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Patent Searching and Data


Title:
RECEPTACLE, AND METHOD FOR THE DETECTION OF FLUORESCENCE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2008/132247
Kind Code:
A2
Abstract:
The invention relates to a liquid receptacle (22) comprising a bottom (1) and sidewalls for holding a liquid. The bottom (1) encompasses a flat sensor surface (3) that is in contact with the liquid when the receptacle is filled, a light-incident area (2) that is located below the sensor surface (3) and is suitable for focusing light (13) onto the sensor surface (3), a light emergence area (5), and a cover area (4) that is suitable for reflecting light from the sensor surface (3) such that the light can emerge through the light emergence area (5). The invention further relates to a method for qualitatively or quantitatively determining an analyte in such a liquid receptacle (22). In said method, excitation light (13) is focused onto the sensor surface (3) via the light-incident area (2) such that a luminescent marker which characterizes the analyte is excited, and the generated luminescence is then reflected onto the cover surface (4) and is detected after emerging through the light emergence area (5). The invention also relates to an analysis device comprising a holder for a liquid receptacle, a light source (10) that is disposed such that the light (13) thereof can be focused onto the sensor surface (3) of the liquid receptacle (22) via the light-incident area (2), and a detector (17) which is arranged in such a way as to be able to detect the light (9) emerging from the light emergence area (5) of the liquid receptacle (22).

Inventors:
RUCKSTUHL, Thomas (C Zürich, H-8403, CH)
SEEGER, Stefan (Dorfstrasse 69, Zumikon, CH-8126, CH)
Application Number:
EP2008/058302
Publication Date:
November 06, 2008
Filing Date:
June 27, 2008
Export Citation:
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Assignee:
RUCKSTUHL, Thomas (C Zürich, H-8403, CH)
SEEGER, Stefan (Dorfstrasse 69, Zumikon, CH-8126, CH)
International Classes:
G01N21/03; G01N21/64; B01L3/00; B01L3/14; G01N33/551; G02B19/00
Domestic Patent References:
1999-09-16
Foreign References:
US5300423A1994-04-05
US20070262265A12007-11-15
US5300423A1994-04-05
US20070026265A12007-02-01
Other References:
KRIEG A ET AL: "Towards single-molecule DNA sequencing: Assays with low nonspecific adsorption" ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, Bd. 349, Nr. 2, 15. Februar 2006 (2006-02-15), Seiten 181-185, XP024941988 ISSN: 0003-2697 [gefunden am 2006-02-15]
RUCKSTUHL T ET AL: "Highly sensitive biosensing using a supercritical angle fluorescence instrument" BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, ELSEVIER BV, NL, Bd. 18, 15. August 2003 (2003-08-15), Seiten 1193-1199, XP002475568 ISSN: 0956-5663
RUCKSTUHL THOMAS ET AL: "Supercritical angle fluorescence (SAF) microscopy." OPTICS EXPRESS 6 SEP 2004, Bd. 12, Nr. 18, 6. September 2004 (2004-09-06), Seiten 4246-4254, XP002562614 ISSN: 1094-4087
KRIEG A. ET AL.: 'Towards single-molecule DNA sequencing: Assays with low nonspecific adsorption' ANALYTICAL BIOCHEMISTRY Bd. 349, Nr. 2, 2006, Seiten 181 - 185
RUCKSTUHL T. ET AL.: 'Highly sensitive biosensing using a supercritical angle fluorescence instrument' BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS Bd. 18, 2003, Seiten 1193 - 1199
RUCKSTUHL, THOMAS ET AL.: 'Supercritical angle fluorescence (SAF) microscopy' OPTICS EXPRESS Bd. 12, Nr. 18, 2004, Seiten 4246 - 4254
See also references of EP 2227684A2
Attorney, Agent or Firm:
HOFFMANN EITLE et al. (Arabellastrasse 4, München, 81925, DE)
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Claims:

Patentansprüche

1 . Flüssigkeitsbehälter , umfas send einen Boden und Seitenwände zum Halten einer Flüssigkeit ,

wobei der Boden umfasst:

a) eine ebene Sensoroberfläche, die bei Befüllung mit der Flüssigkeit in Kontakt steht;

b) eine Lichteintrittsfläche unterhalb der Sensoroberfläche, die geeignet ist, Licht auf die Sensoroberfläche zu fokussieren;

c) eine Lichtaustrittsflache;

d) eine Mantelfläche, die geeignet ist, Licht von der Sensoroberfläche zu reflektieren, so dass es durch die Lichtaustrittsfläche austreten kann.

2. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Analytbestimmung in einem Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei Anregungslicht über die Lichteintrittsfläche auf die Sensoroberfläche fokussiert wird, hierdurch ein den Analyten kennzeichnender Lumineszenzmarker angeregt wird, und dann die so entstehende Lumineszenz an der Manteloberflache reflektiert und nach Austritt durch die Lichtaustrittsfläche detektiert wird.

3. Analysevorrichtung, umfassend

a) eine Halterung für einen Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1;

b) eine Lichtquelle, die derart angeordnet ist, dass ihr Licht über die Lichteintrittsfläche auf die

Sensoroberflache des Flussigkeitsbehalters fokussiert werden kann; sowie

c) einen Detektor, der derart angeordnet ist, dass er das aus der Lichtaustrittsflache des

Flussigkeitsbehalters austretende Licht detektieren kann .

4. Verwendung eines Flussigkeitsbehalters nach Anspruch 1 für Bindungsassays .

5. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache konvex geformt ist.

6. Flussigkeitsbehaiter nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache aspharisch geformt ist.

7. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache sphärisch geformt ist,

8. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache zylindrisch geformt ist.

9. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache eine Fresnelsche Linse ist.

10. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine diffraktive Struktur auf der Lichteintrittsflache geeignet ist, Licht auf die Sensoroberflache zu fokussieren.

11. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-10, dadurch gekennzeichnet , dass eine lichtundurchlässige Blende im Boden integriert ist, mit welcher der Lichteintritt um die Lichteintrittsfläche lateral begrenzt werden kann.

12. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-11, der an der Außenseite Vertiefungen enthält, die geeignet sind, den Flüssigkeitsbehälter in der Analysevorrichtung zu fixieren .

13. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-11, der an der Außenseite hervorstehende Strukturen enthält, die geeignet sind, den Flüssigkeitsbehälter in der Analysevorrichtung zu fixieren.

14. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei der Boden in den Behälter geklebt ist .

15. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei der Boden in den Behälter ohne Klebstoff gesteckt wird.

16. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei ein transparentes pianares Substrat im Boden integriert ist.

17. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, der als Testtube verwendet wird.

18. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, der als ein Mikrofluidic-Chip verwendet wird,

19. Mehrere Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-18, welche in einer Ebene angeordnet sind.

20. Anordnung von Flüssigkeitsbehältern nach Anspruch 1, 4- 16, 19, welche die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte sind.

21. Verfahren zur Analytbestimmung nach Anspruch 2 in einem Flüssigkeitsbehälter nach Ansprüchen 1, 4-20, wobei das Anregungslicht die Lichteintrittsfläche vollständig ausleuchtet und der Lichteintritt lateral von der lichtundurchlässigen Blende begrenzt wird.

22. Verfahren zur AnalytbeStimmung nach Anspruch 2 in einem Flüssigkeitsbehälter nach Ansprüchen 1, 4-20, wobei das Anregungslicht in vollem Umfang auf die Lichteintrittsfläche geführt wird.

23. Verfahren zur AnalytbeStimmung nach Anspruch 2 in einem Flüssigkeitsbehälter nach Ansprüchen 1, 4-20, wobei ausschließlich oberhalb des kritischen Winkels von der Sensoroberfläche emittiertes Licht durch die Lichtaustrittsfläche tritt.

24. Analyseeinrichtung nach Anspruch 3, wobei eine Rastereinrichtung das Verschieben des Flüssigkeitsbehälters ermöglicht.

