发明领域

本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产丁二酸的领 域。具体而言，本发明提供了一种用 于生产丁二酸的经工程化的重组大肠杆菌。本 发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠 杆菌用于生产丁二酸的用途， 及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产丁二 酸的方法。 发明背景

丁二酸又称作琥珀酸， 是一种优秀的平台化合物， 在化工、 材料、 医药、 食品领 域有着广泛的用途，被美国能源部列为未来 12 种最有价值的平台化合物之一 (McKinlay et al. 2007, Appl Microbiol Biotechnol 76:727-740)。 丁二酸目前主要应用于酯化溶剂、 除 冰装置、 发动机冷却剂、 食品香精、 水处理化学品等。 丁二酸还可以用于生产很多下游 产品， 如 1,4-丁二醇、 四氢呋喃、 γ-丁内酯、 Ν-甲基吡咯垸酮、 2-吡喏垸酮。 另外， 丁 二酸和 1,4-丁二醇聚合能得到 PBS (聚丁二酸丁二醇酯)塑料， 其是一种性能优良的生物 全降解塑料。据估计丁二酸未来的市场潜力每 年将超过 270万吨。大约有 250种可以用 苯为原料生产的化工产品都可以通过丁二酸为 原料生产 (McKinlay et al. 2007, Appl Microbiol Biotechnol 76:727-740)。

目前丁二酸的生产主要是基于顺酐为原料的石 油化工路线。 石油价格近年来波动 很大， 这严重制约了丁二酸生产的可持续性和价格稳 定。 另一方面， 化学合成法工艺复 杂且常需高温高压， 这大大增加了生产所需的能耗物耗； 同时化学合成还会造成严重的 环境污染。开发丁二酸的高效生物制造技术能 从根本上解决石油化工路线的弊端： 保证 丁二酸价格稳定不受制于石油价格波动， 降低 PBS塑料的制造成本， 促进其进一步的 推广应用； 实现绿色可持续生产、 简化生产工艺、 节能减排、 减少环境污染。 另外， 丁 二酸的生物制造过程中还可以吸收二氧化碳， 对实现低碳经济具有很好的促进作用。丁 二酸生物制造技术的核心就是能够将生物质原 料高效转化为丁二酸的微生物菌株。

目前丁二酸发酵菌种主要有两大类。 第一类是天然产丁二酸菌， 主要有产丁二酸 放线杆菌 4" wo6ac〃 succinogens)(Guettler et al. 1996, US Patent No. 5504004)、产丁二 .^M ^{Anaerobiospirillum succiniciproducens)(G\assner and Datta 1992, US Patent No. 5143834)、 产丁二酸曼海姆菌 ( arww ze a succiniciproducens)(Lee et al. 2002, Appl Microbiol Biotechnol 58 :663-668)禾口巴斯夫琥¾菌 60^ ¾2 succiniciproducens)(Scho\ten et al. 2009, Biotechnol Lett 31 : 1947-1951) ₀ 另一类是通过代谢工程改造的工程菌， 主要是 大肠杆菌。

天然产丁二酸菌虽然能够高产丁二酸， 但其自有很多缺陷。 发酵过程中， 糖酸转 化率低， 有相当一部分碳源流入到其他有机酸的合成。 另外， 天然产丁二酸菌发酵过程 中需要丰富培养基，提高了生产成本和下游分 离纯化成本，限制了其大规模工业化生产。 大肠杆菌在糖发酵过程中虽然只积累少量的丁 二酸， 但由于其生理遗传背景都很清晰， 易于改造， 因此很多研究单位都选取大肠杆菌作为出发菌 种，将其改造成高产丁二酸的 工程菌。

磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)是丁二酸合成途径的关键前体。 将 PEP 羧化成草酰乙酸

(OAA)是丁二酸合成途径的关键步骤。 Millard等人通过过表达大肠杆菌的 PEP羧化酶 基因 ppc， 将丁二酸的产量提高了 3.5倍 (Millard et al., 1996, Appl Environ Microbiol 62: 1808-1810)。 Kim等人发现在野生型大肠杆菌中过表达 PEP羧化激酶基因 ：， 对丁 二酸生产没有影响， 但在敲除了^ c基因的大肠杆菌中过表达 基因， 能将丁二酸的 产量提高 6.5倍 (Kim et al., 2004, Appl Environ Microbiol 70: 1238-1241)。韩国 Kwon等人 进一步发现当发酵液中含有高浓度碳酸氢根离 子时，在野生型大肠杆菌中过表达 基 因， 能将丁二酸的产量提高 2.2 倍 (； Kwon et al., 2006, J Microbiol Biotechnol 16: 1448-1452)。

Chatteijee等人通过在大肠杆菌中敲除丙酮酸甲� �裂解酶基因/ 和乳酸脱氢酶基 因 IdhA,构建了工程菌 NZN111。该菌株不能以葡萄糖为碳源发酵生长， 但可以以乳糖、 果糖、甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成丁二 酸、 乙酸和乙醇。在此基础上筛选出能够 重新利用葡萄糖为碳源发酵生长的突变菌株 AFPl l lCChatteijee et al., 2001, Appl Environ Microbiol 67: 148-154; Donnelly et al., 1998, Appl Biochem Biotechnol 70-72: 187-198 Vemuri等人通过在 AFP111中高表达埃特里根瘤菌 et/ )的丙酮酸羧化酶基因 pyc, 进一步提高了丁二酸的产量。在两步法培养 (先好氧培养， 然后厌氧发酵产酸)条件 下， 丁二酸的最终浓度可达到 99.2 g/L(841 mM)， 糖酸转化率为 1.1 g/g(1.68 mol/mol)(Vemuri et al., 2002, J Ind Microbiol Biotechnol 28:325-332)。

Sanchez等人通过敲除醇脱氢酶基因 α^ ：、 IdhA , 乙酸激酶基因 ac 4、 磷酸乙酰 转移酶基因 pto、 异柠檬酸裂解酶调控蛋白基因 c/R， 构建出工程菌 SBS550MG。 在两 步法培养 (先好氧培养，然后厌氧发酵产酸)条件下，可� ��生产 40 g/L(339 mM)的丁二酸， 糖酸转化率达到 1.06 g/g (1.61 mol/mol)(Sanchez et al., 2005, Metab Eng 7:229-239)。

Vemuri等人和 Sanchez等人构建出的重组大肠杆菌虽然能生产� �浓度的丁二酸， 但仍有一些缺陷。发酵过程采用的是两步发酵 ，即先采用好氧过程将细胞培养生产起来， 再转变为厌氧过程进行发酵。这种工艺操作复 杂， 而且好氧工艺会大大提高设备的构建 和运行成本。这些重组大肠杆菌都需要使用丰 富培养基，这将极大地提高发酵的原料成 本， 并导致计算的转化率偏高。

Jantama等人通过敲除 /i¾4、 adhE、 甲酸转运蛋白基因/ ο 、 ρ 、 ackA、 甲基乙 二醛合成酶基因∞g^4、 丙酮酸氧化酶基因 pox 并经过进化代谢， 构建出重组大肠杆 菌 KJ073。 使用无机盐培养基， 在厌氧条件下可以生产 79 g/L(668 mM)的丁二酸， 糖酸 转化率达到 0.79 g/g (1.2 mol/mol)(Jantama et al., PCT/US2008/057439; Jantama et al., 2008a, Biotechnol Bioeng 99: 1140-1153)。 进一步敲除丙酸激酶基因 tdcD、 2-酮基丁酸甲 酸裂解酶 /丙酮酸甲酸裂解酶基因 fcfc£、 天冬氨酸氨基转移酶基因 o^C、 苹果酸酶基因 sfcA , 并经过进化代谢， 构建出重组大肠杆菌 KJ122。 使用无机盐培养基， 在厌氧条件 下可以生产 80 g/L(680 mM)的丁二酸， 糖酸转化率达到 0.89 g/g (1.36 mol/mol)(Jantama et al., PCT/US2008/057439; Jantama et al., 2008b, Biotechnol Bioeng 101 :881-893)。上述的 两个重组大肠杆菌都是经过进化代谢提高了丁 二酸的生产能力。 Zhang等人还通过敲除 PEP-糖磷酸转移酶的酶 I基因/ te/、 基因， 并增强 PEP羧化激酶 (PCK)的活性， 构 建出重组大肠杆菌 XZ721。使用无机盐培养基，在厌氧条件下可以� ��产 39 g/L(327 mM) 的丁二酸， 糖酸转化率达到 0.82 g/g (1.25 mol/mol)(Zhang et al., PCT/US2010/029728; Zhang et al., 2009b, Appl Environ Microbiol 75:7807-7813)。

为了提高大肠杆菌生产丁二酸的产量和 /或转化率， 需要进一步对大肠杆菌的代谢 途径进行改造。 发明概述

一方面， 本发明提供了一种用于生产丁二酸的重组大肠 杆菌。

在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠 杆菌，所述大肠杆菌中含有如下修饰：

(1)磷酸烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)中所涉及的基因表达的抑制、 和 /或磷酸 烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑� ��，

(2) pflB和 /或 adhE基因表达的抑制、 和 /或 pflB和 /或 adhE基因所编码的蛋白质活性的 抑制， （3)/ύ¾4基因表达的抑制、和 /或 /^¾4基因所编码的蛋白质活性的抑制， 和 (4)g _a ff 基因和 /或外源 g//基因表达的增强、 和 /或 gaff基因和 /或外源 g//基因所编码的蛋白质 活性的增强； 其中所述大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰 ： （a) 磷酸戊糖途径 (PPP) 中所涉及的基因表达的增强、 和 /或磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质 活性的增强； 和 (b) W/^4基因表达的增强、 和 /或^^基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)所涉及的基因表达的抑制、 和 /或磷酸烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)中所 涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制， 其中所述基因是选自如下的一或多种基因： 编 码 PTS系统酶 I的基因 ptsl、编码 PTS系统酶 Hpr的基因 ptsH、编码 PTS系统酶 ΠΑ ^ε 的基因 CJT和编码 PTS系统酶 IICB^的基因 ptsG。

在另一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌的磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因表 达增强、 和 /或磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增� ��， 其中所 述基因是选自如下的一或多种基因： 编码转酮醇酶的基因 tA 、 编码 6-磷酸葡萄糖脱氢 酶的基因 zw/、编码 6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因 pgl、编码 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因 gnd、 编码 5-磷酸核糖异构酶的基因 r '、 编码 5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因r _J ^和编 码转醛醇酶的基因 talB。

在进一步的实施方案中， 所述磷酸戊糖途径 (PPP)中表达增强的基因或所编码的蛋 白质的活性增强的基因是选自如下的一或多种 基因： 编码转酮醇酶的基因 tA 、 编码 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶的基因 zw/、编码 6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因 pgl、编码 6-磷酸葡萄糖 酸脱氢酶的基因 gm/和编码转醛醇酶的基因 talB。

在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠 杆菌，其中所述大肠杆菌中 基因 和 tktA基因的表达增强、 和 /或 sthA基因和 tktA基因所编码的蛋白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 IpdA 基因， 其所编码的多肽 在对应于 SEQ ID No.: l所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修� �： T81、 Ρ275和 Α358, 对应的位置是通过与 SEQ ID No.: l进行序列比对而确定的， 任选其中在对应于 T81的位置上的修饰是用 I置换 T， 在对应于 Ρ275的位置上的修饰是用 S置换 Ρ， 以及 在对应于 Α358的位置上的修饰是用 V置换 Α。 在一个优选的实施方案中， 本发明的大 肠杆菌中所含有的突变的 IpdA基因的表达增强，和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋 白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 IpdA 基因， 并且所述突变的 IpdA基因位于染色体中或者质粒中。

