本発明の試薬において、第一のシアニン化� ��物残基としては活性酸素種と容易に反応し� ��分解する性質を有し、かつ第二のシアニン� ��合物残基の消光団として機能するシアニン� ��合物残基を選択する必要がある。本明細書� ��おいて「シアニン化合物残基」とは、シア� ��ン化合物(例えば、カルボシアニン化合物、 チアカルボシアニン化合物、テトラメチルイ ンドカルボシアニン化合物;以下、これらを� �称してカルボシアニン化合物と呼ぶ場合が� �る)の1つの水素原子を除いて生成する一価の 基を意味する。活性酸素種と容易に反応して 分解する性質については、例えば、活性酸素 種の1つであるヒドロキシルラジカル(・OH)を� ��成する標準的な方法として広く用いられて� ��るフェントン反応により色素が分解する度� ��いに基づいて判定することができる。例え� ��、10μMのシアニン化合物のリン酸緩衝液溶� �(0.1 M、pH 7.4)をフラスコ内で激しく攪拌し� �がら1 M 過酸化水素(H ₂ O ₂ )水溶液を終濃度1 mMとなるように加え、10 mM  鉄(II)水溶液を終濃度50μMとなるように滴下� ��る。シアニン化合物の極大吸収波長におけ� ��吸光度をこの操作を行う前後で比較し、そ� ��減少の有無で活性酸素種に対する反応性を� ��義することができる。例えば、このフェン� ��ン反応により、37℃において1分以内に20%以� ��分解する場合に活性酸素種と容易に反応し� ��分解すると判定することができる。第一の� ��アニン化合物残基は、活性酸素種に対して� ��二のシアニン化合物残基と同等か、又はそ� ��以上の反応性を有していればよく、第二の� ��アニン化合物残基は、実質的に活性酸素種� ��対して安定であることが好ましい。ここで� ��活性酸素種に対して実質的に安定とは、活� ��酸素種による反応(分解や修飾)を全く受け� �い場合だけでなく、活性酸素種による反応� �受けた場合でも、第二のシアニン残基の蛍� �特性が、第一のシアニン化合物残基と第二� �シアニン化合物残基の関係において変化し� �いことを指す。

 第一のシアニン化合物残基としては、例え� ��、上記[化1]に示した部分構造を有するシア� ��ン化合物残基が好ましい。より具体的には� ��例えば、下記の一般式(I):
〔式中、R ¹ 、R ² 、R ³ 、R ⁴ 、R ⁵ 、R ⁶ 、R ⁷ 、及びR ⁸ はそれぞれ独立に水素原子、スルホ基、ホス ホ基、ニトロ基、ハロゲン原子、又は置換基 を有していてもよいC _1-6 アルキル基を示し;R ⁹ 及びR ¹⁰ はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C _1-18 アルキル基を示し;R ¹¹ は水素原子又は置換基を有していてもよいC _1-18 アルキル基を示す;Zは酸素原子、硫黄原子、� ��は-N(R ¹² )-(式中、R ¹² は水素原子又は置換基を有していてもよいC _1-6 アルキル基を示す。ただし、Zが-N(R ¹² )-の場合、R ¹¹ とR ¹² は、活性酸素種と反応して、第二のシアニン 化合物残基の蛍光特性に影響を与える基は除 かれる)を示し;Y ¹ 及びY ² はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R ¹³ )(R ¹⁴ )-(式中、R ¹³ 及びR ¹⁴ はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C _1-6 アルキル基を示す)を示し;M ^- は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す 〕で表されるシアニン化合物の残基が好まし い。

 本明細書において、特に言及しない場合� ��はアルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、� ��はそれらの組み合わせのいずれでもよい。� ��ルキル基が置換基を有する場合には、置換� ��の種類、個数、置換位置は特に限定されな� ��が、例えば、アルキル基、アルコキシ基、� ��リール基、ハロゲン原子(フッ素原子、塩素 原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよ い)、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、� �ルボキシ基若しくはそのエステル、スルホ� �若しくはそのエステルなどを置換基として� �していてもよい。

