BOEUF PHILIPPE (AU)
PASTEUR INSTITUT (FR)
BEHR CHARLOTTE (FR)
BOEUF PHILIPPE (AU)
WO1999054510A2 | 1999-10-28 | |||
WO2000020629A2 | 2000-04-13 | |||
WO2003060119A2 | 2003-07-24 | |||
WO1996039536A1 | 1996-12-12 |
FR2842211A1 | 2004-01-16 |
BOEUF PHILIPPE ET AL: "CyProQuant-PCR: a real time RT-PCR technique for profiling human cytokines, based on external RNA standards, readily automatable for clinical use." BMC IMMUNOLOGY ÄELECTRONIC RESOURCEÜ. 2005, vol. 6, no. 1, 2005, page 5, XP009067336 ISSN: 1471-2172
1. | Procédé de quantification absolue d'un ou de plusieurs ARN cibles dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : (i) pour chacun des ARN cibles à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN cible, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN cibles synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (ii) la transcription inverse d'un ou plusieurs ARN de gènes de ménage à quantifier, puis l'amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN de gènes de ménage, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN de gène de ménage synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (iii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i) et (ii), (iv) déduction d'une part de la quantité de l'ARN ou des ARN cibles dans l'échantillon et d'autre part de la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage dans l'échantillon, et (v) Normalisation de la quantité de l'ARN ou des ARN cibles par rapport à Ia quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage. |
2. | Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le couple d'amorces est choisi de façon à respecter les critères suivants : les amorces ne se chevauchent pas et permettent l'amplification d'un fragment de taille inférieure ou égale à 200 paires de bases, de préférence inférieure ou égale à 150 paires de base, de manière encore préférée inférieure ou égale à 100 paires de bases, le contenu en nucléotides G et C des amorces est compris entre 20 et 80%, les amorces ne contiennent pas de répétition de plus de trois guanines consécutives, la température de fusion des amorces est comprise entre 58 et 6O0C, les 5 nucléotides à l'extrémité 3' des amorces comportent au maximum 2 bases G et/ou C. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel I1ARN déterminé est un ARN viral, un ARN 16S ou un ARN messager. , Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la quantification absolue des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : (i) pour chacun des ARN messagers de cytokines à quantifier, transcription inverse, puis amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN messager, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN cibles synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (ii) la transcription inverse d'un ou plusieurs ARN de gènes de ménage à quantifier, puis l'amplification du produit de cette transcription inverse, à l'aide d'un couple d'amorces spécifique de chaque ARN de gènes de ménage, à partir de l'échantillon biologique, et à partir d'une gamme d'ARN de gène de ménage synthétique comprenant la séquence amplifiée par le couple d'amorces spécifique, (iii) détection en temps réel du produit des réactions d'amplification de l'étape (i) et (ii), (iv) déduction d'une part de la quantité de l'ARN ou des ARN messagers de cytokines dans l'échantillon et d'autre part de la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage dans l'échantillon, et (v) Normalisation de la quantité de l'ARN ou des ARN messagers de cytokines par rapport à la quantité de l'ARN ou des ARN de gènes de ménage. |
3. | 5 Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel pour chaque ARN messager à quantifier, la gamme d'ARN synthétique est constituée d'une série de dilutions d'un ARN transcrit à partir d'une cassette d'ADN comprenant le promoteur de l'ARN polymérase du phage T7 en 5' et en 3' de la séquence de l'amplicon amplifié à partir de l'ARN messager, par le couple d'amorces spécifique dudit ARN messager. |
4. | 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les étapes (i) et (ii) sont effectuées par RTPCR, toutes les réactions de RTPCR étant réalisées dans les mêmes conditions de température. |
5. | 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la détection en temps réel du produit d'amplification est effectuée par mesure d'un signal susceptible d'être transcrit électroniquement, de préférence par mesure de l'incorporation d'un intercalant fluorescent, et de manière encore préférée par mesure de l'incorporation de SYBR Green I. |
6. | 8 Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel la RTPCR est effectuée en une seule étape. |
7. | 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'étape (i) est précédée d'une étape d'introduction d'une quantité connue d'ARN hétérologue ou de cellules hétérologues dans l'échantillon biologique et d'une étape d'extraction de l'ARN de l'échantillon biologique, et dans lequel ledit ARN hétérologue ou l'ARN desdites cellules hétérologues fait l'objet, à l'étape (i), d'une transcription inverse suivie d'une amplification du produit de cette transcription inverse. |
8. | 10 Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel les réactions de RTPCR sont effectuées dans les conditions de thermocyclage suivantes : transcription inverse : incubation des amorces : 8 à 12 minutes entre 23 et 27°C, de préférence 10 minutes à 250C ; action de la transcriptase inverse : 20 à 80 minutes entre 45 et 510C, de préférence 30 minutes à 48°C ; inactivation de la transcriptase inverse : 4 à 10 minutes entre 90 et 980C, de préférence 5 minutes à 95°C ; 2 à 7 minutes entre 45 et 55°C, de préférence 5 minutes à 500C, puis 8 à 12 minutes entre 90 et 98°C, de préférence 10 minutes à 95°C ; puis 30 à 45 cycles, de préférence 40 cycles, comprenant : 12 à 20 secondes entre 90 et 98°c, de préférence 15 secondes à 95°C, et 50 à 80 secondes entre 55 et 65°C, de préférence 1 minute à 600C. |