在一个实施方案中， 本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠 杆菌中含有如下 修饰： （a) 磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因表达的增强、 和 /或磷酸戊糖途径 (PPP)中 所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增强； 和 (b) W/^基因表达的增强、和 /或 基因 所编码的蛋白质活性的增强； 和 （c) 突变的 基因， 其所编码的多肽在对应于 SEQ ID No. : l所示氨基酸序列的如下位置的位置上含有修� �： T81、 Ρ275和 Α358， 对应的 位置是通过与 SEQ ID No. : l进行序列比对而确定的， 任选其中在对应于 T81的位置上 的修饰是用 I置换 T，在对应于 Ρ275的位置上的修饰是用 S置换 Ρ，以及在对应于 Α358 的位置上的修饰是用 V置换 Α。 在一个优选的实施方案中， 本发明的大肠杆菌中所含 有的突变的 IpdA基因的表达增强，和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋白质的活性增 强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰： （5)acM和 pto基因表 达的抑制、 和 /或 ackA和 pta基因所编码的蛋白质活性的抑制； ^>aceBA基因簇表达的 增强、 和 /或 ace ^基因簇所编码的蛋白质活性的增强； （7 fc _M C基因表达的增强、 和 / 或 dc C基因簇所编码的蛋白质活性的增强； 和 (8 ^&4基因表达的抑制、 和 /或 m _gS A 基因所编码的蛋白质活性的抑制。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有如下修饰： （9)ρ 基因表达的增强、 和 /或 pck基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有 如下修饰：（IO ^ :基因表达的抑制、 和 /或 adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制； 和 (l l)tofc£>£基因簇表达的抑制、 和 /或 tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰： （12) a _Ce £F基因簇表达 的增强、 和 /或 基因簇所编码的蛋白质活性的增强。

在第二方面， 本发明提供了一种生产丁二酸的方法，其中包 括培养本发明的大肠杆 菌的步骤。

在第三方面， 本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中 的用途。 附图简述

图 1 : 改造大肠杆菌获得重组菌株 NZ-037的示意图。 X代表基因敲除，包括 /^¾4、 pflB、 ptsl、 ac 4-pto基因。 四角星代表基因表达的增强， 包括 ga/P、 aceBA , dcuC 基因。

图 2: NZ-037经过 1080代进化获得菌株 HX021。

图 3： HX023经过 360代进化获得菌株 HX024。

图 4: HX024在 5L发酵罐水平发酵生产丁二酸。

图 5 : HX027经过 650代进化获得菌株 HX028。

图 6: HX028在 5L发酵罐水平发酵生产丁二酸。

图 7: HX024的转录组分析。灰色方框和白色方框中的� ��字代表 HX024基因表达 强度和野生型大肠杆菌 ATCC 8739的相对值； 缩写词： GLC: 葡萄糖； G6P: 6-磷酸葡 萄糖； F6P: 6-磷酸果糖； FBP: 1,6-二磷酸果糖； GAP: 3-磷酸甘油醛； DHAP: 磷酸 二羟基丙酮； GBP: 1,3-二磷酸甘油酸； G3P: 3-磷酸甘油酸； PEP: 磷酸烯醇式丙酮 酸； OAA: 草酰乙酸； MAL: 苹果酸； FUM: 富马酸； SUC: 丁二酸； 6PGCL: 6-磷 酸葡萄糖酸内酯； 6PGC: 6-磷酸葡萄糖酸； RL5P: 5-磷酸核酮糖； X5P: 5-磷酸核糖； R5P: 5-磷酸木糖； S7P: 7-磷酸景天庚酮糖； E4P: 4-磷酸赤鲜糖； PYR: 丙酮酸； ACA: 酰基辅酶 A; ACP: 酰基磷酸； ACE: 乙酸； CIT: 柠檬酸； ICIT: 异柠檬酸； GLO: 乙 醛酸； DLAC: D-乳酸； FOR: 甲酸； ETH; 乙醇； NAD+: 氧化型尼克烟酰胺腺嘌吟 二核苷酸； NADPH: 还原型尼克烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸； NADH: 还原型尼克烟 酰胺腺嘌吟二核苷酸； NADP+: 氧化型尼克烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸。 galP-. 半乳 糖透型酶基因； glk: 葡萄糖激酶基因； gapA: 3-磷酸甘油脱氢酶基因； pflA : 6 磷 酸果糖激酶基因； pck:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因； mdh:苹果酸脱氢酶基因； fumA : 富马酸水合酶酶 I基因； frdABCD: 富马酸还原酶基因； 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基 因； pgl: 6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因； gnd: 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因； rpe: 5-磷 酸核酮糖差向异构酶基因； ψίΑΒ'. 5-磷酸核糖差向异构酶基因； tktA : 转酮醇酶基因； tktB: 转酮醇酶基因； talB: 转醛醇酶基因； p≠F'. 丙酮酸激酶基因； pdh: 丙酮酸脱氢 酶基因； pta: 磷酸乙酰转移酶基因； ackA: 乙酸激酶基因； gltA: 柠檬酸合成酶基因； ac 顺乌头酸酶基因； aceB: 苹果酸合成酶基因； ac : 异柠檬酸裂解酶基因； sthA: 嘧啶核苷酸转氢酶基因； maeB: NADPH依赖苹果酸酶基因； dc B: 厌氧 C4双羧酸转 运蛋白基因； dcuC: C4双羧酸转运蛋白基因； dctA: 好养 C4双羧酸转运蛋白基因。

图 8: (A)野生型 基因以及突变的 基因 的核苷酸序列比对； （B) 野生型以及突变的 IpdA基因 所编码的多肽的氨基酸序列比对。

图 9: Zwf酶活与丁二酸转化率和产量之间的关系。 图 10: Pgl酶活与丁二酸转化率和产量之间的关系。

图 11 : Gnd酶活与丁二酸转化率和产量之间的关系。

图 12: Tkt酶活与丁二酸转化率和产量之间的关系。

图 13 : Tal酶活与丁二酸转化率和产量之间的关系。 发明详述

除非另有说明， 所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见 含义。 所有专利、 专利申请、 公开出版物、 序列、 以及其他公开材料均援引加入本文， 除非另有说明。

一方面， 本发明提供了一种用于生产丁二酸的经工程化 改造的重组大肠杆菌。 在本 发明的大肠杆菌中， 通过调节代谢途径中所涉及的一些酶的活性， 从而改善了大肠杆菌 丁二酸的产量和 /或转化率。

如本文所用， 术语"经工程化改造的重组大肠杆菌"、 "工程化的大肠杆菌 "和"重组大 肠杆菌"可互换使用， 均是指经过修饰的大肠杆菌， 其中所述的修饰可以是， 例如， 基 因表达的增强、 基因表达的抑制、 引入新的基因、 引入突变的基因或者对基因进行突变 等， 其中可以通过本领域常规的技术手段实现基因 表达的增强或基因表达的抑制， 例如 基因的敲除、 改变基因的拷贝数、 引入质粒、 改变基因的启动子 (例如使用强启动子或 弱启动子)等。

在一个实施方案中， 本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠 杆菌中含有如下 的一或多种修饰： （a) 磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因表达增强、 和 /或磷酸戊糖途 径 (PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的增� ��； 和 (b) sthA 基因的表达增强、 和 / 或 sthA基因所编码的蛋白质的活性增强。

如本文所用， 术语"磷酸戊糖途径 Cpentose-phosphate pathway)"具有本领域内熟知的 含义。 磷酸戊糖途径是在动物、 植物和微生物中普遍存在的一条糖的分解代谢 途径， 其 特征在于葡萄糖被直接氧化脱氢和脱羧， 而不经过糖酵解， 脱氢酶的辅酶不是 NAD+而 是 NADP+, 产生的 NADPH作为还原力以供生物合成用， 而不是传递给 0 ₂ 。

在一些实施方案中， 本发明的大肠杆菌的磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因表达 增强、 或者磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增� ��， 其中所述 基因是选自如下的一或多种基因： 编码转酮醇酶的基因 tA 、 编码 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 的基因 /、 编码 6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因 pgl、 编码 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因 gnd, 编码 5-磷酸核糖异构酶的基因 rpi、 编码 5-磷酸核酮糖差向异构酶的基因 rpe和编 码转醛醇酶的基因 talB。

在本发明中， tktA基因 (Genbank No: ACA76448.1)所编码的蛋白质的是转酮醇酶 (EC No: 2.2.1.1), ZH /基因 (Genbank No: ACA77430.1)所编码的蛋白质的是 6-磷酸葡萄糖脱氢 酶 (EC No: 1.1.1.49)； pg/基因 (Genbank No: ACA78522.1)所编码的蛋白质的是 6-磷酸葡 糖酸内酯酶 (EC No: 3.1.1.31)； gm/基因 (Genbank No: ACA76645.1)所编码的蛋白质的是 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (EC No: 1.1.1.44)； rpi基因 (Genbank No: ACA76468.1)所编码的蛋 白质的是 5-磷酸核糖异构酶 (EC No: 5.3.1.6)； rpe基因 (Genbank No: ACA76005.1)所编码 的蛋白质的是 5-磷酸核酮糖差向异构酶 (EC No: 5.1.3.1)； talB 基因 (Genbank No: ACA79258.1)所编码的蛋白质的是转醛醇酶 (EC No: 2.2.1.2)。

基因 (Genbank No: ACA79653.1)编码一种可溶性转氢酶 (EC No: 1.6.1.1)。 在一 个实施方案中， 本发明的 sthA基因的序列如 SEQ ID No. :5所示。 在一个实施方案中， 本发明的 sthA基因的序列与 SEQ ID No. :5所示的核苷酸序列具有 90%、91%、92%、93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 或 99%的序列相同性。

在一个实施方案中， 本发明的 基因的序列如 SEQ ID No. :6所示。 在一个实施 方案中， 本发明的 tktA基因的序列与 SEQ ID No. :6所示的核苷酸序列具有 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 或 99%的序列相同性

如本文所用， 术语"基因表达增强"， 其具有本领域内熟知的含义， 是指基因表达强 度的增强， 并导致基因转录后产生的 mRNA数量的增加。 基因表达增强可以通过如下 方式实现，例如但不限于：在基因前引入强启 动子、增加基因的拷贝数、或者增强 mRNA 的稳定性等。如本文所用，术语"基因所编码� �蛋白活性增强"具有本领域内熟知的含义， 是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的增加。 其可以例如通过基因表达强度的增强、 增 加酶在细胞中的含量、 氨基酸位点的突变来实现。 实现"基因的表达增强"以及"基因所 编码的蛋白质的活性增强"的各种技术手段是� �领域技术人员熟知的。

在本发明中， 基因表达增强可以例如通过引入强启动子来实 现。 在本发明的一些实 施方案中， 使用的强启动子例如是： Ppck*(SEQ ID No. : 108)(Zhang et al.， 2009b, Appl Environ Microbiol 75 :7807-7813)、 Ml-37 (SEQ ID No. : 109)、 或 Ml-93 (SEQ ID No. : 110) (Lu et al., 2012, Appl Microbiol Biotechnol 93 :2455-2426)。

在一个实施方案中， 本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠 杆菌中含有如下 的一或多种修饰： （a) 磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因表达增强、 和 /或磷酸戊糖途 径 (PPP)中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增� ��； （b) sthA 基因的表达增强、 和 /或 ^^基因所编码的蛋白质的活性增强； 和 (c)突变的 基因， 其所编码的多肽在对应 于 SEQ ID No. : l所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位� �上含有修饰： T81、 Ρ275 和 Α358， 对应的位置是通过与 SEQ ID Νο. : 1进行序列比对而确定的， 任选其中在对应 于 T81的位置上的修饰是用 I置换 Τ， 在对应于 Ρ275的位置上的修饰是用 S置换 Ρ， 以及在对应于 Α358的位置上的修饰是用 V置换 Α。在一个优选的实施方案中， 本发明 的大肠杆菌中所含有的突变的 IpdA基因的表达增强，和 /或所述突变的 IpdA基因所编码 的蛋白质的活性增强。