 R ¹ 、R ² 、R ³ 、R ⁴ 、R ⁵ 、R ⁶ 、R ⁷ 、又はR ⁸ が示すC _1-6 アルキル基としては、メチル基又はエチル基 などが好ましく、R ¹ 、R ² 、R ³ 、R ⁴ 、R ⁵ 、R ⁶ 、R ⁷ 、又はR ⁸ が示すハロゲン原子としてはフッ素原子、塩 素原子などが好ましい。R ¹ 、R ² 、R ³ 、R ⁴ 、R ⁵ 、R ⁶ 、R ⁷ 、又はR ⁸ が示すスルホ基又はホスホ基は、それぞれエ ステルを形成していてもよい。R ¹ 、R ² 、R ³ 、R ⁴ 、R ⁵ 、R ⁶ 、R ⁷ 、又はR ⁸ がすべて水素原子であってもよい。

 R ⁹ 、R ¹⁰ 、及びR ¹¹ が示すC _1-18 アルキル基としては、例えば、メチル基、エ チル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-� �チル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-� �チル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、ネ オペンチル基、tert-ペンチル基、1-メチルブ� �ル基、2-メチルブチル基、1-エチルプロピル� ��、n-ヘキシル基、1-メチルペンチル基、2-メ� ��ルペンチル基、3-メチルペンチル基、4-メチ ルペンチル基、2,3-ジメチルブチル基、1,3-ジ� ��チルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、1-エ� ��ルブチル基、2-エチルブチル基、1-イソプロ ピルプロピル基、n-ヘプチル基、n-オクチル� �、n-ノニル基、n-デシル基、n-ウンデシル基� �n-ドデシル基、n-トリデシル基、n-テトラデ� �ル基、n-ペンタデシル基、n-ヘキサデシル基� ��n-ヘプタデシル基、又はn-オクタデシル基な どを挙げることができる。アルキル基として は、直鎖状のアルキル基が好ましい。R ⁹ 及びR ¹⁰ が示すC _1-18 アルキル基上に存在可能な置換基としては、 例えば、アルコキシ基、アリール基、ハロゲ ン原子(フッ素原子、塩素原子、臭素原子、� �ウ素原子のいずれでもよい)、ヒドロキシ基� ��アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基若しく� ��そのエステル、又はスルホ基若しくはその� ��ステルなどを挙げることができるが、これ� ��のうち、カルボキシ基、スルホ基又はアミ� ��基などが好ましく、特にカルボキシ基又は� ��ルホ基が好ましい。R ⁹ 及びR ¹⁰ の両者が無置換のC _1-18 アルキル基であってもよく、あるいはそれら のいずれか片方のC _1-18 アルキル基が置換基を有することも好ましい 。R ⁹ 及びR ¹⁰ がともに無置換アルキル基であることが好ま しく、ともにメチル基であることがより好ま しい。R ¹¹ はカルボキシ基で置換されたC _1-4 アルキル基であることが好ましく、このカル ボキシ基でリンカーに結合することが好まし い。リンカーとの結合様式は特に限定されな いが、例えば、エステル結合やアミド結合な どが挙げられる。第一のシアニン化合物残基 と第二のシアニン化合物残基が第一のシアニ ン化合物残基と第二のシアニン化合物残基に 置換した置換基で直接結合する場合には、R ⁹ 、R ¹⁰ 、及びR ¹¹ が示す置換基を有していてもよいC _1-18 アルキル基に置換したカルボキシ基、スルホ 基又はアミノ基などを利用してエステル結合 やアミド結合で第二のシアニン化合物残基と 結合することが好ましい。

