Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beinhaltet und Chromosom

Die Erfindung betrifft eine Pyruvatcarboxylase und eine für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, ein Plasmid enthaltend die DNA sowie einen Mikroorganismus zur Produktion und ein Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beinhalten und ein Chromosom. Corynebacterium glutamicum wird industriell für die Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Glutamat und L-Lysin, genutzt. Für die Produktion von L-Lysin wird dem Citrat-Zyklus das Intermediat Oxalacetat entzogen, da es als Vorstufe für Aminosäuren oder Salze der Aminosäuren der Aspartatfamilie dient. Diese sind L-Aspartat, L-Asparagin, L-Lysin, L- Methionin, L-Threonin und L-Isoleucin. Damit der Citrat-Zyklus trotz des Entzugs dieser Intermediate weiter ablaufen kann, muss er durch sogenannte anaplerotische Reaktionen wieder aufgefüllt werden. Bei Wachstum auf Zuckern erfolgt das Auffüllen des Oxalacetat- Pools durch die Carboxylierung von Pyruvat oder Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat. Die ATP-abhängige Bildung von Oxalacetat aus Pyruvat und Kohlenstoffdioxid bzw. HC0 ₃ ^' wird durch das Enzym Pyruvatcarboxylase (Pye) katalysiert. Für die industrielle mikrobielle Pro- duktion von Aminosäuren der Aspartat-Familie wie z.B. L-Lysin und der Glutamat-Familie wie z.B. L-Glutamat ist demnach eine hohe Aktivität der Pye wichtig. Auch für die Produktion anderer Metabolite, die sich aus Intermediaten des Citratzyklus ableiten, ist eine hohe Pye- Aktivität förderlich.

Die enzymatische Aktivität der nativen Pye von C. glutamicum wird allosterisch unter ande- rem durch Aspartat gehemmt und hat daher bei hohen intrazellulären Aspartat-

Konzentrationen nur eine begrenzte Aktivität. Damit ist auch die Produktion von L-Lysin und anderen, vom Oxalacetat abgeleiteten Produkten, begrenzt, da nur eine begrenzte Menge der Vorläufer-Metabolite bereitgestellt wird. Die bisher beschriebenen Pye-Varianten führen nur zu einer moderaten Erhöhung der L-Lysinproduktion. Die Veröffentlichung von Peters-Wendisch et al.„Pyruvate carboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysine production by Corynebacterium glutamicum" im Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology (2001 ) 32: 295-300 offenbart, dass die Deletion des pyc- Gens im Stamm C. glutamicum DG52-5 zu einer 60%igen Reduktion des Lysin-Titers führt, während die plasmid-vermittelte Überexpression des pyc-Gens im Stamm DG52-5 zu einem um 50% gesteigerten Lysin-Titer führt. Weiterhin wird gezeigt, dass die Deletion des pyc- Gens im Wildtyp-Stamm ATCC13032 die durch Tween 60 induzierte L-Glutamat-Produktion um etwa 50% reduziert, während die plasmid-basierte Überexpression des pyc-Gens die Glutamat-Bildung um 700% steigert. Die Wichtigkeit einer hohen Pye-Aktivität für die Produk- tion von Lysin und Glutamat wurde später auch noch in anderen Publikationen gezeigt (Blombach et al. 2007 Applied Microbiology and Biotechnology 76: 615-623; Shirai et al. 2007 Microbial Cell Factories 6: 19; Neuner und Heinzle 201 1 Biotechnology Journal 6: 318- 329; Neuner et al. 2013 Journal of Biotechnology 163: 217-224; Guo et al. 2013 Biotechnology Letters 35: 943-950). Auch für die Produktion anderer Metabolite außer Aminosäuren, die Intermediate des Citratzyklus darstellen oder sich von Intermediaten des Citratzyklus ableiten, ist eine hohe Pye- Aktivität von großer Bedeutung. Die Veröffentlichungen von Shohei Okino et al.„An efficient succinic acid production process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain" in Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 81 : 459-464 und Torben Hoefel et al.„Compara- tive reaction engineering studies for succinic acid production from sucrose by metabolically engineered Escherichia co// ^' in fed-batch-operated stirred tank bioreactiors" in Biotechnol. J. 2012, 7, 1277-1287 offenbaren, dass die Expression bzw. Überexpression von Genen, kodierend für eine Pyruvatcarboxylase, zu einer Produktion oder gesteigerten Produktion von Succinat führt. Dies wird auch in weiteren Publikationen gezeigt (Li et al. 2016 Bioresource Technology 218: 217-223; Tajima et al. 2015 Applied and Environmental Microbiology 81 :

929-937; Litsanov et al. 2012 Applied and Environmental Microbiology 78: 3325-3337; Meng et al. 2016 Microbial Cell Factories 15: 141 ). Für die Produktion von Malat mit Thermobifida fusca erwies sich eine erhöhte Pye-Aktivität ebenfalls als förderlich (Deng et al. 2016 Biotechnology Progress 31 : 14-20). Ebenfalls wurde für die Produktion von Diaminen, die sich aus Intermediaten des Citratzyklus ableiten, wie z.B. Putrescin (1 ,4-Diaminobutan) oder

Cadaverin (1 ,5-Diaminopentan) eine Verstärkung der Pyc-Aktvität eingesetzt (Nguyen et al. 2015 Metabolites 5: 21 1-231 ; Kind et al. 2010 Metabolie Engineering 12: 341 -351 ).

Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology (2002) 58: 217-223) haben die chromosomale Einführung des Aminosäureaustausches Prolin zu Serin an Position 458 der Pye von C. glutamicum in den C. g/ivfam/ci/m-Stamm AHD2 beschrieben, der auf dem Wildtyp ATCC 13032 basiert und zwei Punktmutationen trägt, Val59Ala im Gen für die Homoserin- Dehydrogenase (hom) und Thr31 1 lle im Gen für die Aspartatkinase (/ysC). Der Stamm AHP- 3 mit der pyc-P458S-Mutation bildete 6% mehr L-Lysin als der Parentalstamm AHD-2. Die Autoren beschreiben, dass es für die Identifizierung der pyc-Mutation keinen bekannten selektierbaren Phänotyp gibt und sie vermutlich nur durch vergleichende Genomanalyse zu finden sei. Darüber hinaus wurde die Pye-Variante Pyc-P458S noch nicht weiter charakterisiert.

Die Schrift US 7,300,777 B2 beschreibt einen Organismus, in welchem eine Pyruvatcar- boxylase aus dem C. glutamicum-Slamm NRRL-B1 1474 mit mehreren Mutationen (M1V, E153D, A182S, A206S, H227R, A452G, D1 120E) gegenüber der Pye aus dem C. glutami- cum-Stamm ATCC 21523 isoliert wurde. Mindestens eine der genannten Mutationen führt zu einer Pye-Variante, die durch Aspartat in niedrigen Konzentrationen (1 -10 mM) bis zu 2,5- fach in ihrer Aktivität stimuliert wird und bei höheren Aspartat-Konzentrationen wieder inhibiert wird bis zu maximal 30% der Aktivität in Abwesenheit von Aspartat. Bei 30 mM Aspartat zeigte die Pye aus Stamm NRRL-B11474 noch die gleiche Aktivität wie in Abwesenheit von Aspartat, während die Pye des Stammes ATCC 21523 bei 30 mM Aspartat nur noch 30% der Aktivität besaß, die sie in Abwesenheit von Aspartat zeigte. Die Auswirkung der feed- back-resistenten Pye-Variante aus C. glutamicum NRRL-B1 1474 auf die fermentative Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, wurde in der Schrift US 7,300,777 B2 jedoch nicht offenbart.

Die Deutsche Patentanmeldung 102012016716.4 offenbart ein Screening -Verfahren, mit dem verbesserte Enzyme aufgefunden werden können.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, einen Mikroorganismus, eine Pyruvatcarboxylase, ein für die Pyruvatcarboxylase kodierendes Gen, ein Plasmid oder Chromosom enthaltend dieses Gen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese

Oxalacetat als Vorstufe beinhaltet, zur Verfügung zu stellen, mit denen die Ausbeute, der Titer, die volumetrische Produktivität (g Produkt/Liter/Stunde) oder die spezifische Produktivität (g Produkt/Stunde/g Zelltrockenmasse) bei der Produktion von aus Oxalacetat abgeleiteten Produkten gesteigert werden kann. Insbesondere soll die Produktion von Aminosäuren der Aspartat-Familie gesteigert werden, also L-Lysin, L-Aspartat, L-Asparagin, L-Threonin, L- Isoleucin und L-Methionin. Weiterhin soll die Produktion von Aminosäuren der Glutamat- Familie, wie L-Glutamat, L-Glutamin, L-Arginin oder L-Prolin, von Intermediaten wie Salzen und Säuren des Citrat-Zyklus beispielsweise Succinat, Malat, Fumarat, 2-Oxoglutarat, Citrat oder Isocitrat, von Diaminen wie zum Beispiel 1 ,5-Diaminopentan oder 1 ,4-Diaminobutan oder auch von weiteren Produkten wie Itaconat, Ectoin, gamma-Aminobutyrat, Butanol, 1 - Propanol, L-Citrullin, L-Ornithin, D-Arginin oder 4-Hydroxyprolin gesteigert werden.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 und den nebengeordneten Ansprüchen wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 und der nebengeordneten Ansprüche angegebenen Merkmalen. Mit dem Mikroorganismus, der Pyruvatcarboxylase, dem für die Pyruvatcarboxylase kodierenden Gen, dem Plasmid oder Chromosom enthaltend dieses Gen, sowie mit dem Herstellungsverfahren kann die Ausbeute von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beinhalten, gesteigert werden. Insbesondere kann die Produktion von Aminosäuren der Oxalacetat/Aspartat-Familie gesteigert werden, also L-Lysin, L-Aspartat, L-Asparagin, L- Threonin, L-Isoleucin, L-Methionin. Weiterhin kann die Produktion von Aminosäuren der Glutamat-Familie wie L-Glutamat, L-Glutamin, L-Arginin oder L-Prolin, von Intermediaten wie Salzen und Säuren des Citrat-Zyklus, beispielsweise Succinat, Malat, Fumarat oder 2- Oxoglutarat, Citrat oder Isocitrat, von Diaminen beispielsweise. 1 ,5-Diaminopentan oder 1 ,4- Diaminobutan oder auch von weiteren Produkten wie Itaconat, Ectoin, gamma-Aminobutyrat, Butanol, 1-Propanol, L-Citrullin, L-Ornithin, D-Arginin oder 4-Hydroxyprolin gesteigert werden. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Im Folgenden wird die Erfindung in ihrer allgemeinen Form beschrieben, ohne dass dies einschränkend auszulegen ist. Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine gegenüber dem Stamm C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 veränderte Pyruvatcarboxylase mit einem Austausch von Threonin in Position 343 durch Alanin, und ein für diese Pyruvatcarboxylase kodierendes, genetisch verändertes Gen, ein Plasmid, enthaltend dieses Gen, sowie ein Mikroorganismus enthaltend dieses Gen oder Plasmid sowie das Herstellungsverfahren die gestellten Aufgaben löst. Beispielsweise wird für die Produktion von L-Lysin gegenüber dem Stamm ATCC 13032 /ysC ^T3111 eine um 15% gesteigerte Endkonzentration an L-Lysin festgestellt.

