L'invention a pour objet un gène codant pour un polypeptide présentant une activité endofucanase c'est-à-dire pour un polypeptide et plus précisément une enzyme capable de dégrader les fucanes ou fucoidanes qui sont des polysaccharides constitués par des unités fucose sulfatées.

L'invention a également pour objet un procédé de production du susdit polypeptide par mise en œuvre des techniques de génie génétique en utilisant le susdit gène.

La demande de brevet PCT WO 00/17215 décrit des fractions oligosaccharidiques, obtenues à partir des fucoidanes et présentant un intérêt considérable, en particulier dans leurs applications au domaine de la protection des plantes, dont notamment le tabac, les céréales dont le blé et le persil.

Ces fractions sont obtenues par hydrolyse des fucoidanes à l'aide d'une enzyme caractérisée par certaines séquences polypeptidiques. Cette enzyme est extraite d'une bactérie dénommée SW5 et déposée sous le n°12171 dans la collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

La préparation d'une enzyme par extraction à partir de cellules bactériennes a un rendement faible qui ne permet pas sa production à l'échelle industrielle.

Or la préparation des fractions oligossacharidiques dont il est question ci-dessus requiert des quantités importantes d'enzyme.

L'invention a donc pour but, surtout de fournir un procédé permettant de préparer industriellement l'enzyme en question par des techniques de génie génétique. Et il est du mérite de la Société Demanderesse d'avoir rendu possible le recours à ces techniques grâce aux travaux qui lui ont permis d'isoler, identifier et définir le gène responsable de l'activité endofucanase dans le génome de la bactérie SW5.

Le gène isolé en question conforme à l'invention, est caractérisé par le fait qu'il est constitué par la séquence nucléotidique SEQ ID NO :1 et par des polynucléotides constitués par des séquences nucléotidiques analogues.

La séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 est représenté à la figure 1.

On rappelle qu'une séquence nucléotidique sera analogue à la séquence nucléotidique du gène SEQ ID NO : 1 dans la mesure où, bien que présentant un ou plusieurs nucléotides différents par rapport SEQ ID NO : 1, les polypeptides codés par les deux séquences nucléotidiques présentent une activité endofucanase identique.

Le gène conforme à l'invention code pour l'enzyme ou polypeptide recherché qui est caractérisé par une séquence en acides aminés analogue à la séquence SEQ ID NO :2 ; ce polypeptide ou enzyme présente une activité enzymatique de dégradation des fucoidanes.

La séquence peptidique SEQ ID NO : 2 est représentée à la figure 2.

On rappelle que deux séquences peptidiques sont analogues dans la mesure où, bien que se différenciant par un ou plusieurs acides aminés, les polypeptides présentent une activité endofucanase identique.

L'invention a également pour objet le susdit gène ou polynucléotide sous une forme modifiée, notamment par mutagenèse dirigée.

Plus particulièrement, l'invention vise tout polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés analogue à l'une des séquences : SEQ ID NO :3 correspondant aux acides aminés 29 à 1007 de SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4 correspondant aux acides aminés 29 à 794 de SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :5 correspondant aux acides aminés 29 à 736 de SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :6 correspondant aux acides aminés 29 à 526 de SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :7 correspondant aux acides aminés 29 à 418 de SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :8 correspondant aux acides aminés 29 à 399 de SEQ ID NO :2,

Chacun de ces polypeptides présente une activité enzymatique de dégradation des fucoidanes.

En précisant que le gène conforme à l'invention est «isolé », on indique qu'il est placé dans un environnement différent de celui dans lequel il se trouve naturellement. On rappelle que ce qualificatif d' «isolé » est également utilisé en rapport avec les polypeptides ou enzymes et les cellules hôtes.

On rappelle également que les termes « polynucléotide » et « acide nucléique » peuvent être utilisés de façon interchangeable. Ils désignent des polymères de nucléotides de toute longueur, soit qu'il s'agisse de ribonucléotides ou de déoxynucléotides.

Ces termes incluent mais ne sont pas limités à des ADN, ARN, ADN génomique simple brin ou double brin, ni à des hybrides ADN-ARN.

Les acides nucléiques peuvent être modifiés chimiquement ou biochimiquement, par exemple par marquage avec un isotope radioactif ou un groupement fluorescent.

Ils peuvent également être modifiés par la substitution d'un ou plusieurs nucléotides par un analogue ou par des moyens permettant de greffer un acide nucléique sur une protéine, sur des composés marqués, sur d'autres acides nucléiques ou sur un substrat solide. On indique ci-après la définition de quelques termes et expressions utilisées dans le texte de la présente demande de brevet.

Ainsi, un « polynucléotide recombinant » est une molécule d'acide nucléique, simple ou double brin qui a été modifiée par une intervention humaine de manière à contenir des segments d'acides nucléiques combinés ou juxtaposés selon un arrangement n'existant pas à l'état naturel.

Par le terme « génome » on désigne l'ensemble du matériel génétique d'une cellule.

Par l'expression « banque génomique », on désigne l'ensemble des clones moléculaires comprenant des fragments d'ADN génomiques ou inserts.

Par le terme « clones », on désigne au moins deux entités (molécules, cellules,...) ayant une information génétique identique.

Les termes « polypeptide, enzyme » et « protéine » peuvent être utilisés de façon interchangeable et désignent des molécules caractérisées par des séquences en acides aminés de toute longueur, éventuellement modifiées par voie chimique ou biochimique.

Ces termes incluent les « protéines de fusion », expression par laquelle on désigne une protéine hybride codée par un polynucléotide comprenant les séquences nucléotidiques d'au moins deux gènes ou fragments des deux gènes différents l'un de l'autre ; l'une des séquences peut coder pour un tag.