术语"突变"具有本领域内常用的含义， 是指在核苷酸序列中插入、 添加、 缺失、 或 者取代一或多个核苷酸， 或者是指在多肽序列中插入、 添加、 缺失、 或者取代一或多个 氨基酸。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 IpdA 基因， 并且所述突变的

IpdA基因位于质粒中或者染色体中。 在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 IpdA 基因， 并且所述突变的 基因位于染色体中。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 IpdA 基因， 并且所述突变的 基因位于质粒中。

如本文所用， 术语"质粒"具有本领域熟知的定义， 其是以附加体形式存在于细胞中 的非染色体 DNA并且能够自主复制的 DNA分子。 本发明中可以使用的质粒例如有： pEASY-Blunt、 pACYC184、 pTrc99A、 pTrc99A-M、 pTrc99A-M-Kan pKD4禾 P pKD46 等。

如本文所用， 术语"染色体 "具有本领域熟知的定义。 在一些实施方案中， 本发明所 涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰 的基因整合至染色体的技术是本领域技术 人员熟知的，例如可以参见 Michael R. Green和 Joseph Sambrook的" Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition)。

IpdA 基因 (Genbank No: ACA79157.1)是编码硫辛酰胺脱氢酶 (EC No: 1.8.1.4)的基 因。 在本发明的一个实施方案中， 所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型 IpdA基因的 核苷酸序列如 SEQ ID No. :2所示， 其所编码的多肽的氨基酸序列如 SEQ ID No.: l所示， 而本发明的大肠杆菌中所引入的突变的 IpdA基因则含有如下的一或多种突变： C242T、 C823T、 和 C1073T; 而所述突变的 ^dA基因所编码的多肽具有如下的一或多种氨基 酸 置换： T81I、 P275S、 和 A358V (参见图 8)。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 IpdA 基因， 其所编码的多肽 在对应于 SEQ ID No. : l所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位� �上含有修饰： T81、 P275和 A358, 对应的位置是通过与 SEQ ID No. : l进行序列比对而确定的， 任选其中在 对应于 T81的位置上的修饰是用 I置换 T，在对应于 Ρ275的位置上的修饰是用 S置换 Ρ， 以及在对应于 Α358的位置上的修饰是用 V置换 Α。 在一个优选的实施方案中， 本发明 的大肠杆菌中所含有的突变的 IpdA基因的表达增强，和 /或所述突变的 IpdA基因所编码 的蛋白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 基因， 所述突变的 基因在对应于 SEQ ID Να :2所示核苷酸序列的如下位置的一个或多个位� ��上含有突变： C242、 C823和 C1073 , 对应的位置是通过与 SEQ ID No.:2进行序列比对而确定的， 任 选其中所述突变均是用 T置换 C。在一个优选的实施方案中， 本发明的大肠杆菌中所含 有的突变的 IpdA基因的表达增强，和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋白质的活性增 强。

本领域技术人员会意识到不同大肠杆菌菌株的 ^dA基因序列可能与 SEQ ID No. :2 所示 IpdA基因序列不完全等同， 以及不同大肠杆菌菌株的 IpdA基因所编码的多肽序列 可能与 SEQ ID Να: 1所示的多肽序列不完全等同。 在本发明的某些实施方案中， 所述 突变的 基因中的突变位于对应于 SEQ ID No. :2的第 C242位、 第 823位、 和 /或第 1073位的位置上。 在本发明的某些实施方案中， 所述突变的 基因所编码的多肽中 的置换位于对应于 SEQ ID No.: l的第 81位、 第 275位、 和 /或第 358位的位置上。 在本发明中， "对应于" SEQ ID No. : l或 SEQ ID No. :2中某一特定位置的位置可以 通过序列比对而确定，包括如使用人工排列对 比及通过使用众多可利用的排列对比程序 (例如 BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。 通过对比多肽或核苷酸序列， 本 领域技术人员可以在适当的位置引入相应的突 变， 从而实现本发明的技术效果。 另外， 本领域技术人员也可以使用保守和类似的氨基 酸残基来置换相应位置上的氨基酸残基， 或者在 基因序列中引入同义突变， 而实现本发明的技术效果。

在一个实施方案中，本发明涉及一种重组大肠 杆菌，其中所述大肠杆菌中 基因 和 tktA基因的表达增强、 或者 sthA基因和 tktA基因所编码的蛋白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠 杆菌中含有如下 遗传修饰： （a)磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因表达增强、 和 /或磷酸戊糖途径 (PPP) 中所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强； （b) W/^基因的表达增强、和 /或 基因 所编码的蛋白质的活性增； 和 (c) 突变的 基因， 其所编码的多肽在对应于 SEQ ID No. : l所示氨基酸序列的如下位置的一个或多个位� �上含有修饰： T81、 Ρ275和 Α358， 对应的位置是通过与 SEQ ID No.: l进行序列比对而确定的， 任选其中在对应于 T81的 位置上的修饰是用 I置换 T，在对应于 Ρ275的位置上的修饰是用 S置换 Ρ， 以及在对应 于 Α358的位置上的修饰是用 V置换 Α。在一个优选的实施方案中， 本发明的大肠杆菌 中所含有的突变的 IpdA基因的表达增强，和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋白质的 活性增强。

在另一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中含有突变的 IpdA 基因， 其所编码的多 肽在对应于 SEQ ID No.: l所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修饰� � T81、 Ρ275和 Α358, 对应的位置是通过与 SEQ ID No.: l进行序列比对而确定的， 任选其中在对应于 T81的位置上的修饰是用 I置换 T， 在对应于 Ρ275的位置上的修饰是用 S置换 Ρ， 以及 在对应于 Α358的位置上的修饰是用 V置换 Α。 在一个优选的实施方案中， 本发明的大 肠杆菌中所含有的突变的 IpdA基因的表达增强，和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋 白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中所含有的突变的 ^dA基因在对应于 SEQ ID No. :2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突变� �� C242、 C823和 C1073 , 对应的 位置是通过与 SEQ ID No. :2进行序列比对而确定的，任选其中所述突变� ��是用 T置换 C。 在一个优选的实施方案中， 本发明的大肠杆菌中所含有的突变的 IpdA基因的表达增强， 和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠 杆菌中含有如下 遗修饰： （a)磷酸戊糖途径 (PPP)中所涉及的基因表达增强、 和 /或磷酸戊糖途径 (PPP)中 所涉及的基因所编码的蛋白质的活性增强； （b) W/^基因的表达增强、和 /或 基因所 编码的蛋白质的活性增强； 和 (c) 突变的 基因， 其所编码的多肽在对应于 SEQ ID No. : l所示氨基酸序列如下位置的位置上含有修饰� � T81、 Ρ275和 Α358， 对应的位置是 通过与 SEQ ID No.: l进行序列比对而确定的， 任选其中在对应于 T81的位置上的修饰 是用 I置换 T， 在对应于 Ρ275的位置上的修饰是用 S置换 Ρ， 以及在对应于 Α358的位 置上的修饰是用 V置换 Α。 在一个优选的实施方案中， 本发明的大肠杆菌中所含有的 突变的 IpdA基因的表达增强， 和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明涉及一种重组大肠杆菌，其中所述大肠 杆菌中含有如下 修饰： （a) 基因的表达增强、和 /或 基因所编码的蛋白质的活性增强， （b) W/^基 因的表达增强、 和 /或^^基因所编码的蛋白质的活性增强， 和 (c) 突变的 基因， 其在对应于 SEQ ID No. :2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突变� �� C242、 C823和 C1073 , 对应的位置是通过与 SEQ ID No. :2进行序列比对而确定的， 任选其中所述突变 均是用 T置换 C。在一个优选的实施方案中，本发明的大肠� �菌中所含有的突变的 ^dA 基因的表达增强， 和 /或所述突变的 IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种 修饰： （1)磷酸 烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)所涉及的基因表达的抑制、和 /或磷酸烯醇式丙酮 酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制� �� （2) pflB和 /或 adhE基因表达的抑制、和 /或 pflB或 adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制； （3) IdhA基 因表达的抑制、 和 /或 /^¾4基因所编码的蛋白质活性的抑制； （4) g _a ff基因和 /或外源 g// 基因表达的增强、和 /或^ 基因或外源 g//基因所编码的蛋白质活性的增强； 和 (9)pd: 基因表达的增强、 和 /或^^基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)所涉及的基因表达的抑制、 和 /或磷酸烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶系统 (PTS)中所 涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制， 其中所述基因是选自如下的一或多种基因： 编 码 PTS系统酶 I的基因 ptsl、编码 PTS系统酶 Hpr的基因 ptsH、编码 PTS系统酶 ΠΑ ^ε 的基因 CJT和编码 PTS系统酶 IICB^的基因 ptsG。

在本发明中， pte/基因 (GenBank No: ACA76928. K NC_010468.1)编码磷酸烯醇式 丙酮酸-糖磷酸转移酶 I(EC No: 2.7.3.9)。 pteH基因 (GenBank No: ACA76929.1)编码磷酸 烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶 Hpr (EC No: 2.7.1.69)。 err基因 (GenBank No: ACA76927.1) 编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶 ΠΑ ^ε (EC No: 2.7.1.69)。 ptsG基因 (GenBank No: ACA78131.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶 IICB^ (EC No: 2.7.1.69)。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种 修饰： W ptsl 基因表达的抑制、 和 /或 pto/基因所编码的蛋白质的活性抑制； （2) pflB和 /或 adhE基因 表达的抑制、和 /或 pflB和 /或 adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制； （3) IdhA基因表达 的抑制、和 /或 /^¾4基因所编码的蛋白质活性的抑制；（4) g _a ff基因和 /或外源 g//基因表 达的增强、 和 /或 gaff基因和 /或外源 g//基因所编码的蛋白质活性的增强； 和 (9) p 基 因表达的增强、 和 /或^^基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种 修饰： W ptsl 基因表达的抑制、 和 /或 pto/基因所编码的蛋白质的活性抑制； （2) pflB和 /或 adhE基因 表达的抑制、和 /或 pflB和 /或 adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制； （3) IdhA基因表达 的抑制、 和 /或 /^¾4基因所编码的蛋白质活性的抑制； （4) g _a ff基因表达的增强、 和 /或 ^ff基因所编码的蛋白质活性的增强； 和 (9) 基因表达的增强、 和 /或 基因所编 码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种 修饰： W ptsl 基因表达的抑制、和 /或/^ /基因所编码的蛋白质的活性抑制； （2 基因表达的抑制、 和 /或 pflB所编码的蛋白质活性的抑制； OWhA基因表达的抑制、 和 /或 !dhA基因所编 码的蛋白质活性的抑制； （4)g _a ff基因表达的增强、和 /或^ 基因所编码的蛋白质活性 的增强； 和 (9 d:基因表达的增强、 和 /或^^基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有选自如下修饰： （l) pto/基因表达的 抑制、 和 /或/^ /基因所编码的蛋白质的活性抑制； 基因表达的抑制、 和 /或 所编码的蛋白质活性的抑制； （3)/ί¾4基因表达的抑制、和 /或 /^¾4基因所编码的蛋白质 活性的抑制； （4)g _a ff基因表达的增强、和 /或^ 基因所编码的蛋白质活性的增强； 和 (9 d:基因表达的增强、 和 /或^^基因所编码的蛋白质活性的增强。

在本发明中， 基因 (GenBank No: ACA78322.1)编码丙酮酸甲酸裂解酶 (Pyruvate formate lyase)(EC No. 2.3.1.54)。 基因 (； Genbank No: ACA78022.1)编码乙醇 /乙醛脱 氢酶 (Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase)(EC No: 1.1.1.1, EC No: 1.2.1.10)。 /ύ¾4基因 (GenBank No: ACA77176.1)编码乳酸脱氢酶 A (lactate dehydrogenase A)(EC No: 1.1.1.28)。 galP基因 (GenBank No: ACA76443.1)编码半乳糖 MFS转运蛋白。 g//基因 (GenBank No: AAA27691.1) 编码葡萄糖转运蛋白 Glf(glucose facilitator protein)。 pck基 因 (GenBank No: ACA75988.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,又称 作 PCK酶 (EC No: 4.1.1.49)。