In einer bevorzugten Variante beinhaltet eine gegenüber dem Stamm C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 veränderte Pyruvatcarboxylase neben dem Austausch von Threonin in Position 343 durch Alanin zusätzlich einen Austausch vom Isoleucin in Position 1012 durch Serin. Entsprechend betrifft die Erfindung auch ein für diese Pyruvatcarboxylase mit den Veränderungen T343A und I1012S kodierendes, genetisch verändertes Gen, ein Plasmid, enthaltend dieses Gen, sowie einen Mikroorganismus enthaltend dieses Gen oder Plasmid sowie das Herstellungsverfahren. In dieser Ausführungsform wird für die Produktion von L-Lysin gegenüber dem Stamm ATCC 13032 /ysC ^T3111 eine um 9 bis 19% gesteigerte Endkonzentration an L-Lysin festgestellt.

Erfindungsgemäß wird ein Gen einer Identität von mindestens 70% des Gens nach Sequenz Nr.1 , kodierend für eine Pyruvatcarboxylase zur Verfügung gestellt, welches ausgehend von dem Gen einer mindestens 70%igen Identität von Sequenz Nr.1 in Position 1027-1029 einen Austausch des für Threonin-343 kodierenden Tripletts gegen ein Triplett kodierend für Alanin besitzt. Position 1027-1029 kodiert daher für Alanin. Von der erfindungsgemäßen DNA sind Sequenzen einer 70%igen bis 100%igen Identität umfasst. Vorzugsweise ist die Identität 80%, 85% bis 90%. Besonders bevorzugt 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%. Ganz besonders bevorzugt ist das Gen nach Sequenz Nr. 1. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird ein Gen einer Identität von mindestens 70% des Gens nach Sequenz Nr.1 , kodierend für eine Pyruvatcarboxylase zur Verfügung gestellt, welches ausgehend von dem Gen einer mindestens 70%igen Identität von Sequenz Nr.1 zusätzlich in der Position 3034-3036 ein Triplett besitzt, welches für Serin kodiert. Auch in dieser Ausführungsform sind Sequenzen einer 70%igen bis 100%igen Identität umfasst. Vorzugsweise ist die Identität 80%, 85% bis 90%. Besonders bevorzugt 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%. Ganz besonders bevorzugt ist das Gen nach Sequenz Nr. 2

Identität wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung I (%) = [1-V/X] ^χ 100, definiert werden, worin I Identität bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide kodieren, alle Sequenzen umfasst, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen.

Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Vektor, vorzugsweise ein Plasmid, enthaltend dieses Gen kodierend für eine Pyruvatcarboxylase mit der Veränderung T343A oder T343A und

I1012S zur Verfügung gestellt. Dabei kommt grundsätzlich jeder Leervektor oder jedes Leer- plasmid als Ausgangsvektor oder Ausgangsplasmid in Betracht. Beispielsweise kann als Leervektor das Plasmid pAN6, wie es in der Veröffentlichung von Frunzke et al., Molecular Microbiology 2008, 67:305-322 beschrieben wird, eingesetzt werden, bei dem das erfin- dungsgemäße Gen inseriert ist.

