cas ou l'oligonucléotide n'est pas purifié par HPLC, on peut éliminer l'hydroxyde de sodium par simple précipitation à l'acétone, et l'utiliser tel quel pour les expériences de copolymérisation.

Exemple 10 : Incorporation de pyrrole substitué en position 3, protégé sur l'azote par un groupement monométhoxytrityle, à l'extrémité 5'd'un l'oligonucléotide Un dernier cycle de synthèse est effectué en utilisant le monomère du pyrrole, le dont la synthèse est décrite à l'exemple 4 ci-dessus. Ce monomère est utilisé exactement dans le mêmes conditions qu'une base classique, à la seule différence du temps de couplage qui est de 15 minutes au lieu de 1.3 minute afin de tenir compte d'éventuels problèmes d'incorporation.

D'autre part le groupement MMT est conservé sur l'oligonucléotide à des fins de purification ultérieure. L'oligonucléotide est finalement déprotégé dans l'ammoniaque concentrée (16h à 55°C).

Le schéma réactionnel est représenté ci-dessous. MeO d Ntf /NC-\ Y7/\0 H. Basent,-/\ \ N con o O N _ CN y ase n I NC-OP, Base n o °/" C IO'Me n il Incorporation du monomère NC ~Pß dans le cycle de synthèse n y 21 Utilisation du réactif de 8eaucage/CH3CN NC~op S \ si Y = S au lieu de la solution dtiode aqueuse o Y O bases 0 Base S ? S Ups CPG CPG . ° Y\ Ó\ li NH3 30%, 6h, 55-C 0 Base n+, 2/AcOH 80%, RT, 1 h Y, 1 Y' ? 0 ase n 0 1--in y P, bzw Y O ase, _ p n p PO O Base HO

Exemple 11 : Clivage du groupement monométhoxytrityle et purification de l'oligonucléotide Le grand avantage à utiliser le monomère monométhoxytritylé est qu'il peut être utilisé pour la purification de l'oligonucléotide et qu'il est très facilement éliminable en milieu acide. Il sera donc préféré par rapport au groupement tosyle.

L'oligonucléotide est purifié par un système de purification manuel utilisant les propriétés hydrophobes du groupement MMT. (Colonne CTGen MDP-WS 1000 TM).

Ce système est similaire aux cartouches OPCTM (Applied Biosystems) dans lequel l'oligonucléotide portant le groupement MMT est spécifiquement retenu sur la phase inverse alors que les impuretés ne portant pas le groupement MMT sont éluées dans la phase liquide.

Après élution des espèces avortées, l'oligonucléotide portant le MMT a été élué avec une solution d'acétonitrile. Après évaporation, l'oligonucléotide a été traité par une solution d'acide acétique à 80% pendant une heure. L'acide a été évaporé à froid et l'oligonucléotide a été précipité à l'éthanol. La pureté de ce composé a été controlée par chromatographie en échangeuse d'ion sur colonne Gen Pack Fax (WATERS) dans un gradient de NaCI (figure 3). La figure 3 représente l'oligonucléotide purifié portant le pyrrole substitué en 3 et synthétisé à partir du monomère portant le MMT (gradient de 340 à 580 mM NaCl en 20 min, colonne Gen Pack Fax (WATERS), 0.75 ml/min).

Sa pureté est nettement supérieure à celle que l'on peut obtenir avec le monomère tosylé.

Exemple 12 : Montage éléctrochimique Les manipulations ont toutes été réalisées en milieu aqueux, à l'aide d'un montage électrochimique à trois électrodes relié à un potentiostat Autolab PGSTAT 100 .

Celui-ci impose une différence de potentiel fixe entre l'électrode de référence et l'électrode de travail, la contre-électrode servant à moduler le courant de façon à obtenir la différence de potentiel stable voulue entre l'électrode de travail et la référence, quelque soit les propriétés électriques de la cellule. Les manipulations ayant

lieu en milieu aqueux, les électrodes utilisées ont été les suivantes : électrode de référence = électrode au Calomel Saturé (ECS), contre-électrode = fil de platine et électrode de travail = disque de platine de 1 mm de diamètre.

Exemple 13 : Solutions utilisées (1) Electrolyte LiCI04 dans H-0 Le perchlorate de lithium est l'électrolyte utilisé dans les solutions d'étude. Le produit se présente sous forme de poudre (masse molaire 106,39 g. mol-1) facilement soluble dans l'eau distillée. électrolyte LiC104= 0.5 M dans H2O (2) Solution de polymérisation du 3-(hydroxyéthyl)pyrrole dans l'électrolyte 3- (hydroxyéthyl) pyrrole = 0. 1 M électrolyte LiC104 = 0.5 M dans H20 (3) Solution de copolymérisation du 3-(hydroxyéthyl ! pyrrole avec le pyrrole-ODN (oligonucléotide) en 3 L'ODN (oligonucléotide) a pour séquence : 5'GCCTTGACGATACAGCTA 3' Le pyrrole substitué avec un oligonucléotide selon l'invention (ou pyrrole-ODN) est représenté ci-dessous : je I I O-P-O-Thymine o N 0 1- 0 1 0 TT TTT TTT TGC CTT GAC GAT ACA GCT A

Cette solution a été préparée avec un ratio de 1 unité pyrrole-ODN pour 20000 unités pyrrole.