如本文所用， 术语"基因表达的抑制"具有本领域内熟知的含� ��， 是指基因表达强度 的降低， 从而导致基因转录后产生的 mRNA数量的减少。 基因表达的抑制可以通过如 下方式实现， 例如但不限于： 基因的敲除、 减少基因的拷贝数、 改变基因的启动子 (例 如使用弱启动子)等。如本文所用， 术语"基因所编码的蛋白质的活性抑制"具有本� ��域内 熟知的含义， 是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的降低。 其可以例如通过基因表达强 度的降低、 基因中核苷酸的插入或缺失、 氨基酸位点的突变来实现。 实现"基因表达的 抑制"以及"基因所编码的蛋白质的活性抑制"的 各种技术手段是本领域技术人员熟知 的。

在另一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有如下修饰： （l) pto/基因表达的抑 制、 和 /或 ptsl基因所编码的蛋白质的活性抑制； 2、pflB基因表达的抑制、 和 /或 pflB所 编码的蛋白质活性的抑制； （3)/ί¾4基因表达的抑制、和 /或 /^¾4基因所编码的蛋白质活 性的抑制； （4)g _a ff基因表达的增强、 和 /或^ 基因所编码的蛋白质活性的增强。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰： （5)acM和 pto基因表 达的抑制、 和 /或 ackA和 pta基因所编码的蛋白质活性的抑制； ( aceBA基因簇表达的 增强、 和 /或 ace ^基因簇所编码的蛋白质活性的增强； （7 fc _M C基因表达的增强、 和 / 或 dc C基因簇所编码的蛋白质活性的增强； 和 (8 ^&4基因表达的抑制、 和 /或 m _gS A 基因所编码的蛋白质活性的抑制。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有 如下的修饰：（9) 基因表达的增强、 和 /或 pck基因所编码的蛋白质的活性增强。 在另一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌 中的 基因被敲除。

pta基因 (GenBank No: ACA77021.1)编码磷酸乙酰转移酶 (EC No: 2.3.1.8), 而 cickA 基因 (GenBank No: ACA77022.1)编码乙酸激酶 (EC No: 2.7.2.1)。 aceBA基因簇包括 aceB 基因（GenBank No: ACA79615.1)编码苹果酸合成酶 (EC No: 2.3.3.9)禾 P aceA 基因 (GenBank No: ACA79614.1)编码异柠檬酸裂解酶 (EC No: 4.1.3.1)。 基因 (GenBank

No: ACA78647.1) 编码 C4二羧酸转运蛋白 DcuC。 g¾4基因 (GenBank No: ACA78263.1) 编码甲基乙二醛合成酶 (EC No: 4.2.3.3)。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有 如下修饰：（IO ^ :基因表达的抑制、 和 /或 adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制； 和 (l l)tofc£>£基因簇表达的抑制、 和 /或 tdcDE基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。

基因簇包括 tifcD基因 (GenBank No:ACA76259.1)和 tifc£基因 (GenBank No: ACA76260.1 ), 其中 tifcD基因编码丙酸激酶 （EC No: 2.7.2.15 ), 而 ^<?£基因编码 2- 酮基丁酸甲酸裂解酶 /丙酸甲酸裂解酶 （EC No: 2.3.1.54)。 adhE基因 （GenBank No: ACA78022.1 ) 编码乙醇 /乙醛脱氢酶 （EC No: 1.1.1.1/EC No: 1.2.1.10)。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰 ： （12) _aCeJ EF基 因簇表达的增强、和 /或 基因簇所编码的蛋白质活性的增强;（13 fc ^基因表达的 增强、和 /或 dcuB基因所编码的蛋白质活性的增强； (\4)mdh基因表达的增强、和 /或 mdh 基因所编码的蛋白质活性的增强；（15y _M ^基因表达的增强、 和 /或/ 基因所编码的 蛋白质活性的增强；（16y _M 基因表达的增强、 和 /或/ 基因所编码的蛋白质活性的 增强； 和 (17)^¾ 0)基因簇表达的增强、和 /或 frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的 增强。

基因簇编码丙酮酸复合体 El/E2(EC No: 1.2.4.1)，包括 基因 (GenBank No: ACA79159.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体 El和 aceF基因 (GenBank No: ACA79158.1)编码 丙酮酸脱氢酶复合体 E2。 dcuB基因 (GenBank No: ACA79506.1) 编码厌氧 C4二羧酸转 运蛋白 0^8。^^基因(0608&01^ ^^0: 。 76147.1)编码苹果酸脱氢酶(£。^^0： 1.1.1.37)。 fumA基因 (GenBank No: ACA77662.1) 编码好氧富马酸酶 I(EC No: 4.2.1.2)。 fumB基因 (GenBank No: ACA79507.1)编码厌氧富马酸酶 I (EC No: 4.2 Λ .2) frdABCD基因簇编码 富马酸还原酶 (EC No: 1.3.5.4),包括 6¾基因 (GenBank No: ACA79460.1)编码富马酸还 原酶黄素蛋白亚基、 frdB基因 (GenBank No: ACA79461.1)编码富马酸还原酶铁硫蛋白亚 基、 frdC基因 (GenBank No: ACA79462.1)编码富马酸还原酶 C 亚基、 禾 P frdD 基因 (GenBank No: ACA79463.1)编码富马酸还原酶 D亚基。 在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌是以保藏号 CGMCC 7260 (2013年 2月 25 日， 分类命名： 大肠埃希氏菌 E. coli)保藏于 CGMCC (北京市朝阳区北辰西路 1号院 3 号， 中科院微生物所)的菌株。

在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌是以保藏号 CGMCC 7259 (2013年 2月 25 日， 分类命名： 大肠埃希氏菌 E. coli)保藏于 CGMCC (北京市朝阳区北辰西路 1号院 3 号， 中科院微生物所)的菌株。

在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌是以保 藏号 CGMCC 7550 (2013年 5月 3日， 分类命名：大肠埃希氏菌 E. coli)保藏于 CGMCC (北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号， 中科院微生物所)的菌株。

在第二方面， 本发明提供了一种生产丁二酸的方法，其中包 括培养本发明的大肠杆 菌的步骤。

在一个实施方案中， 本发明生产丁二酸的方法包括培养本发明的大 肠杆菌， 以及任 选的收集或者纯化丁二酸。

在一个实施方案中， 本发明所述的"培养"包括种子培养和发酵培养� ��

如本文所用， 术语"种子培养"是指将用于发酵的菌种在固体� ��养基上活化后， 再经 过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量 和质量的纯种的过程。

如本文所用， 术语"发酵培养"是指利用微生物菌种， 在适宜的条件下， 将培养基组 分经过特定的代谢途径转化为某些特定产物的 过程。

在一个实施方案中， 本发明的方法中包括将本发明的大肠杆菌厌氧 发酵。

如本文所用， 术语"厌氧发酵"是指利用厌氧发酵菌株， 在隔绝空气的条件下， 经特 定代谢途径将培养基组分转化为某些特定产物 的过程。

在一个实施方案中， 本发明的方法中的培养过程不进行任何通气步 骤。

在一个实施方案中， 本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下 步骤：

(1)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基 ， 在适宜大肠杆菌生长的条件下培 养一段时间得到种子液；

(2)将种子液接种于发酵培养基， 在厌氧条件下培养。

本发明的方法中可以使用本领域中常规用于培 养大肠杆菌的各种培养条件，例如培 养基、 培养温度、 培养时间和是否摇动以及摇动速度等。本领域 技术人员根据需要可以 选择适当的培养条件。本发明的方法中所使用 的培养条件以及发酵条件是本领域技术人 员熟知的 (诸葛健等， 1994， 工业微生物实验技术手册， 中国轻工业出版社；)。

在一个实施方案中， 本发明的培养条件包括但不限于： 温度为 30-45 °C， 例如 30-31 °C 31-32°C 32-33 °C 33-34°C 34-35 °C 35-36 °C 36-37 °C 37-38 °C 38-39 °C、 39-40°C、 40-41 °C、 41-42 °C 42-43 °C、 43-44°C、 或 44-45 °C。

在一个实施方案中， 本发明的培养条件包括但不限于： 种子培养的时间为 6-16小 时， 例如 6-7小时、 7-8小时、 8-9小时、 9-10小时、 10-11小时、 11-12小时、 12-13小 时、 13-14小时、 14-15小时、 或 15-16小时。 在一个实施方案中， 本发明的培养条件包括但不限于： 发酵培养的时间为 2-5天， 例如 2天、 3天、 4天、 或 5天。

在一个实施方案中， 本发明的培养条件包括但不限于： 将本发明的重组大肠杆菌按 照 0.1-10 % (VA 的接种量接种于种子培养基， 例如 0.1%、 0.5%、 1%、 2.5%、 5%、 或 10

在一实施方案中， 本发明的培养条件包括但不限于： 将种子液按照终浓度 OD ₅₅ Q=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基， 例如 OD ₅₅ Q为 0.05-0.1、 0.1-0.2、 0.2-0.3、 0.3-0.4或 0.4-0.5。

在一实施方案中， 可以使用常用于大肠杆菌的培养基。用于本发 明的大肠杆菌的培 养基可以包括合适的氮源， 例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混 合物。在一实 施方案中， 所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、 花生饼粉、 牛肉膏、 鱼粉、 酵母膏、 蛋白胨、 玉米浆中的一种或任意几种的混合物， 所述无机含氮化合物选自硝酸盐 (如硝 酸钠、 硝酸钾、 硝酸钙)， 铵盐 (如磷酸铵、 硫酸铵、 硝酸铵、 氯化铵)中的一种或任意几 种的混合物。 在一实施方案中， 用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适 的碳源， 例如选自葡萄糖、 淀粉、 淀粉水解糖、 果糖、 糊精、 乳糖、 半乳糖、 木糖、 蔗糖、 甘油、 麦芽糖、 脂肪酸、 乙酸、 丙酮酸、 和富马酸中的一种或任意几种的混合物。

在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的 种子培养基和发酵培养基由以下成分 组成 (溶剂为水)：

大量元素：葡萄糖、 KH ₂ P0 ₄ 、 K ₂ HP0 ₄ 、 ( H ₄ ) ₂ HP0 ₄ MgS0 ₄ -7H ₂ 0 和甜菜碱 -KC1; 微量元素： FeCl ₃ '6H ₂ 0、 CoCl ₂ '6H ₂ 0、 CuCl ₂ '2H ₂ 0、 ZnCl ₂ 、 Na ₂ Mo0 ₄ '2H ₂ 0、

MnCl ₂ -4H ₂ 0 ₂ 和 H ₃ B0 ₃ 。

在一个实施方案中， 本发明的培养基由以下成分组成 (溶剂为水)：

大量元素：葡萄糖 20-120 g/L, KH ₂ P0 ₄ 2-5 g/L、K ₂ HP0 ₄ 4-8 g/L、( H ₄ ) ₂ HP0 ₄ 3-5 g/L、 MgS0 ₄ ·7Η ₂ 0 0.1-0.3g/L、 以及甜菜碱 -KC1 0.1-1 g/L;

微量元素： FeCl ₃ -6H ₂ 0 1-5 μgfL, CoCl ₂ -6H ₂ 0 0.05-1 μgfL, CuCl ₂ -2H ₂ 0 0.05-1 μgfL,

ZnCl ₂ 0.05-1 g/L、 Na ₂ Mo0 ₄ -2H ₂ 0 0.05-1 g/L、 MnCl ₂ -4H ₂ 0 ₂ 0.1-1 g/L, H ₃ B0 ₃ 0.01-0.5 在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的 种子培养基和发酵培养基由以下成分 组成 (溶剂为水)：