Erfindungsgemäß wird auch ein Chromosom zur Verfügung gestellt, welches die erfindungsgemäße DNA mit der Veränderung T343A oder T343A und I1012S enthält. Dabei soll die erfindungsgemäße DNA so in das Chromosom inseriert sein, dass die Funktion der für die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus relevanten Gene nicht beeinträchtigt oder zerstört wird.

Durch Expression des Gens nach Sequenz Nr. 1 wird eine erfindungsgemäße Pyruvatcarboxylase mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität zu der Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 3 erhalten, bei welcher ausgehend von der Pyruvatcarboxylase des Stammes ATCC 13032 /ysC ^T3111 das Threonin an Position 343 durch Alanin ersetzt ist (pyc ^{T3 3A} ). In Position 343 der Pyruvatcarboxylase befindet sich daher erfindungsgemäß Alanin, wie beispielsweise in Seq. Nr.3. Von der erfindungsgemäßen Pyruvatcarboxylase sind Pyruvatcar- boxylasen einer 90%igen bis 100%igen Identität zu der Sequenz Nr. 3 umfasst. Vorzugswei- se ist die Identität 95%, 96%, oder 97%, besonders bevorzugt 98% oder 99% der erfindungsgemäß veränderten Pyruvatcarboxylase von Sequenz Nr.3. Ganz besonders bevorzugt ist die Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 3.

Durch Expression des Gens nach Sequenz Nr. 2 wird eine erfindungsgemäße Pyruvatcarboxylase mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität zu der Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 4 erhalten, bei welcher ausgehend von der Pyruvatcarboxylase des Stammes ATCC 13032 /ysC ^T3111 das Threonin in Position 343 durch Alanin ersetzt ist und zusätzlich das Isoleucin an Position 1012 durch Serin ersetzt ist (pyc ^T343A;l1012S ). In Position 343 der Pyruvatcarboxylase befindet sich daher erfindungsgemäß Alanin und in Position 1012 Serin. Von der erfindungsgemäßen Pyruvatcarboxylase sind Pyruvatcarboxylasen einer 90%igen bis 100%igen Identität zu der Sequenz Nr. 4 umfasst. Vorzugsweise ist die Identität 95%, 96% oder 97%, besonders bevorzugt 98% oder 99% der erfindungsgemäß veränderten Pyruvatcarboxylase von Sequenz Nr. 4. Ganz besonders bevorzugt ist die Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 4.

Der Ausdruck Identität wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung I (%) = [1-V/X] ^χ 100, definiert werden, worin I Identität bedeutet, X die Gesamtzahl an Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedliche Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Folgende Sequenzen sind im Sequenzprotokoll gelistet:

Seq. Nr. 1 : Erfindungsgemäß veränderte DNA-Sequenz der Plasmid-basierten Variante, codierend für die erfindungsgemäß veränderte Pyruvatcarboxylase pyc ^T343A

Seq. Nr. 2: Erfindungsgemäß veränderte DNA-Sequenz der Plasmid-basierten Variante, codierend für die erfindungsgemäß veränderte Pyruvatcarboxylase py _C ^{T343A;| 012S}

Seq. Nr. 3: Aminosäuresequenz der erfindungsgemäß veränderten Pyruvatcarboxylase

Pyc-T343A.

Seq. Nr. 4: Aminosäuresequenz der erfindungsgemäß veränderten Pyruvatcarboxylase

Pyc-T343A;I1012S. Seq. Nr. 5: DNA-Sequenz des Referenzstammes ATCC 13032 /ysC ^T3111 für die Wildform der Pyruvatcarboxylase.

Seq. Nr. 6. Aminosäuresequenz der Pyruvatcarboxylase des Referenzstammes

ATCC 13032 /ysC ^{T3 11} für die Wildform der Pyruvatcarboxylase. Seq. Nr. 7: DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen chromosomalen Variante DNA-pyc- A1027G-T1035G codierend für Pyc-T343A.

Seq. Nr. 8: DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen chromosomalen Variante DNA-pyc- A1027G-T1035G-T3035G-C3039G codierend für Pyc-T343A;I1012S.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung kann die Expression der erfindungsgemäßen Gene verstärkt werden. Dazu können beispielhaft aber nicht beschränkend stärkere Promotoren verwendet werden, die Anzahl der Genkopien kann erhöht werden oder es kann die Ribosomenbindestelle verändert werden, um die Translation der Boten-RNA zu steigern. Die für die Durchführung dieser Methoden zu verwendenden Verfahren sind dem Fachmann bekannt.