 Zはリンカーに結合する酸素原子、硫黄原子 、又は-N(R ¹² )-(Zが-N(R ¹² )-の場合、R ¹¹ とR ¹² は、活性酸素種と反応して、第二のシアニン 化合物残基の蛍光特性に影響を与える基は除 かれる)を示し、R ¹² は水素原子又は置換基を有していてもよいC _1-6 アルキル基を示す。Zがイオウ原子であるこ� �が好ましい。Zがイオウ原子である場合には� ��一のシアニン化合物残基の酸化電位が低下� ��、活性酸素種に対する反応性が増す効果が� ��られる。R ¹² は水素原子又はメチル基などが好ましい。Y ¹ 及びY ² はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R ¹³ )(R ¹⁴ )-を示し、R ¹³ 及びR ¹⁴ はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C _1-6 アルキル基を示す。Y ¹ 及びY ² が-C(R ¹³ )(R ¹⁴ )-であることが好ましく、R ¹³ 及びR ¹⁴ としてはメチル基が好ましい。M ^- は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す 。対イオンとしては、例えば、塩化物イオン 、硫酸イオン、硝酸イオン、過塩素酸アニオ ン、メタンスルホン酸アニオン、p-トルエン� ��ルホン酸アニオン、シュウ酸アニオン、ク� ��ン酸アニオン、酒石酸アニオンなどの有機� ��アニオン、グリシンなどのアミノ酸のイオ� ��、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マ� ��ネシウムイオンなどの金属イオン、4級アン モニウムイオンなどを挙げることができる。 例えば、一般式(I)においてR ⁹ 及びR ¹⁰ が示すC _1-18 アルキル基にカルボキシ基、スルホ基などが 存在する場合、あるいはR ¹ 、R ² 、R ³ 、R ⁴ 、R ⁵ 、R ⁶ 、R ⁷ 、及びR ⁸ のうちのいずれか1個以上がスルホ基又はホ� �ホ基であり、対イオンとしてナトリウムイ� �ンを用いる場合には、M ^- として2個以上の対イオンが必要になる場合� �ある。また、一般式(I)においてR ⁹ 又はR ¹⁰ が示す一方のC _1-18 アルキル基に1個のカルボキシ基又はスルホ� �などが存在する場合には、R ¹⁰ が結合する4級窒素原子上の陽電荷とカルボ� �シ基又はスルホ基のアニオンとが分子内ツ� �ッターイオンを形成するので、電荷の中和� �必要な対イオンが不必要になる場合もある� �さらに、第二のシアニン化合物残基に電荷� �中和に必要な数のカルボキシ基又はスルホ� �などを有する場合には、それらのアニオン� �分子内ツビッターイオンを形成するので、� �荷の中和に必要な対イオンが不必要になる� �合もある。

 第一のシアニン化合物残基を構成するシア� ��ン化合物として特に好ましい化合物の一例� ��下記に挙げるが、第一のシアニン化合物残� ��を構成するシアニン化合物は下記の特定の� ��合物に限定されることはない。この化合物� ��カルボキシ基がリンカーとアミド結合など� ��形成することが好ましい。

 第二のシアニン化合物残基は、活性酸素� ��に対して実質的に安定であり、消光団とし� ��機能する第一のシアニン化合物残基と同等� ��上に安定であればよく、多様なシアニン化� ��物残基を用いることができる。例えば、近� ��外領域、好ましくは650 nm以上に極大蛍光波 長を有しており、かつ蛍光量子収率が0.03以� �であるシアニン化合物の残基を用いること� �好ましく、蛍光団中に下記の部分構造:-CH=CH- CH=CH-CH=を有するものが特に好ましい。