Description:

BEHALTER UND VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON FLUORESZENZ

Die vorliegende Erfindung beschreibt Reaktionsgefäße mit integrierten Lichtsammlungsoptiken, die für den Nachweis an Oberflächen gebundener fluoreszierender Moleküle eingesetzt werden können. In der Bioanalytik spielen festphasenbasierte Assays, bei denen die nachzuweisenden Substanzen aus der Lösung über immobilisierte Rezeptoren an der Oberfläche aufkonzentriert werden, eine zentrale Rolle. über die affinitätsbasierte Reaktion an der Oberfläche können biologischer Substanzen sehr selektiv, auch aus einem Gemisch, nachgewiesen werden. Typische Rezeptoren sind Antikörper und DNA Moleküle. Ein Beispiel von besonders hoher Relevanz ist der Antigennachweis über hoch affine Antikörper. Für den fluoreszenzbasierten Nachweis wird häufig der so genannte Sandwichtest verwendet, wobei ein Fangantikörper, der Rezeptor, das nachzuweisende Antigen an die Oberfläche bindet. Ein zweiter fluoreszenzmarkierter Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen und ermöglicht den empfindlichen Nachweis der Komplexe. Die Antigenkonzentration kann durch eine Intensitätsmessung der gebundenen Fluoreszenzmarker quantifiziert werden. Aufgrund der hohen erreichbaren Empfindlichkeit ist die Fluoreszenzdetektion eine der wichtigsten Nachweistechniken in der Biotechnologie.

Die Quantifizierung geringer Mengen von Biomaterialien stellt an die Nachweistechnik hohe Anforderungen hinsichtlich der Empfindlichkeit, der Sicherheit und der Kosten. Für den Nachweis von Biomarkern, welche z.B. im Zusammenhang mit Krebs- oder Herzkreislauferkrankungen entstehen, werden immer geringere Nachweisgrenzen angestrebt. Für medizinische Anwendungen sind gleichzeitig Robustheit und

Reproduzierbarkeit der Analyse von großer Bedeutung. Außerdem erfordert die ständig wachsende Zahl an solchen Tests Messungen mit möglichst geringem Material- und Zeitaufwand. Für die Leistungsfähigkeit einer empfindlichen Messmethode ist das Signal-Rausch Verhältnis von zentraler Bedeutung.

Dies gilt im Besonderen für die Fluoreszenzmessung, wo eine technologische Verbesserung des Verhältnisses von Fluoreszenzintensität und Rauschen zu niedrigen Nachweisgrenzen und/oder zu Einsparungen an Material und Zeitaufwand führt. Bei der Detektion von Bindungsassays mittels Fluoreszenzmethoden erfolgt die Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses über die Maximierung der Fluoreszenzsammlung von oberflächengebundenen Molekülen bei gleichzeitiger Minimierung der Lichtsammlung sämtlicher ξtörquellen.

Die Bindurtgsreaktion wird in der Regel an einer Grenzfläche zwischen einer wassrigen Lösung und einem transparenten Messsubstrat aus Glas oder Kunststoffmaterial durchgeführt, welches mit Rezeptormolekülen beschichtet ist. Eine wichtige Störquelle ist das Fluoreszenzsignal frei diffundierender Moleküle in der Probenlösung, welches das Fluoreszenzsignal der an die Oberfläche gebundenen Moleküle überlagern kann und somit die Konzentrationsbestimmung erschwert. Dies kann durch Waschschritte verhindert werden, was aber zeit- und kostenaufwendig ist. Um Echtzeitmessung der

Bindungsreaktionen zu ermöglichen und aufwendige Spülschritte zu umgehen, ist die oberflächenselektive Fluoreszenzdetektion von entscheidendem Vorteil. Hierbei gilt es, das Detektionsvolumen so weit wie möglich auf die Oberfläche einzuschränken und so von ungebundenen Molekülen herrührende Fluoreszenz von der Detektion auszuschließen.

Die Emission von Fluoreszenz erfordert die optische Anregung mit Licht geeigneter Wellenlänge. Das Anregungslicht induziert Streuung und Autofluoreszenz in Probe und Substrat. Problematisch ist besonders jener Anteil des Lichts, welcher spektral mit der Emission des nachzuweisenden Fluoreszenzfarbstoffs überlappt und nicht durch Wellenlängenfilter geblockt werden kann. Da ein erheblicher Teil dieses Lichts im Messsubstrat entsteht, erfolgt Unterdrückung dieses Beitrags durch die Reduzierung des

