ANTIGENO RECOMBINANTE PARA LA INDUCCION DE RESPUESTA INMUNE

CONTRA EL VIRUS ZIKA

Campo de la técnica

La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología y la industria farmacéutica, en particular con la obtención de antígenos proteicos recombinantes y composiciones vacunales contra el virus zika.

Estado de la técnica anterior

El virus zika pertenece al género flavivirus de la familia Flaviviridae (Kuno & Chang, 2007, Arch Virol, 152:687-696), la cual incluye a otros patógenos como el virus de la Fiebre Amarilla, el virus de la Encefalitis Japonesa, el virus del Oeste del Nilo, el virus de la Encefalitis Transmitida por Garrapatas y los virus del dengue. El virus zika se transmite a los humanos a través de la picadura del mosquito infectado del género Aedes (Kindhauser et al., 2016, Bull World Health Organ, 94:675-6860), el cual abunda principalmente en regiones tropicales y subtropicales (Sharma & Lal, 2017, Front Microbiol, 8:110-). Es un virus envuelto y tiene como genoma una simple cadena de ácido ribonucleico (ARN) de polaridad positiva, que se traduce a una poliproteína, la cual es escindida co- y post-traduccionalmente en diez proteínas individuales (Kuno & Chang, 2007, Arch Virol, 152:687-696): tres proteínas estructurales y siete proteínas no estructurales, que están involucradas en la replicación viral, en el ensamblaje del virus y en la evasión del sistema inmune (Sirohi et al., 2016, Science, 352:467-470). Las proteínas estructurales son la proteína de la cápsida (C), la proteína de la envoltura (E) y la proteína de la membrana (M) o el precursor de membrana (prM)). Las proteínas no estructurales se conocen como NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5.

Hasta la fecha han ocurrido tres grandes brotes epidémicos por el virus zika, el primero ocurrió en el Estado Federal de Micronesia, en el 2007, con cerca de 7 000 personas infectadas, pero sin complicaciones serias (Duffy et al., 2009, N Engl J Med, 360:2536- 2543). En el 2013 ocurrió el segundo brote epidémico en la Polinesia Francesa, donde se estima que 28000 habitantes sufrieron infección por el virus zika (Musso et al., 2014, Clin Microbiol Infect, 20:0595-0596). En este brote, se observó por primera vez un incremento en la incidencia de casos de daños neurológicos como el Síndrome de Guillain-Barré (Cao-Lormeau et al., 2016, Lancet, 387:1531-1539). El tercer brote fue en el 2015 en Brasil, con 440 000 - 1 300 000 de casos sospechosos de infección por el virus zika (Hennessey et al., 2016, MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 65:55-58). En ese brote hubo un incremento en el número de casos con daños neurológicos, específicamente de individuos con Síndrome de Guillain-Barré y de recién nacidos con microcefalia (Schuler-Faccini et al., 2016, MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 65:59-62).

En el 2016 la Organización Mundial de la Salud declaró “Emergencia de Salud Pública de Interés Internacional” la enfermedad causada por el virus zika. En el 2017 la transmisión de la enfermedad por la infección a través del mosquito se reportó en 48 países, lo cual acumuló 510 000 casos sospechosos y más de 170 000 casos confirmados con el virus zika (Yun & Lee, 2017, J Microbiol, 55:204-219). Hasta el 2019, 87 países registraron transmisión autóctona de virus zika a través de la picadura de mosquitos infectados, distribuida en cuatro de las seis regiones de la Organización Mundial de la Salud: África, Asia Suroriental, el Pacífico Occidental y América. Particularmente para este virus, además de la transmisión por el vector, son posibles otras vías de transmisión como las relaciones sexuales, la transmisión de madre a hijo y las transfusiones de sangre (Frank et al., 2016, Euro Surveill, 21 :).

Tras la infección por el virus se desarrolla en los humanos una enfermedad similar al dengue, que puede transitar de forma leve o asintomática, aproximadamente el 80% de las infecciones son asintomáticas (Grossi-Soyster & LaBeaud, 2017, Curr Opin Pediatr, 29:102-106). Los casos sintomáticos generalmente son leves y pueden incluir erupción, estado febril, artritis, artralgia, conjuntivitis no purulenta y edema en las extremidades (Calvet et al., 2016, Curr Opin Infect Dis, 29:459-466). Asimismo, se pueden presentar otros síntomas como: dolor de cabeza, mialgia, dolor retro-orbital, dolor en la espalda baja, linfoadenopatía y vómitos (Brasil et al., 2016, PLoS Negl Trop Dis, 10:e0004636-). A pesar de la enfermedad ser frecuentemente leve, existen reportes de casos fatales, particularmente en individuos con condiciones médicas subyacentes (Arzuza-Ortega et al., 2016, Emerg Infect Dis, 22:925-927).

Datos iniciales indican que la respuesta inmune al virus zika es similar a la de otros flavivirus, donde los anticuerpos neutralizantes dirigidos a la proteína E (Fernandez & Diamond, 2017, Curr Opin Virol, 23:59-67), constituyen los elementos principales en la protección contra la infección (Sapparapu et al., 2016, Nature, 540:443-447). La proteína E es la más expuesta en la superficie del virión, y está involucrada en la fusión y entrada del virus a la célula hospedero (Larocca et al., 2016, Nature, 536:474-478). Sin embargo, el alto nivel de reactividad cruzada entre los flavivirus, especialmente entre los virus dengue y el virus zika, complica el aporte serológico de los anticuerpos para discriminar entre las dos infecciones virales (Kostyuchenko et al., 2016, Nature, 533:425-428). Hasta el momento, no se conoce con certeza si los anticuerpos generados contra el virus zika podrían facilitar la infección viral de otro flavivirus relacionado, a través del fenómeno de Amplificación Dependiente de Anticuerpos, como se ha visto para el caso de los virus dengue. Tampoco se conoce si la respuesta inmune generada contra el virus zika podría afectar la posterior infección con los virus dengue o viceversa, o si los daños neurológicos, como el Síndrome de Guillain-Barré observado en algunos pacientes, es un resultado de la infección viral directa o de efectos secundarios de la respuesta inmune (Poland et al., 2018, Lancet Infect Dis, 18:e211-e219).