3- (hydroxyéthyl) pyrrole = 0.1 M [pyrrole-ODN] = 5 µM électrolyte LiC104= 0. 5 M dans H20 (4) Solution de polymérisation du pyrrole-ODN en 3 [pyrrole-ODN] = 5 MM électrolyte LiC104 0. 5 M dans H20 (5) Tampon d'hybridation TH 1X Le TH 1X est le milieu electrolytique utilise comme solution d'hybridation. Il a la composition suivante : - Tampon phosphate 9.5 mM, -NaC1 0. 515 M, -KC1 2. 6 mM, - Tween 0. 048 %, - 1X Denhardt, - ADN de Saumon 10µg/mL.

(6) Solution d'hybridation de cibles non complémentaire Un oligonucléotide non complémentaire de séquence par exemple : 5'CGCCAGCAGCTCCAA 3'a été utilisé à une concentration de 0,1 aM dans TH 1X.

(7) Solution d'hybridation de cibles complémentaire (CP) Un oligonucléotide complémentaire à l'ODN immobilisé dans le film de polypyrrole a été utilisé à une concentration 0*1 pM dans du TH 1X.

5'TAGCTGTATCGTCAAGGC 3' Exemple 14 : Principe de la détection

Les polymères selon l'invention sont notamment utilisables pour la détection d'espèces biologiquement actives suceptibles d'être présentes dans un échantillon et de réagir avec l'ODN présent sur la chaîne polymérique. En effet, comme montré ci-après, on observe que les polymères conjugués fonctionnalisés en position 3 de leur hétérocycle après réaction avec un ou plusieurs ligands, présentent une modification de la réponse électrochimique par rapport à un polymère de référence n'ayant pas réagit avec le ou les ligands d'un milieu biologique, visualisée par un changement du potentiel d'oxydation. Cette variation du signal électrochimique du polymère confère une fonction de capteur, et peut ainsi être utilisée pour une mesure quantitative de l'espèce biologiquement active, soit par la variation du potentiel, à courant fixe, soit par la variation du courant à potentiel fixe.

Dans la première partie des manipulations, il a été vérifié que les monomères sont polymérisable, il a été établi les paramètres optimaux de polymérisation et a été défini les conditions de stabilité et d'électroactivité des dépôts dans les solutions utilisées.

Le point essentiel concerne la nature des propriétés physico-chimiques du polymère appelées à être modifiés lors de la reconnaissance « ODN/AN » (oligonucléotide/acide nucléique). En effet, afin de développer une méthode de mesure rapide, sensible et quantitative de la présence d'AN, le but de la présente invention concerne l'élaboration de matériaux électroactifs dans une seule étape, dont la réponse électrochimique sera modifiée après hybridation « ODN/AN ». La modification concernera une variation de type potentiométrique, par variation du courant du potentiel d'oxydation du polymère, ou ampérométrique, par variation du courant d'oxydation (ou de réduction) observé à un potentiel déterminé. Ces variations de réponse électrochimique pourront être mesurées quantitativement, les films de polymères fonctionnalisés étant utilisés soit comme capteurs électrochimique de types ampérométriques ou potentiométriques.

Exemple 15 : Modification de la réponse électrochimique suite à l'hybridation A-Polymérisation des pyrrole-ODN en 3 sur un pré-film polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole 1-Réalisation d'un pré-film polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole

On applique un courant de 0.75 V pendant 2.4 secondes (charges de 51 mC. cm~2) à partir de la solution (2) Figure 4 : Premier cycle de voltamétrie cyclique d'une solution de monomères 3- (hydroxyéthyl) pyrrole 0. 1M sur une électrode de platine (diamètre 1mm) (électrolyte LiC104 0,5 M dans H20), v = 50 mV. s'1) Figure 5 : Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un film polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole transféré dans l'électrolyte exempte de monomère (LïC104 0,5 M dans H20, v = 50 mV. s-1) Il a été supposé que ce polymère homogénéise la surface et sert de points d'ancrage pour démarrer la deuxième couche de polymérisation des pyrroles substitués en 3 par des ODN. Actuellement il n'est pas possible de réaliser une homopolymérisation de pyrroles substitués en 3 par des ODN directement sur l'électrode. Ainsi la polymérisation de pyrrole-ODN seuls sur ce pré-film polymérique permettrait d'augmenter la quantité de sondes ODN immobilisées sur le support et donc d'observer une modification de la réponse électrochimique du polymère plus évidente.