Detektionsvolumens im Substratmaterial. Dies kann durch räumliche Filterung des Fluoreszenzsignals erreicht werden. Hierbei wird ausgenutzt, dass Fluoreszenz und Streulicht raumlich getrennt entstehen und somit vom optischen System separiert werden können. Durch die verschiedenen optischen Pfade von Fluoreszenz und Streuung kann letztere auf geometrischem Wege, z.B. mit einer Lochblende, stark unterdruckt werden. Zusammengefasst ergeben sich für das Detektionsvolumen der Fluoreszenzmessung einfache Designziele: Erstens sollte die Fluoreszenzsammlung des optischen Systems an der Grenzfläche möglichst hoch sein. Zweitens sollte die LichtSammlung sowohl innerhalb der wassrigen Probe als auch innerhalb des Substrats möglichst gering sein.

Die Nahe der Grenzfläche zweier dielektrischer Materialien, wie z.B. zwischen Wasser (Brechungsindex nl » 1.33} und Glas (n2 « 1.52) hat erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften der Fluoreszenzemission. Im Gegensatz zur Fluoreszenzabstrahlung innerhalb eines homogenen Mediums ist die Emission von der Oberfläche nicht isotrop, sondern weist ein starkes Maximum in Richtung des kritischen Winkels der Totalreflexion α c auf, wobei

α c = aresin (nl/n2) .

Für die Wasser/Glas-Grenzfläche ist a c « 61°. Fluoreszierende Moleküle, die an der Grenzfläche gebunden sind, strahlen etwa 74% des Lichts ins Glas ab. Dabei erfolgt 34% der Gesamtemission oberhalb des kritischen Winkels α c . Die Fluoreszenzemission oberhalb des kritischen Winkels (englisch: supercritical angle fluorescence) ist für Bindungsassays von ganz besonderer Bedeutung. Sie erfolgt ausschließlich von Molekülen, welche sich direkt vor der Grenzflache befinden, d.h. in einem Abstand zum Substrat deutlich kleiner als die Emissionswellenlange . Folglich ermöglicht eine Fluoreszenzsammlung, welche ausschließlich

auf den Bereich oberhalb des kritischen Winkels beschränkt ist, eine oberflächenselektive Detektion. Der Beitrag ungebundener Fluoreszenzfarbstoffe kann also fast vollständig unterdrückt werden, was z.B. Echtzeitmessungen von Bindungsreaktionen ermöglicht .

Die herkömmliche Methode der oberflächenselektiven Fluoreszenzmessung erfolgt über eine so genannte evaneszente Anregung der Grenzfläche. Dabei trifft das Anregungslicht oberhalb des kritischen Winkels auf die Grenzfläche und wird im Messsubstrat intern total reflektiert. Auf der Probenseite der Grenzfläche wird so eine dünne Anregungsschicht generiert, mit der oberflächengebundene Moleküle selektiv zur Fluoreszenz angeregt werden können. Diese Methode ist aber technisch aufwendig und erschwert die Miniaturisierung.

Ruckstuhl und Seeger beschreiben eine Methode, die Fluoreszenzemission über dem kritischen Winkel sehr effizient zu sammeln (PCT/EP099/1548 ) . Ein optischer Wellenleiter, aus Glas oder Kunststoff, besitzt eine Mantelfläche, welche das

Licht durch eine interne Reflexion kollimiert . Die Verwendung einer Mantelfläche parabolischer Form kollimiert die Fluoreszenz zu einem parallelen Strahlenbündel und macht die weitere Verarbeitung des Signals besonders einfach. Die kollimierte Fluoreszenz kann durch eine Lochblende fokussiert werden, welche als räumlicher Filter dient. Die Blende reduziert das Detektionsvolumen innerhalb des Substrats und filtert das dort vom Anregungslicht induzierte Streulicht/Autofluoreszenz aus. Somit erzielt der Kollimator ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis und erlaubt sogar den Nachweis einzelner Moleküle. Selbst bei ausschließlicher Sammlung der Fluoreszenz oberhalb des kritischen Winkels beträgt die Sammlungseffizienz des Kollimators mehr als 30%, was deutlich über den Werten herkömmlicher Detektionssysteme liegt. Fluoreszenzsensoren, die auf Faseroptiken basieren, erreichen Sammlungseffizienzen um 1%. Auf Lichtbrechung basierende Einzellinsen sind bis zu einer numerischen Apertur

(N. A,) von etwa 0.6 herstellbar und erzielen immerhin Effizienzen um 5%. Konventionelle Linsen oder Linsensysteme sammeln jedoch vornehmlich Fluoreszenz unterhalb des kritischen Winkels und ermöglichen somit keine oberflächenselektive Fluoreszenzsammlung.