Por otro lado, estudios recientes indican un papel importante en la respuesta de células T contra la infección por virus zika. Con el empleo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos inmunes a la infección viral, se han identificado los principales blancos de la respuesta inmune celular, dirigida fundamentalmente a las proteínas estructurales C y prM, y a las no estructurales NS2 y NS5 (Xu et al., 2016, PLoS Curr, 8:, Elong et al., 2017, Cell Host Microbe, 21 :35-46).

Actualmente, se encuentran en desarrollo más de 40 candidatos vacunales contra el virus zika, los cuales utilizan varias de las plataformas vacunales disponibles, entre las que se incluyen vacunas de virus inactivados, vacunas atenuadas, vacunas de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) mensajero, vacunas basadas en vectores virales y vacunas de subunidades (Barouch et al., 2017, Immunity, 46:176- 182). Sin embargo, en algunas de estas estrategias se identifican desventajas como los altos costos de producción y los bajos perfiles de seguridad, que dejan abierto el camino a las vacunas de subunidades.

Dentro de las vacunas por subunidades, se han obtenido de forma recombinante variantes que comprenden el 80% de la proteína E (Liang et al., 2018, PLoS One, 13:e0194860-; Qu et al., 2018, Antiviral Res, 154:97-103), o la región del dominio III de la proteína E (EDI II) (Qu et al., 2018, Antiviral Res, 154:97-103). Específicamente, la región del EDIII emerge como un inmunógeno promisorio, a partir de los resultados obtenidos con esta región como candidato para otros flavivirus (Beltramello et al., 2010, Cell Host Microbe, 8:271-283). Varios trabajos que emplean la región EDIII de forma recombinante han demostrado la inducción de respuesta inmune humoral y celular, así como capacidad de conferir protección ante el reto viral en ratones (Yang et al., 2017, Sci Rep, 7:7679-; Qu et al., 2018, Antiviral Res, 154:97-103). No obstante, no todas estas estrategias han podido reproducir los resultados promisorios de inmunogenicidad en modelos animales más cercanos a los humanos. Con el propósito de incrementar la respuesta inmune generada, las estrategias basadas en vacunas de subunidades han valorado incluir nuevos antígenos, mejorar las formas de presentación al sistema inmune, o combinar las proteínas recombinantes con adyuvantes, de modo que permitan mejorar la respuesta inmune humoral y celular inducida.

De acuerdo a los elementos previamente referidos, el desarrollo de vacunas de subunidades contra el virus zika, capaces de inducir una respuesta inmune segura y efectiva contra este flavivirus, es aún un problema no resuelto.

Explicación de la invención

La presente invención resuelve el problema antes planteado, al proveer antígenos quiméricos recombinantes que comprenden en su cadena polipeptídica un polipéptido correspondiente a los aminoácidos 2 al 104 de la proteína de la cápsida del virus zika o un polipéptido con una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de identidad con dicha región de la proteína de la cápsida de ese virus. De esta forma, los antígenos quiméricos de la invención contienen regiones potencialmente inductoras de respuesta inmune celular, capaces de reducir la carga viral y proveer protección, sin que medie la presencia de anticuerpos neutralizantes al virus.

En una materialización de la invención, los antígenos quiméricos adicionalmente comprenden un polipéptido correspondiente al dominio EDIII de la proteína de la E del virus zika o un polipéptido con una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de identidad con dicho dominio de la proteína de la envoltura. En este caso, los antígenos quiméricos comprenden dos regiones potencialmente protectoras, capaces de inducir a la vez anticuerpos neutralizantes y respuesta inmune celular. Estas regiones consisten en 145 aminoácidos del dominio EDI II y 103 aminoácidos de la proteína de la cápsida viral. Ambas regiones virales presentan un alto grado de homología entre los diferentes aislamientos, que comprenden los dos linajes que se han identificado para el virus zika, linaje asiático/americano y linaje africano (Haddow et al., 2012, PLoS Negl Trop Dis, 6:e1477-). Estas regiones convierten a los antígenos quiméricos de la invención en moléculas útiles para proteger ante la infección por cepas diferentes del virus zika.

En una realización de la invención, los antígenos quiméricos adicionalmente comprenden un segmento de seis residuos histidina en el N-terminal de su cadena polipeptídica. En una realización particular, el antígeno quimérico posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

Es objeto de la invención una composición vacunal que comprende el antígeno quimérico recombinante que comprende en su cadena polipeptídica a) un polipéptido correspondiente a los aminoácidos 2 al 104 de la proteína de la cápsida del virus zika o un polipéptido con una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de identidad con dicha región de la proteína de la cápsida de ese virus y b) un adyuvante vacunal farmacéuticamente aceptable. En una realización de la invención el adyuvante es una sal de aluminio.

La capacidad de las composiciones vacunales de inducir inmunidad se evaluó primeramente en estudios preclínicos en ratones inmunocompetentes (BALB/c), los cuales se inmunizaron por vía intraperitoneal. En dichos estudios se empleó la alúmina como adyuvante, por su versatilidad para su posterior empleo en humanos. Además, las composiciones vacunales se ensayaron también combinadas con una cadena de ácido desoxiribonucleico (DNAss) inmunopotenciador (referido como SEQ ID NO: 11 en la presente invención). Esto permitió la generación de nuevas composiciones vacunales donde se incrementa la inmunogenicidad de las mismas, al compararlas con las preparaciones sin el inmunopotenciador, debido a la formación de agregados de estos antígenos, que son más eficientemente presentados al sistema inmune que las variantes no agregadas. Por tanto, en una materialización de la invención, la composición vacunal basada en antígenos quiméricos adicionalmente comprende un ácido nucleico que posee una secuencia de nucleótidos que se identifica como SEQ ID NO: 11. En una realización de la invención, en la composición vacunal el antígeno quimérico se encuentra en un rango de 10-150 microgramos por dosis.

Las composiciones vacunales que incluyeron la región de la cápsida viral, tanto soluble como en forma agregada por la presencia del DNAss inmunopotenciador, generaron en los ratones inmunizados una respuesta inmune celular. Esta inmunidad confirió protección parcial a los animales luego del reto con diferentes cepas del virus.