Weiterhin ist ein Mikroorganismus Gegenstand der Erfindung, welcher ein erfindungsgemäßes Gen oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieser Mikroorganismus ist vorzugsweise ein coryneformes Bakterium. Als coryneforme Bakterien können beispielsweise Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoa- cidophilum, Corynebacterium melassecola, Corynbacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Brevibacterium flavum oder Brevibacterium lactofermentum genannt werden.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Zymomonas, Methylobacterium, Ralstonia, Clostridium, Candida, Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces und Yarrowia, wobei Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Zymomonas mobilis, Yarrowia lipoly- tica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha und Pichia pastoris besonders bevor- zugt sind. Erfindungsgemäß am meisten bevorzugte Zellen sind solche der Gattung Corynebacterium und Escherichia, wobei Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli ganz besonders bevorzugte Bakterienstämme sind. Insbesondere in dem Fall, in dem das Produkt L-Lysin ist, können sich die gentechnisch veränderten Zellen insbesondere von Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC1 020, und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709, Brevibacterium flavum FERM-P 1708, Brevibacterium lactofermentum FERM- P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und Corynebacterium glutamicum DSM 5715 oder wie beispielsweise der L-Methionin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC21608 ableiten. Als Beispiele geeigneter Escherichia co// ^' -Stämme seien Escherichia co// ^' AJ 1 1442 (siehe JP 56-18596 und US 4,346,170), Escherichia co//-Stamm VL61 1 und Escherichia co//-Stamm WC196 (siehe WO-A-96/17930) genannt.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beinhaltet, zur Verfügung gestellt.

Dazu wird ein Mikroorganismus, enthaltend ein für die Pyruvatcarboxylase codierendes Gen mit der genetischen Veränderung, kodierend für den Austausch T343A oder zwei Austau- sehe T343A und I1012S im Protein, für die Produktion von aus Oxalacetat abgeleiteten Stoffwechselprodukten verwendet.

Hierzu wird ein Gen mit einer mindestens 70%igen Identität zu der Sequenz Nr. 1 , bei der in den Positionen 1027-1029 das für Threonin kodierende Triplett gegen ein Triplett kodierend für Alanin ausgetauscht ist, oder ein Gen mit einer mindestens 70%igen Identität zu der Sequenz Nr. 2, bei der in den Positionen 1027-1029 das für Threonin kodierende Triplett gegen ein Triplett kodierend für Alanin ausgetauscht ist und zusätzlich in Position 3034-3036 das für Isoleucin kodierende Triplett gegen ein Triplett kodierend für Serin ausgetauscht ist, in den Mikroorganismus eingeführt.

Von dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung eines Gens mit einer mindes- tens 70%igen bis 100%igen Identität zu dem Gen nach Sequenz Nr. 1 oder 2 umfasst.

Vorzugsweise wird ein Mikroorganismus mit einem Gen einer Identität von mindestens 80% bis 90% zu Sequenz Nr. 1 oder Seq. Nr. 2 verwendet. Besonders bevorzugt wird ein Gen mit einer Identität von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu Sequenz Nr. 1 oder Sequenz Nr. 2 für das Herstellungsverfahren verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist das Gen nach Sequenz Nr. 1 oder Sequenz Nr. 2.

Das erfindungsgemäß eingesetzte für die Pyruvatcarboxylase kodierende Gen kann dabei chromosomal oder in einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmid, verwendet werden. Das Gen wird exprimiert und die erfindungsgemäße Pyruvatcarboxylase mit einer Identität von mindestens 90% zu der Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 3, bei der in Position 343 Threonin durch Alanin ersetzt ist, bewirkt die erhöhte Produktion von Oxalacetat abgeleiteten Stoffwechselprodukten.

Auch die Expression der erfindungsgemäßen Pyruvatcarboxylase mit einer Identität von mindestens 90% zu der Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 4, bei der in Position 343 Threonin durch Alanin und in Position 1012 Isoleucin durch Serin ersetzt ist, bewirkt die erhöhte Produktion von Oxalacetat abgeleiteten Stoffwechselprodukten.

Von dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung einer Pyruvatcarboxylase mit einer 90%igen bis 100%igen Identität zu der Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 3 und Sequenz Nr. 4 umfasst.

Vorzugsweise ist die Identität der erfindungsgemäß verwendeten Pyruvatcarboxylase 95%, 96% oder 97%, besonders bevorzugt 98% oder 99% zu Sequenz Nr. 3 oder 4. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 3. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung der Pyruvatcarboxylase nach Sequenz Nr. 4. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Gen verstärkt exprimiert.

Die so erhaltenen Mikroorganismen werden fermentiert.