In der Bioanalytik werden oft kleine standardisierte Reaktionsgefäße verwendet, wie z.B. Testtubes oder Küvetten für Einzelmessungen und Mikrotiterplatten für Messungen mit höherem Durchsatz. Auf Mikrotiterplatten sind eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen, so genannte Wells, auf einer Fläche von ~7 χ ll cm 2 gitterförmig angeordnet, was standardmäßig 96, 384 oder 1526 unabhängige Messungen erlaubt. Die Wells werden in der Regel sequentiell ausgelesen, was ein schnelles Verschieben der Platte zwischen den Messungen erfordert. Durch Integration des Kollimators für superkritische Fluoreszenz in Mikrotiterplatten lässt sich die Signalausbeute im Vergleich zu herkömmlichen Platten erheblich verbessern. Zudem werden Echtzeitmessungen von Bindungsreaktionen mit hohem Durchsatz ermöglicht. Allerdings muss der Kollimator dazu auf wenige Millimeter Durchmesser miniaturisiert werden.

Die hervorragende Lichtsammlungseigenschaft des Kollimators ist auf einen begrenzten Bereich um die optische Achse beschränkt. Mit wachsendem Abstand der Fluoreszenzemission von der optischen Achse verschlechtern sich die Qualität der Lichtbündelung und die Sammelungseffizienz . Dies ist analog zur Fluoreszenzmikroskopie, wo Optiken mit hoher numerischer Apertur zwar hohe Sammlungseffizienz und Sensitivität erreichen, dies jedoch nur innerhalb eines relativ kleinen Bereichs im öbjektraum. Um die Leistungsfähigkeit des Kollimators voll auszuschöpfen, irtuss das Anregungslicht an der Oberfläche um die optische Achse des Kollimators gebündelt werden. Die Größe der nutzbaren Fläche und die Genauigkeit, mit der das Anregungslicht auf die optische Achse zentriert werden muss, hängen dabei von der Größe des

Kollimators ab. Eine Miniaturisierung des Kollimators führt zur Verkleinerung der nutzbaren Fläche und erhöht somit die Präzisionsanforderungen. Dies erhöht die Anforderung und Kosten der motorisierten Verschiebevorrichtungen, führt zu mehr Zeitbedarf und kann auch negativen Einfluss auf die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Messungen haben.

Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden der Fluoreszenzsammlung oberhalb des kritischen Winkels in kostengünstigen Flüssigkeitsbehältern., wie beispielsweise Testtubes und Mikrotiterplatten aus Kunststoff. Dies wird durch einen neuartigen Kollimator und die Integration des Elements in den Gefäßboden erreicht. Eine Verbesserung stellt im Besonderen die Integration der Fokussierungsoptik für das Anregungslicht in den Gefäßboden dar. Mit einer unterhalb der Grenzfläche zwischen Analyt und Gefäßboden angeordneten konvexen Fläche kann Anregungslicht nahe der optischen Achse des Kollimators auf die Grenzfläche fokussiert werden. Dies führt zu einer deutlichen Vergrößerung der erlaubten Toleranzen bei der Zentrierung des Anregungslichts auf die optische Achse des Kollimators. Daraus ergibt sich unter anderem der Vorteil, dass bei sequentieller Auslesung mehrerer Reaktionen die Verschiebung der Gefäße über dem Detektionssystem weniger mit geringerer Präzision erfolgen kann, ohne negative Auswirkung auf die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Messungen. Der manuelle oder automatisierte Wechsel der Behälter zwischen zwei Messungen kann damit schneller erfolgen und/oder mit kostengünstigeren Komponenten realisiert werden.