9. | 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 dans lequel les réactions de RTPCR sont effectuées dans les conditions de thermocyclage suivantes : transcription inverse : incubation des amorces : 10 minutes à 25°C ; action de la transcriptase inverse : 30 minutes à 480C ; inactivation de la transcriptase inverse : 5 minutes à 95°C ; 5 minutes à 5O0C puis 10 minutes à 95°C ; puis 40 cycles, comprenant : 15 secondes à 95°C, et 1 minute à 60°C. |
10. | 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , dans lequel au moins deux des couples d'amorces sont choisis parmi les suivants ou parmi les couples d'amorces ayant au moins 85% d'identité avec les couples d'amorces suivants : couple spécifique de l'IL1 fi humaine : 5' CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA 3' (SEQ ID No : 1 ) et 5' GGGAACTGGGCAGACTCAAA 3' (SEQ ID No : 2) couple spécifique de l'IL10 humaine : 5' GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT 3' (SEQ ID No : 3) et 5' CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT 3' (SEQ ID No : 4) couple spécifique de l'IL12p40 humaine : 5' CATGGTGGATGCCGTTCA 3' (SEQ ID No : 5) et 5' ACCTCCACCTGCCGAGAAT 3' (SEQ ID No : 6) couple spécifique de l'IL13 humaine : 5' ACAGCCCTCAGGGAGCTCAT 3' (SEQ ID No : 7) et 5' TCAGGTTGATGCTCCATACCAT 3' (SEQ ID No : 8) couple spécifique de l'IL15 humaine : 51 CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTT 3' (SEQ ID No : 9) et 5' CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA 31 (SEQ ID No : 10) couple spécifique de l'IL18 humaine : 5'CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA3' (SEQ ID No : 11)et 5'GGGAACTGGGCAGACTCAAA3' (SEQ ID No : 12) couple spécifique de l'IFNγ humain : 5' GTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTA 3' (SEQ ID No : 13) et 5' AAAAGAGTTCCATTATCCGCTACATC 3' (SEQ ID No : 14) couple spécifique du MIF humain : 5' GCCCGGACAGGGTCTACA 3' (SEQ ID No : 15) et 5' CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT 3' (SEQ ID No : 16) couple spécifique du TGF&1 humain : 5' CAAGGGCTACCATGCCAACT 3! (SEQ ID No : 17) et 5' AGGGCCAGGACCTTGCTG 3' (SEQ ID No : 18) couple spécifique du TNFα humain : 5' CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC 3' (SEQ ID No : 19) et 5' GGTTTGCTACAACATGGGCTACA 3' (SEQ ID No : 20) couple spécifique de l'IL4 humaine : 51 AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC 3' (SEQ ID No : 21 ) 51 GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT 3' (SEQ ID No : 22) couple spécifique de la β2μglobuline humaine : δ'AATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGAS' (SEQ ID No : 23) et δ'GGCTGTGACAAAGTCACATGGTTS' (SEQ ID No : 24) couple spécifique de la séquence YWHAZ humaine : 5' ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 3' (SEQ ID No : 25) 5' CCGCCAGGACAAACCAGTAT 31 (SEQ ID No : 26) couple spécifique de l'Ubiquitine C humaine : 5' ATTTGGGTCGCGGTTCTTG 31 (SEQ ID No : 27) 5' TGCCTTGACATTCTCGATGGT 3" (SEQ ID No : 28). |
11. | Ensemble de couples d'amorces nucléotidiques, dans lequel au moins deux couples d'amorces, de préférence trois, sont choisis parmi les couples d'amorces suivants ou parmi les couples d'amorces ayant au moins 85% d'identité avec les couples d'amorces suivants : couple spécifique de l'IL1 β humaine : 5'CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA3'(SEQIDNo : 1)et 5'GGGAACTGGGCAGACTCAAA3'(SEQ ID No : 2) couple spécifique de l'IL10 humaine : 5' GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT 3' (SEQ ID No : 3) et 5' CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT 3' (SEQ ID No : 4) couple spécifique de l'IL12p40 humaine : 5' CATGGTGGATGCCGTTCA 3' (SEQ ID No : 5) et 51 ACCTCCACCTGCCGAGAAT 3' (SEQ ID No : 6) couple spécifique de l'IL13 humaine : 5' ACAGCCCTCAGGGAGCTCAT 3' (SEQ ID No : 7) et 5' TCAGGTTGATGCTCCATACCAT 3' (SEQ ID No : 8) couple spécifique de l'IL15 humaine : 5' CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTT 3' (SEQ ID No : 9) et 5' CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA 3' (SEQ ID No : 10) couple spécifique de l'IL18 humaine : 5' CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA 3' (SEQ ID No : 11 ) et 5' GGGAACTGGGCAGACTCAAA 3' (SEQ ID No : 12) couple spécifique de l'IFNγ humain : 5' GTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTA 3' (SEQ ID No : 13) et 5' AAAAGAGTTCCATTATCCGCTACATC 3' (SEQ ID No : 14) couple spécifique du MIF humain : 5' GCCCGGACAGGGTCTACA 3' (SEQ ID No : 15) et 5' CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT 3' (SEQ ID No : 16) couple spécifique du TGFβ1 humain : 5' CAAGGGCTACCATGCCAACT 3' (SEQ ID No : 17) et 5' AGGGCCAGGACCTTGCTG 3' (SEQ ID No : 18) couple spécifique du TNFα humain : 5' CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC 3' (SEQ ID No : 19) et 5' GGTTTGCTACAACATGGGCTACA 3' (SEQ ID No : 20) couple spécifique de l'IL4 humaine : 5' AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC 31 (SEQ ID No : 21 ) 5' GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT 3' (SEQ ID No : 22) couple spécifique de la β2μglobuline humaine : δ'AATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGAS' (SEQ ID No : 23) et δ'GGCTGTGACAAAGTCACATGGTTS' (SEQ ID NO : 24), couple spécifique de la séquence YWHAZ humaine : 5' ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 31 (SEQ ID No : 25) 51 CCGCCAGGACAAACCAGTAT 31 (SEQ ID No : 26) couple spécifique de l'Ubiquitine C humaine : 5'~ ATTTGGGTCGCGGTTCTTG 31 (SEQ ID No : 27) 5' TGCCTTGACATTCTCGATGGT 3" (SEQ ID No : 28) lesdits au moins deux couples d'amorces étant utilisables dans des conditions telles que définies à la revendication 10 ou 11 pour quantifier des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon biologique. |