 第二のシアニン化合物の残基としては、例� ��ば、下記の一般式(II):
〔式中、R ²¹ 、R ²² 、R ²³ 、R ²⁴ 、R ²⁵ 、R ²⁶ 、R ²⁷ 、及びR ²⁸ はそれぞれ独立に水素原子、スルホ基、ホス ホ基、ハロゲン原子、又は置換基を有してい てもよいC _1-6 アルキル基を示し;R ²⁹ 及びR ³⁰ はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C _1-18 アルキル基を示し;Y ¹¹ 及びY ¹² はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R ³¹ )(R ³² )-(式中、R ³¹ 及びR ³² はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C _1-6 アルキル基を示す)を示す〕で表されるシア� �ン化合物の残基が好ましい。

 R ²¹ 、R ²² 、R ²³ 、R ²⁴ 、R ²⁵ 、R ²⁶ 、R ²⁷ 、又はR ²⁸ が示すC _1-6 アルキル基としては、メチル基又はエチル基 などが好ましく、R ²¹ 、R ²² 、R ²³ 、R ²⁴ 、R ²⁵ 、R ²⁶ 、R ²⁷ 、又はR ²⁸ が示すハロゲン原子としてはフッ素原子、塩 素原子などが好ましい。R ²¹ 、R ²² 、R ²³ 、R ²⁴ 、R ²⁵ 、R ²⁶ 、R ²⁷ 、又はR ²⁸ が示すスルホ基又はホスホ基は、それぞれエ ステルを形成していてもよい。R ²¹ 、R ²² 、R ²³ 、R ²⁴ 、R ²⁵ 、R ²⁶ 、R ²⁷ 、又はR ²⁸ がすべて水素原子であってもよい。R ²¹ 、R ²² 、R ²³ 、又はR ²⁴ の内の1つがスルホ基などの電子吸引性の基(� ��し、ニトロ基を除く)であるか、R ²⁵ 、R ²⁶ 、R ²⁷ 、又はR ²⁸ の内の1つがスルホ基などの電子吸引性の基(� ��し、ニトロ基を除く)であることが好ましく 、R ²¹ 、R ²² 、R ²³ 、又はR ²⁴ の内の1つがスルホ基などの電子吸引性の基(� ��し、ニトロ基を除く)であり、かつR ²⁵ 、R ²⁶ 、R ²⁷ 、又はR ²⁸ の内の1つがスルホ基などの電子吸引性の基(� ��し、ニトロ基を除く)であることがより好ま しく、特にR ²² 及びR ²⁶ が共にスルホ基であることが好ましい。この ような場合には、第二のシアニン化合物残基 の酸化電位が高まり、活性酸素種に対する安 定性が増す効果が得られる。