2-La polymérisation du pyrrole-ODN en 3 sur le pré-film est conduite à 0.6 V pendant 115 secondes (Charges de 19 mC. cm-2) à partir de la solution (4) Figure 6 : Premier cycle de voltamétrie cyclique dans une solution de 5 uM de pyrrole - ODN en 3 sur une électrode de platine (diamètre 1 mm). (électrolyte LiCI04 0.5 M dans H20), v= 50 mV. s-1 Le transfert du polymère double couche dans la solution d'électrolyte LiCI04 est présentée dans la voltamétrie cyclique Figure 7 : Cycles dans LiCI04 0,5 M dans H20, (a) de la sous-couche polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole (Q = 57 mC. cm-2), (b) de la sous-couche et du polypyrrole-ODN en 3 (Q = 15 mC. cm~2). v=50 mV. s'1.

Le dépôt est transféré dans le tampon d'hybridation (solution (5)) puis mis en présence de cibles non complémentaires (solution (6)), rincé, puis mis en présence de cibles complémentaires (solution (7)) Dans ces différentes solutions le dépôt est analysé (cyclé) par voltampérométrie cyclique.

On obtient les résultats de la figure 8 qui montre une baisse d'électroactivité du pic d'oxydation ainsi qu'un décalage de potentiel du pic d'oxydation.

Figure 8 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à différentes solutions. Cycles dans TH 1X, v = 50 mV. s~l. a : 3 jours dans TH 1X ; b : 1 h dans M5 ; c : 2 h dans CP.

Le polymère pyrrole-ODN en 3 est donc capable de traduire le phénomène d'hybridation de ces sondes en un signal électrochimique.

B-Copolymérisation du 3- (hydroxyéthyl) pyrrolelpyrrole-C) DN en 3 sur un pré-film polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole 1-Réalisation d'un pré-film polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole On applique un courant de 0.75 V pendant 0.5 secondes (charges de 9 mC. cm~2) à partir de la solution (2) 2-La copolymérisation 3- (hydroxyéthyl) pyrrole/pyrrole-ODN en 3 sur le pré-film est conduite à 0.75 V pendant 1.3 secondes (Charges de 30 mC. em~2) à partir de la solution (3) Figure 9 : Courbes de voltamétrie cyclique du film contenant deux couches des polymères dans LiClO4 0,5 M dans H20 ; (a) de la sous-couche polymérique de 3- (hydroxyéthyl) pyrrole (Q = 37 mC. cm-2), (b) de la sous-couche et du copolymère substitué en 3 (Q = 60 mC. cm~2). v=50 mV. s~3.

Le dépôt est transféré dans le tampon d'hybridation (solution (5)) puis mis en présence de cibles non complémentaires (solution (6)), rincé, puis mis en présence de cibles complémentaires (solution (7)) Dans ces différentes solutions le dépôt est analysé (cyclé) par voltampérométrie cyclique.

On obtient les résultats de la figure 10 qui montre une baisse d'électroactivité du pic d'oxydation ainsi qu'un léger décalage de potentiel du pic d'oxydation.

Figure 10 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à a : Tampon d'hybridation b : Solution d'hybridation en présence de cibles non complémentaires c : Solution d'hybridation en présence de cibles complémentaires

Le copolymère 3- (hydroxyéthyl) pyrrole/pyrrole-ODN en 3 est donc capable de traduire le phénomène d'hybridation de ces sondes en un signal électrochimique.

C-Copolymérisation directe du 3-0ydroxyéthyl) pyrrole avec/pyrrole ODN en 3 directement sur l'électrode de platine Solution de copolymérisation du 3- (hydroxyéthyl) pyrrole avec le pyrrole-ODN en 3 Cette solution a été préparée avec un ratio de 1 unité pyrrole-ODN pour 20000 unités pyrrole.

3- (hydroxyéthyl) pyrrole = 0.1 M [pyrrole-ODN] = 5 uM électrolyte Licol04= 0.5 M dans H20 La copolymérisation a lieu à 0. 75V sur une électrode de platine diamètre 3mm, contre électrode de platine, référence ECS, agitation et dégazage sous Argon 15 min avant dépôt, temps de dépôt 20s, charge obtenue= 7.39 mC Le dépôt réalisé est par la suite transféré dans une solution d'électrolyte et dans le tampon d'hybridation. L'allure de la courbe de voltamétrie cyclique (figure 11) confirme la présence d'un film électroactif, stable et réversible.

Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à a : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20mV/s b : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20mV/s en présence des sondes non-complémentaires après 20 min c : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20mV/s en présence des sondes complémentaires t=5min d : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20mVs en présence des sondes complémentaires après 20 min L'ajout de cibles non complémentaires montre un faible décalage de potentiel de 10 mV.

La présence de cibles complémentaires conduit à un déplacement d'environ 60mV au bout de 20 min.