Par le terme « tag » on désigne toute séquence polypeptidique capable de se fixer à des matrices d'affinité et/ou d'être reconnue par des anticorps permettant de détecter et/ou de purifier le polypeptide auquel elle est fusionnée. Ceci étant le procédé conforme à l'invention grâce auquel il a été possible d'isoler, d'identifier et de définir le gène conforme à l'invention, est caractérisé par le fait que successivement -on prépare, par des techniques classiques de biologie moléculaire, une sonde permettant de cribler une banque génomique, - on construit, par des techniques classiques de clonage, une banque génomique à partir du génome de la bactérie SW5, - on crible la banque génomique par hybridation de la sonde en vue d'isoler le gène recherché, - on séquence le gène ainsi isolé par les techniques classiques de séquençage, et - on met en évidence l'activité endofucanase de l'enzyme codée par ledit gène.

On prépare d'abord la sonde.

On rappelle qu'une « sonde» correspond à un fragment d'acide nucléique marqué par l'incorporation d'atomes radioactifs ou de groupements fluorescents et dont la séquence est sensiblement complémentaire à la séquence d'un gène recherché ; ce dernier sera décelé par hybridation avec la sonde, cette hybridation se produisant lorsque les deux séquences complémentaires s'apparient.

Par « séquence complémentaire », on désigne une séquence nucléotidique constituée d'une succession de bases complémentaires à celles d'une autre séquence avec laquelle elle est donc capable de s'hybrider.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique de la sonde préparée pour le criblage de la banque génomique SW5 est complémentaire d'un segment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO :1.

Cette sonde est préparée en procédant de la façon indiquée ci-après. Des cellules bactériennes de la souche SW5 sont mises en culture dans des conditions de culture standard.

Les inventeurs ont montré que lorsque les milieux de culture sont supplémentés par des fucoidanes, l'activité de dégradation des fucoidanes est plus importante.

L'enzyme endofucanase produite par les cellules de la souche SW5 mises en culture est extraite du milieu de culture et purifiée au moyen de techniques de précipitation et de chromatographie classiques. L'enzyme ainsi purifiée est ensuite soumise à une hydrolyse partielle. Les fragments peptidiques résultant de cette hydrolyse sont séparés et purifiés par chromatographie d'absorption telle que la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) ; ces fragments peptidiques sont ensuite micro-séquencés par exemple selon la méthode d'Edman qui permet l'identification des acides aminés N-terminaux ; les fragments sont ensuite analysés.

La connaissance de ces séquences peptidiques partielles de l'endofucanase permet, par le jeu du code génétique, de déduire les séquences nucléotidiques correspondantes.

Le code génétique équivaut à la correspondance entre les séquences nucléotidiques et les séquences peptidiques. Ainsi, chaque triplet de nucléotides de la séquence nucléotidique ou codon correspond à un acide aminé unique.

On parle de dégénérescence du code génétique dans la mesure où plusieurs codons synonymes peuvent spécifier un même acide aminé. En conséquence, par le jeu du code génétique, plusieurs séquences nucléotidiques peuvent être déduites pour une séquence peptidique unique.

A partir de ces informations, on conçoit et synthétise deux amorces oligonucléotidiquees dégénérées: elles servent d'amorces dans le cadre d'une réaction d'amplification à l'issue de laquelle on obtient une sonde ayant une grande spécificité pour le gène recherché. On construit, par ailleurs, la banque d'ADN génomique en ayant recours aux techniques classiques de clonage.

Pour ce faire, le génome de la bactérie SW5 est découpé d'une façon la plus aléatoire possible, par une action mécanique ou à l'aide d'une nucléase de restriction.

L'utilisation de nucléases conduisant à des extrémités cohésives est un moyen préféré dans la mesure où elle simplifie l'étape ultérieure de clonage. Les fragments d'ADN ainsi obtenus et dont la taille est telle qu'ils soient admissibles par un vecteur, sont insérés dans ce vecteur ; on obtient ainsi des vecteurs recombinants.

L'ensemble du génome étudié, ici celui de la bactérie SW5, est représenté au sein de la banque génomique ainsi construite.

On rappelle que le terme « vecteur » désigne une molécule d'acide nucléique extrachromosomique, notamment un plasmide, un cosmide ou un phage ayant une réplication autonome et pouvant être incorporé dans une « cellule hôte », à savoir un microorganisme, une cellule eucaryote animale ou végétale ou une cellule d'une lignée cellulaire en tant qu'entité unicellulaire qui peut être utilisée comme récipient pour un vecteur recombinant.

La cellule hôte devient recombinante lorsqu'elle contient un vecteur de clonage ou d'expression ou un acide nucléique qui lui est étranger. Dans le contexte de l'invention, un exemple de cellule hôte recombinante est une cellule qui produit un polypeptide présentant une activité endofucanase à partir d'un vecteur d'expression comprenant le polynucléotide codant pour ledit polypeptide.

Typiquement un vecteur de clonage est conçu pour permettre le transport d'un fragment d'ADN clone et contient un ou plusieurs sites de reconnaissance pour des enzymes de restriction qui permettent l'insertion ou clonage d'un fragment d'acide nucléique ainsi qu'une ou des séquences nucléotidiques codantes pour des gènes permettant l'identification et la sélection de cellules hôtes transformées par ledit vecteur.

Dans le cas où les cellules hôtes sont des cellules bactériennes E. CoIi, les susdits gènes correspondent à des gènes de résistance à des antibiotiques notamment l'ampicilline et la kanamycine.