 R ²⁹ 及びR ³⁰ はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C _1-18 アルキル基を示す。アルキル基としては、例 えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、� ��ソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基� �sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、 イソペンチル基、ネオペンチル基、tert-ペン� ��ル基、1-メチルブチル基、2-メチルブチル基 、1-エチルプロピル基、n-ヘキシル基、1-メチ ルペンチル基、2-メチルペンチル基、3-メチ� �ペンチル基、4-メチルペンチル基、2,3-ジメ� �ルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、1,2-ジメ チルブチル基、1-エチルブチル基、2-エチル� �チル基、1-イソプロピルプロピル基、n-ヘプ� ��ル基、n-オクチル基、n-ノニル基、n-デシル� ��、n-ウンデシル基、n-ドデシル基、n-トリデ� ��ル基、n-テトラデシル基、n-ペンタデシル基 、n-ヘキサデシル基、n-ヘプタデシル基、又� �n-オクタデシル基などを挙げることができる 。アルキル基としては、直鎖状のアルキル基 が好ましい。R ²⁹ 及びR ³⁰ が示すC _1-18 アルキル基上に存在可能な置換基としては、 例えば、アルコキシ基、アリール基、ハロゲ ン原子(フッ素原子、塩素原子、臭素原子、� �ウ素原子のいずれでもよい)、ヒドロキシ基� ��アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基若しく� ��そのエステル、又はスルホ基若しくはその� ��ステルなどを挙げることができるが、これ� ��のうち、カルボキシ基、スルホ基又はアミ� ��基などが好ましく、特にカルボキシ基又は� ��ルホ基が好ましい。R ²⁹ 及びR ³⁰ の両者が無置換のC _1-18 アルキル基であってもよく、あるいはそれら のいずれか片方のC _1-18 アルキル基が置換基を有することも好ましい 。R ²⁹ 及びR ³⁰ のうちのいずれかに置換するカルボキシ基又 はスルホ基がリンカーと結合することが好ま しい。リンカーとの結合様式は特に限定され ないが、例えばアミド結合、エステル結合、 スルホアミド結合などが挙げられる。R ²⁹ 及びR ³⁰ のうちのいずれかに置換するカルボキシ基又 はスルホ基がリンカーを介さずに第一のシア ニン化合物残基の-Z-R ¹¹ (ただし、R ¹¹ は水素原子を示す)とアミド結合、エステル� �合、チオエステル結合、スルホアミド結合� �どで直接結合してもよく、R ²⁹ 及びR ³⁰ のうちのいずれかに置換するカルボキシ基、 スルホ基又はアミノ基がリンカーを介さずに 一般式(I)で表される第一のシアニン化合物の 残基のR ⁹ 、R ¹⁰ 、及びR ¹¹ が示す置換基を有していてもよいC _1-18 アルキル基に置換したカルボキシ基、スルホ 基又はアミノ基とアミド結合、エステル結合 、スルホアミド結合などで直接結合してもよ い。Y ¹¹ 及びY ¹² はそれぞれ独立に-O-、-S-、又は-C(R ³¹ )(R ³² )-を示し、R ³¹ 及びR ³² はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C _1-6 アルキル基を示す。Y ¹¹ 及びY ¹² が-C(R ³¹ )(R ³² )-であることが好ましく、R ³¹ 及びR ³² としてはメチル基が好ましい。

 第二のシアニン化合物の残基を構成するシ� ��ニン化合物の特に好ましい例として下記の� ��合物を挙げることができるが、第二のシア� ��ン化合物残基を構成するシアニン化合物は� ��記の例に限定されることはない。この化合� ��の2個のカルボン酸のうちの1個の水素原子� �除去して得られる残基が好ましく、該カル� �ン酸がリンカーとアミド結合することがさ� �に好ましい。

 リンカーは、第一のシアニン化合物残基が� ��二のシアニン化合物残基に対して消光団と� ��て作用することができるように選択される� ��、この性質を有している限り、リンカーの� ��類は特に限定されることはない。リンカー� ��炭素原子のみからなるリンカーであっても� ��いが、窒素原子、イオウ原子、又は酸素原� ��などのヘテロ原子を1個又は2個以上含むリ� �カーでもよい。リンカーは直鎖状、分枝鎖� �、環状、又はそれらの組み合わせからなる� �のであってもよい。例えば、リンカーの連� �原子数は1から10個程度であり、4から10個程� �であることが好ましい。本明細書において� �リンカーの連結原子数とは、リンカーの一� �の末端の原子から他方の末端の原子に至る� �短経路に含まれる原子個数を意味する。リ� �カーは1又は2個以上の置換基を有していても よい。リンカーの一例として、例えば、下記 のリンカーを挙げることができるが、このリ ンカーの連結原子数は6である。

 第一のシアニン化合物残基が第二のシア� ��ン化合物残基に対して消光団として作用す� ��か否かは、例えば、第二のシアニン化合物� ��基の蛍光スペクトルに対して十分に吸収ス� ��クトルが重なる第一のシアニン化合物残基� ��選択して、第一のシアニン化合物残基と第� ��のシアニン化合物残基の蛍光量子収率をそ� ��ぞれ測定し、両者の蛍光量子収率を比較す� ��ことにより予測可能であり、第二のシアニ� ��化合物残基の蛍光量子収率に対して第一の� ��アニン化合物残基の蛍光量子収率が4分の1� �下であることが好ましい。