大量元素： 葡萄糖、 H ₄ H ₂ P0 ₄ 、 ( H ₄ ) ₂ HP0 ₄ MgS0 ₄ -7H ₂ 0 和甜菜碱 -KC1; 微量元素： FeCl ₃ '6H ₂ 0、 CoCl ₂ '6H ₂ 0、 CuCl ₂ '2H ₂ 0、 ZnCl ₂ 、 Na ₂ Mo0 ₄ '2H ₂ 0、 MnCl ₂ -4H ₂ 0 ₂ 和 H ₃ B0 ₃ 。

在一个实施方案中， 本发明的培养基由以下成分组成 (溶剂为水)：

大量元素： 葡萄糖 20-120 g/L , H ₄ H ₂ P0 ₄ 0.5-1.5 g/L、 (NH ₄ ) ₂ HP0 ₄ 2-5 g/L、 MgSO ₄ -7H ₂ O 0.1-0.3g/L 以及甜菜碱 -KC1 0.1-1 g/L;

微量元素： FeCl ₃ -6H ₂ 0 1-5 μgfL, CoCl ₂ -6H ₂ 0 0.05-1 μgfL, CuCl ₂ -2H ₂ 0 0.05-1 μgfL, ZnCl ₂ 0.05-1 g/L、 Na ₂ Mo0 ₄ -2H ₂ 0 0.05-1 g/L、 MnCl ₂ -4H ₂ 0 ₂ 0.1-1 g/L, H ₃ B0 ₃ 0.01-0.5 在一个实施方案中， 本发明中对大肠杆菌进行培养的具体方法如下 ：

将菌株厌氧发酵， 包括以下步骤：

(1)种子培养： 将 1/3-1/2体积的种子培养基置于三角瓶中， 高温高压灭菌。 冷却后 将本发明的重组大肠杆菌按照 0.1-10 % (V/V)的接种量接种于种子培养基， 在 TTC以及 摇动的条件下培养 6-16小时得到种子液， 用于发酵培养基接种；

(2)发酵培养： 将 1/3-1/2体积的发酵培养基体积置于厌氧发酵罐� �， 将种子液按照 终浓度 OD ₅₅₍₎ =0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基， 37°C培养 2-5天， 得到发酵液。

在一个实施方案中， 本发明生产丁二酸的方法中还包括从发酵液中 提取和 /或纯化 丁二酸的步骤。

在第三方面， 本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中 的用途。 实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实 施例或其组合不应当理解为对本发明 的范围或实施方式的限制。 本发明的范围由所附权利要求书限定， 结合本说明书和本领 域一般常识， 本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求 书所限定的范围。 在不偏离 本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人 员可以对本发明的技术方案进行任何修改 或改变， 这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。 下述实施例中所用 的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。

本发明具体包括如下实施例： 实施例 1 : 重组大肠杆菌 NZ-037的构建

重组大肠杆菌 NZ-037的构建 (表 1)， 分为以下八个步骤：

(1)乳酸脱氢酶基因 IdhA的敲除

(1-1)： 首先构建质粒 pXZ-CS， 用于基因敲除、 基因表达调控和外源基因整合。 质粒构建操作步骤共四步：

第一步， 以 pACYC184质粒 DNA (Mok et al.， 1991, Nucleic Acids Res 19:2321-2323) 为模板， 使用引物 184-cat-up (SEQ ID No.:7)和 184-cat-down(SEQ ID No. :8), 扩增得到 氯霉素抗性基因， 基因片段大小为 994 bp， 包含有氯霉素基因启动子序列， 称为片段 I。

扩增体系为： NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液 10 μ1、 dNTP (每种 dNTP各 10 ηιΜ)1μΚ DNA模板 20 ng、 引物（10 μΜ)各 2 μ1、 Phusion High-Fidelity DNA聚合酶 （2.5 υ/μ1) 0.5 μ1、 蒸熘水 33.5 μ1， 总体积为 50 μ1。

扩增条件为 98°C预变性 2分钟 (1个循环；)； 98°C变性 10秒、 56°C退火 10秒、 72°C 延伸 30秒 (30个循环)； 72°C延伸 5分钟 (1个循环)。 第二步，以芽孢杆菌 BacUhis subtilis sp subtilis 168 的染色体 DNA (该菌购自中国普 通微生物菌种保藏中心， CGMCC No. 1.1390)为模板，使用引物 Bs-sacB-upCSEQ ID No. :9) 和 Bs-sacB-down(SEQ ID No. : 10)进行 PCR扩增果聚糖蔗糖转移酶基因 (^ααβ),基因片段 大小为 1618 bp， 含有 基因启动子序列， 称为片段 II。 扩增体系和扩增条件参见上 文第一步。

第三步， 将第一步得到的片段 I和第二步得到的片段 II分别用限制性内切酶 Sacl (NEB公司） 在 37°C酶切 30分钟； PCR纯化试剂盒清洗 (Gel/PCR Extration Kit, 购自 BioMIGA生物技术有限公司）； 各取 20 ng片段 I和片段 II， 加入 1 μΐ 10XT4连接缓冲 液NEB公司）、 1 μΐ T4-DNA连接酶 （ ΕΒ公司）， 补充蒸熘水至 10 μ1， 25 °C反应 5分 钟； 以酶连片段为底物， 取 1 μ1， 用引物 184-cat-up和 Bs-sacB-down进行 PCR扩增， 扩增体系和扩增条件参见上文第一步， 得到含有 cat-sacB的连接片段 III。

第四步，将 PCR获得的片段 III取 1 μ1，加入 1 μΐ pEASY-blunt simple载体 (；试剂盒， 北京全式金生物技术有限公司）， 25 °C反应 15分钟； 氯化钙转化法： 加入 50μ1 TranslO 感受态细胞 (购自北京全式金生物技术有限公司)中进行，� ��浴 30分钟。 42°C热激 30秒， 立即置于冰上 2分钟。 加入 250 μΐ LB培养基， 200 rpm, 37°C孵育 1小时。 取 200 μΐ 菌液涂在含有氨苄霉素 (终浓度为 100 g/ml)和氯霉素 (终浓度为 34 g/ml)的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5 个阳性单菌落， 进行菌落 PCR 验证， 引物为 M13-F(SEQ ID No. : l l)/M13-R(SEQ ID No. : 12)。 送样测序分析， 结果正确的为阳性克隆， 得到质粒 pXZ-CS (表 3)。

(1-2)： 从大肠杆菌 ATCC 8739 (Gunsalus et al., 1941, J Biol Chem 141 :853-858)出发， 采用两步同源重组的方法敲除 WW基因，获得重组大肠杆菌 Suc-T102，包括以下六步： 第一步，以大肠杆菌 ATCC 8739基因组 DNA为模板，使用引物 XZ-ldhA-up (SEQ ID No. : 13和 XZ-ldhA-down (SEQ ID No. : 14)进行 PCR扩增， PCR产物为 1753 bp, 该 PCR 产物包含大肠杆菌 ATCC 8739的乳酸脱氢酶编码基因 IdhA (GenBank No: ACA77176.1) 及其上下游各大约 400个碱基。 扩增体系和扩增条件参考实施例上文 α二！)中的第一步。

将扩增得到的 1753 bp PCR产物克隆到 pEASY-Blunt克隆载体 (购自北京全式金生物 技术有限公司)上。克隆体系及氯化钙转化法� �见上文 (1二！)中质粒 pXZ-CS构建方法中的 第四步。取 200μ1菌液涂在含有卡那霉素 (终浓度为 15 g/ml)的 LB平板上，过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 进行菌落 PCR验证， 弓 I物为 M13-F/M13-R。 送样测序分析， 结 果正确的为阳性克隆， 将得到的重组质粒命名为 pXZ001。

第二步， 以 pXZOOl质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-ldhA-1 (SEQ ID No. : 15和 XZ-ldhA-2 (SEQ ID No. : 16)进行 PCR扩增， 得到 4758 bp的 PCR产物， 该 PCR产物包 含 pEASY-Blunt载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游各� �� 400个碱基。扩增体系和扩增条 件参考实施例上文 (1二！)中的第一步。

第三步， 将含有氯霉素基因 (cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因 Cra )DNA片段 cat-sacB 连接至第二步的 PCR扩增产物， 具体如下： 以 pXZ-CS为模板，使用引物 cat-sacB-up (SEQ ID No. : 17)和 cat-sacB-down (SEQ ID No. : 18)进行 PCR扩增， 得到 2618 bp的 PCR产物， 即为含有氯霉素基因 (cat)和果聚糖 蔗糖转移酶基因 ( c )的 DNA片段。

连接体系为： 10 ng的第二步 4758 bp的 PCR产物、 30ng的 cat-sacB DNA片段， 2μ1 10ΧΤ ₄ 连接缓冲液 (NEB公司）， Ι μΐ Τ4 连接酶 (NEB公司， 400,000 cohesive end units/ml), 补充蒸熘水至 20μ1。 室温连接 2小时。 取 10 ul用氯化钙转化法转入 TranslO, 过程参见 上文 α二！)中质粒 pXZ-CS构建方法中的第四步。取 200μ1菌液涂在含有氯霉素 (终浓度为 17ug/ml)的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 将阳性克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒 (将 cat-^ DNA片段克隆到 pXZOOl中的质粒)进行测序验证， 测序 结果在上述第二步的 PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段， 证明质粒构建正确， 将得到的重组质粒命名为 pXZ002C。

第四步， 以 pXZ002C质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-ldhA-up/ XZ-ldhA-down扩 增出 3447bp DNA片段 I。 扩增体系和扩增条件参见上文 (1二!)中质粒 pXZ-CS构建步骤 中的第一步。 DNA片段 I包含乳酸脱氢酶编码基因 上游约 400个碱基、 cat-^ DNA 片段、 乳酸脱氢酶编码基因 IdhA下游约 400个碱基。

将 DNA片段 I用于第一次同源重组：首先将 pKD46质粒 (Datsenko and Wanner 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645; 质粒购买于美国耶鲁大学 CGSC大肠杆菌保藏中 心)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌 ATCC8739,然后将 DNA片段 I电转至带有 pKD46 的大肠杆菌 ATCC8739。

电转条件为： 首先准备带有 pKD46质粒的大肠杆菌 ATCC8739的电转化感受态细 胞 (Dower et al.， 1988, Nucleic Acids Res 16:6127-6145)； 将 50μ1感受态细胞置于冰上， 加 入 50ng DNA 片段 I， 冰上放置 2 分钟， 转移至 0.2 cm 的 Bio-Rad 电击杯。 使用 MicroPulser(Bio-Rad公司）电穿孔仪， 电击参数为电压 2.5kv。 电击后迅速将 lml LB培 养基转移至电击杯中， 吹打 5次后转移至试管中， 75rpm， 30°C孵育 2小时。 取 200μ1 菌液涂在含有氯霉素 (终浓度为 17ug/ml)的 LB平板上， 37°C过夜培养后， 挑选 5个单菌 落进行 PCR验证， 使用引物 XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证， 挑选一个正确的单 菌落， 命名为 Suc-T101。

第五步， 将第二步得到的 4758bp的 PCR产物进行磷酸化处理， 自连得到的质粒用 于第二次同源重组；具体步骤如下：将第二步 的 4758bp的 PCR产物首先用 PCR纯化试 剂盒清洗 CGel/PCR Extration Kit, 购自 BioMIGA生物技术有限公司）； 取 30ng纯化后的 PCR扩增产物， 加入 2μ1 10XT4连接缓冲液 (NEB公司）、 Ι μΐ Τ4多核苷酸激酶 (ΝΕΒ公 司；)， 补充蒸熘水至 20μ1， 37°C反应 30分钟； 加入 Ι μΐ T4连接酶 (NEB公司， 400,000 粘 附末端单位 /ml)， 室温反应 2小时得到连接产物。 酶连产物取 lOul用氯化钙转化法转入 TranslO, 过程参见上文 α二！)中质粒 pXZ-CS构建步骤中的第四步。 取 200μ1菌液涂在含 有卡那霉素 (终浓度为 15ug/ml)的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 将阳 性克隆进行液体培养， 提取阳性克隆质粒进行测序验证， 测序结果上述第二步的 PCR 扩增产物进行了自连， 证明质粒构建正确， 得到质粒 pXZ003。