En el caso de las composiciones vacunales que incluyeron la proteína quimérica que comprende a la región EDI II de virus zika y la región de la proteína de la cápsida viral, en forma soluble y en forma agregada luego de la combinación con el DNAss inmunopotenciador, fueron capaces de generar en los ratones inmunizados una respuesta inmune humoral, así como respuesta inmune celular efectiva. Esta inmunidad confirió protección a los animales luego del reto con diferentes cepas del virus. Posteriormente, se escogieron las composiciones vacunales que incluyen las variantes agregadas de ambas moléculas y se evaluaron en primates no humanos de la especie Macaca mulatta, los cuales se inocularon por vía subcutánea, empleando igualmente la alúmina como adyuvante. Como resultado, en los animales inmunizados se generaron anticuerpos contra el virus zika con capacidad neutralizante, así como respuesta inmune celular luego de tres dosis. Por tanto, en otro aspecto, la invención comprende el uso de los antígenos quiméricos recombinantes antes descritos para la fabricación de un medicamento para la inducción de respuesta inmune contra el virus zika.

La invención también provee un método para la inducción de respuesta inmune contra el virus zika en un individuo donde se administra una cantidad farmacéuticamente efectiva del antígeno quimérico recombinante que comprende en su cadena polipeptídica un polipéptido correspondiente a los aminoácidos 2 al 104 de la proteína de la cápsida del virus zika o un polipéptido con una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de identidad con dicha región de la proteína de la cápsida de ese virus y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una materialización de la invención, el adyuvante es una sal de aluminio. En una realización del método de la invención la cantidad farmacéuticamente efectiva del antígeno quimérico recombinante se encuentra en un rango de 10-150 microgramos por dosis. Como una realización particular, en el método de la invención adicionalmente se administra un ácido nucleico que posee una secuencia de nucleótidos que se identifica como SEQ ID NO: 11 junto al antígeno quimérico recombinante.

A pesar de que varios trabajos que emplean la región EDI 11 del virus zika han demostrado la inducción de respuesta inmune humoral y celular, y protección ante el reto viral en ratones, estas estrategias no han podido reproducir los buenos resultados de inmunogenicidad en primates. La presente invención tiene evidentes ventajas en comparación con esos intentos de desarrollo de candidatos vacunales basados en subunidades del virus zika. Los antígenos quiméricos de la invención, en composiciones vacunales que los contienen, han demostrado la inducción tanto de respuesta celular como humoral en primates no humanos. En parte, esta respuesta efectiva frente al virus zika se debe a la inclusión de un fragmento de 103 aminoácidos de la proteína de la cápsida del virus, y a una mejor forma de presentación del antígeno al sistema inmune.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Clonaje de las regiones codificantes para las proteínas ZC (A) y ZEC (B) en el vector de expresión pET-28AC.

Figura 2. Separación por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) y caracterización por Western blotting de los antígenos recombinantes ZEC y ZC: (A) SDS-PAGE al 12,5% de la proteína ZEC; (B) Western blotting de la proteína ZEC; (C) SDS-PAGE al 12,5% de la proteína ZC y (D) Western blotting de la proteína ZC.

Figura 3. Caracterización antigénica por ELISA de las proteínas recombinates ZC y ZEC con anticuerpos policlonales humanos, provenientes de personas inmunes tras la infección con virus zika. La figura muestra la reactividad de las dos proteínas recombinantes con diluciones seriadas de los sueros humanos SH1 y SH2 (A), SH6 y SH7 (B), SH8 y SH9 (C). Figura 4. ELISpot de interferón gamma (IFNy) a partir de PBMC de individuos inmunes al virus zika, luego de la estimulación in vitro con proteínas recombinantes o el virus zika. Para la estimulación se emplearon 10 mr de proteína recombinante ZC o ZEC, y para la estimulación con el virus se empleó una multiplicidad de infección (MOI) de 1 o 5. Los resultados se muestran como la media ± la desviación estándar de las unidades formadores de puntos (UFP) por cada un millón de PBMC, a partir de dos experimentos independientes. La línea discontinua indica el criterio de positividad (50 UFP/millón de células).

Figura 5. Evaluación de la respuesta inmune humoral en ratones BALB/c inmunizados con las composiciones que comprenden las proteínas ZC o ZEC. (A) Anticuerpos contra el virus zika determinados por ELISA. (B) Anticuerpos neutralizantes medidos por el ensayo de neutralización viral in vitro. Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar ( n=10 ). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p<0,01). La línea horizontal discontinua indica el límite de positividad del ensayo.

Figura 6. Evaluación de la respuesta inmune mediada por células en los ratones BALB/c inmunizados con las proteínas ZC o ZEC, determinada mediante ELISpot de IFNy. Los datos se presentan como la media ± el error estándar de la media de las UFP por cada millón de células del bazo ( n=10 ). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p<0,001). La línea horizontal discontinua indica el límite de positividad del ensayo.

Figura 7. Evaluación de la respuesta inmune humoral en ratones BALB/c inmunizados con las formulaciones de las proteínas ZC o ZEC. (A) Anticuerpos contra el virus zika medidos por ELISA. (B) Anticuerpos neutralizantes determinados por el ensayo de neutralización viral in vitro. Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar ( n=10 ). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p<0,01). La línea horizontal discontinua indica el límite de positividad del ensayo.

Figura 8. Evaluación de la respuesta inmune mediada por células en los ratones BALB/c inmunizados con las proteínas ZC o ZEC, determinada mediante ELISpot de IFNy. Los datos se presentan como la media ± el error estándar de la media de las UFP por cada millón de células del bazo ( n=10 ). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p<0,01). La línea horizontal discontinua indica el límite de positividad del ensayo.

Figura 9. Gráfico de viremia en cerebro de los ratones BALB/c inmunizados con las proteínas recombinantes ZC o ZEC y retados con diferentes cepas neuroadaptadas de virus zika. (A) Ensayo de reto viral con cepa aislada de un paciente cubano (cepa ZIK16); (B) Ensayo de reto viral con cepa de referencia MR766; (C) Ensayo de reto viral con cepa de referencia Brazil ZKV2015. Los datos se presentan como la media ± el error estándar de la media ( n=10 ). La línea discontinua representa el límite de detección del ensayo. Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas entre los grupos (p<0,05).