 また、第二のシアニン化合物残基から第� ��のシアニン化合物残基に効率的にFRETが起る ように第二のシアニン化合物残基の蛍光スペ クトルに対して十分に吸収スペクトルが重な る第一のシアニン化合物残基を選択すれば、 第一のシアニン化合物残基は消光団に限らず 実質的に蛍光量子収率の高い蛍光団であって もよい(本明細書中、第一のシアニン化合物� �基としての「消光団」には、第二のシアニ� �化合物残基からのFRETによって効率的に蛍光� ��発する蛍光団も含む)。この場合、本発明の 活性酸素測定用試薬は、第二のシアニン化合 物残基の極大吸収波長で励起すると、活性酸 素種との反応前には、FRETによって第一のシ� �ニン化合物残基からの蛍光が観察され、活� �酸素種との反応後には、第一のシアニン化� �物残基が活性酸素種によって分解されるた� �にFRETが起らず第二のシアニン化合物残基か� ��の蛍光が観察されることから、一波長励起� ��波長蛍光測定型のFRET蛍光プローブとして活 性酸素種を測定する試薬とすることもできる 。

 消光団として機能する第一のシアニン化合� ��残基と第二のシアニン化合物残基の組み合� ��せは、第一のシアニン化合物残基が活性酸� ��種に対して第二のシアニン化合物残基と同� ��か、又はそれ以上の反応性を有している組� ��合わせであればよく、言い換えれば、第二� ��シアニン化合物残基は活性酸素種に対して� ��一のシアニン化合物残基と同等以上に安定� ��あればよい。一方、インドカルボシアニン� ��合物などのカルボシアニン化合物では、化� ��物中の共役ポリメチン鎖が長くなるほど酸� ��電位が低くなり活性酸素種に対する反応性� ��上昇する。よって、第一のシアニン化合物� ��基と第二のシアニン化合物残基の組み合わ� ��は、例えば、ジカルボシアニン化合物とジ� ��ルボシアニン化合物、トリカルボシアニン� ��合物とトリカルボシアニン化合物、トリカ� ��ボシアニン化合物とジカルボシアニン化合� ��の組み合わせが好ましい。

 一般式(I)のR ¹ ないしR ¹⁰ および一般式(II)のR ²¹ ないしR ³⁰ のうち1つ又は2つは細胞膜内に埋没可能な基� ��あってもよい。この場合、本発明の試薬を� ��局在型の蛍光プローブとして使用して、細� ��膜近傍で生成する活性酸素種を効率的に測� ��できる。細胞膜内に埋没可能な基としては� ��直鎖又は分岐C _7-18 アルキル基及びリン脂質(例えば、ホスファ� �ジルエタノールアミン類、ホスファリジル� �リン類、ホスファチジルセリン類、ホスフ� �チジルイノシトール類、ホスファチジルグ� �セロール類、カルジオリピン類、スフィン� �ミエリン類、セラミドホスホリルエタノー� �アミン類、セラミドホスホリルグリセロー� �類、セラミドホスホリルグリセロールホス� �ァート類、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシ� �スファチジルコリン類、プラスマロゲン類� �又はホスファチジン酸類が挙げられるが、� �れらのリン脂質における脂肪酸残基は特に� �定されず、炭素数12~20個程度の飽和又は不飽 和の脂肪酸残基を1個又は2個有するリン脂質� ��用いることができる)が好ましい。