Un vecteur d'expression est conçu pour permettre l'expression d'une séquence nucléotidique codante insérée en aval d'un promoteur. La séquence insérée ou insert est alors transcrite, puis traduite en polypeptide.

Certains vecteurs d'expression ont une séquence codante pour un tag en amont ou en aval du site d'insertion ou de clonage ; la séquence insérée est alors transcrite puis traduite sous la forme d'une protéine de fusion.

Par « promoteur », on désigne une région de régulation située en amont de la région codante d'un gène, à proximité de son extrémité 5'.

Un promoteur comporte certaines séquences nucléotidiques caractéristiques permettant la fixation du complexe d'initiation de la transcription ainsi que la fixation de protéines régulatrices de la transcription.

Lorsque le promoteur est inductible, le taux de transcription augmente en réponse à un agent inducteur.

Les vecteurs recombinants sont transférés et amplifiés au moyen de cellules hôtes bactériennes, dont notamment E. CoIi. Après un temps suffisant de culture, des clones cellulaires contenant chacun un vecteur recombinant sont séparés, étant entendu que les clones différent entre eux par la nature de l'insert du vecteur.

On a donc obtenu la banque génomique.

On procède ensuite au criblage de la banque génomique ; un tel criblage sert à trier et à identifier les clones positifs.

Par « clones positifs », on désigne les clones qui comprennent un insert correspondant à une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence de la sonde.

Le criblage représente l'une des parties les plus délicates des techniques de clonage et il en existe de nombreuses variantes.

Avantageusement, on procède comme suit.

On détecte la séquence nucléotidique recherchée, généralement par hybridation moléculaire.

Avantageusement, l'hybridation est effectuée in situ lorsque la banque génomique est propagée dans des cellules bactériennes.

Ainsi, les clones bactériens cultivés en boite de Pétri sont répliqués sur des disques de nitrocellulose.

Après un temps de culture suffisant, les clones bactériens des répliques sont traitées par la soude qui non seulement lyse les cellules bactériennes mais également dénature l'acide nucléique en molécule simple brin. Ainsi, dans la collection de clones, seuls ceux qui possèdent un insert dont la séquence est complémentaire à celle de la sonde sont marqués par hybridation avec celle-ci et sont sélectionnés.

Chaque clone positif sélectionné comporte un insert codant pour tout ou partie du polypeptide recherchée ; la séquence nucléotidique de cet insert est déterminée par une méthode classique de séquençage.

Le criblage est donc terminé.

L'étape suivante comprend le séquençage du gène.

Pour reconstituer la séquence nucléotidique de ce gène, les séquences nucléotidiques de chaque insert sont déterminées par séquençage, puis sont ordonnées les unes par rapport aux autres au sein d'un contig par la mise en évidence de recouvrements des extrémités chevauchantes.

Par « contig », on désigne deux ou plusieurs séquences nucléotidiques présentant des extrémités chevauchantes ordonnancées pour reconstituer le gène recherché ; le but est d'obtenir par recouvrements successifs un contig aboutissant à la séquence nucléotidique consensus codant pour l'enzyme endofucanase.

On rappelle que par « extrémités chevauchantes », on désigne des régions terminales présentant un enchaînement de nucléotides identiques.

Par « séquence nucléotidique consensus », on désigne une séquence idéalisée dans laquelle chaque position représente le nucléotide le plus souvent trouvé quand plusieurs séquences sont comparées : elle est alors établie après alignement des séquences nucléotidiques des inserts. La connaissance de la séquence nucléotidique consensus du gène permet de le préparer par une méthode d'amplification.

A partir de la susdite séquence nucléotidique consensus, il est possible de concevoir et de synthétiser des amorces pour obtenir et amplifier le gène codant pour l'endofucanase ou l'un de ses fragments.

Le procédé de préparation du gène codant pour l'endofucanase ou d'un de ses fragments comprend deux étapes, à savoir - la sélection d'une paire d'amorces oligonucléotidiques, chacune étant complémentaire de l'une des extrémités du gène ou du fragment choisi et - l'amplification du gène ou du fragment choisi, à l'aide des amorces oligonucléotidiques et d'une enzyme polymérase.

L'amplification peut être réalisée soit à partir du génome d'une bactérie étudiée, dont notamment SW5, soit à partir du gène codant pour l'endofucanase ou de l'un de ses fragments. i L'activité endofucanase est vérifiée pour chaque polypeptide conforme à l'invention au moyen d'un test mettant en évidence, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide- carbohydrate (C-PAGE), la libération d'oligosaccharides anioniques résultant de la dégradation des fucoidanes.

Avantageusement, la méthode utilisée est celle développée par Zablackis E. et Perez J. [A partially pyruvated carrageenan from Hawaiian Grateloupia filicina (Cryptonemiales, Rhodophyta) 1990 Bot. Mar. 33, 273-276].

Le gène isolé ou polynucléotide conforme à l'invention est caractérisé par le fait qu'il code également pour un polypeptide modifié comprenant un ou plusieurs acides aminés modifiés, ledit polypeptide modifié présentant une activité enzymatique de dégradation des fucoidanes optimisée. Typiquement, pour modifier la séquence en acides aminés d'un polypeptide, on agit sur la molécule d'acide nucléique qui code pour ce polypeptide en ayant recours aux techniques connues de l'homme du métier.

II est possible pour modifier l'acide nucléique constitutif du gène ou de l'un des polynucléotides conformes à l'invention, de le soumettre à un traitement par un agent mutagène, c'est-à-dire d'un agent physique ou chimique capable de provoquer des mutations qui altèrent la signification des codons, ce qui par le jeu du code génétique modifie la séquence en acides aminés.