Figura 10. Cinética de la respuesta inmune humoral en primates no humanos inmunizados con las composiciones ZEC+DNAss o ZC+DNAss. (A) Anticuerpos anti- proteína recombinante (ZC o ZEC) medidos por ELISA. (B) Anticuerpos contra el virus zika medidos por ELISA. Las flechas indican los tiempos de administración de cada dosis. La línea horizontal discontinua indica el límite de positividad del ensayo.

Figura 11. Cinética de la respuesta inmune mediada por células determinada mediante ELISpot de IFNy en primates no humanos inmunizados con las composiciones ZEC+DNAss o ZC+DNAss. Los datos se presentan como la media ± el error estándar de la media de las UFP por cada millón de PBMC (n=4). La línea horizontal discontinua indica el límite de positividad del ensayo.

Figura 12. Viremia en primates no humanos inmunizados con las composiciones ZC+DNAss o ZEC+DNAss y retados con virus zika infectivo (cepa ZIK16). Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar (n=4).

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Clonaje y expresión de las proteínas recombinantes ZC y ZEC.

A partir de muestras de orina y suero de personas con síntomas de infección por el virus zika, colectadas entre los días 3 - 7 de la enfermedad, se realizó la infección de células Vero. Después de 6 - 7 días de incubación, los sobrenadantes de cultivos de las células se colectaron y se emplearon para repetir la infección en células Vero. Este procedimiento se repitió hasta la aparición visible de efecto citopático. Luego de 7 - 8 pases sucesivos, se obtuvieron preparaciones con títulos virales estimados de 7x10 ⁶ UFP/mL. Resultados similares se han descrito en los experimentos de aislamiento para el virus zika, a partir de muestras provenientes de individuos infectados (Musso et al., 2015, J Clin Virol, 68:53-55; Bonaldo et al., 2016, PLoS Negl Trop Dis, 10:e0004816-).

A partir de los sobrenadantes de cultivos provenientes de las células Vero infectadas, se extrajo el ARN viral. Este se empleó como molde en la reacción de reverso transcripción para la amplificación de la cadena de ADN que comprende las regiones codificantes para la proteína de la cápsida del virus y la envoltura (E) viral. Como cebadores, se emplearon oligonucleótidos que se unen a regiones conservadas que flaquean ambas proteínas virales, los que se muestran en la Tabla 1 .

Tabla 1. Secuencia de ADN de los oligonucleótidos empleados para el aislamiento de las regiones codificantes para la proteína de la cápsida y la envoltura (E) viral.

Luego se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ambas secuencias de ADN. Seguidamente los dos fragmentos producto del PCR se secuenciaron y las secuencias obtenidas se compararon con las descritas previamente para otros aislamientos del virus zika, demostrándose la identidad de la región obtenida. Al virus zika aislado a partir de la muestra del paciente cubano se le denominó ZIK16 en lo adelante.

Posteriormente, se realizó un segundo PCR empleando estas regiones como molde para la amplificación de las regiones correspondientes a ZC y la región EDIII, con los sitios de restricción específicos para realizar los clonajes posteriores (Tabla 2). Tabla 2. Secuencias de ADN de los oligonucleótidos empleados para la amplificación de las regiones codificantes para la proteína de la ZC y el dominio EDIII, con los sitios de restricción para el clonaje en el vector de expresión.

Ambos fragmentos se clonaron en el vector comercialmente disponible pGEMt, y se transformaron en las células competentes de la cepa JM-109. Las células de Escherichia coli transformadas se crecieron en medio Luria Bertani (LB) suplementado con el antibiótico ampicillina a 50 mrLhί, durante 10 h a 37°C. Seguidamente, se emplearon estas células transformadas de E. coli para la obtención y purificación del ADN plasmídico. Las construcciones intermedias pGEMt-ZC y pGEMt-EDIII se digirieron con las enzimas de restricción BamHI//-//r?dlll o BamHI, respectivamente, para la obtención de los fragmentos de ADN codificantes para las regiones de la cápsida viral y EDIII del virus zika.

Seguidamente, se insertó en el vector de expresión pET-28AC la banda de ADN correspondiente a la cápsida viral, este vector contiene el promotor del Fago T7 y una cola de seis residuos histidina en el extremo N-terminal. Como resultado, se obtuvieron cuatro transformantes de la construcción pET-28AC-ZC (Figura 1A), los cuales se chequearon por secuenciación y se corroboró la identidad de la secuencia codificante para la proteína ZC (SEQ ID NO: 9). Luego, se seleccionó uno de los clones del vector pET-28AC-ZC (clon 2). Este clon se digirió con las enzimas BamHI/CIP para la inserción de la banda de ADN del EDIII, previamente digerida con la enzima BamHI, para obtener el vector de expresión resultante pET-28AC-ZEC. Este vector incluye la región del dominio EDIII fusionado al N-terminal de la proteína de la cápsida viral. Como resultado, se escogieron dos transformantes de la construcción pET-28AC-ZEC (Figura 1 B). Por secuenciación, se corroboró que estos se corresponden con la secuencia codificante para la proteína ZEC, identificada en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 10.

La expresión de las proteínas recombinantes quiméricas ZC y ZEC se realizó en la cepa BL-21(DE3) de E. coli, la cual se transformó con los plásmidos pET-28AC-ZC (clon 2) y pET-28AC-ZEC (clon 23), respectivamente. La expresión de la proteína recombinante se llevó a cabo tras la inducción del promotor del Fago T7, con la adición de 1 mM IPTG. Las biomasas celulares se analizaron por SDS-PAGE, y se obtuvo la sobreexpresión de las bandas correspondientes a cada una de las proteínas recombinantes: ZC (SEQ ID NO: 9) y ZEC (SEQ ID NO: 10), de aproximadamente 12,8 KDa y 28,5 KDa de peso molecular, respectivamente.

Ejemplo 2. Purificación y caracterización antigénica de las proteínas recombinantes ZC y ZEC.