12. | Ensemble de couples d'amorces nucléotidiques, dans lequel au moins deux couples d'amorces, de préférence trois, sont choisis parmi les couples d'amorces suivants ou parmi les couples d'amorces ayant au moins 85% d'identité avec les couples d'amorces suivants : couple spécifique de l'IL1 β humaine : 5' CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA 3' (SEQ ID No : 1 ) et 5' GGGAACTGGGCAGACTCAAA 3' (SEQ ID No : 2) couple spécifique de l'IL10 humaine : 5' GCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCT 3' (SEQ ID No : 3) et 5' CTTGATGTCTGGGTCTTGGTTCT 3' (SEQ ID No : 4) couple spécifique de l'IL12p40 humaine : 5' CATGGTGGATGCCGTTCA 3' (SEQ ID No : 5) et 5' ACCTCCACCTGCCGAGAAT 3' (SEQ ID No : 6) couple spécifique de l'IL13 humaine : 5' ACAGCCCTCAGGGAGCTCAT 3' (SEQ ID No : 7) et 5' TCAGGTTGATGCTCCATACCAT 3' (SEQ ID No : 8) couple spécifique de NL 15 humaine : 5' CCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTT 3' (SEQ ID No : 9) et 5' CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA 3' (SEQ ID No : 10) couple spécifique de l'IL18 humaine : 5' CCTGTCCTGCGCTGTTGAAAGA 3' (SEQ ID No : 11 ) et 5' GGGAACTGGGCAGACTCAAA 3' (SEQ ID No : 12) couple spécifique de l'IFNγ humain : 5' GTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTA 3' (SEQ ID No : 13) et 5!. AAAAGAGTTCCATTATCCGCTACATC 3' (SEQ ID No : 14) couple spécifique du MIF humain : 5' GCCCGGACAGGGTCTACA 3' (SEQ ID No : 15) et 5' CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT 3' (SEQ ID No : 16) couple spécifique du TGFβ1 humain : 51 CAAGGGCTACCATGCCAACT 3' (SEQ ID No : 17) et 5' AGGGCCAGGACCTTGCTG 3' (SEQ ID No : 18) couple spécifique du TNFα humain : 5' CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC 3' (SEQ ID No : 19) et 5' GGTTTGCTACAACATGGGCTACA 3' (SEQ ID No : 20) couple spécifique de l'IL4 humaine : 5' AACAGCCTCACAGAGCAGAAGAC 31 (SEQ ID No : 21 ) 51 GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT 31 (SEQ ID No : 22) couple spécifique de la β2μglobuline humaine : δ'AATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGAS' (SEQ ID No : 23) et δ'GGCTGTGACAAAGTCACATGGTTS' (SEQ ID NO : 24), couple spécifique de la séquence YWHAZ humaine : 51 ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 31 (SEQ ID No : 25) 5' CCGCCAGGACAAACCAGTAT 31 (SEQ ID No : 26) couple spécifique de l'Ubiquitine C humaine : 5' ATTTGGGTCGCGGTTCTTG 31 (SEQ ID No : 27) 5' TGCCTTGACATTCTCGATGGT 31 (SEQ ID No : 28) lesdits au moins deux couples d'amorces étant utilisables dans un procédé, tel que défini dans les revendications 4 à 11 , pour quantifier des ARN messagers d'une ou plusieurs cytokines dans un échantillon * biologique. |
13. | Trousse de détection de désordres liés à la régulation des lymphocytes Th1/Th2, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel les couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi PIL10, l'IL 13, le TGFβ, le TNFα, et l'IFNγ. |
14. | Trousse de détection selon la revendication 15, comprenant en outre un ou plusieurs couples d'amorces spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL2, l'IL4, l'IL5, et le TNFβ. |
15. | Trousse de détection de désordres inflammatoires ou de désordres de l'immunité innée, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel les couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IFNγ, le TNFα, le TGFβ, l'IL1β, l'IL12p40, l'IL15 et I1IL18 et un couple d'amorces spécifiques d'ARNm de NL12p35. . |
16. | Trousse de détection selon la revendication 17, comprenant en outre un ou plusieurs couples d'amorces spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IFNα, I1ILB, l'IL8, l'IL21 , l'IFNβ, TiNOS et l'IL16. |
17. | Trousse pour l'analyse des niveaux d'expression de cytokines, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel un couple d'amorces est spécifique de I1ARN messager de I1ILIO, un ou plusieurs couples d'amorces sont spécifiques de gènes de ménage choisis parmi les gènes de β2 microglobuline humaine, l'ubiquitine C et le gène YWMAZ, et d'autres couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL19, l'IL20, l'IL22 et l'IL24. |
18. | Trousse pour l'analyse des niveaux d'expression de cytokines, comprenant un ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, dans lequel un couple d'amorces est spécifique de I1ARN messager de l'IL12p40, un ou plusieurs couples d'amorces sont spécifiques de gènes de ménage choisis parmi les gènes de β2 microglobuline humaine, l'ubiquitine C et le gène YWMAZ, et d'autres couples d'amorces sont spécifiques d'ARN messagers de cytokines choisies parmi l'IL12p35, l'IL23, l'IL27 et IΑK155. |
19. | Trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, pour chaque couple d'amorces spécifique d'un ARN messager, un ARN synthétique comprenant la séquence dudit ARN messager telle que résultant de l'amplification par le couple d'amorces, sous forme d'une solution, d'une gamme, ou sous forme sèche. |
20. | Trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, pour chaque couple d'amorces spécifique d'un ARN messager, un ADN synthétique comprenant la séquence de l'ADN complémentaire telle que résultant de l'amplification par le couple d'amorces, sous forme d'une solution, d'une gamme, ou sous forme sèche. |
21. | Trousse comprenant un ensemble d'amorces selon la revendication 13 ou 14, et un logiciel de traitement des données, capable de traiter les résultats obtenus à l'issue des étapes (i) à (iii) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, et d'en déduire la quantité d'ARN messager de chaque cytokine testée dans l'échantillon biologique. |
22. | Ensemble de couples d'amorces selon la revendication 13 ou 14, ou trousse de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend des couples d'amorces spécifiques des ARN messagers d'au moins trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf ou dix cytokines. |
23. | Ensemble de couples d'amorces ou trousse de diagnostic selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des couples d'amorces spécifiques des ARN messagers d'au moins un, deux, trois ou quatre gènes de ménage. |
24. | Trousse selon l'une quelconque des revendications 20 à 25, comprenant en outre un ARN utilisable comme ARN hétérologue, ou des cellules utilisables comme cellules hétérologues lors de la mise en œuvre du procédé selon la revendication 10 et, le cas échéant, des amorces spécifiques dudit ARN hétérologue ou d'une séquence d'ARN desdites cellules hétérologues. |
Légende des figures
Figure 1 : Schéma du protocole de RT-PCR quantitative en temps réel utilisant une gamme d'ARN standards recombinants.