 本発明の試薬を細胞、生体組織又はイン・� ��ボで使用する場合には、一般式(I)のR ¹ ないしR ¹⁰ 及び一般式(II)のR ²¹ ないしR ³⁰ に置換する基、又は一般式(I)のR ¹ ないしR ¹⁰ 及び一般式(II)のR ²¹ ないしR ³⁰ の置換基を有していてもよいアルキル基の置 換基を適宜選択して本発明の試薬の水溶性を 調節し、細胞膜透過型及び非膜透過型のプロ ーブとして使用することができる。例えば、 スルホ基及びカルボキシ基を1つ又は2つ、好� ��しくは3つ以上有する本発明の化合物は水溶 性が非常に高く非膜透過性を示して細胞内に 取り込まれないため、細胞外に放出される活 性酸素種の検出に好適に用いることができる 。また、例えば、置換基としてポリエチレン グリコールやポリプロピレングリコールなど のポリアルキレングリコール鎖を置換基とし て1つ又は2つ導入すれば、導入したポリアル� ��レングリコール置換基の数とポリアルキレ� ��グリコール鎖の長さによって所望の水溶性� ��適宜本発明の試薬に付加できる。

 本発明の試薬は水和物又は溶媒和物とし� ��存在する場合もあるが、いずれも本発明の� ��囲に包含される。また、本発明の試薬は、� ��換基の種類により、1個又は2個以上の不斉� �素を有する場合があるが、1個又は2個以上の 不斉炭素に基づく光学活性体や2個以上の不� �炭素に基づくジアステレオ異性体などの立� �異性体のほか、立体異性体の任意の混合物� �ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に� �含される。

 本発明の試薬の代表的化合物の製造方法� ��本明細書の実施例に具体的に示した。従っ� ��、当業者は、これらの説明を基にして反応� ��料、反応条件、及び反応剤などを適宜選択� ��、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変� ��加えることによって、本発明の試薬を容易� ��製造することができる。

 本明細書において用いられる「測定」と� ��う用語は、定量、定性、又は診断などの目� ��で行われる測定、検査、検出などを含めて� ��最も広義に解釈しなければならない。本発� ��の活性酸素種の測定方法は、一般的には、( A)上記の試薬と活性酸素種とを反応させる工� ��、及び(B)上記工程(A)で生成した上記試薬由� ��の分解物の蛍光を測定する工程を含んでい� ��。 本発明の試薬により測定可能な活性酸� �種としては、ヒドロキシルラジカル、パー� �キシナイトライト、次亜塩素酸イオン、一� �化窒素、過酸化水素、スーパーオキサイド� �ニオン、及び一重項酸素などを挙げること� �できる。

 本発明の試薬を用いた蛍光測定手段は特� ��限定されないが、イン・ビトロで蛍光スペ� ��トルを測定する方法や、バイオイメージン� ��の手法を用いてイン・ビボで蛍光スペクト� ��を測定する方法などを採用することができ� ��。例えば、定量を行う場合には、常法に従� ��て予め検量線を作成しておくことが望まし� ��が、例えば定量的なヒドロキシルラジカル� ��発生系としてガンマーラジオリシス法など� ��利用することができ、一重項酸素の発生系� ��して、例えば、ナフタレンエンドパーオキ� ��ド系(Saito, I,. et al., J. Am. Chem. Soc., 107,� �pp.6329-6334, 1985)などを利用することができる 。本発明の試薬はマイクロインジェクション 法等により細胞内に取り込ませれば、個々の 細胞内に局在する活性酸素種をバイオイメー ジング手法により高感度にリアルタイムで測 定することができるほか、細胞培養液又は組 織切片等の培養液又は灌流液中に用いること で細胞や生体組織が放出する活性酸素種を測 定できる。すなわち、本発明の試薬を用いる ことにより、細胞又は生体組織での酸化スト レスをリアルタイムに測定することが可能で あり、疾患病態の原因究明、治療薬の開発な どに好適に利用できる。

 本発明の試薬は、必要に応じて試薬の調� ��に通常用いられる添加剤を配合して組成物� ��して用いてもよい。例えば、生理的環境で� ��薬を用いるための添加剤として、溶解補助� ��、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加� �を用いることができ、これらの配合量は当� �者に適宜選択可能である。これらの組成物� �、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤� �錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として� �供される。