Las biomasas celulares, obtenidas a partir de la transformación de la cepa BL-21(DE3) de E. coli con las construcciones pET-28AC-ZC (clon 2) y pET-28AC-ZEC (clon 23), se resuspendieron en tampón fosfato salino y se lisaron luego de tres pases de ultrasonido. Tras la ruptura, ambas proteínas recombinantes se distribuyeron mayoritariamente en las fracciones insolubles obtenidas por centrifugación. A partir de la fracción insoluble de cada biomasa, las proteínas recombinantes se solubilizaron en solución tamponada de Tris con Urea 7 M como agente caotrópico, y se purificaron a través de un proceso de cromatografía de intercambio iónico, utilizando la matriz SP Sepharose FF. Cada proteína de interés se obtuvo incrementando la fuerza iónica del tampón. Seguidamente, se eliminó la Urea y las proteínas se renaturalizaron, mediante un proceso de filtración en gel en el tampón Tris 10 mM pH 8,0. Luego de los procesos de cromatografía de intercambio iónico y filtración en gel, las proteínas ZC y ZEC se obtuvieron con un 85% y un 70% de pureza, respectivamente (Figuras 2A y 2C).

La caracterización antigénica de ambas proteínas se realizó primeramente mediante Western blotting, empleando dos fuentes de anticuerpos diferentes (Figuras 2B y 2D). Los anticuerpos empleados fueron anticuerpos policlonales de individuos inmunes al virus y el anticuerpo monoclonal que reconoce la cola de seis residuos histidina (AcM anti-His). Se pudo comprobar que la proteína ZEC es reconocida por los anticuerpos policlonales humanos provenientes de personas inmunes a la infección por el virus zika. A su vez, esta proteína se inmunoidentificó con el AcM anti-His, el cual reconoce un epítopo presente en el N-terminal de la proteína ZEC. Igualmente, con este anticuerpo también se inmunoidentificaron bandas de proteína de menor talla, lo cual indica que durante la purificación de la proteína ZEC ocurren degradaciones por la región C- terminal.

En la caracterización por Western blotting de la proteína recombinante ZC, no se observó reconocimiento por los anticuerpos policlonales humanos de personas inmunes a la infección por el virus, debido a que la proteína de la cápsida del virus zika se encuentra envuelta en la partícula viral nativa. Sin embargo, sí se obtuvo reconocimiento con el AcM anti-His, el cual reconoce un epítopo presente en el N- terminal del antígeno recombinante.

Para la verificación de la estructura primaria de las proteínas recombinantes y la evaluación de la correcta formación del puente disulfuro, presente en la región del EDIII en el polipéptido quimérico ZEC, se realizó el análisis de las proteínas recombinantes mediante espectrometría de masas. Las bandas correspondientes a cada proteína purificada se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS y se extrajeron del gel, y luego se les realizó una digestión con la enzima tripsina. La Tabla 3 resume las asignaciones de masas de los espectros obtenidos, luego de la digestión de ambas muestras. Algunas de las señales se detectaron en ambas preparaciones, debido a que tienen en común el C-terminal de la molécula. Tras este análisis se pudo comprobar el 62,7% y 41 ,7% de la secuencia de la proteína ZEC (SEQ ID NO: 10) y de ZC (SEQ ID NO: 9), respectivamente. Además se verificó la correcta formación del puente disulfuro entre los residuos de cisteínas (Cys 7 y Cys ₅₈ ), presente en la región EDIII que se encuentra dentro de la proteína quimérica ZEC. Este puente disulfuro es esencial para la adecuada conformación de la región EDIII, de forma similar a como se presenta en la estructura nativa de la proteína E (Sirohi et al., 2016, Science, 352:467-470; Sirohi & Kuhn, 2017, J Infect Dis, 216:S935-S944). Sorprendentemente, el puente disulfuro entre los residuos de cisteínas Cys ₂ 7 y Cys ₅₈ se conservó, aun cuando esta región se fusionó a la proteína de la cápsida viral, para formar la nueva proteína quimérica ZEC. Tabla 3. Valores de relación masa/carga de los péptidos detectados y asignación de secuencias. a Numeración según la secuencia.

Además, se realizó la caracterización antigénica de ambas proteínas recombinantes mediante un sistema tipo ELISA, empleando sueros humanos. En el ensayo se inmovilizaron las proteínas recombinantes ZC o ZEC en la placa, y posteriormente se evaluó el reconocimiento de las mismas por anticuerpos policlonales humanos. Para este ensayo se emplearon sueros humanos (SH) provenientes de seis personas inmunes a la infección por el virus zika, los cuales fueron colectados durante la fase aguda (SH1 , SH6 y SH8) o la fase convaleciente de la enfermedad (SH2, SH7 y SH9). Como se puede observar en la Figura 3, hubo mayor reconocimiento de la proteína ZEC por los anticuerpos policlonales de los individuos inmunes al virus, en contraste con la baja reactividad detectada para la proteína ZC. Este comportamiento fue similar para todas las muestras de sueros evaluadas, lo cual se debe a la presencia de la región del dominio EDIII incluida en la proteína quimérica ZEC. Esta región se encuentra expuesta en la superficie de la partícula viral (Sirohi et al., 2016, Science, 352:467-470; Sirohi & Kuhn, 2017, J Infect Dis, 216:S935-S944). Por ello, los anticuerpos generados durante la infección natural reconocen la proteína ZEC. Por el contrario, la proteína de la cápsida viral se encuentra envuelta en el virión maduro y no se generan anticuerpos hacia esta región durante la infección con el virus zika (Mukhopadhyay et al., 2005, Nat Rev Microbiol, 3:13-22). Eso explica que la proteína quimérica ZC, que solo contiene la región de la cápsida, prácticamente no se reconoce por los sueros de individuos que se infectaron con el virus zika.

Por otro lado, las proteínas recombinantes ZC y ZEC se evaluaron, en cuanto a su capacidad de estimular la respuesta de células T de memoria específicas al virus zika, mediante un ensayo ELISpot de IFNy. Esta citocina está descrita como un mediador de la respuesta inmune celular a través de su actividad antiviral contra varios flavivirus (Shresta et al., 2004, J Virol, 78:2701-2710). Para este experimento se emplearon las PBMC de voluntarios inmunes al virus, las cuales se estimularon in vitro con 10 pg/mL de las proteínas recombinantes ZC o ZEC, o con una preparación de virus zika (MOI de 1 y 5). Luego, se cuantificó el número de células T de memoria, inducidas tras la estimulación, capaces de secretar la citocina antiviral IFNy.