Figure 2 : Construction d'une gamme d'ARN standard. Le couple d'amorce spécifique génère un amplicon qui sert de matrice à une seconde PCR utilisant les amorces spécifiques modifiées par la fusion en 5' de la séquence du promoteur 11 suivie d'un site de restriction EcoRI. Le produit de PCR est purifié avant d'être utilisé comme matrice de transcription in vitro. L1ARN standard produit est purifié, quantifié afin de réaliser une gamme d'ARN standard. Cette gamme subira une RT-PCR et servira de référence pour la quantification absolue du nombre de copies de TARNm considéré.
Figure 3 : Protocole de comparaison des approches gamme ARN versus gamme ADN. Voie I : après transcription inverse, un ADNc du standard ARN est dilué en série d'un facteur 10 afin de générer une gamme d'ADNc. Voie II : l'ARN standard est dilué en série d'un facteur 10 et chaque point subit une RT- PCR. Voie III : une gamme d'ADN de séquence correspondant à celle de l'ARN standard est amplifiée par PCR. Cette voie est celle classiquement utilisée pour la quantification des ARNm. Les conditions de PCR en temps réel sont identiques pour les 3 voies (même mix PCR, même plaque). Les efficacités d'amplification correspondantes sont calculées à partir des pentes des droites standards. L'efficacité de transcription inverse est égale au rapport entre EII et El. Efficacité de PCR (El) Efficacité de RT-PCR (EII) Efficacité de PCR (EIII)
Figure 4 : Validation des amorces. La spécificité des couples d'amorces utilisés est validée par analyse sur gel d'agarose (A) et par séquençage. Les courbes de dissociation (B) renseignent également sur la formation de dimères d'amorces. Enfin, les amorces sélectionnées sont utilisées en RT- PCR temps réel pour amplifier une gamme d'ARN standard spécifique dudit couple d'amorces (exemple de la β2-μglobuline : C).
Figure 5 : Courbes de dissociation des produits d'amplification humains pour la β2-microglobuline, le MIF, l'IFN-γ, IL-1β, l'IL-15, l'IL-12p40, l'IL-10, Ie TNF, l'IL-13, l'IL-18 et le TGF-β-1. Après 40 cycles d'amplification, les amplicons sont soumis à une montée progressive en température de 60 à 85°C. Une diminution brutale de la fluorescence accompagne la dissociation des deux brins d'ADN du produit d'amplification lorsque ceux-ci atteignent leur température de fusion. La spécificité des amorces utilisées est validée par la présence d'un pic unique.
Figure 6 : Courbes de dissociation des produits d'amplification humains pour l'ubiquitine C (A.) et la YWHAZ (B.). La spécificité des amorces utilisées est validée par la présence d'un pic unique.
Figure 7 : Courbes de dissociation des produits d'amplification simiens pour la β2-microglobuline, le MIF, l'IL-12p40, l'IL-10, l'IL-15 (A.) et l'IFN-γ, la GAPDH et le TNF-α (B.). La spécificité des amorces utilisées est validée par la présence d'un pic unique. Figure 8 : Détermination des concentrations d'amorces optimales pour le TNF-α. Les amorces sens et antisens ont été utilisées à 50, 300 ou 900 nM final pour amplifier les transcrits du TNF-α par RT-PCR en temps réel.
Figure 9 : Détermination de la sensibilité de la technique. L'ARN total issu d'un nombre décroissant de cellules a été soumis à une RT-PCR pour le gène de la β2-microglobuline. Parallèlement, une gamme d'ARN standard de ce même gène a subi les mêmes étapes. Ainsi, il a été déterminé que la technique de la présente invention permettait l'extraction et l'amplification de l'ARN d'au moins 10 cellules. L'amélioration du rendement de la phase d'extraction de l'ARN est en cours et devrait permettre d'augmenter cette sensibilité.
Figure 10 : Sensibilité des gammes ARN. Une gamme de nombre de copies d'ARN standard de chaque transcrit a été rétro-transcrite puis amplifiée par PCR en temps réel afin de déterminer le nombre minimum de copies amplifiable. Pour les transcrits de l'IL-1β, notre technique permet la détection de 10 copies d'ARNm.
Figure 11 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de la β2-microglobuline et de l'IL-1 β. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 12 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de l'IL-15 et de l'IL-18. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 13 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de l'IFN-γ et du TGF-β1. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 14 : Reproductibilité intra-expérimentale de la technique pour les gènes de l'ubiquitine C et de la YWHAZ. Quatre gammes identiques d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points. Une des gammes a servi de base pour la détermination du nombre de copies présentes dans les 3 autres gammes. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne de ces valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 15 : Reproductibilité inter-expérimentale de la technique pour les gènes de la β2-microglobuline et du TGF-β1. Huit gammes différentes d'ARN standard ont été rétro-transcrites et soumises à une amplification par PCR à des jours différents. Les panneaux A. et B. montrent la moyenne des cycles seuils et l'écart à cette moyenne pour chacun des points de gamme. Les graphiques C. et D. représentent la moyenne des valeurs calculées et l'écart type à cette moyenne pour chacun des points en fonction du nombre de copies théoriques.
Figure 16 : Comparaison des efficacités de RT-PCR entre une gamme standard et un échantillon cellulaire. Une gamme d'ARN standard pour la β2- microglobuline allant de 10 à 108 copies a été amplifiée par RT-PCR. La pente de la droite standard résultante (A.) est égale à -3,305. Cette pente est très proche de celle issue de la droite standard B. correspondant à une gamme de densité cellulaire allant de 10 à 105 cellules dont l'ARN total a subi les mêmes conditions de RT-PCR que la gamme standard pour l'amplification des ARNm de la β2-microglobuline (= -3,307).
Figure 17 : Comparaison des efficacités et des sensibilités entre la méthode de l'invention et le kit TaqMan™ pour l'amplification des transcrits du TNF-α. Une gamme d'ARN cellulaire total a été rétro-transcrite puis amplifiée par PCR en temps réel en utilisant soit la méthode de l'invention soit le kit commercial TaqMan™. Les droites standard obtenues permettent de déterminer l'efficacité et les sensibilités des deux techniques. Dans les conditions testées, la méthode de l'invention est aussi sensible et plus efficace que TaqMan ™ considérée comme technique de référence.