Avantageusement, on a recours à une technique de mutagenèse dirigée pour modifier la séquence nucléotidique du gène ainsi que celles des polynucléotides conformes à l'invention; il s'agit alors d'introduire spécifiquement une ou plusieurs mutations dans le polynucléotide étudié, ce qui par le jeu du code génétique entraîne la substitution d'un ou plusieurs acides aminés par un ou plusieurs autres acides aminés dans le polypeptide codé par le polynucléotide muté.

L'intérêt de réaliser ces mutations est non seulement de permettre une étude approfondie du mécanisme catalytique du polypeptide sur la dégradation des fucoidanes mais également d'optimiser ladite activité catalytique du polypeptide sous forme recombinante en vue de son application industrielle.

L'activité endofucanase est vérifiée selon la méthode de Zablackis E. et Parez J. telle que mentionnée ci-dessus.

Une fois que conformément à l'invention le gène a été isolé et identifié, il devient possible de produire l'enzyme endofucanase à l'échelle industrielle sous forme d'un polypeptide recombinant codé par le gène codant pour l' endofucanase ou l'un des polynucléotides conformes à l'invention. II est également possible de produire le polypeptide recombinant sous la forme d'une protéine de fusion correspondant à l'un des polypeptides conformes à l'invention fusionné à un tag, dont notamment une séquence de résidus histidine ou la gluthation- S-transférase ; un tel tag est capable de se fixer à des matrices d'affinité et, ainsi, de faciliter la détection et la purification du polypeptide recombinant.

Pour produire le polypeptide recombinant, à l'échelle industrielle, qu'il soit codé par le gène ou par l'un des polynucléotides conformes à l'invention, successivement - on sélectionne une cellule hôte choisie dans le groupe comprenant les microorganismes de type bactérie et levure, des cellules eucaryotes animales ou végétales et des cellules de lignées cellulaires, - on introduit dans ladite cellule hôte, par les techniques classiques de génie génétique, le gène ou l'un des polynucléotides conformes à l'invention, - on exprime le gène ou l'un des polynucléotides, et - on extrait le polypeptide recombinant obtenu.

Pour introduire dans une cellule hôte un polynucléotide recombinant caractérisé par le fait qu'il comprend le gène ou l'un des polynucléotides conformes à, l'invention, on peut avoir recours aux moyens classiques de transformation, transfection ou de conjugaison.

Avantageusement, ce polynucléotide recombinant peut être introduit et produit dans la cellule hôte au moyen d'un vecteur d'expression ; un tel vecteur est caractérisé par le fait qu'il comprend le gène ou l'un des polynucléotides conformes à l'invention codant pour l'endofucanse.

Toutefois, en raison du fait que Pendofucanase est une enzyme, la mise en œuvre de la production de sa forme recombinante peut se heurter à des difficultés majeures ; ces difficultés proviennent du système et des conditions d'expression, de la procédure de purification de l'enzyme recombinante ainsi produite et enfin de la possibilité d'une perte de l'activité pour l'enzyme recombinante par rapport à l'enzyme native. La cellule hôte est mise en culture sous des conditions déterminées notamment de pH et de composition du milieu de culture, supplémenté ou non de composés particuliers qui sont adaptées au type cellulaire de la cellule hôte ; ces conditions sont optimisés de façon à produire efficacement les volumes souhaités du polypeptide recombinant sous forme soluble.

La cellule hôte est avantageusement une cellule bactérienne E. CoIi.

Le polypeptide recombinant ainsi obtenu est extrait des cellules hôtes et purifié.

L'extraction du polypeptide recombinant à partir d'un homogénat de cellules est une procédure délicate d'une part en raison du fait que l'on est en présence de plusieurs centaines de protéines ayant des propriétés chimiques relativement proches de celles du polypeptide recombinant recherché et, d'autre part, en raison du fait qu'il faut choisir des conditions d'extraction et de purification qui ne dénaturent pas ce polypeptide recombinant.

Dans la mesure où le système d'expression du polypeptide recombinant permet sa surexpression, on peut surmonter la première difficulté.

La seconde difficulté peut être surmontée grâce aux moyens mis en œuvre dans le procédé de production du polypeptide recombinant conforme à l'invention et dont il va être question ci-après.

Le polypeptide recombinant s'accumule dans les cellules hôtes bactériennes E. CoIi.

Après un temps de culture suffisant, les cellules sont centrifugées, puis lysées par des traitements classiques mécaniques ou chimiques.

Seule la phase liquide exempte de fragments cellulaires est conservée et soumise à des moyens de purification tels que la dialyse, la précipitation par les sels neutres dont notamment par le sulfate d'ammonium, la chromatographie d'absorption, la chromatographie par échange d'ions et/ou la chromatographie d'affinité. L'activité endofucanase est vérifiée après chaque étape de purification.

Le polypeptide recombinant peut également s'accumuler dans les cellules hôtes sous forme de corps d'inclusion.

Dans ce cas, les cellules hôtes sont lysées, les corps d'inclusion sont collectés par centrifugation et rendus solubles à l'aide de composés communément utilisés dans le domaine de la purification des protéines tels que l'urée ou le chlorhydrate de guanidine.

Une fois solubilisé, le polypeptide recombinant recherché est purifié grâce aux méthodes de purification décrites ci-dessus.

Le polypeptide recombinant peut également être sécrété par la cellule hôte directement dans le milieu de culture et peut alors être isolé par des techniques d'ultracentrifugation, la purification finale étant celle décrite ci-dessus.