Los resultados de esa evaluación se muestran en la Figura 4, como la media ± la desviación estándar de las unidades formadores de puntos (UFP) por cada millón de células, de dos experimentos independientes. En este ensayo, se detectaron células secretoras de IFNy específicas al virus zika en muestras de tres de los cuatro voluntarios, tras la estimulación in vitro con las proteínas recombinantes ZC y ZEC. Igualmente, tras la estimulación con el antígeno viral se detectaron células secretoras de IFNy específicas al virus zika en muestras de tres de los cuatro voluntarios analizados. Estos resultados, en su conjunto, demuestran que las proteínas quiméricas recombinantes ZC y ZEC incluyen epítopos para células T de memoria específica al virus zika. A su vez, estos antígenos proteicos son capaces de estimular la respuesta inmune celular previamente generada por la infección viral. Ejemplo 3. Evaluación de la inmunogenicidad y capacidad protectora de las proteínas recombinantes ZC y ZEC en ratones BALB/c.

La evaluación de la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes ZC y ZEC se realizó en ratones BALB/c hembras, para lo cual se utilizaron cuatro grupos, de 10 animales cada uno. Los grupos incluidos en el estudio se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Diseño del esquema de inmunización para la evaluación de la inmunogenicidad y capacidad protectora de las proteínas recombinantes ZC y ZEC en ratones BALB/c.

Para la inmunización de los animales se emplearon las proteínas recombinantes de interés, ZC o ZEC teniendo en cuenta su peso molecular, por lo cual el grupo inoculado con la proteína recombinante ZC recibió 10 mr y el grupo inoculado con la proteína ZEC recibió 20 mr de proteína recombinante. Ambas proteínas se formularon en hidróxido de aluminio (alúmina) como adyuvante base, a una concentración de 1,44 mg/mL. Todos los grupos se inmunizaron por vía intraperitoneal, con tres dosis del inmunógeno en los días 0, 15 y 45 del esquema de inmunización.

Quince días después de la última administración, se sangraron los animales de cada grupo y se emplearon los sueros para la evaluación de la respuesta inmune humoral. En la Figura 5, se muestran los resultados de las determinaciones de anticuerpos contra el virus zika, medidos por ELISA, y de anticuerpos neutralizantes evaluados por el ensayo de neutralización viral in vitro. Para el ELISA, se recubrieron las placas con el virus zika (cepa ZIK16), seguidamente se incubaron las muestras de sueros a diferentes diluciones, y luego se añadió una dilución apropiada de conjugado anti-lgG de ratón comercialmente disponible. Como se observa en la Figura 5A, se detectaron altos títulos de anticuerpos contra el virus zika en los grupos inmunizados con la formulación de la proteína recombinante ZEC y en el grupo control viral. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre ellos (p>0,05). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de comparación múltiple de Tukey. En los grupos que recibieron el Placebo y la proteína recombinante ZC, no se detectaron anticuerpos contra el virus, los niveles detectados fueron inferiores al límite de positividad para el ensayo.

La funcionalidad de los anticuerpos inducidos, luego de la inmunización, se midió a través del ensayo de neutralización viral in vitro por reducción del número de placas (PRNT), 30 días después de la última dosis. Para el ensayo de PRNT se prepararon diluciones de sueros de los animales y se mezclaron con una preparación de virus zika (cepa ZIK16). Luego de un tiempo de incubación, las mezclas se aplicaron sobre placas de 24 pozos con células Vero, así las partículas virales no neutralizadas por los anticuerpos fueron capaces de infectar las células y ocasionar la aparición de placas visibles. En la Figura 5B se representa la media ± desviación estándar de los títulos de anticuerpos neutralizantes contra el virus zika, determinados en los sueros de los animales inmunizados. El título neutralizante se definió como la máxima dilución en la que se alcanza el 50% de reducción del número de placas. De forma similar a la respuesta de anticuerpos anti-virus zika detectada, en los grupos inmunizados con la formulación de la proteína ZEC y en el grupo control viral se detectaron anticuerpos neutralizantes, con Títulos Promedios Geométricos (TPG) mayores de 1 :200, sin diferencias estadísticas entre ellos (p>0,05).

Además, en el estudio se evaluó la inducción de una respuesta inmune celular, medida 30 días tras la última inmunización en los animales inmunizados con las diferentes formulaciones. Para ello, se extrajeron las células del bazo de los 10 animales de cada grupo, y se determinó la frecuencia de células secretoras de IFNy, luego de la estimulación in vitro de los esplenocitos con el virus zika. En la Figura 6 se representa el número de células secretoras de la citoquina antiviral en cada grupo. En los grupos inmunizados con las formulaciones de las proteínas recombinantes ZC y ZEC se detectaron células secretoras de IFNy, luego de la estimulación in vitro de los esplenocitos con el virus zika (cepa ZIK16), resultando el 100% de los animales respondedores en estos grupos. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre los valores de células secretoras de IFNy detectadas en los animales que recibieron las proteínas recombinantes ZC o ZEC; y el número de células secretoras de IFNy detectadas en los animales del grupo Placebo (p<0,05). En los animales del grupo control viral, el número de células secretoras de la citoquina antiviral fue superior comparado a los niveles de células secretoras de IFNy detectados en los animales inmunizados con las proteínas recombinantes (p<0,05). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba ANOVA y una comparación múltiple de Tukey.

Ejemplo 4. Agregación o formación de las partículas semejantes a nucleocápsidas a partir de las proteínas recombinantes ZC y ZEC.

La proteína de la cápsida viral de los flavivirus es la que forma la nucleocápsida, la cual envuelve y protege al genoma durante el proceso de ensamblaje de la partícula viral (Duffy et al., 2009, N Engl J Med, 360:2536-2543). Teniendo en cuenta estas características estructurales, se emplearon las proteínas recombinantes ZC y ZEC, para realizar un proceso in vitro de agregación, o de formación de partículas semejantes a nucleocápsidas (PSN), mediante la incubación de cada proteína recombinante con ADN de simple cadena con propiedades inmunomoduladoras (aquí denominado DNAss, e identificado como SEQ ID NO: 11).