Figure 18 : Cinétiques de transcription et de sécrétion du MIF (A.) et du TNF-α (B.) A. Cinétiques de transcription et de sécrétion du MIF par des cellules mononucléées du sang périphérique issues d'un donneur sain après 3, 6 et 9 heures de culture en présence de LPS (10 ng/mL), de SAC (0,0075%), de globules rouges parasités par Plasmodium falciparυm au stade trophozoïtes (20:1) ou de globules rouges sains (20:1). Cette cytokine étant pour partie préformée, il n'existe pas de relation directe entre les taux de transcrits et les taux de protéines sécrétées. La sécrétion du MIF est mesurée dans les surnageants de culture par ELISA (R&D™). B. Cinétiques de transcription et de sécrétion du TNF-α par des cellules mononucléées du sang périphérique issues d'un donneur sain après 3, 9 et 18 heures de culture en présence de LPS (10 ng/mL), de SAC (0,0075%), de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum au stade trophozoïtes (20:1 ) ou de globules rouges sains (20:1). Cette cytokine n'étant pas stockée dans la cellule, la transcription de l'ARNm précède de quelques heures la sécrétion mesurée dans les surnageants de culture par ELISA (BioSource). Il y a donc corrélation entre l'activité transcriptionnelle et la sécrétion de la protéine correspondante.
Figure 19 : Transcription des gènes de différentes cytokines par des monocytes isolés de donneurs sains. Les monocytes isolés ont été incubés pendant 0.5, 1 , 2, 3, 6 ou 9 heures en présence de LPS (100 ng/mL) ou de SAC (0,0075%). Les transcrits de cytokines sont quantifiés puis normalisés pour un million de copies d'ARN de β2-μglobuline. Les histogrammes représentent le rapport entre le nombre de copies d'ARN cibles et d'ARNm de la β2-microglobuline (moyenne de 2 donneurs).
Figure 20 : Capacité de transcription du TGF-β1 chez des sujets contrôles ou des patients souffrant de paludisme. Des PBMC d'individus contrôles (Asymptomatic Controls) ou de patients souffrant de paludisme (Malaria patients) ont été prélevés et stimulés pendant 22 heures par du LPS (100 ng/mL). L1ARN total de ces PBMC a été extrait afin de quantifier le nombre de transcrits TGF-β1. Les histogrammes représentent le nombre de copies d'ARNm de TGF-β1 pour un million de copies d'ARNm de β2-microglobuline. * : différence statistiquement significative (p< 0,05) Figure 21 : Développement des conditions pour la quantification de l'ARNm de l'IL-4. La spécificité des amorces choisies est validée par la présence d'un pic unique sur la courbe de dissociation (A.) et par séquençage du produit. Une gamme de concentration d'ARN standard est amplifiée par RT-PCR pour valider son utilisation pour la quantification des ARNm de l'IL-4 (B.). Celle-ci est réalisée sur des PBMC de 2 donneurs sains (D16 et D18) stimulées par du LPS, du SAC ou des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum pendant 0.5, 1 , 2, 3, 6 ou 9 heures (C).
EXEMPLES Pour tous les exemples qui suivent, les matériels et méthodes décrits ci-après ont été utilisés :
Stimulation des cellules
Des cellules humaines mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains ont été isolées en utilisant du Ficoll™ 1.077 (Nycomed™), Un million de cellules vivantes ont été distribuées dans des plaques de culture à 48 puits à fond plat (Costar™), et stimulées avec du LPS (10 ng/ml, E. co// 0111 : B7, Sigma™), PHA-L (10 μg/ml, Sigma™), SAC (0,0075%, Pansorbin Cells™), des schizontes vivants de P. falciparum (parasitémie finale de 1%, souche FCR3) ou des globules rouges O+ intacts et non infectés. Les cellules ont été récoltées pour l'extraction de l'ARN après 3, 6, 9, 12, 18, 24 et 48 heures de stimulation, puis resuspendues dans du tampon RNA PLUS (Q-Biogene™, 500 μl pour 106 cellules).
Extraction d'ARN et transcription inverse
L'ARN cellulaire total a été extrait en utilisant le kit RNA-PLUS® de chez Q-Biogene®, en suivant les instructions du fournisseur et resuspendu dans de l'eau dépourvu de RNase (Ambion™). La quantité d'ARN total a été déterminée par densité optique à 260 nm. L'ADN complémentaire a été obtenu en utilisant les réactifs "TaqMan™ Reverse Transcription Reagents" {Applied Biosystems™) dans un volume réactionnel de 50 μl.
Amplification de IADN complémentaire
Une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (ACP ou polymérase chain reaction, PCR) quantitative en temps réel a été effectuée sur un thermocycleur ABI Prism 7700™ en utilisant le tampon SYBR-Green PCR master mix™ (Applied Biosystems™) dans un volume final de 30 μl. Les conditions de thermocyclage étaient les conditions par défaut : 500C pendant 2 minutes, 95°C pendant 10 minutes et 40 cycles de {95°C pendant 15 secondes puis 600C pendant 1 minute}. Chaque point a été dupliqué. Les amorces utilisées pour chaque amplification (chacune à 900 nM finale) sont décrites dans le Tableau 1.
Construction de standards ARN externes
Des amorces modifiées ont été utilisées sur I1ADNc cellulaire pour construire la matrice de transcription. Ces amorces étaient les amorces spécifiques des gènes considérés, fusionnées à leur extrémité 5' à la séquence du promoteur T7. Chaque matrice a ensuite été purifiée sur colonne de silice (Nucleospin™, Macherey-Nagel™) avant d'être transcrite in vitro en utilisant le kit MegaShort Script Transcription Kit™ (Ambion™). Les concentrations des ARN standard ont été calculées par densité optique à 260 nm. Des dilutions en série ont été réalisées pour chaque standard externe, dans une plage allant de 10 copies par μL à 1012 copies par μL, dans de l'eau dépourvue de RNase. Ces dilutions ont été aliquotées et stockées à -80°C. Ces standards ont ensuite subi la même transcription inverse que I1ARN cellulaire.
Analyse quantitative
Les courbes de standards externes et la quantification ont été obtenues en utilisant le logicielSDS 1.9. A partir de ces courbes standard, la quantité initiale des ARN messagers cibles a été déterminée pour chacun des échantillons, et standardisée pour la β2-microglobuline. Les résultats sont exprimés en nombre de copies d'ARN messager par million de copies d'ARN messager de β2-microglobuline.
Test ELISA
Les tests ELISA ont été réalisés en suivant les instructions du fournisseur (TNF-alpha: BioSource et MIF: R&D).