Abbildung 1 zeigt eine Ausführung der Erfindung. Der gezeigte Kollimator 1 ist Teil eines Flüssigkeitsbehälters. Für die Fokussierung des Anregungslichts ist an der Unterseite des Kollimators 1 eine konvex geformte Fläche 2 integriert. Die konvexe Fläche 2 ist vorzugsweise rotationssymmetrisch um die optische Achse des Kollimators angeordnet und fokussiert das Licht vorzugsweise achsennah auf die gegenüberliegende

Sensoroberfläche 3, welche mit dem flüssigen Analyten in Kontakt steht. Für Bindungsassays kann die Sensoroberfläche 3 mit Rezeptormolekülen beschichtet werden. Die unter großen Winkeln in das Wellenleitermaterial emittierte Fluoreszenz wird von der Mantelfläche des Kollimators 4 reflektiert und verlässt den Kollimator durch die unterseitige Lichtaustrittsfläche 5. Die Kollimierung der Mantelfläche kann auf der totalen internen Reflektion beruhen, wenn sie von einem Medium mit einem Brechungsindex kleiner als 1.1 umgeben ist, also z.B. Luft mit einem Brechungsindex von 1.0. Die Mantelfläche kann aber auch metallisch verspiegelt sein. Die Mantelfläche ist vorzugsweise derart konvex geformt, dass die Fluoreszenz nach Austritt aus dem Kollimator gebündelt um die optische Achse verläuft 9. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung einer parabolischen Mantelfläche weil dadurch die Fluoreszenz zu einem annähernd, parallelen Strahlenbündel kollimiert werden kann. Die Mantelfläche 4 kann direkt an die Lichtaustrittsfläche 5 angrenzen, aber auch an eine weitere Fläche 6, welche z.B. zu Halterungszwecken des Elements verwendet werden kann. Mit der lichtundurchlässigen Blende 7 kann verhindert werden, dass Anregungslicht außerhalb der Lichteintrittsfläche 2 in den Kollimator 1 eindringt. Zudem kann über Wahl des λußendurchmessers der Blende 7 der Winkelbereich der Fluoreszenzsammlung nach oben begrenzt werden. Mit einer lichtundurchlässigen Blende 8 kann der Winkelbereich der Fluoreszenzlichtsammlung nach unten begrenzt werden, vorzugsweise oberhalb des kritischen Winkels α c . Der Winkelbereich der Lichtsammlung kann aber auch ohne Blende 8 nach unten beschränkt werden, nämlich durch geeignete Wahl des Außendurchmessers der Mantelfläche 4. Der Bereich der Sensoroberfläche 3 ist zumindest in dem Bereich, der von der Lichtquelle angeregt wird eben. Vorzugsweise hat der ebene Bereich einen Durchmesser von mehr als 100 Mikrometer. Der Größe des Kollimators ist vorzugsweise auf die jeweilige Größe der Analytbehälter angepasst. Typisch ist ein Durchmesser zwischen 2 und 15 Millimeter. Wird eine parabolische Mantelfläche 4 gewählt, so liegt deren

Brennweite vorzugsweise im Bereich von 0.4 bis 3 Millimeter. Der Brennpunkt der parabolischen Mantelfläche befindet sich dann vorzugsweise auf der Sensoroberfläche, so dass die auf die Mantelfläche treffende Fluoreszenz zu einem annähernd parallelen Strahlenbündel kollimiert wird.

Der Abstand der konvexen Lichteintrittsfläche zur Sensoroberfläche beträgt vorzugsweise 2 Millimeter bis 20 Millimeter. Der Durchmesser der Lichteintrittsfläche 2 ist in der Regel kleiner als der innere Durchmesser der Mantelfläche 4 und liegt vorzugsweise im Bereich von 0.5 bis 6 Millimeter. Für die kostengünstige Massenfertigung des Kollimators eignen sich- besonders spritzgießbare optische Kunststoffe, wie beispielsweise PMMA, PC, PS, Zeonor oder Zeonex.