L'invention vise l'utilisation du susdit polypeptide recombinant notamment obtenu par la méthode selon l'invention pour dégrader des polysaccharides de type fucoidane, ce qui permet d'obtenir des fractions oligosaccharidiques et notamment les fractions tétrasaccharidique et hexasaccharidique particulièrement intéressantes.

L'invention pourra être encore mieux comprise à l'aide de l'exemple non limitatif décrit ci-après ; cet exemple est relatif à l'identification du gène codant pour l'endofucanase, à sa préparation, au procédé de préparation de l' endofucanase recombinante ainsi qu'à l'utilisation de l'enzyme endofucanase pour la dégradation des polysaccharides de type fucoidane.

Liste des figures : La figure 1 représente la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1. La figure 2 représente la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 2. La figure 3 montre les différents domaines structuraux de l' endofucanase isolée de la bactérie SW5 (1007 acides aminés, 110 IcDa). Exemple

Dans un premier temps, on construit une banque d'ADN génomique de la souche bactérienne SW5.

L'extraction de l'ADN génomique de la souche SW5 est effectuée par les méthodes classiques de biologie moléculaire. Les cellules bactériennes sont mises en culture jusqu'à saturation dans un milieu d'eau de mer filtrée comprenant 5 g/1 de Bacto peptone (Difco), 1 g/1 d'extrait de levure (Difco) puis sont récoltées par centrifugation. Elles sont ensuite lysées chimiquement en présence de lyzozyme et de SDS à froid. Les acides nucléiques du lysat sont alors soumis à une extraction au phénol- chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol. Les ARNs sont éliminés par traitement à la RNAse et l'ADN génomique est repurifié par précipitation à l'éthanol puis conservé dans un tampon Tris-EDTA.

L' ADN génomique est ensuite partiellement digéré par l'enzyme de restriction Sau3AI puis fractionné dans un gradient de saccharose. Les fragments d'ADN obtenus d'une taille de 4 à 10 kb sont clones dans le site de restriction BamHI du vecteur pAT153. Les vecteurs recombinants sont introduits dans des cellules hôtes de la souche bactérienne E. CoIi DH5α. Les cellules bactériennnes ainsi transformées sont mises en culture puis étalées sur des boites de Pétri comprenant un milieu de culture solide ; ceci afin d'isoler les clones bactériens. La banque génomique ainsi construite comprend approximativement 6000 clones.

Parallèlement, on construit une sonde oligonucléotidique pour permettre le criblage de la banque génomique.

La sonde est obtenue en réalisant une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) sur l'ADN génomique extrait de la souche SW5 à l'aide de deux amorces dégénérées dont les séquences nucléotidiques se lisent comme suit : amorce amont complémentaire d'une séquence à l'extrémité 5' de la séquence à amplifier : ATHACNGTNGAYCATGT - amorce aval complémentaire d'une séquence à l'extrémité 3' de la séquence à amplifier : TGYTGD ATNGTIAGCCA

L'ADN ainsi amplifiée correspondant à la sonde est purifié par électrophorèse sur gel d'agarose puis inséré dans un vecteur de clonage (vecteur de clonage TOPO TA Cloning, Invitrogen) : le vecteur recombinant est lui-même amplifié et maintenu dans la souche bactérienne DH5α de E.Coli. L'insert correspondant à la sonde est séquence par séquençage automatique.

La sonde d'une longueur de 203 nucléotides a la séquence nucléotidique suivante: ATTACAGTTGATCATGTTGCAGGTTTTACTAATTTGGGTAATGGAGCACCT GTTTGGTCTTCACCTATACTTAATCTTACCGATGGAAAAGGATCATTCGCCT ATAATTATACTTTGCAATTAGGAACCGATTATTATGATTTTGAAGGTGATG CACTTACTATTACTAAAACATCAGGACCTGATTGGCTTACTATTCAACA

On prépare ensuite la sonde par excision de l'insert du vecteur recombinant à l'aide de l'enzyme de restriction EcoRI. Après purification sur gel d'agarose, ce fragment sert de matrice à une réaction « Random priming » permettant la synthèse d' oligonucléotide simple brin complémentaire ayant incorporé du dCTP marqué au [OC32P]. Le marquage radioactif de la sonde est réalisé à l'aide du kit Megaprime DNA labelling System (Amersham Pharmaciàbiotech). La sonde est purifiée sur colonne Microspin S-200HR columns (Amersham Pharmaciàbiotech) afin d'éliminer les dCTP marqués libres.

A l'aide cette sonde marquée, on procède au criblage de la banque génomique par hybridation in situ pour détecter les clones positifs.

Le criblage est réalisé selon la procédure développée par Sambrook et Russel [Molecular cloning : a laboratory manual, third édition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, 1, 1126-1128, 1135-1142 (2001)]. Chaque colonie bactérienne issue d'un clone bactérien est transférée de la boite de Pétri à une membrane de nitrocellulose (Hybond-N+, Amersham Pharmaciabiotech). Ces colonies sont alors traitées selon un protocole de « colony blotting » standard préconisé par le fabricant de la membrane. Il est basé sur une lyse alcaline des colonies suivie d'une neutralisation, d'un lavage et d'une fixation de l'acide nucléique à la membrane par cuisson à 80°C.

L'hybridation de la sonde sur les membranes suit également un protocole standard préconisé par le fabricant. La membrane est immergée à 65 0C dans une solution de préhybridation comprenant SSPE 5X, 0,5% SDS, solution DENHARDT 5X et lOOμg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. L'étape d'hybridation proprement dite se déroule à 650C dans une solution de même composition mais sans DENHARDT à laquelle on ajoute la sonde marquée. Les trois lavages successifs qui suivent se font dans des solutions comprenant 0,1% SDS et 2X SSPE, puis 0 ,1% SDS et IX SSPE, et finalement 0,1% SDS et 0,1 %X SSPE. Enfin, les membranes sont séchées puis lues sur Storm system840 (Molecular Dynamics) après exposition sur écran phosphore.