Exemple 1 : Courbe standard d'ARN
1.1 : génération de la courbe standard La technique d'ACP emboîtée (Nested-PCR) a été utilisée pour flanquer chaque amplicon spécifique d'une séquence promotrice de la polymérase T7. Cette construction a été utilisée pour générer un ARN standard qui a été chargé sur un gel et soumis à une migration pour vérifier sa clonalité (résultats non montrés). Le poids moléculaire de chacun des standards a été calculé sur la base de sa séquence attendue, puis des solutions allant de 101 à 1012 copies d'ARN standard par microlitre ont été faites. Ces solutions diluées en série ont été soumises à une transcription inverse, et l'ADN a été amplifié en doublant chaque point, pour générer une courbe standard, en pointant le cycle seuil (CT) en regard de la valeur logarithmique du nombre de copies d'ARN de départ pour chaque dilution. La figure 2 montre un exemple de ces courbes pour IFN-γ. Chaque courbe générée a montré une efficacité de RT-PCR supérieure à 84% et une gamme dynamique d'au moins 7 ordres de grandeur. Ceci a permis une quantification fiable et reproductible d'un ARNm d'un échantillon cellulaire.
1.2 : Comparaison entre des courbes d'ARN et d'ADN standard
Afin de comparer les résultats générés par l'utilisation d'une gamme d'ARN standard à ceux issus de l'utilisation d'une gamme d'ADN standard, l'expérience suivante a été réalisée. Les matrices ADN servant de base à la transcription des ARN standard de I1IL-I β, de l'IFN-γ et du TNF-α ont été purifiées et quantifiées par D. O. afin de réaliser des gammes de concentrations allant de 10 copies à 1012 copies/μL. On disposait donc de deux types de gammes dans lesquelles les deux constructions ont quasiment la même séquence. Les gammes d'ARN standard ont été soumises à une étape de transcription reverse et 5 μL du produit de RT ont été amplifiés par PCR en temps réel. Parallèlement, un échantillon d'ARN standard a été rétro-transcrit, et I1ADNc correspondant a fait l'objet de dilutions en série d'un facteur dix. Une gamme d'ADNc a donc ainsi été générée et soumise à amplification (même mix, même volume final que les gammes d'ARN et d'ADN). Le protocole est schématisé à la figure 3. Les droites standard résultant de ces trois gammes ont les caractéristiques indiquées dans le tableau 1 ci-dessous: D'après la théorie de la PCR1 le nombre de copies entre deux cycles augmente d'un facteur X qui est égal à 2 si la PCR est efficace à 100 %. L'efficacité E d'une PCR est donnée par E = X-1 , or X = 1 o-1/pente. Ainsi, on a les efficacités indiquées ci-dessous.
RNA standard VOIE III : DNA standard Voie : PCR Voie II : RT-PCR Efficacité Pente efficacité Pente efficacité pente efficacité de RT (ll/l) IL-1β -3,1966 1 ,05 -3,4794 0,94 -3,067 1 ,11 0,84
IFN-y -3,1 161 1 ,09 -3,843 0,82 -2,944 1 ,19 0,76 TNF-α -3,556 0,91 -3,61 0,89 -3,503 0,93 0,97 Tableau 2 : Influence des approches gamme ARN versus gamme ADN sur la quantification des transcrits. Les données de pente et d'efficacité pour les trois types de gamme sont données. Les efficacités de transcription inverse (RT) sont calculées par le rapport entre l'efficacité de RT-PCR (voie II) et celle de PCR (voie I). Il apparaît donc que les efficacités des RT-PCR sont inférieures à celles des PCR pour les 3 gènes. Ceci est dû à la phase de RT puisque les efficacités des PCR sur ADNc et ADN sont similaires pour chaque gène. Les efficacités des PCR sur ADNc étant semblables à celles des PCR sur ADN, la différence d'efficacité entre la RT-PCR et la PCR est attribuable à la phase de RT qui n'a pas une efficacité de 100% contrairement à ce qui est avancé par la plupart des auteurs pour justifier l'emploi d'une gamme ADN pour la quantification d'ARNm. Ceci est un premier biais à prendre en compte pour quantifier de façon fiable le taux de transcrits. Cependant, si ce biais était constant, la comparaison entre les expériences serait possible. L'expérience montre que, l'efficacité de la phase de RT diffère selon les ARN Le biais de quantification apporté par la phase de RT existe donc et varie. Ceci ne peut donc en aucun cas permettre l'utilisation de gammes d'ADN pour la quantification fiable, reproductible et précise des ARN messagers. En effet, si on compare les données obtenues en se basant sur les droites standard issues des gammes ADN ou ARN pour quantifier un nombre connu de transcrits de TNF-α on obtient les résultats suivants :
Tableau 3 : Influence des approches gamme ARN versus gamme ADN sur la quantification des' transcrits En se basant sur une gamme d'ADN, on sous-estime donc fortement le nombre de transcrits présents dans l'échantillon. De plus, le 5 degré de sous-estimation varie selon les transcrits étudiés. L'ensemble de ces données justifie l'emploi d'une gamme d'ARN standard pour la quantification fiable et reproductible de transcrits et démontre le manque d'exactitude et l'inutilité de l'utilisation d'une gamme d'ADN.
i o Exemple 2 : Amorces
Exemple 2.1 : Validation des amorces
Des paires d'amorces ont été dessinées à partir des séquences génomiques publiées en utilisant le logiciel Primer Express™ (Applied Biosystems™), en respectant au mieux les critères suivants : 15 - Choisir des amorces les plus proches possible l'une de l'autre à condition qu'elles ne se chevauchent pas - Garder le contenu en GC entre 20 et 80% - Éviter la répétition de nucléotides. Ceci est particulièrement vrai pour la guanine pour laquelle une suite de 4 guanines ou plus devrait être 20 évitée. - Choisir des amorces dont la température de fusion se situe entre 58 et 600C quand on utilise le logiciel Primer Express™. - Les 5 nucléotides à l'extrémité 3' ne devraient pas comporter plus de 2 bases G et/ou C. 25 La spécificité des amorces pour les ADNc cibles a été assurée en dessinant des amorces directes et inverses amplifiant un produit couvrant un intron et qui ne conduit pas à l'amplification de pseudo-gènes ou d'autres gènes reliés. La spécificité a été estimée par une analyse sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium, par des courbes de dissociation (Fig. 4 à 7) et par séquençage des produits d'amplification par PCR (résultats non montrés). Chaque amplicon a été clone dans un vecteur pCR2.1 en utilisant le kit d'Invitrogen™ (TyA cloning kit™), et séquence. Les séquences présentaient toutes au moins 98% d'identité avec la séquence attendue (résultats non montrés).