Abbildung 2 zeigt eine mögliche Ausführung des Analysegeräts zur Fluoreszenzmessung mit dem in einem Gefäßboden integrierten Kollimator 1. Eine Lichtquelle 10 emittiert Licht zur Fluoreszenzanregung geeigneter Wellenlänge. Das Licht wird durch optische Komponenten 11 ausreichend kolliraiert and auf einen geeigneten Strahldurchmesser gebracht. Diese Komponenten können optische Linsen, optische Fasern, Spiegel und Blenden beinhalten. Das Licht wird durch Weilenlängenfilter 12 spektral aufgereinigt . Das Anregungslicht wird in Richtung seiner optischen Achse in den Kollimator eingestrahlt. Die über dem kritischen Winkel emittierte Fluoreszenz tritt ringförmig als gebündelte Strahlung aus dem Kollimator. Der Kollimator sammelt aber auch Fluoreszenz mit der konvexen Fläche 2. Die Fluoreszenz in diesem Winkelbereich um die optische Achse kann auch von Molekülen abgestrahlt werden, die nicht an der Grenzfläche 3 gebunden sind. Für eine oberflächenselektive Messung muss daher Fluoreszenz, welche von der konvexen Fläche 2 gesammelt wird, vollständig blockiert werden. Zu diesem Zweck ist unterhalb des Kollimators ein Reflektorelement 14 angeordnet, welche achsennah emittierte Fluoreszenz von der überkritschen Fluoreszenz trennt. Im gezeigten Fall lenkt das Reflektorelement 14 das Anregungslicht 13 auf die optische

Achse des Kollimators und spiegelt die durch die konvexen Fläche 2 gesammelte Fluoreszenz gleichzeitig vollständig aus dem Detektionsstrahlengang. In einer weiteren Ausführung kann das Reflektorelement derart beschaffen sein, dass die überkritische emitterte Fluoreszenz gespiegelt, aber Anregungslicht und achsennah gesammelte Fluoreszenz durchgelassen werden. Im Detektionsstrahlengang sind optische Komponenten 15 angeordnet, welche die überkritische Fluoreszenz durch eine Lochblende 16 fokussieren und auf die lichtsensitive Fläche eines Detektors 17 projizieren. Die Lochblende dient dabei zur räumlichen Filterung und ist derart angeordnet, dass im Kollimator erzeugtes Streulicht bzw. Autofluoreszenz weitgehend geblockt wird die Fluoreszenz von der Oberfläche passiert. Im Detektionsstrahlengang sind vorzugsweise Wellenlängenfilter 18 enthalten.

In einer Ausführung der Erfindung weist die konvexe Fläche 2 eine asphärische Form auf. Die Krümmung der Fläche kann dabei so gewählt sein, dass das Anregungslicht beugungsbegrenzt im Wellenleitermaterial fokussiert wird. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kann die Brennweite der Asphäre dabei so gewählt sein, dass der Fokus unterhalb oder oberhalb der Sensoroberfläche 3 liegt. Auf diese Weise kann auf der Grenzfläche eine Anregungsscheibe mit definiertem Durchmesser produziert werden, vorzugsweise mit einem Durchmesser kleiner als 300 Mikrometer.

In einer Ausführung der Erfindung ist der Durchmesser der konvexen Fläche 2 kleiner gewählt als der Querschnitt des kollimierten Anregungsstrahls 13 (Abbildung 4) . Der Teil des Anregungsstrahls der außerhalb der konvexen Fläche auf den Kollimator trifft, wird durch die lichtundurchlässige Blende 7 am Kollimator geblockt. Besitzt der Anregungsstrahl ein homogenes Intensitätsprofil, d.h. gleichbleibende Intensität über den gesamten Querschnitt, so hat ein gewisser lateraler Versatz zwischen der optischen Achse des Kollimators und dem Anregungsstrahl keinen Einfluss auf das Anregungsprofil der

Sensoroberfläche 3. Dadurch kann die an der Oberfläche des Kollimators gebundene Fluoreszenz reproduzierbar ausgelesen werden, ohne eine hochpräzise laterale Justierung des Kollimators. Dies ist besonders von Vorteil für die schnelle sequentielle Auslesung mehrerer Kollimatoren. Die

Sensoroberfläche 3 wird vorzugsweise in einem Bereich um die optische Achse angeregt, vorzugsweise hat dieser Bereich einen Durchmesser kleiner als 300 Mikrometer. Kleine Kollimatoren von wenigen Millimetern Durchmesser erfordern allerdings eine noch genauere Zentrierung des Anregungslichts auf die optische Achse . Durch die Integration der konvexen Fläche 2 in den Gefäßboden kann das auf die Sensoroberfläche treffende Anregungslicht präzise auf die optische Achse zentriert werden, selbst bei einem lateralen Versatz des kollimierten Anregungsstrahls 13 zur optischen Achse des Kollimators von mehreren hundert Mikrometern.