Pour chaque clone positif, le vecteur recombinant est extrait et purifié par centrifugation isopycnique sur gradient de chlorure de césium.

Parmi les 6000 clones que renferme la banque, on a sélectionné 3 clones respectivement pAT153full, pAT153ful4 et pAT153fu33 ; ces clones ont chacun un insert capable de s'hybrider à la sonde ; leur taille respectivement est de 4 kb, 13.5 kb et 4 kb.

Les inserts ont été séquences par séquençage automatique à l'aide d'un séquenceur 16 capillaires ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems) et selon la méthode appelée marche sur le chromosome permettant une progression pas à pas de la séquence par chevauchement de chaque nouvelle lecture avec la précédente. Les réactions de séquences sont obtenues via le kit BigDye Terminator V3.0 (Abi Prism, Applied Biosystems) qui répond au principe de marquage fluorescent terminal indépendant pour les quatre bases.

L'ensemble des séquençages a été répété 5 fois de façon à lever toute ambiguïté.

Ainsi, les inserts des clones pAT153rall et pAT153m33 ont approximativement la même séquence nucléotidique, excepté en ce qui concerne leur orientation. Par « approximativement », on désigne des séquences nucléotidiques qui peuvent éventuellement différer dans leur séquence nucléotidique en raison de mutations spontanées qui résulteraient d'erreurs se produisant lors de la réplication, de la réparation ou de la recombinaison de l'ADN.

L'insert du clone pAT153ful4 a son extrémité 5' qui chevauche l'extrémité 3' de l'insert du clone ρAT153ful 1.

Les séquences de ces inserts ont été alignées et organisées au sein d'un contig. La séquence du gène codant pour l'endorucanase étant à cheval entre les deux inserts, son obtention dans son intégralité physique a été réalisée par PCR à partir de l'ADN génomique de SW5. Dans ce but, les informations découlant des séquences nucléotidiques des inserts des clones ont permis de concevoir et de synthétiser des amorces oligonucléotidiques complémentaires des séquences nucléotidiques en amont et en aval du gène d'intérêt.

L'amorce amont complémentaire de la séquence située à l'extrémité 5' du gène codant pour l'endorucanase correspond à la séquence suivante : GGA AAC ATC AAC CCA ACT CTT G

L'amorce aval complémentaire de la séquence située à l'extrémité 3' du gène codant pour l'endorucanase correspond à la séquence suivante : GCC ATG AGG CAA CAT ACA ACT AGA Une séquence nucléotidique consensus du gène a ensuite été déduite ; dans son cadre de lecture elle comprend 3021 nucléotides.

Elle est représentée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO :1.

On a ensuite déterminé la structure de la séquence peptidique du gène isolé et identifié codant pour l'endofucanase.

Par le jeu du code génétique, une séquence peptidique a été déduite de la séquence nucléotide du gène. Elle est représentée par la séquence SEQ ID NO :2.

Une analyse comparative au moyen des programmes BLASTp et PSI-BLAST (à partir du serveur du NCBI) entre la séquence peptidique SEQ ID NO :2 et des séquences peptidiques disponibles dans la banque GENBANKnr a révélé que près de 60 % de la séquence SEQ ID NO :2 ne présente aucune similitude significative avec les autres séquences peptidiques.

Toutefois, il a été possible de déduire l'existence de domaines particuliers comme l'illustre la figure 3: - une région constitué de 3 domaines répétés en tandem correspondant aux acides aminés 419 à 736 de SEQ ID NO :2 dont la fonction n'a pas été complètement élucidée ; toutefois, il semblerait que les motifs favorisent les interactions protéine-protéine, - une partie C-terminale d'environ 70 résidus aminés comprenant un motif conservé YPNP dont la fonctionnalité est complètement inconnue à ce jour.

Une autre analyse comparative de la SEQ ID NO°2, toujours par le programme BLASTp (serveur du NCBI) mais contre la banque PAT, a révélé la présence d'une large région homologue à une partie des séquences peptidiques des enzymes fucoidanases Fdal et Fda2 isolées de la souche bactérienne Alteromonas sp. SN-1009. Leur alignement a permis de déduire que les limites du domaine catalytique correspondent approximativement aux acides aminés 29 à 418 de SEQ ID NO :2 situés à l'extrémité N-terminale de la séquence de l' endofucanase.

Les enzymes fucoidanases Fdal et Fda2 ont été identifiées par Sakai et al (brevet US 6,489,155).

A partir de cette analyse, les inventeurs ont suggéré que trois résidus acide aspartique en positions 226, 275 et 289 pouvaient être des résidus catalytiques impliqués dans l'hydrolyse des liaisons glycosidiques des fucoidanes.

La pré-protéine comprend par ailleurs une séquence signal regroupant 28 acides aminés à l'extrémité N-terminale.

Pour produire l'enzyme endofucanase recombinante, on procède comme suit.

La région codante du gène codant pour l' endofucanase et/ou l'un des polynucléotides codant pour l'une des séquences peptidiques SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 sont amplifiées par PCR à partir de l'ADN génomique de SW5 en utilisant une polymérase haute fidélité (Platinum Pfic DNA polymérase, Invitrogen) ainsi que des amorces comprenant une séquence complémentaire à celle du gène ou de l'un des polynucléotides recherchés. Par ailleurs, pour permettre le clonage des produits de PCR dans le vecteur de clonage pDONR201 (Gateway™, Invitrogen), ces amorces sont flanquées d'une séquence spécifique de ce système de clonage.