En las reacciones de agregación se emplearon diferentes combinaciones de proteína y de DNAss, teniendo en cuenta la masa de cada molécula. Posteriormente, las mezclas de reacción se incubaron durante 30 minutos a 25°C, seguido de 4 horas a 4°C, luego las mezclas de reacción se centrifugaron a 10 000 x g, y los sobrenadantes se analizaron por SDS-PAGE. Como resultado, se observó que las proteínas recombinantes solubles ZC o ZEC podían formar agregados de alto peso molecular insolubles en varias de las combinaciones ensayadas, dependiendo de la concentración de DNAss utilizado en la reacción de agregación. Para los posteriores estudios, se escogió la combinación proteína:DNAss que favorece la agregación de aproximadamente el 50% de la proteína recombinante de interés. Las cantidades de DNAss requeridas para lograr la agregación del 50% fueron diferentes para cada proteína recombinante, de acuerdo a su masa y composición de aminoácidos. Ejemplo 5. Evaluación de la inmunogenicidad de las composiciones de las proteínas recombinantes ZC y ZEC agregadas.

Para la evaluación de la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes ZC y ZEC agregadas se utilizaron seis grupos de ratones BALB/c hembras, con 30 animales cada uno. Los grupos incluidos en el estudio se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Diseño del esquema de inmunización para la evaluación de la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes ZC y ZEC agregadas. Para la inmunización de los animales se emplearon las proteínas quiméricas recombinantes de interés, ZC o ZEC, tanto solubles como agregadas tras la incubación con DNAss. Igualmente, se tuvo en cuenta el peso molecular de cada molécula, por lo cual los grupos inoculados con la proteína recombinante ZC recibieron 10 mr de proteína y los grupos inoculados con la proteína ZEC recibieron 20 mr de proteína recombinante. Todas las formulaciones se prepararon con alúmina como adyuvante, a una concentración de 1,44 mg/mL. Los grupos se inmunizaron por vía intraperitoneal, con tres dosis del inmunógeno en los días 0, 15 y 45 del esquema de inmunización. Quince días después de la última administración, se sangraron 10 animales de cada grupo, y se empleó el suero para la determinación de los anticuerpos contra el virus zika, medidos por ELISA. Como se observa en la Figura 7, se detectaron altos títulos de anticuerpos contra el virus en los grupos que recibieron las formulaciones que contenían la proteína quimérica ZEC, con títulos similares a los detectados en los animales del grupo control viral (p>0,05). Esto indica que la agregación de la proteína quimérica ZEC, debido a la presencia de DNAss, no afectó la generación de anticuerpos contra dicho virus. A su vez, en los animales inmunizados con la formulaciones ZC y ZC+DNAss no se detectaron títulos de anticuerpos contra el virus zika (Figura 7A). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de Kruskal- Wallis y la comparación múltiple a posterior i mediante la prueba de Dunn.

La funcionalidad de los anticuerpos generados por la inmunización se analizó a través del ensayo de neutralización viral in vitro , a los 30 días de la última dosis. En la Figura 7B se representan la media ± desviación estándar de los títulos de anticuerpos neutralizantes contra el virus zika. El título neutralizante se define como la máxima dilución en que se alcanza el 50% de reducción del número de placas. Como se puede apreciar, en los animales de los grupos ZEC y ZEC+DNAss se detectaron anticuerpos neutralizantes, con TPG mayores de 1 :200, los cuales no tuvieron diferencia con los títulos obtenidos en el grupo que recibió la preparación de virus zika (p>0,05). Adicionalmente, en el esquema de inmunización referido, se evaluó la capacidad de las formulaciones de las proteínas ZC y ZEC de inducir en los animales una respuesta inmune mediada por células. Para ello, a los 30 días de la última inmunización, se extrajeron las células del bazo a 10 animales de cada grupo y se determinó la frecuencia de células secretoras de IFNy, luego de la estimulación in vitro de los esplenocitos con el virus zika. En la Figura 8 se representa el número de células secretoras de la citocina antiviral en cada grupo. Como se observa, en los grupos inmunizados con las formulaciones de las proteínas recombinantes ZC y ZEC, el 100% de los animales tuvieron células secretoras de IFNy, con diferencias significativas con respecto al grupo Placebo (p<0,01). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba ANOVA y una comparación múltiple de Tukey. Se observaron diferencias en el número de células secretoras entre los grupos que recibieron las formulaciones de las proteínas solubles y las formulaciones agregadas que incluyen el DNAss (p<0,01). A su vez, los niveles de células secretoras de IFNy en los animales de los grupos inmunizados con las formulaciones con la proteína agregada fueron similares a los detectados en el grupo que se inoculó con el virus zika (p>0,05). Ejemplo 6. Evaluación de la capacidad protectora de las formulaciones de proteínas recombinantes ZC y ZEC agregadas en ratones BALB/c.

Como parte del estudio de inmunogenicidad en ratones BALB/c de las proteínas recombinantes ZC y ZEC agregadas, luego de la evaluación de la respuesta inmune humoral y celular presentada anteriormente, se evaluó la capacidad protectora al reto viral en este modelo. La protección se midió como la capacidad de controlar o reducir la carga viral en cerebro en los animales inmunizados, luego del reto viral con cepas neuroadaptadas.

Para el ensayo de reto, un mes tras la última inmunización, 10 animales de cada grupo se inocularon, por vía intracraneal, con 50 dosis letal media (DL ₅₀ ) de virus zika neuroadaptado, de tres cepas diferentes (cepa ZIK16, cepa MR766 y cepa Brazil ZKV2015). A los 7 días del reto viral, a los animales se les extrajo el cerebro en condiciones asépticas. Los cerebros extraídos se maceraron, y los sobrenadantes provenientes de estas muestras se emplearon para la cuantificación de la carga viral, mediante la infección en células Vero.

Para los tres ensayos, empleando diferentes cepas virales de zika, en los animales inmunizados con el Placebo se observó una alta carga viral en las muestras de sobrenadantes provenientes de los cerebros de los animales, superior a 10 ⁴ UFP/ml Estos resultados se muestran en la Figure 9. Por el contrario, en los animales de los grupos inoculados con las diferentes preparaciones que incluyen las proteínas recombinantes ZC, ZC+DNAss y ZEC se observó una reducción de la carga viral si se compara con el grupo Placebo, la cual alcanzó para algunos grupos la significación estadística, en dependencia de la cepa viral empleada (Figura 9A - 9C). Sin embargo, los animales que recibieron la formulación de la proteína recombinante ZEC+DNAss o el virus zika, lograron una reducción significativa de la carga viral, con respecto a los animales del grupo Placebo, en los tres ensayos de reto (p<0,001) (Figura 9A - 9C). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba ANOVA y una comparación múltiple de Tukey. Ejemplo 7. Evaluación de la inmunogenicidad y capacidad protectora de las proteínas quiméricas ZC y ZEC en primates no humanos.