Als Produktionsorganismus kann vorzugsweise ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Zymomonas, Methylobacterium, Ralstonia, Clostridium, Candida, Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces und Yarrowia, wobei Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Zymomonas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha und Pichia pastoris besonders bevorzugt sind, eingesetzt werden. Erfindungsgemäß am meisten bevorzugte Zellen sind solche der Gattung Corynebacterium und Escherichia, wobei Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli ganz besonders bevorzugte Bakterienstämme sind. Insbesondere in dem Fall, in dem der Metabolit L-Lysin ist, können die gentechnisch veränderten Zellen bzw. Mikroorganismen insbesondere von Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutami- cum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium me- lassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacteri- um flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709, Brevibacterium flavum FERM-P 1708, Brevibacterium lactofer- mentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und Corynebacterium glutamicum DSM 5715 oder wie beispielsweise der L-Methionin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC21608 ableiten. Als Beispiele geeigneter Escherichia co//-Stämme seien Escherichia coli AJ1 1442 (siehe JP 56-18596 und US 4,346,170), Escherichia co//-Stamm VL61 1 und Escherichia coli- Stamm WC196 (siehe WO-A-96/17930) eingesetzt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere Aminosäuren der Aspartat- Familie gesteigert werden, also L-Lysin, L-Aspartat, L-Asparagin, L-Threonin, L-Isoleucin und L-Methionin hergestellt werden. Weiterhin kann die Produktion von Aminosäuren der Gluta- mat-Familie, wie L-Glutamat, L-Glutamin, L-Arginin oder L-Prolin, von Intermediaten des Citrat-Zyklus, wie z.B. Succinat, Fumarat, Malat, Citrat, Isocitrat oder 2-Oxoglutarat, von

Diaminen z.B. Diaminopentan oder Diaminobutan oder auch anderen Produkten wie Itaco- nat, Ectoin, gamma-Aminobutyrat, Butanol, 1 -Propanol, L-Citrullin, L-Ornithin, D-Arginin oder 4-Hydroxyprolin gesteigert werden.

Das durch Fermentation hergestellte und in den Kulturüberstand sekretierte Produkt wird dann angereichert und isoliert.

Im Folgenden werden experimentelle Ergebnisse anhand von Figuren dargestellt, die die Erfindung exemplarisch wiedergeben.

Es zeigt:

Fig. 1 : Wachstum von C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit nativer Pye, chromosomal codierter Pyc ^T343A und chromosomal codierter p _yc ^T343A :' ^{10 2S} .

Fig. 2: L-Lysin-Produktion der Stämme C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 , C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit chromosomal codierter Pyc ^T343A , sowie C. glutamicum ATCC 13032 /ysC™ ¹¹ mit chromosomal codierter p _yc ^T343A ' ^{l10 2S} Fig. 3: Wachstum von C. glutamicum ATCC 13032 /ysC™ ¹¹ Apyc mit dem Plasmid pAN6- p _yc T343A;M012S

Fig. 4: L-Lysin-Produktion des Stammes C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 Apyc mit dem Plasmid pAN6- pyc ^T343A;l1012S .

In Figur 1 wird das Wachstum des Stammes C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit den chromosomal codierten Pye-Varianten Pyc ^T343A und pyc ^{T343A;l10 2S} dargestellt. In Figur 1 zeigt die Abszisse die Zeit in Stunden (h) und die Ordinate den Wert für Backscatter bei 620 nm (A.U.) als Maß der Zelldichte. Als Kontrolle diente der Stamm C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit nativer Pye, also mit Threonin an Position 343 und Isoleucin an Position 1012. Alle Stämme wurden in CGXII Minimalmedium mit 4% (wt/vol) Glucose in einem BioLector® System bei 30 °C und 1200 rpm für 24 h kultiviert.

Figur 2 zeigt die L-Lysin-Produktion der Stämme C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit der chromosomal codierten Pye-Variante Pyc ^{T3 3A} und mit der chromosomal codierten Pyc- Variante py _C ^T343A;|1012S Darin bezeichnet die Abszisse drei unabhängige Replikate sowie den Mittelwert aus den drei Experimenten und die Ordinate die prozentuale Lysin-Konzentration, wobei die Lysin-Konzentration des Kontrollstammes ATCC 13032 /ysC ^T3111 (schwarze Balken) in den drei unabhängigen Replikaten jeweils als 100% gesetzt wurde. Die L-Lysin Konzentrationen für den Stamm ATCC 13032 /ysC ^T3111 pyc ^{T3 3A} sind als schräg schraffierte Bal- ken dargestellt. Die L-Lysin Konzentrationen für den Stamm ATCC 13032 /ysC ^1"3111 pyc ^{T343A;l 01 S} sind als waagerecht schraffierte Balken dargestellt. Nach Kultivierung der Zellen in einem BioLector® System für 24 h (s. Fig.1 ) wurden die Zellen geerntet und die L-Lysin Konzentration im Überstand der jeweiligen Kulturen via reversed-phase HPLC mit ortho-Phthaldialdehyd-Derivatisierung bestimmt. In jedem der drei Replikate zeigte sowohl der Stamm mit der mutierten Pye-Variante Pyc ^{T3 3A} als auch der Stamm mit der mutierten Pye-Variante py _C ^{T343A I1012S} einen höheren Lysin-Titer als der Vergleichsstamm mit nativer Pye. Es ist eine Steigerung der finalen L-Lysin-Konzentration um durchschnittlich 15-19% gegenüber C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 zu beobachten. Die gemessenen Lysin- Konzentrationen der einzelnen Mutanten wurden mittels t-Test verglichen. Dabei stehen die in der Abbildung gezeigten Sternchen für p .s 0,01.