L'amorce amont utilisée pour réaliser ces amplifications est identique quelque soit la séquence à amplifier. La séquence nucléotidique de l'amorce amont se lit : GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAGTACCAGATCCAAACC AAGGAT

Chaque amorce aval utilisée pour réaliser ces amplifications a une séquence spécifique de séquence polynucléotidique à amplifier. La séquence nucléotidique de l'amorce aval utilisée pour amplifier la région codante du gène codant pour l'endofucanase se lit : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTTCTTAATGAATTTTTCGAAC AA

La séquence nucléotidique de l'amorce aval utilisée pour amplifier la séquence nucléotidique codant pour SEQ ID NO : 3 se lit : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTACGTTATACCTCCTGAAGAACCA GA

La séquence nucléotidique de l'amorce aval utilisée pour amplifier la séquence nucléotidique codant pour SEQ ID NO : 5 se lit : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATCCATCACTAATAATAGTAGCA AT

La séquence nucléotidique de l'amorce aval utilisée pour amplifier la séquence nucléotidique codant pour SEQ K) NO : 6 se lit : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATCCAGGATTTGTAAAACCTGCA GG

La séquence nucléotidique de l'amorce aval utilisée pour amplifier la séquence nucléotidique codant pour SEQ ID NO : 7 se lit : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATGG TGATTGAAATTCTTT CAAATA

La séquence nucléotidique de l'amorce aval utilisée pour amplifier la séquence nucléotidique codant pour SEQ Tû NO : 8 se lit : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGGTTGTAAAGTAAGCACTGG AGC Chaque polynucléotide peut également être amplifié par PCR soit à partir de la région codante du gène codant pour l'endofucacanse précédemment amplifiée soit à partir de l'un des polynucléotides dont la séquence est plus longue que celle du polynucléotide à amplifier.

Les produits de PCR sont donc clones dans le vecteur de clonage pDONR201 (Gateway™, Invitrogen). Les vecteurs recombinants obtenus sont ensuite amplifiés et maintenus après transformation dans la souche E coli DH5α. La séquence des inserts est vérifiée. L' insert présentant la séquence correspondant à celle du gène ou à celle de l'un des polynucléotides est ensuite sous clone en phase dans le vecteur d'expression pDEST17 (technologie Gateway™, Invitrogen). Dans ce vecteur, l'insert est sous le contrôle du promoteur T7. En amont de l'insert, on retrouve une étiquette hexahistidine qui permettra une purification du polypeptide recombinant facilitée.

Des cellules de la souche bactérienne E. Coli BL21 pLysS (Novagen) sont transformées par les vecteurs recombinants pDEST17. Les cellules bactériennes ainsi transformées sont cultivées dans un milieu M9 supplémenté avec 2 % d'acide casamino, 100 μg/ml d'ampicilline et de 35 μg/ml de chloramphenicol dans un incubateur Bioflow 3000 à 37 °C sous atmosphère contrôlés. La croissance des cellules bactériennes s'effectue jusqu'à la phase de croissance exponentielle (OD de 0.8 à 600 nm). La production du polypeptide recombinant est induite par addition d'isopropyl-1- thio-β-D-galactopyranoside à une concentration finale de 1 mM.

Lors de l'induction, les cellules bactériennes sont incubées à une température de 200C pendant la nuit.

Un volume de 500 ml de culture est ensuite centrifugé à 10 00Ox g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est repris dans 50 ml d'un tampon Tris 20 mM pH 7.5 complémenté par 250 mM NaCl et 80 mM d'Imidazol. Les cellules sont alors incubées à 4 °C puis lysées grâce à un appareil couramment utilisé et communément appelé « French Press ». Le lysat cellulaire est ensuite ultracentrifugé à 40 00Ox g pendant 1 heure à 4 0C. Finalement, la fraction protéique comprenant le polypeptide recombinant est partiellement purifié du surnageant par chromatographie d'affinité au moyen d'une résine capable de fixer les résidus histidines et en conséquence de retenir le polypeptide recombinant comprenant un tag histidine. La fraction protéique comprenant le polypeptide recombinant est élue dans un gradient d'imidazole (gradient d'imidazole de 80 mM à 300 mM, élution finale avec 1 mM d'imidazole). Les fractions d'élution présentant l'activité endofucanase sont rassemblées pour être dialysées contre le tampon Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 50 mM, CaCl2 5 mM, MgCl2 5 mM.

La fraction protéique comprenant le polypeptide recombinant et obtenue après dialyse est ensuite concentrée par précipitation au sulfate d'ammonium suite à un fractionnement entre 40 et 60 % de saturation. Ce fractionnement est réalisé par addition de (NEU)2SO4 à 130 g/1 petit à petit et sous agitation lente à 4°C. La fraction protéique entre 40 et 60% de saturation du sulfate d'ammonium, est conservée et solubilisée dans le même tampon que celui utilisé lors de l'étape de dialyse.

Les protocoles décrits ci-dessous mettent en oeuvre la fraction protéique comprenant le polypeptide recombinant obtenue soit à partir du lysat cellulaire clarifié, soit à l'issu de la purification par la chromatographie d'affinité ou à l'issue de l'étape de précipitation.

Pour estimer l'activité enzymatique de la fraction protéique comprenant le polypeptide recombinant, on doit dans un premier temps préparer des fucoidanes qui serviront de substrats.

La préparation de ces substrats est effectué comme suit.