Basado en los resultados de los estudios preclínicos en ratones BALB/c, las proteínas recombinantes ZC y ZEC, combinadas con DNAss y adyuvadas en alúmina, se evaluaron en primates no humanos negativos al virus zika. Adicionalmente, se incluyó un grupo que recibió una formulación Placebo, que incluyó igual cantidad de DNAss que el empleado en el proceso de agregación de las proteínas recombinantes, igualmente en alúmina como adyuvante. En todos los grupos del esquema se incluyeron cuatro animales. Los primates no humanos se inmunizaron con tres dosis de 50 pg o 100 pg de las formulaciones agregadas ZC+DNAss o ZEC+ DNAss, respectivamente. Las formulaciones se administraron por vía subcutánea, espaciadas cada dos meses (día 0, 60 y 120 del esquema). A los animales se les realizaron extracciones de sangre en el momento de cada administración (día 0, 60 y 120), y 30 días después de cada dosis (día 30, 90 y 150 del esquema), para evaluar la respuesta inmune humoral inducida.

En la Figura 10A se muestra la cinética de la respuesta de anticuerpos anti-proteína recombinante ZC o ZEC, determinada por ELISA. Como se observa, los títulos de anticuerpos anti-proteína recombinante, en los primates no humanos inmunizados con la formulaciones agregadas ZC+DNAss y ZEC+DNAss, se comienzan a detectar 30 días después de la primera dosis, y los mismos se incrementan con las posteriores inoculaciones. En los animales del grupo Placebo no se detectaron anticuerpos anti- proteína recombinante, en ninguno de los tiempos evaluados.

La respuesta de anticuerpos contra el virus zika se determinó por ELISA y en la Figura 10B se representa la cinética de los títulos detectados. La respuesta de anticuerpos antivirales en los primates no humanos, inmunizados con la formulación de proteína ZEC+DNAss, se detectó luego de 30 días de administrada la segunda dosis, y la misma se incrementó con la tercera inoculación. Por el contrario, en los primates que se inmunizaron con la formulación de la proteína ZC+DNAss no se detectaron anticuerpos antivirales, en ninguno de los tiempos evaluados, lo cual está en correspondencia con los resultados obtenidos en la evaluación de esta proteína en ratones. Este resultado se debe, principalmente, a que la proteína de la cápsida del virus zika se encuentra envuelta en la partícula viral nativa. Igualmente, en el grupo Placebo tampoco se detectaron títulos de anticuerpos antivirales en ninguno de los tiempos evaluados.

Por otra parte, la funcionalidad de los anticuerpos inducidos por la inmunización se determinó a través del ensayo de neutralización viral in vitro en células Vero y el virus zika (ZIK16). En la Tabla 6 se muestran los resultados de estas determinaciones. En concordancia con los títulos de anticuerpos contra el virus zika, solo se detectaron anticuerpos neutralizantes en el grupo inmunizado con la formulación agregada ZEC+DNAss, 30 días tras la segunda dosis, los cuales se reforzaron luego de la tercera administración. Se detectaron anticuerpos neutralizantes en la totalidad de los animales que recibieron la formulación ZEC+DNAss (100% de seroconversión), los cuales se mantuvieron seropositivos hasta el día 180 (momento del reto viral). Como se esperaba, en los primates no humanos del grupo inmunizado con la formulación ZC+DNAss no se detectaron anticuerpos neutralizantes en ninguno de los tiempos evaluados antes del reto viral. Esto es congruente con la ausencia de respuesta de anticuerpos contra el virus observada en este grupo.

Tabla 6. Títulos promedios geométricos de los anticuerpos neutralizantes contra el virus zika en primates no humanos inmunizados con formulaciones de los antígenos quiméricos recombinantes.

Otro de los parámetros medidos en este estudio fue la respuesta inmune celular, para lo cual las PBMC se obtuvieron de los primates no humanos inmunizados, en tres momentos del estudio: día de la tercera dosis (día 120), un mes tras la tercera dosis (día 150), y el día del reto viral (día 180). Luego, las PBMC se cultivaron in vitro y se estimularon con el antígeno viral (cepa ZIK16), a continuación se determinó el número de células secretoras de IFNy, mediante un ensayo tipo ELISpot. En la Figura 11 se muestran los valores obtenidos en cada tiempo ensayado. Como resultado, se detectaron células secretoras de IFNy en todos los primates no humanos de los grupos inmunizados con la formulación de las proteínas recombinantes ZC y ZEC, a diferencia de los animales que recibieron la formulación Placebo, donde no se detectaron células secretoras de la citoquina antiviral.

Para evaluar la capacidad de protección contra el virus zika en los animales inmunizados, todos los animales del estudio se retaron con virus infectivo (cepa ZIK16, 10 ³ UPF/mL), luego de dos meses de la última inmunización (día 180). La presencia del virus zika en sangre se determinó por cuantificación directa en células Vero, empleando el suero de los animales. En la Figura 12 se muestran los resultados obtenidos, representados como la media ± SEM. Como se puede observar, los animales que recibieron la formulación Placebo desarrollaron viremia, con una media de 9 días, y las cargas virales medias fueron de 400 UFP/ml. En el caso del grupo inmunizado con la formulación combinada ZC+DNAss, uno de los primates resultó totalmente protegido y los tres restantes desarrollaron viremia, con una media de 6 días y una carga viral más baja si se compara al grupo Placebo (con significación estadística). Por el contrario, los animales inmunizados con la formulación ZEC+DNAss no desarrollaron viremia y resultaron completamente protegidos (carga viral <10 UFP). En general, los antígenos quiméricos ZC y ZEC, agregados luego de la combinación con DNAss y adyuvados en alúmina, indujeron una respuesta inmune capaz de controlar la replicación del virus zika en primates no humanos.