In Figur 3 ist das Wachstum des Stammes C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 Apyc mit dem Plasmid pAN6-pyc ^{T3 3A;l1012S} dargestellt. In der Figur zeigt wiederum die Abszisse die Zeit in Stunden (h) und die Ordinate den Wert für Backscatter bei 620 nm (A.U.). Zur Kontrol- le wurden die Stämme C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 Apyc, welche entweder das Leerplasmid pAN6 oder das Plasmid pAN6-pyc mit nativer pyc tragen, mitgeführt. Alle Stämme wurden in CGXII Minimalmedium mit 4% (wt/vol) Glucose und 25 mg L ^"1 Kanamycin in einem BioLector® System bei 30 °C und 1200 rpm für 24 h kultiviert. Zu Beginn der Kulti- vierung wurde die Expression von pyc mit 1 mM IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactosid) induziert.

Figur 4 zeigt die L-Lysin-Produktion des Stammes C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 Apyc mit dem Plasmid pAN6- py _C ^T343A;|1012S Darin bezeichnet die Abszisse den Stamm C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 Apyc enthaltend den Leervektor pAN6 (schraffierter Balken), den Vektor pAN6-pyc mit nativer Pyruvatcarboxylase (weißer Balken) oder den Vektor pAN6- pyc ^T343A;l1012S (schwarzer Balken) im Vergleich. Nach Kultivierung der Zellen in einem BioLector® System für 24 h (s. Fig. 3), wurden die Zellen geerntet und die L-Lysin Konzentration im Überstand der jeweiligen Kulturen via reversed-phase HPLC mit ortho-Phthaldialdehyd- Derivatisierung bestimmt. Als Vergleich wurde die Lysin-Produktion im Stamm C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 Apyc/pAN6 (ohne Pyc) und ATCC 13032 /ysC ^{T311 l} /pAN6-pyc (mit nativer Pyc) gemessen. Die vorliegenden Daten stellen Mittelwerte und Standardabweichungen aus mindestens sechs biologischen Replikaten dar. Die gemessenen Lysin- Konzentrationen der einzelnen Mutanten wurden mittels t-Test verglichen. Dabei steht das in der Abbildung gezeigte Sternchen für p <0.05. Es ist eine deutliche Erhöhung der finalen L-Lysin-Konzentration um 9% in dem Stamm mit der Pyc ^T343A;l1012S -Variante im Vergleich zu dem Stamm mit nativer Pyc zu erkennen.

Im Rahmen der Erfindung konnte eine Mutation im pyc-Gen identifiziert werden, die zu einer erhöhten L-Lysin-Produktion führt. Es wurde zunächst mittels error prone-PCR eine Plasmid- basierte Pyc-Mutanten-Bibliothek erstellt, die anschließend im Stamm ATCC1303 /ysC ^T3111 Apyc mit Hilfe eines genetisch kodierten Lysin-Sensors (pSenLys) und Fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zunächst auf erhöhte Fluoreszenz gescreent wurde. Die isolierten Zellen wurden anschließend vermehrt und auf erhöhte Lysinbildung getestet. Diese Methoden sind dem Fachmann bekannt (vgl. Binder et al., Genome Biol. 2012, 13:R40). Die dabei isolierten Gen- und Enzymvarianten wurden genetisch charakterisiert, was schließlich zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Pye-Variante führte, welche die Produktion von L-Lysin, sowie anderen, von Oxalacetat abgeleiteten Metaboliten, steigert. Die gefundenen Mutationen lauten T343A und T343A;I1012S. 1. Chromosomal kodierte Pye-Variante Pvc-T343A:

Messung der L-Lysin-Produktion von C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit der chromosomal kodierten Pye-Variante Pyc-T343A:

Der Austausch des Threonin-Codons 343 im chromosomalen pyc-Gen durch ein Alanin- Codon erfolgte mittels zweifacher homologer Rekombination unter Verwendung des Vektors pK19mobsacB nach dem Fachmann bekannten Verfahren (Schäfer et al. 1994 Gene 145:69-73; Hochheim et al. 2017 Biotechnol Lett 39:283-288). Verglichen wurde die Produktion mit dem Stamm C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit nativem chromosomalem pyc-Gen. Die Stämme wurden in 800 μΙ CGXII-Minimalmedium mit 4% (wt/vol) Glucose für 24h in einem Biolector-System bei 30°C und 1200 rpm kultiviert (Fig.1 ). Die

Start-OD bei 600 nm betrug 0,5. Nach 24 h wurden die Zellen der einzelnen Kulturen se- dimentiert und die L-Lysin-Konzentration im Überstand gemessen. Die Messung erfolgte über reversed phase HPLC mit einer Vorsäulenderivatisierung der Aminosäuren über ortho-Phthaldialdehyd. Als mobile Phase wurde ein Gradient von 80% Lösung A (100 mM Natrium-Acetat (pH 7,2)) und 20% Lösung B (100% (vol/vol) Methanol) zu 20% Lösung A und 80% Lösung B verwendet. Das Beispiel zeigt, dass die untersuchte Pye- Variante einen positiven Effekt auf die Lysin-Produktion hat und diese bis zu 15% gesteigert werden kann, wenn die Pye-Variante Pyc-T343A anstelle des wildtypischen Pye- Proteins chromosomal codiert ist. 2. Chromosomal kodierte Pye- Variante Pvc-T343A:I1012S:

Messung der L-Lysin-Produktion von C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit der chromosomal kodierten Pye- Variante Pyc-T343A;I1012S:

Der Austausch des Threonin-Codons 343 durch ein Alanin-Codon und des Isoleucin- Codons 1012 durch ein Serin-Codon im chromosomalen pyc-Gen erfolgte mittels zweifa- eher homologer Rekombination unter Verwendung des Vektors pK19mobsacB nach dem

Fachmann bekannten Verfahren (Schäfer et al. 1994 Gene 145:69-73; Hochheim et al. 2017 Biotechnol Lett 39:283-288). Verglichen wurde die Produktion mit dem Stamm C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^T3111 mit nativem chromosomalem pyc-Gen. Die Stämme wurden in 800 μΙ CGXII-Minimalmedium mit 4% (wt/vol) Glucose für 24h in einem Biolec- tor-System bei 30°C und 1200 rpm kultiviert (Fig.1 ). Die Start-OD bei 600 nm betrug 0,5.

Nach 24 h wurden die Zellen der einzelnen Kulturen sedimentiert und die L-Lysin- Konzentration im Überstand gemessen. Die Messung erfolgte über reversed phase HPLC mit einer Vorsäulenderivatisierung der Aminosäuren über ortho-Phthaldialdehyd. Als mobile Phase wurde ein Gradient von 80% Lösung A (100 mM Natrium-Acetat (pH 7,2)) und 20% Lösung B (100% (vol/vol) Methanol) zu 20% Lösung A und 80% Lösung B verwendet. Das Beispiel zeigt, dass die untersuchte Pye-Variante einen positiven Effekt auf die Lysin-Produktion hat und diese bis zu 19% gesteigert werden kann, wenn die Pye-Variante Pyc-T343A;I1012S anstelle des wildtypischen Pye-Proteins chromosomal codiert ist. 3. Plasmid-kodierte Pvc-Variante Pvc-T343A;I1012S:

Messung der L-Lysin-Produktion von C. glutamicum ATCC 13032 /ysC ^{T311 l} Apyc/pAN6-

Verglichen wurde die Produktion mit dem Stamm C. glutamicum ATCC 13032

/ysC ^{T311 l} Apyc/pAN6-pyc codierend die native Pye und der Leerplasmidkontrolle C. gluta- micum ATCC 13032 /ysC ^{T31 l} Apyc/pAN6. Die Stämme wurden in 800 μΙ CGXII-

Minimalmedium mit 4% (wt/vol) Glucose und 25 mg/l Kanamycin für 24 h in einem Biolec- tor-System bei 30°C und 1200 rpm kultiviert (Fig.3). Die Start-OD bei 600 nm betrug 0,5. Nach 24 h wurden die Zellen der einzelnen Kulturen sedimentiert und die L-Lysin- Konzentration im Überstand gemessen. Die Messung erfolgte über reversed phase HPLC mit einer Vorsäulenderivatisierung der Aminosäuren über ortho-Phthaldialdehyd. Als mobile Phase wurde ein Gradient von 80% Lösung A (100 mM Natrium-Acetat (pH 7,2)) und 20% Lösung B (100% (vol/vol) Methanol) zu 20% Lösung A und 80% Lösung B verwendet. Das Beispiel zeigt, dass die Lysin-Produktion um bis zu 9% gesteigert werden kann, wenn die Pye-Variante py _C ^T343A;|1012S anstelle der wildtypischen Pye auf dem Plasmid pAN6 codiert ist. (Fig.4)

Disclaimer:

Gegenstand der Erfindung sind nicht Mutationen, die aus nachstehendem Stand der Technik bekannt sind, wie Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology (2002) 58: 217- 223), nämlich die chromosomale Einführung des Aminosäureaustausches Prolin zu Serin an Position 458 der Pye von C. glutamicum in den C. glutamicum-Stamm AHD2, der auf dem Wildtyp ATCC 13032 basiert und zwei Punktmutationen trägt, Val59Ala im Gen für die Ho- moserin-Dehydrogenase (hom) und Thr31 1 lle im Gen für die Aspartatkinase (lysC) und aus der Schrift US 7,300,777 B2, mit einem Organismus, in welchem eine Pyruvatcarboxylase aus dem C. glutamicum-Stamm NRRL-B1 1474 mit mehreren Mutationen (M1V, E153D, A182S, A206S, H227R, A452G, D1120E) gegenüber der Pye aus dem C. glutamicum- Stamm ATCC 21523 isoliert wurde.