Une quantité d'un kg en poids frais d'algue Pelvetia canaliculata est collectée à marée basse à Roscoff (France), puis lavée à l'eau distillée.

Ces algues sont ensuite écrasées dans un mortier en présence d'azote liquide et laissées à macérer toute la nuit dans un volume de 2 L d'une solution éthanol/formaldéhyde/eau (80 :5 :15 v/v). Les fragments d'algues sont extraits de cette solution puis rincés avec 2 L d'acétone. On récupère les fragments d'algues sous forme d'un culot qui est séché à une température de 60 0C. Puis les fragments d'algues subissent deux extractions pendant 3 heures à 70 °C dans une solution d'HCl 0.01 N supplémentée de 4 % (w/v) de CaC12. L'extrait est filtré, concentré dans un évaporateur tournant puis neutralisé avec du carbonate d'ammonium.

Les fucoidanes sont précipités dans 2.5 volume d'éthanol. Le précipité est redissous dans de l'eau et congelé (Lyolab ALSL, Secfroid).

Typiquement, cette fraction de fucoidane présente une quantité de 55 % de carbohydrate en poids par rapport au poids sec total (selon la méthode de Tillmans and Phillipi [(1929) The carbohydrate content of the important protein of foodstuff on colorimetric procédure for the détermination of nitrogen free sugars in protein. Biochem Z. 215, 36-60]), une quantité de 30 % de résidus fucosyl en poids sec par rapport au poids sec total (selon la méthode de Disches and Schettles [(1948) A spécifie color reaction of methyl-pentoses and a spectrophotometric micromethod for their détermination. J. Biol. Chem. 175, 595-603]). En outre, la quantité de sulfate correspond à 26 % et la quantité d'acide uronique est de 2 %, ces pourcentage étant exprimé en poids sec par rapport au poids sec total.

Avantageusement, des fractions de fucoidanes peuvent être extraits des espèces Pelvetia canaliculata, Ascophyllum nodosum ou Fucus spiralis selon une méthode décrite dans Mabeau et al. [(1990) Fractionation and analysis of fucans from brown alguae. Phytochemistry 19, 2441-2445].

L'activité endofucanase de la fraction protéique sous forme d'une fraction précipitée au sulfate d'ammonium entre 40 et 60 % de saturation est mise en évidence selon le protocole suivant.

On procède à un test mettant en œuvre un électrophorèse sur gel de polyacrylamide- carbohydrate (C-PAGE) permettant d'estimer la libération d'oligosaccharides selon le protocole de Zablackis E. et Perez J. [A partially pyruvated carrageenan from Hawaiian Grateloupia filicina (Cryptonemiales, Rhodophyta) 1990 Bot. Mar. 33, 273- 276].

100 μl de tampon de pH 7.5 comprenant 20 mM Tris/H+, 5 mM MgC12, 5 mM CaC12 et 50 mM NaCl et 0.2 % (w/v) fucoidanes, sont incubés avec 5 μl de la fraction protéique (sous forme d'une fraction précipitée au sulfate d'ammonium entre 40 et 60 % de saturation) pendant 1 heure à température ambiante. Le résultat de l'hydrolyse enzymatique est analysé par electrophorèse à travers un gel de polyacrylamide (à 6 % pour le gel de concentration et 27 % pour le gel de séparation) dans un tampon de pH 8.7 comprenant 50 mM Tris/H+ et 2 mM EDTA. Un échantillon correspondant à des fractions pures d'hexasaccharide et de tétrasaccharide est également déposé sur le gel à titre de référence qualitative.

Après migration, les sucres chargés sont fixés et colorés dans le gel avec une solution de 0,5 % de bleu alcian (Fluka) pendant 10 minutes. Après plusieurs rinçage à l'eau distillée jusqu'à ce que le gel devienne incolore, il est soumis à une coloration au nitrate d'argent 0.4 % pendant 10 min puis rincé à l'eau distillée. La coloration est révélée par une solution de carbonate de sodium 7 % (m/v) additionnée de 0.1% (v/v) de formaldehyde à 37 % et stoppée avec une solution d'acide acétique à 5 % (v/v).

Après coloration du gel, on compare le profil de migration des oligosaccharides générés après hydrolyse des fucoidanes par la fraction protéique comprenant le polypeptide recombinant et le profil de migration des fractions pures tétrasaccharidique et hexasaccharidique. Ceci permet de mettre en évidence la présence de fractions tétrasaccharidique et hexasaccharidique parmi les oligosaccharides générés par le polypeptide recombinant.

Les oligosaccharides générés par le polypeptide recombinant sont purifiés, isolés et analysés selon le protocole détaillé dans la demande de brevet PCT WO 00/17215. L'analyse par résonance magnétique nucléaire de la structure des oligosaccharides obtenus confirme que l'hydrolyse par la fraction protéique comprenant le polypeptide recombinant génère effectivement une fraction tétrasaccharidique et une fraction hexasaccharidique dont la structure respective est : α-L-Fucp-2,3-(diOSO3)-l->3-α-L-Fucp-2-(OSO3)-l-»4- α-L-Fucp-253-(diOSO3)- l-»3-α-L-Fucp-2-(OSO3) et , α-L-Fuc/?-2,3-(diOSO3)-l-»3-α-L-Fucp-2-(OSO3)-l->4- α-L-Fucp-2,3-(diOSO3)- 1 →3-α-L-Fucp-2-(OSO3)- 1 →4- α-L-Fucp-2,3-(diOSO3)- 1 →3-α-L-Fucp-2-(OSO3).

Le polypeptide recombinant a donc une activité endofucanase.