第六步， 以 pXZ003质粒 DNA为模板， 用引物 XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出 829bp DNA片段 II。 DNA片段 II用于第二次同源重组。 将 DNA片段 II电转至菌株 Suc-T101 o

电转条件为：首先准备带有 pKD46质粒的 Suc-TlOl的电转化感受态细胞 (制备方法 参见 Dower et al.， 1988)； 将 50μ1感受态细胞置于冰上， 加入 50ng DNA片段 II， 冰上放 置 2分钟， 转移至 0.2 cm的 Bio-Rad电击杯。使用 MicroPulser (； Bio-Rad公司;)电穿孔仪， 电击参数为电压 2.5kv。 电击后迅速将 1ml LB培养基转移至电击杯中， 吹打 5次后转移 至试管中， 75转， 30°C孵育 4小时， 去除 pKD46质粒。 将菌液转移至含有 10%蔗糖的 没有氯化钠的 LB液体培养基 (250ml烧瓶中装 50ml培养基)， 培养 24小时后在含有 6% 蔗糖的没有氯化钠的 LB 固体培养基上划线培养。 经过 PCR 验证， 所用引物为 XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down, 正确的菌落扩增产物为 763bp的片段， 挑选一个正确的单 菌落， 将其命名为 Suc-T102(表 1)。

敲除 IdhA基因所构建的质粒见表 3， 使用的引物序列见表 2。

(2)丙酮酸甲酸裂解酶编码基因 pflB的敲除

从重组大肠杆菌 SUC-T102 出发， 使用上文 (1)部分中相同的方法敲除 pflB基因 (GenBank No: ACA78322.1), 获得重组大肠杆菌 Suc-T104。 构建的质粒见表 3， 使用的 引物序列见表 2， 其中引物的命名对应于敲除 IdhA基因过程中所使用的引物的名称， 仅将 ldhA替换为 pflB。

(3)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶 I基因 ptsl的敲除

从重组大肠杆菌 SUC-T104 出发， 使用上文 (1)部分中相同的方法敲除 pte/基因 (GenBank No: ACA76928.1), 获得重组大肠杆菌 Suc-T106。 构建的质粒见表 3， 使用的 引物序列见表 2， 其中引物的命名对应于敲除 IdhA基因过程中所使用的引物的名称， 仅将 ldhA替换为 ptsl。

(4)半乳糖 MFS转运蛋白 GalP的激活

从重组大肠杆菌 Suc-T106出发， 将 galP基因 (GenBank No: ACA76443.1)的原始调 控元件替换为调控元件 ^^*(SEQ ID No. l08)， 获得重组大肠杆菌 Suc-T108。在本发明 中， ^ *代表大肠杆菌 启动子突变体， 也即在相对于 ATG起始处的 -64位处 G变 为 A(Zhang et al., 2009b, Appl Environ Microbiol 75:7807-7813

包括以下六步：

第一步， 以大肠杆菌 ATCC 8739基因组 DNA为模板，使用引物 XZ-galP-P-up (SEQ ID No. :27)和 XZ-galP-P-down (SEQ ID No. :28)进行 PCR扩增，得到 841 bp扩增产物，为 大肠杆菌 ATCC 8739的半乳糖转运蛋白编码基因 galP调控元件以及其上下游各约 400 个碱基。将扩增产物克隆到 pEASY-Blunt克隆载体上。提取阳性克隆质粒进行� ��序验证， 测序结果表明在载体 pEASY-Blunt上插入了敲除半乳糖转运蛋白编码基� �� galP调控元 件及其上下游各 400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的 重组质粒命名为 pXZOl l。 第二步， 以 pXZOl l质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-galP-P-1 (SEQ ID No. :29和 XZ-galP-P-2(SEQ ID No. :30)进行 PCR扩增， 得到 4614 bp扩增产物， 其扩增产物包含 pEASY-Blunt载体和半乳糖转运蛋白编码基因 galP调控元件及上下游各约 400个碱基。

第三步， 以 pXZ-CS质粒为模板， 使用引物 cat-sacB-up/cat-sacB-down进行 PCR扩 ±曾，得到 2618 bp的 PCR产物，即为含有氯霉素基因 和果聚糖蔗糖转移酶基因 的 DNA片段。

将含有氯霉素基因 (cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因 C^ _CJ B)DNA 片段连接至第二步的 4614 bp PCR扩增产物。 转化 Transl-Tl感受态细胞。 取 200μ1菌液涂在含有氯霉素 (终 浓度为 17 μ _§ /ιη1)的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 将阳性克隆进行液 体培养， 提取阳性克隆质粒 (将 cat-sacB DNA片段克隆到 ρΧΖΟΙΟ中的质粒)进行测序验 证， 测序结果在上述第二步的 PCR扩增产物上连接了 cat- DNA片段， 证明质粒构 建正确， 将得到的重组质粒命名为 pXZ012C。

第四步， 以 pXZ012C质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down 进行 PCR扩增， 得到 3303bp DNA片段 I； 该 DNA片段 I包含半乳糖转运蛋白编码基 因 galP调控元件上游约 400个碱基、 cat-sacB DNA片段、半乳糖转运蛋白编码基因 galP 调控元件下约 400个碱基。

将 DNA片段 I用于第一次同源重组。首先将 pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至 菌株 Suc-T106， 然后将 DNA片段 I电转至带有 pKD46的菌株 Suc-T106。

电转条件参见上文 (1二2}中 基因敲除的第四步。取 200 μΐ菌液涂在含有氯霉素 (终 浓度为 17ug/ml)的 LB平板上， 37°C过夜培养后， 挑选 5个单菌落进行 PCR验证， 使用 引物为 XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down， 得到验证正确的单菌落， 将其命名为 Suc-T107。

第五步，以大肠杆菌 ATCC 8739基因组 DNA为模板，使用引物 P-pck*-up-SpeI (SEQ ID No. :31)和 P-pck*-down-KpnI (SEQ ID No. :32)扩增大肠杆菌 ATCC 8739的磷酸烯醇式 丙酮酸羧化激酶 PCK的调控元件 pck， 引物序列见表 2。 PCR产物进行 购自 EB 公司)和 Μ (购自 ΕΒ公司)酶切。 将其克隆到经过相同酶酶切的质粒 pTrc99A(Amann et al., 1998, Gene 69:301-15)表达载体上， 命名为质粒 pXZ602。 以质粒 pXZ602为模板， 使用引物 pck*-F (SEQ ID No. :33)和 pck*-R (SEQ ID No. :34)进行扩增， 引物序列为见表 2。扩增产物经过 T4多核苷酸激酶 (购自 EB公司)磷酸化， 自连得到阳性质粒， 测序验 证无误后， 命名为 pXZ603。

以 pXZ603为模板， 使用引物 P-pck*-up-SpeI和 P-pck*-down-KpnI进行 PCR扩增， 得到 378 bp磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 PCK的突变调控元件 Ppck , 与第二步得到的 4614 bp扩增产物连接， 得到质粒 pXZ013。

用 XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down引物对以质粒 pXZ013为模板扩增出 DNA片段 II。 第六步， DNA片段 II用于第二次同源重组。 将 DNA片段 II电转至 Suc-T107。 电 转条件参见上文 (1-2)中 IdhA 基 因敲除步骤 中 的第六步 。 用 引 物 XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down进行 PCR以及测序验证， 得到 1051 bp为正确的单菌落， 将其命名为 Suc-T108(表 1)。

将半乳糖转运蛋白编码基因 galP调控元件置换成 ^ *所构建的质粒见表 3，使用 的引物序列见表 2。

(5)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 PCK的激活

从重组大肠杆菌 Suc-T108出发，将 基因 (GenBank No: ACA75988.1)的原始调控 元件替换为调控元件 cA:*， 获得重组大肠杆菌 Suc-Tl lO (表 1)。

具体如下：

第一步同源重组： 以 pXZ-CS为模板， 使用引物 pck-cat-sacB-up (SEQ ID No. :35;>和 pck-cat-sacB-down (SEQ ID No. :36)扩增 DNA片段 I， 用于第一次同源重组。引物序列见 表 2; 得到 2717bp DNA片段 I，将所得 DNA扩增片段 I电转至带有 pKD46质粒的重组 菌 Suc-T108， 筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落， 得到中间重组菌；

第二步同源重组： 以 pXZ603 质粒为模板， 使用引物 P-pck*- _U p-SpeI/ P-pck*-down-KpnI扩增 (；引物序列见表 2)， 得到 378bp人工调控元件 Ppck* ; 将 378bp 人工调控元件 ^ *电转入整合了片段 I的中间重组菌， 得到重组菌 1。 重组菌 1 PCR 验证的引物 pck-YZ-up (SEQ ID No. :37)和 pck-YZ-down (SEQ ID No. :38)， 得到 676 bp 且测序正确的单菌落， 将其命名为菌株 Suc-T110。

(6)磷酸乙酰转移酶基因 pto和乙酸激酶基因 cickA的敲除

从重组大肠杆菌 Suc-Tl lO出发， 使用上文 (1)部分中相同的方法敲除磷酸乙酰转移 酶编码基因 pto(GenBank No. ACA77021.1)和乙酸激酶编码基因 ac 4(GenBank No. ACA77022.1), 获得重组大肠杆菌 NZ-035(表 1)。 构建的质粒见表 3， 使用的引物序列 见表 2， 其中引物的命名对应于敲除 基因过程中所使用的引物的名称， 仅分别将 ldhA替换为 ackA或者 pta。

(7)苹果酸合成酶 AceA和异柠檬酸裂解酶 AceB的激活

以重组大肠杆菌 NZ-035出发， 使用和实施案例上文 (4)部分中相同的方法将 _aCe ^4 基因簇 (ace GenBank No: ACA79615.1, aceA GenBank No: ACA79614.1)的原始启动子 替换为 启动子， 获得重组大肠杆菌 NZ-036(表 1)。 构建的质粒见表 3， 使用的引 物序列见表 2, 其中引物的命名对应于激活 ^ff基因过程中所使用的引物的名称，仅将 galP替换为 aceB。

(8)二羧酸 Dcu转运蛋白 DcuC的激活

以重组大肠杆菌 NZ036 出发， 使用和上文 (4)部分中相同的方法将 d C 基因

(GenBank No. ACA78647.1)的原始调控元件替换为调控元件 Ppck 获得重组大肠杆菌 NZ-037(表 1)。 构建的质粒见表 3， 使用的引物序列见表 2, 其中引物的命名对应于激活 galP基因过程中所使用的引物的名称， 仅将 galP替换为 dcuC。 表 1 : 生产丁二酸的重组大肠杆菌

菌株名 相关特征 ATCC 8739 野生型

Suc-T102 ATCC 8739, MdhA

Suc-T104 ATCC 8739, MdhA, ApflB

Suc-T106 ATCC 8739, MdhA, ApflB, Aptsl

Suc-T108 ATCC 8739, MdhA, ApflB, Aptsl Ppck*-galP

Suc-Tl lO ATCC 8739, MdhA, ApflB, Aptsl, Ppck*-galP, Ppck*-pck

Suc-T112 ATCC 8739, MdhA, ApflB, Aptsl, Ppck*-pck

NZ-035 ATCC 8739, Aptsl, MdhA, ApflB, Ppck*-pck, Ppck*-galP, \ackA-pta

NZ-036 ATCC 8739, Aptsl, MdhA, ApflB, Ppck*-pck, Ppck*-galP, \ackA-pta, Ppck*-aceBA