Exemple 2.2 : Optimisation de la concentration des amorces
II s'agit de tester l'effet d'une variation de la concentration en amorces sur la quantité de copies d'ARN détectées. Pour ce faire, les concentrations d'amorces sens et anti-sens variaient de 50 à 900 nM. Les concentrations des amorces ont été optimisées pour déterminer les1 concentrations d'amorces minimum donnant le cycle de seuil (threshold cycle, CT) le plus bas (et donc la plus grande sensibilité) et le ratio signal/bruit maximum en fluorescence (ΔRn), tout en minimisant les amplifications non-spéficques (résultats non montrés). La figure 8 présente les résultats obtenus pour la détection du TNF-α. Pour ce gène comme pour tous les autres, le couple de concentration optimale est de 90OnM pour l'amorce sens et anti-sens.
Exemple 3 : Détermination de la sensibilité de la technique : Taille minimale de l'échantillon et nombre de copies minimal Afin de déterminer la sensibilité de la technique, une gamme de densité cellulaire allant de 105 cellules à 1 cellule a été réalisée. L'ARN total de ces cellules a été extrait et rétro-transcrit. Un dixième de l'ADNc obtenu a subi une amplification par PCR pour le gène de la β2-microglobuline. En parallèle, une gamme d'ARN standard de ce même gène a subi les mêmes étapes de RT-PCR. Les résultats de cette expérience sont présentés en figure 9. Ils montrent que cette technique permet de détecter de façon fiable les transcrits du gène de la β2-microglobuline dans 10 cellules au minimum. II est à noter qu'il ne s'agit pas ici d'une dilution d'ARN correspondant à un «équivalent cellule» de 10 mais bien d'ARN extrait directement de 10 cellules. Si on raisonne en dilution d'ARN standard, la sensibilité est de 10 copies. Il a également été établi, pour chacun des gènes développés, la sensibilité de la technique en termes de nombre de copies détectables. Celle-ci varie selon les cytokines entre 10 et 100 copies (Figure 10)
Exemple 4 : Variabilités intra et inter expérimentales La reproductibilité de la technique a été étudiée. La variabilité intra expérimentale a été calculée à partir de points de gamme d'ARN standard en quadruplicate pour les gènes de la β2-microglobuline, ubiquitine C, YWHAZ, IL-IB1 IL-15, IL-18, IFN-gamma et TGF-B1. La moyenne des cycles seuils pour chaque point ainsi que les écarts types à cette moyenne ont été calculés et sont représentés sur les figures 11 , 12, 13 et 14 (A et B). De même, une des gammes a servi de standard pour calculer les quantités d'ARN standard pour les 3 autres points. La moyenne des quantités obtenues ainsi que les écarts types à cette moyenne sont montrés en figures 1 1 , 12, 13 et 14 (C et D).
La variabilité inter expérimentale a été déterminée pour les gènes de la β2-microglobuline et du TGF-β1 à partir de 8 expériences indépendantes réalisées à plusieurs jours d'intervalle et en utilisant des lots différents de mix PCR. La même stratégie que pour la variabilité intra expérimentale a été utilisée et les résultats sont présentés sur la figure 15. Ces résultats montrent que la technique de la présente invention est très reproductible, aussi bien au niveau intra expérimental qu'au niveau interexpérimental. Ceci est un atout majeur pour la fiabilité et la comparaison des résultats obtenus pour différents échantillons traités à différents moments. Exemple 5 : Comparaison des efficacités de RT-PCR entre la gamme et l'échantillon
Comme à l'exemple 4, l'efficacité de RT-PCR varie d'un gène à l'autre et selon les expériences pour un même gène. II est donc possible que cette variation entraîne un biais dans la quantification si elle se produit entre la gamme et les échantillons. Les efficacités de RT-PCR entre une gamme de β2- microglobuline et des ARN cellulaires extraits de 10, 100, 1000, 10 000 ou 100 000 cellules ont donc été comparées. Ainsi, les ARN standard et cellulaires composent chacun une gamme de concentration en ARN dont les points sont espacés d'un facteur 10. Ces deux populations d'ARN ont subi en parallèle les mêmes conditions de RT-PCR pour l'amplification des ARNm de la β2- microglobuline. Les résultats sont présentés à la figure 16. Ils montrent que les pentes des droites standards sont quasiment identiques et que donc les efficacités de RT-PCR sont très proches entre la gamme standard et l'échantillon cellulaire (100,7% et 100,6% respectivement). Ainsi, la variabilité de l'efficacité de RT-PCR n'introduit pas de biais dans, la quantification des ARNm dans les conditions utilisées dans cette expérience. Les résultats obtenus par cette technique sont donc fiables.
Exemple 6 : Comparaison des efficacités de RT-PCR entre la méthode de l'invention et le kit TaqMan™ La méthode de l'invention a été comparée à la technique Taqman™, technique de référence dans ce domaine, pour le gène du TNF- α. Des monocytes ont été stimulés pendant 6 heures avec du LPS. L'ARN total a été extrait de 106 cellules et dilué en série. Cette gamme d'ARN cellulaire total a été amplifiée pour I1ARNm du gène TNF-α, en parallèle, sur une même plaque et dans les mêmes conditions de thermocyclage en utilisant soit la méthode de l'invention soit la chimie Taqman™ (Applied- Biosystem). Les résultats de ce test sont montrés figure 7. Aux dilutions étudiées, il apparaît que la méthode de l'invention est aussi sensible que la technique de référence Taqman™. De plus, la présente méthode montre une efficacité légèrement supérieure à celle de la technique Taqman™: 105% versus 80% correspondant respectivement à des pentes de -3,2 (technique de l'invention) et -3,9 (technique Taqman™).