In einer Ausführung der Erfindung ist der Durchmesser der konvexen Fläche 2 größer als der Querschnitt des kollimierten Anregungsstrahls (Abbildung 5) . Selbst bei einem gewissen lateralen Versatz von Kollimator und Anregungsstrahl trifft das Licht sehr achsenzentriert auf die Sensoroberfläche 3 des Kollimators .

In einer Ausführung der Erfindung ist ein transparentes vorzugsweise planares Substrat aus Kunststoff oder Glas, z.B. ein Mikroskopie-Deckglas, im Gefäßboden integriert. Dies ist in Abbildung 6 gezeigt. Das Substrat 19 kann dabei durch einem optischen Klebstoff 20 mit dem Kollimator verbunden sein. Das Substrat, der optische Klebstoff und der Kollimator 1 besitzen vorzugsweise ähnliche Brechungsindizes. Die Anordnung ist dabei so gewählt, dass die Fluoreszenz an der Oberseite des Substrats angeregt und gesammelt wird, d.h. die Sensoroberfläche 3 liegt auf dem Substrat. Die Verwendung eines pianaren Substrats hat folgende Vorteile: Erstens ermöglicht das Mikroskopie-Deckglas Fluoreszenzmessungen mit sehr geringem Untergrund. Zweitens werden solche Gläser

massengefertigt und sind sehr kostengünstig. Drittens verhindert das Substrat den Kontakt der wässrigen Probe mit der Mantelfläche 4. Eine gasförmige Umgebung 21 der Mantelfläche erlaubt eine verlustfreie Kollimierung durch totale interne Reflexion. Viertens ist Glas für die

Immobilisierung von Rezeptormolekülen besonders gut geeignet. Im gezeigten Beispiel ist der Kollimator in einem Testtube 22 integriert .

Eine weitere Ausführung der Erfindung ist in Abbildung 7 gezeigt. Hier besteht das Flüssigkeitsbehältnis lediglich aus zwei Komponenten, aus Gefäßwand und aus als Gefäßboden fungierendem Kollimator. Die Gefäßwand ist dabei derart geformt, dass sie an die Sensoroberfläche 3 angrenzt. Auf diese Weise kann ein Kontakt von Analytflüssigkeit und Mantelfläche verhindert werden. Die Gefäßwand kann vorzugsweise den Kollimator seitlich umschließen. Dadurch ist die optische Mantelfläche 4 vor Verunreinigungen geschützt, z.B. vor Fingerabdrücken des Anwenders. Auch kann durch Verwendung einer lichtundurchlässigen Gefäßwand verhindert werden, dass Umgebungslicht durch die Mantelfläche in den Kollimator gelangt. Vorteile dieser Ausführung sind insbesondere die verringerten Herstellkosten und verringerte Zahl an Klebeflächen, die Ursachen für Qualitätsschwankungen sein können.

In einer Ausführung der Erfindung ist das planare Substrat der Boden einer Mikrotiterplatte, durch welche die Fluoreszenz detektiert wird (Abbildung 8} . Die Wells sind an der Unterseite mit Kollimatoren versehen. Die Kollimatoren können dabei einzeln mit dem Boden der Mikrotiterplatte verbunden sein oder auf einem optischen Element integriert sein, welches mehrere in einer Ebene angeordnete Kollimatoren enthält. Die Kollimatoren können den Gitterabstand der Wells besitzen, aber auch dichter angeordnet sein, was mehrere Messungen an mehreren Stellen eines Wells ermöglicht. Die Auslesung der Kollimatoren erfolgt sequentiell,

beispielsweise durch eine Verschiebeeinheit 24, welche die Mikrotiterplatte mit den Kollimatoren senkrecht zur optischen Achse bewegt. Alternativ dazu kann der Anregungsstrahl translatorisch bewegt werden.