NZ-037 ATCC 8739, Aptsl, MdhA, ApflB, Ppck*-pck, Ppck*-galP, AackA-pta, Ppck*-aceBA,

Ppck*-dcuC

HX021 NZ-037经过 1080代进化后获得的菌株

HX024 HX023经过 360代进化后获得的菌株， 以保藏号 CGMCC 7259保藏于 CGMCC

HX026 HX024, A dhE

HX027 HX024, AadhE, AtdcDE

HX028 HX027经过 650代进化后获得的菌株， 以保藏号 CGMCC 7550保藏于 CGMCC

HX041 HX024, Apck, 以保藏号 CGMCC 7260保藏于 CGMCC

HX042 HX024, AmaeA

HX043 HX024, AmaeB

HX044 HX024, Appc

ZT-251 Suc-T 110, Ml-37-tktA

ZT-252 Suc-TnO, Ml-37-sthA

ZT-253 Suc-TU O, Ml-37-tktA, Ml-37-sthA

ZT-273 ΖΎ-253, Ml -93-aceEF, ackA::Ml-93-lpdA *

NZ-511 ATCC 8739, MdhA, ApflB, Aptsl, Ppck*-galP, Ppck*-pck, AadhE

NZ-512 ATCC 8739, MdhA, Aptsl, Ppck*-galP, Ppck*-pck, AadhE

NZ-513 ATCC8739, MdhA, Aptsl, Ppck*-galP, Ppck*-pck, AadhE, Ml-37 -tktA

NZ-517 ATCC8739, MdhA, Aptsl, Ppck*-galP, Ppck*-pck, AadhE, Ml-37 -sthA

NZ-514 ATCC8739, MdhA, Aptsl, Ppck*-galP, Ppck*-pck, AadhE, Μ1-37-ίΑ¾ , Ml-37 -sthA

ZT-311 Suc-T 110, RBSL1 -zwf

ZT-312 Suc-T 110, RBSL2-zw

ZT-313 Suc-T110, RBSL3-zw/

ZT-314 Suc-T 110, RBSL4-zw/

ZT-321 Suc-T110, RBSLl-pg/

ZT-322 Suc-T110, RBSL2-pg/

ZT-323 Suc-T110, RBSL3-pg/

ZT-324 Suc-T 110, RBSL4-pg/

ZT-331 Suc-T 110, RBSL1 -gnd

ZT-332 Suc-T110, RBSL2-g«i

ZT-333 Suc-T110, RBSL3-g«t/

ZT-334 Suc-T110, RBSL4-g«t/

ZT-361 Suc-Tl lO, RBSL1-? :L

ZT-362 Suc-Tl lO, RBSL2-? :L

ZT-363 Suc-Tl lO, RBSL3-? :L

ZT-251 Suc-T UO, Ml-37-?^ ZT-371 Suc-T110, RBSLl-to/S

ZT-372 Suc-T110, RBSL2-to/S

ZT-373 Suc-T110, RBSL3-?a¾

ZT-374 Suc-T110, RBSL4-to/S 表 2 : 本发明中使用的引物

名称 序列

pXZ-CS构建

184-cat-up GCTAGGTACCTGTGACGGAAGATCACTTCG(SEQ ID No. :7)

184-cat-down GCTAGAGCTCGCGGCTATTTAACGACCCT (Sad) (SEQ ID No. :8)

Bs-sacB-up GCTAGAGCTCAAGTAAATCGCGCGGGTTT (Sad) (SEQ ID No. :9)

Bs-sacB-down GCTAGGATCCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC (SEQ ID No. : 10)

M13-F GTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID No. : 11)

M13-R CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID No. : 12)

IdhA基因敲除

XZ-ldhA-up GATAACGGAGATCGGGAATG (SEQ ID No. : 13)

XZ-ldhA-down CTTTGGCTGTCAGTTCACCA (SEQ ID No. : 14)

XZ-ldhA-1 TCTGGAAAAAGGCGAAACCT (SEQ ID No. : 15)

XZ-ldhA-2 TTTGTGCTATAAACGGCGAGT (SEQ ID No. : 16)

cat-sacB-up TGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. : 17)

cat-sacB-down TTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT (SEQ ID No. : 18)

pflB基因敲除

XZ-pflB-up TGTCCGAGCTTAATGAAAAGTT (SEQ ID No.: 19)

XZ-pflB-down CGAGTAATAACGTCCTGCTGCT (SEQ ID No. :20)

XZ-pflB-1 AAACGGGTAACACCCCAGAC (SEQ ID No. :21)

XZ-pflB-2 CGGAGTGTAAACGTCGAACA (SEQ ID No. :22)

te/基因敲除

XZ-ptsI-up CGCATTATGTTCCCGATGAT (SEQ ID No. :23)

XZ-ptsI-down GCCTTTCAGTTCAACGGTGT (SEQ ID No. :24)

XZ-ptsI-1 CGGCCCAATTTACTGCTTAG (SEQ ID No. :25)

XZ-ptsI-2 ATCCCCAGCAACAGAAGTGT (SEQ ID No. :26)

galP基因的原始调控元件替换为调控元件 Ppck*

XZ-galP-P-up ATCTGCTGCACCCGATCTAC (SEQ ID No. :27)

XZ-galP-P-down GAACCGGCAACAAACAAAAT(SEQ ID No. :28)

XZ-galP-P-1 ATGCCTGACGCTAAAAAACAGGG (SEQ ID No. :29)

XZ-galP-P-2 GATTAAACGCTGTTATCTGCAA (SEQ ID No. :30)

P-pck*-up-SpeI GCATACTAGTGTTGGTTATCCAGAATCAAA (SEQ ID No. :31)

P-pck *-down-KpnI GCATGGTACCAGCCAATATGTATTGCCTGAATAG (SEQ ID No. :32) pck*-F ACGGTTAACACCCCCAAAAAG (SEQ ID No.:33)

pck*-R GACAAGGCTCATAGATTTACGTATC (SEQ ID No. :34)

Pck的原始调控元件替换为调控元件 Ppck*

GTGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. :35)

pck-cat-sacB-down

AT TTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT(SEQ ID No. :36) pck-YZ-up ACGCCATAAACAATCCAA (SEQ ID No. :37) pck-YZ-down CGCATTTCACTGCTCCTT (SEQ ID No. :38) ackA-pta基因敲除和 整合调控

XZ-ackA-up CGGGACAACGTTCAAAACAT (SEQ ID No. :39)

XZ-pta-down ATTGCCCATCTTCTTGTTGG (SEQ ID No. :40)

XZ-ackA-2 AACTACCGCAGTTCAGAACCA (SEQ ID No. :41)

XZ-pta-2 TCTGAACACCGGTAACACCA (SEQ ID No.:42) aceBA基因的原始调控元件替换为调控元件 Ppck*

XZ-aceB-P-up ATTCTGGCAGAGACGGAAGA (SEQ ID No. :43)

XZ-aceB-P-down TCGAAATCGGCCATAAAGAC (SEQ ID No. :44) XZ-aceB-P-2B TTAATCCAGC GTTGGATTCA (SEQ ID No. :45)

XZ-aceB-P-3 ATGACTGAACAGGCAACAAC (SEQ ID No. :46) dcuC基因的原始调控元件替换为调控元件 Ppck*

XZ-dcuC-P-up TTTTCTGCGATGGGAATAGT (SEQ ID No. :47)

XZ-dcuC-P-down AAGCCTGGCTGGACGGTAAC (SEQ ID No. :48)

XZ-dcuC-P-1 ATGCTGACATTCATTGAGCTCCTTA (SEQ ID No. :49)

XZ-dcuC-P-2 AATTTTTCCTGTCTCCAGGCCCCAA (SEQ ID No. :50) mgsA基因敲除

XZ-mgsA-up CAGCTCATCAACCAGGTCAA (SEQ ID No. :51)

XZ-mgsA- down AAAAGCCGTCACGTTATTGG (SEQ ID No. :52)

XZ-mgsA-1 AGCGTTATCTCGCGGACCGT (SEQ ID No. :53)

XZ-mgsA-2 AAGTGCGAGTCGTCAGTTCC (SEQ ID No. :54) adhE mm^

XZ-adhE-up CAGCTCATCAACCAGGTCAA (SEQ ID No. :55)

XZ- adhE- down AAAAGCCGTCACGTTATTGG (SEQ ID No. :56)

XZ- adhE-1 AGCGTTATCTCGCGGACCGT (SEQ ID No. :57)

XZ- adhE-2 AAGTGCGAGTCGTCAGTTCC (SEQ ID No. :58) iifcD 基因簇敲除

XZ-tdcDE-up CAGCTCATCAACCAGGTCAA (SEQ ID No. :59)

XZ-tdcDE- down AAAAGCCGTCACGTTATTGG (SEQ ID No. :60)

XZ- tdcDE-1 AGCGTTATCTCGCGGACCGT (SEQ ID No. :61)

XZ- tdcDE-2 AAGTGCGAGTCGTCAGTTCC (SEQ ID No. :62) d:基因的敲除

XZ-pck-up TCCGGGCAGTAGTATTTTGC (SEQ ID No. :63)

XZ-pck-down ATGGCTGGATCAAAGTCAGC (SEQ ID No. :64)

XZ-pck-1 CCTGGCGAAACTGTTTATCG (SEQ ID No. :65)

XZ-pck-2 TTGTTAACGCGCATTTCACT (SEQ ID No. :66)

«ία 基因的敲除

XZ-maeA-up AGCGTTTCGTTACCACTG (SEQ ID No. :67)

XZ-maeA-down TACGGCGATGTTGTCCTT (SEQ ID No. :68)

XZ-maeA-1 ATTGACGATAATTTCTGGCA (SEQ ID No. :69)

XZ-maeA-2 ACGCTGTTTTTTTGTTTTTG (SEQ ID No. :70)

基因的敲除

XZ-maeB-up TTAGCGTCATAATGCCAATT (SEQ ID No. :71) XZ-maeB-down CGACCACCTGTTGTTCCTG (SEQ ID No. :72) XZ-maeB-1 ATCGGTGCGTCGTATCGT (SEQ ID No. :73)

XZ-maeB-2 AACCTGGATTTTCCCTGG (SEQ ID No. :74) ppc基因的敲除

XZ-ppc-up GCGCATCTTATCCGACCTAC (SEQ ID No. :75)

XZ-ppc-down GCCTGGACTTCTGTGGAATG (SEQ ID No. :76)

XZ-ppc-1 GTCACTATTG CCGGGATTGC (SEQ ID No. :77)

XZ-ppc-2 CAATGCGGAA TATTGTTCGT (SEQ ID No. :78)

rf^基因的调控

tktA-cat-sacB-up

TGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. :79)

TCCATGCTCAGCGCACGAATAGCATTGGCAAGC

tktA-cat-sacB-down

ATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT (SEQ ID No. :80)

AAATGCGCCGTTTGCAGGTGAATCGACGCT(

tktA-P-up

TTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No.:81)

TCCATGCTCAGCGCACGAATAGCATTGC

tktA-RBS-down

ATAGCTGTTTCCTGGTT (SEQ ID No. :82)

tktA-YZ-up TCAGGAAATCACGCCACA (SEQ ID No. :83)

tktA-YZ-down ATCCGTCATCATATCCATCA (SEQ ID No. :84)

^基因的调控

sthA-cat-sacB-up

GTGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. :85) CCGGGGCCGGAACCTATTACTATGGCATCGTAATCGTAGG

sthA-cat-sacB-down

ATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT (SEQ ID No. :86)

TTACCCGCGATAAAATGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTAT

sthA-P-up

GTTATCTCTGGCGGTGTTGAC(SEQ ID No. :87)