Exemple 7 : Validation des standards internes (gènes de ménage)
Le choix d'un gène endogène exprimé de façon stable, et qui peut être utilisé comme standard interne (gène de ménage) est un pré-requis pour une quantification par RT-PCR précise. Le standard interne est choisi en fonction de l'évaluation clinique du patient et de l'origine tissulaire de l'échantillon biologique. Puisque l'analyse des cytokines nécessite un standard interne pouvant être utilisé sur des leucocytes périphériques sanguins, 3 gènes connus pour la stabilité de leur expression au sein des leucocytes ont été étudiés : la β2-microglobuline (β2-MG), l'ubiquitine C (UBC) et le gène YWHAZ. La stabilité de la quantité de transcrits de ces 3 gènes a été comparée par la méthode de l'invention, dans différentes conditions d'activation.
Des PBMC de donneurs sains ont été stimulés pendant 3 heures par du PBS ou du PHA (phytohaemaglutinin) puis séparés en deux aliquots identiques. Les ARN cellulaires totaux ont été extraits à deux jours d'intervalle puis le même volume d'ARN a été retro-transcrits, et les transcrits des 3 gènes amplifiés par RT-PCR, dans les mêmes conditions. Le tableau 4 suivant montre les résultats obtenus : moyenne obtenue et entre parenthèse les résultats des deux extractions. Ces donnés montrent que la β2- microglobuline donnent des résultats reproductibles, avec moins de 12% de variabilité entre les différentes expériences, alors que les résultats concernant les gènes ubiquitine C et YWHAZ montrent une variabilité pouvant atteindre 47%. La β2-microglobuline a donc été choisi comme standard interne pour les futures expériences de quantification absolue.
TO (non-stimulé) LPS 3h PHA 3h B2-MG 1 ,24.107 1 ,48.107 1 ,37.107 (1 ,00.107-1 ,49.107) (1 ,17.107-1 ,79.107) (1 ,11.107-1 ,64.107) UBC 2,04.105 2.39.105 1 ,98.105 (0,62.105-3,46.105) (1 ,51.105-3,28.105) (1 ,33.105-2,64.105) YWHAZ 1 ,89.105 2.80.105 3,36.105 (0,78.105-3,01.105) " (2 ,25.105-3,34.105) (2 ,60.105-4,13.105) Tableau 4 : Choix du standard interne. Pour chaque gène testé, apparaissent sur la première ligne la moyenne des deux extractions, et sur la seconde ligne, le résultat individuel des deux extractions. Les tests ont été réalisés sans stimulation (TO) ou après une stimulation de 3 heures avec du LPS ou du PHA.
Exemple 8 : Cinétique de transcription des facteurs MIF et TNF-α La figure 18 représente les cinétiques de transcription et de production du MIF (A.) et du TNF-α (B.) par des PBMC d'un donneur sain stimulés par le LPS, le SAC, des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ou des globules rouges sains pendant 3, 9 et 18 heures. Les résultats montrent une augmentation de la transcription de TNF-α environ 3 heures après stimulation, transcription qui précède la sécrétion de la protéine TNF-α (B.). En revanche, le gène MIF est fortement transcrit et ce de façon constitutive à l'état basai (TO), et ni la stimulation par du LPS, ni par du SAC n'augmente cette transcription. Ceci démontre que la méthode de l'invention est validée sur des échantillons stimulés in vitro. De plus, elle souligne la complémentarité de l'approche du dosage des ARN et des protéines pour des cytokines néoformées (TNF-α) en comparaison de cytokines préformées (MIF). Enfin, ces résultats confirment les données de la littérature qui rapportent que MIF est présent dans les cellules à la fois sous forme de protéines préformées prêtes à être sécrétées, et sous forme d'ARNm qui peuvent être rapidement traduits en absence de toute transcription.
Exemple 9 : Cinétique de transcription des gènes de différentes cytokines Des expériences de stimulation in vitro par du LPS et du SAC ont été menées sur les sous-populations monocytaires et lymphocytaires, isolées du sang, pendant 0,5, 1 , 2, 3, 6 et 9 heures. L'extraction des ARN correspondants a été réalisée et la quantification des ARN messagers codant pour les cytokines IL-1 B, IL-15, IL-4, IL-18, IL-10, MIF, IL-12p40, TGF-βi, IL- 13 et TNF-α a été réalisée et rapportée à la quantité d'ARNm codant pour la beta-2 microglobuline, choisi comme gène de ménage (standard interne). La figure 19 présente le résultat obtenu avec les monocytes purifiés d'un des donneurs. Aucune augmentation significative de la quantité d'ARNm d'IL-15, d'IL-18, de MIF ou de TGF- β1 n'a été détectée. Concernant l'IL-1β et l'IL-10, les deux stimulants induisent une cinétique comparable d'accumulation de transcrits. En revanche, on observe une accumulation de transcrits d'IL-4 et d'IL-13 précoce en réponse au LPS (2 heures) que l'on ne retrouve pas pour la stimulation par le SAC. Quant à IML- 12p40, on observe une accumulation de transcrits plus précoce par stimulation avec le LPS qu'avec le SAC. Enfin, l'accumulation de transcrits TNF-α est plus prolongée dans le temps après stimulation avec le SAC, comparée à la stimulation avec le LPS.
Exemple 10 : Capacité de transcription du TGF-$1 Les ARN provenant de cellules mononucléées du sang périphérique de patients souffrant de paludisme ou d'individus contrôles, après stimulation par du LPS, ont été extraits. La quantification des ARNm des gènes de la β2 microglobuline et du TGF-β1 a été réalisée. La figure 20 présente la différence de capacité de transcription du TGF-β1 entre des patients atteints de paludisme et des individus contrôles. Les cellules de patients atteints de paludisme montrent une transcription de TGF-β1 supérieure à ceux de sujets contrôles, après stimulation par le PBS (p= 0,036 ; différence statistiquement significative *).
Exemple 11 : Cinétique de quantification de l'ARNm de l'IL-4 Des amorces pour l'IL-4 ont été dessinées et les conditions d'amplification de l'IL-4 validées. La figure 21 présente la courbe de dissociation des amorces sélectionnées (A.), ainsi que la droite montrant l'efficacité de l'amplification (B.). De façon à valider cette cytokine, des ARN messagers codant pour l'IL-4 à partir de PBMC dérivés de 2 donneurs sains (Donneurs 16 et 18) ont été quantifiés, après stimulation de ces PBMC, entre une demi-heure et 9 heures, avec du LPS (100 ng/ml), du SAC (0, 0075%) ou des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum à la concentration de 20 parasites pour un leucocyte. La cinétique d'expression de l'IL-4 apparaît comparable pour les deux donneurs (C.) BIBLIOGRAPHIE
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