CCGGGGCCGGAACCTATTACTATGGCATCGTAATCGTAGG

sthA-RBS-down

AATGTGGCATAGCTGTTTCCTGGTT (SEQ ID No.:88)

sthA-YZ-up TTTTCAGCGGTTAGTGTTT (SEQ ID No. :89)

sthA-YZ-down AACTCAGGCTGGCGAAGC (SEQ ID No. :90)

ace£ 基因调控

aceEF-cat-sacB-up

GCTTTATGCATGTGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No.:91) aceEF-cat-sacB-down

GTTCTGACATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT (SEQ ID No. :92) aceEF-P-up

GCTTTATGCATGTTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No.:93) aceEF-RBS-down

GTTCTGACATAGCTGTTTCCTG (SEQ ID No. :94)

API -up TTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No. :95)

aceEF-1 ACGGAAGAAGTGGTTAAAGCACAC (SEQ ID No. :96)

基因的整合

Kan-up-PacI GCATTTAATTAAGTGTAGGCTGGAGCTGCT (SEQ ID No. :97)

Kan-down-EcoRI GCATGAATTCCAGAATCGAAATCTC (SEQ ID No. :98)

Kan-F CCGTGATATTGCTGAAGAG (SEQ ID No. :99)

pTrc99A-R CTGCGTTCTGATTTAATCTG (SEQ ID No.: 100)

lpdA-R-170 AGCAGTGCTTTAGAAGGGATAC (SEQ ID No. :101)

ackA-FRT-up

TCAATTATAGGTACTTCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID No. :102)

pta-rrnB-down GTTAAG

AACCGGAAATAGTGAAAAAGGCCATCCGTCAGGAT (SEQ ID No.: 103)

/^^*基因的调控

ackA-cat-sacB-up

TCAATTATAGGTACTTCCTGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. :104)

lpdA-cat-sacB-down

CCT (SEQ ID No. :105)

ackA-P-up TCATCATGCGCTACG

TCAATTATAGGTACTTCCTTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No.: 106) lpdA-RBS-down

CCTGAGTTTTGATTTCAGTACTCATCATAGCTGTTTCCTGGTT (SEQ ID No. :107)

zw/基因的调控

zwf-cat-sacB-up ATCAGT

ATAAGTGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. :112)

zwf-cat-sacB-down CCAGGGTATACTTGTAATTTTCTTACGGTGCACTGTACTGCTTT

GCTTGTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT (SEQ ID No. :113)

zwf-P-up ATCAGTTTTGCCGCACTTTGCGCGCTTTTCCCGTAATCGCACG(

ATAAGTTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No. :114)

zwf-RBSL-down GCGCCGAAAATGACCAGGTCACAGGCCTGGGCTGTTTGCGTT,

CATN N N YCTCCTGGTTTAAACGTACATG (SEQ ID No. :115) zwf-YZ-up CATGGCAAAGTAGTTAATGG (SEQ ID No. :116)

zwf-YZ-down GACTCACGGGTAATGACGAT (SEQ ID No.: 117)

基因的调控

pgl-cat-sacB-up TTCAGCATTCACCGCCAAAAGCGACTAATTTT

TGGCGTTGGCCGATTCATTA (SEQ ID No. : 118)

pgl-cat-sacB-down ACGTGAATTTGCTGGCTCTCAGGGCTGGCGA

ATGGAGAAAATACCGCATCAGG (SEQ ID No. :119) pgl-P-up TTCAGCATTCACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAl

TGTTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No. :120) pgl-RBSL-down ACGTGAATTTGCTGGCTCTCAGGGCTGGCGATATAAACTGTT'

ATN N NYCTCCTGGTTTAAACGTACATG (SEQ ID No.:121) pgl-YZ-up GTGATGGCGACCTGTGACGA (SEQ ID No.: 122)

pgl-YZ-down GGGCGAACACCAACATAGAG (SEQ ID No. :123)

基因的调控

gnd-cat-sacB-up CTTACTAATTTAATGAATAGAACTCAATTG

GCGTTGGCCGATTCATTA (SEQ ID No. :124)

gnd-cat-sacB-down TTGCGCCCCATCACTGCCATACCGACTACG

TGGAGAAAATACCGCATCAGG (SEQ ID No. :125) gnd-P-up CTTACTAATTTAATGAATAGAACTCAATTGTAT

TTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No. :126)

gnd-RBSL-down TTGCGTCCCATCACTGCCATACCGACTACGCC

TN N NYCTCCTGGTTTAAACGTACATG (SEQ ID No. :127) gnd-YZ-up GGTCCTTGCTATAAGAGTGA (SEQ ID No. :128)

gnd-YZ-down ACGGTTACGACGGATGGTGT (SEQ ID No. :129)

rf^基因的调控

tktA-cat-sacB-up AAATGCGCCGTTTGCAGGTGAATCGACGCTCAGTCTCAGTA

TGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. :130) tktA-cat-sacB-down ATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT (SEQ ID No. : 131)

tktA-P-up AAATGCGCCGTTTGCAGGTGAATCGACGCTC

TTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No. : 132) tktA-RBSL-down TCCATGCTCAGCGCACGAATAGCATTGGCAA(

ATN N NYCTCCTGGTTTAAACGTACATG (SEQ ID No. : 133) tktA-YZ-up TCAGGAAATCACGCCACA (SEQ ID No. : 134)

tktA-YZ-down ATCCGTCATCATATCCATCA (SEQ ID No. : 135)

toffi基因的调控

talB-cat-sacB-up AGTCTCGCCTGGCGATAACCGTCTTGTCGGCGGTTGCGCTGA(

CGTCGTGTGTGACGGAAGATCACTTCGCA (SEQ ID No. : 136) talB-cat-sacB-down TCATGATAGTATTTCTCTTTAAACAGCTTGTTAGGGGGATGTAA

CTGCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT (SEQ ID No. : 137)

talB-P-up AGTCTCGCCTGGCGATAACCGTCTTGTCGGCGGTTGCGCTGAC

GTCGTGTTATCTCTGGCGGTGTTGAC (SEQ ID No. : 138)

talB-RBSL-down TCGGCCACTACGGTGGTGTACTGACGAAGGGAGGTCAATTTG ^r

CATN N N YCTCCTGGTTTAAACGTACATG (SEQ ID No. : 139) talB-YZ-up CCGAAGAGCAGGTAAATCAT (SEQ ID No. : 140)

talB-YZ-down TACCAGCATCGTTGTAGAGT (SEQ ID No. : 141) 表 3 : 本发明中构建的质粒

质粒 质粒信息

cat-sacB 载体

pXZ-CS 来自于 pACYC184质粒的 cat基因和来自于 Bacillus subtilis的 sacB基因连接 到一起， 克隆到 pEAS Y-blunt simple质粒

IdhA基因敲除

pXZOOl 以 E.coli ATCC 8739 基因组为模板 ， PCR 扩增 IdhA 基 因 (XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ002C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZOOl质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-ldhA-l/XZ-ldhA-2扩增出 的 DNA片段上。

pXZ003 以 pXZOOl质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-ldhA-l/XZ-ldhA-2扩增出的 DNA 片段磷酸化并自连。

pflB基因敲除

pXZ014 以 E.coli ATCC 8739 基 因组为模板 ， PCR 扩增 ^ β 基 因 (XZ-pflB-up/XZ-pflB-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。 pXZ015C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ014质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-pflB-l/XZ-pflB-2扩增出 的 DNA片段上。

pXZ016 以 pXZ014质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-pflB-l/XZ-pflB-2扩增出的 DNA 片段磷酸化处理并自连。

te/基因敲除

pXZ008 E.coli ATCC 8739基因组为模板， PCR扩增 te/基因 (XZ-ptsI-up/XZ-ptsI

-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ009C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ008质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-ptsI- l/XZ-ptsI-2扩增出的

DNA片段上。

ρΧΖΟΙΟ 以 pXZ008质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-ptsI-l/XZ-ptsI-2扩增出的 DNA 片段磷酸化处理并自连。

galP基因的原始调控元件替换为调控元件 Ppck*

pXZ602 以 E.coli ATCC 8739 的基因组为模板， PCR 扩增 pck基因的调控元件 i^c :(P-pck*-up-SpeI/ P-pck*-down-KpnI)并克隆到载体 pTrc99A上。

pXZ603 以 pXZ602质粒 DNA为模板， 使用引物 pck*-F/pck*-R扩增出的 DNA片段 磷酸化处理并自连。

pXZOl l 以 E. coli ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 galP 基因

(XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ012C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZOl l质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-galP-P-l/XZ-galP-P-2扩增 出的 DNA片段上。

pXZOO 将 调控元件（以质粒 pXZ603 为模板， 引物 P-pck *-up-SpeI/

P-pck*-down-KpnI)克 隆到 以 pXZOl l 质粒 DNA 为模板（引 物 XZ-galP-P-l/XZ-galP-P-2)扩增出的 DNA片段上。

ackA-pta基因敲除和 整合调控

pXZ023 以 E. coli ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 ackA-pta 基因

(XZ-ackA-up/XZ-pta-down)并克隆到 pEASY-Blunt载体上。 pXZ024C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ023质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-pta-2/XZ-ackA-2扩增出的 DNA片段上。

pXZ025 以 pXZ023质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-pta-2/XZ-ackA-2扩增出的 DNA 片段磷酸化处理并自连。

aceBA基因的原始调控元件替换为调控元件 Ppck*

pXZ026 以 E. coli ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 aceBA 基因

(XZ-aceB-P-up/XZ-aceB-P-up)并克隆到 pEASY-Blunt载体上。 pXZ027C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ026质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-aceB-P-2B/XZ-aceB-P-3 扩增出的 DNA片段上。

PXZ028 将 Ppck* 启 动 子 （ 以 质 粒 pXZ603 为 模 板 ， 引 物

P-pck*-up-SpeI P-pck*-down-KpnI)克隆到以 pXZ026质粒 DNA为模板 (引物 XZ-aceB-P-2B/XZ-aceB-P-3)扩增出的 DNA片段上。

dcuC基因的原始调控元件替换为调控元件 Ppck*

pXZ065 以 E. coli ATCC 8739基因组为模板， PCR扩增 dcuC基因 (XZ-dcuC-P-up I

XZ-dcuC-P-down)并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ066C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ065质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-dcuC-P-1/ XZ-dcuC-P-2 扩增出的 DNA片段上。

pXZ067 将 Ppck*启动子（以质粒 pXZ603 为模板， 引物 P-pck*-up-SpeI/

P-pck*-down-KpnI)克隆到以 pXZ065 质粒 DNA 为模板（XZ-dcuC-P-1/ XZ-dcuC-P-2)扩增出的 DNA片段上。

mgsA基因敲除

pXZ071 以 E. coli ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 mgsA 基因

(XZ-mgsA-up/XZ-mgsA -down)并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ072C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ071质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-mgsA-l/XZ-mgsA-2扩增 出的 DNA片段上。

pXZ073 以 pXZ071质粒 DNA为模板，使用弓 |物 XZ-mgsA-l/XZ-mgsA-2扩增出的 DNA 片段磷酸化处理并自连。

" 基因敲除

pXZ020 以 E. coli ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 adhE 基因 (XZ-adhE-up/XZ-adhE -down)并克隆到 pEASY-Blunt载体上。 pXZ021C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ020质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-adhE-l/XZ-adhE-2扩增出 的 DNA片段上。

pXZ022 以 pXZ020质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-adhE-l/XZ-adhE-2扩增出的 DNA 片段磷酸化处理并自连。

iifcD 基因簇敲除

pXZ641 以 E.coii ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 tdcDE 基因簇 (XZ-tdcDE-up/XZ-tdcDE -down)并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ642C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ641质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-tdcDE-l/XZ-tdcDE-2扩增 出的 DNA片段上。

pXZ643 以 pXZ641质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-tdcDE-l/XZ-tdcDE-2扩增出的

DNA片段磷酸化处理并自连。

基因敲除

pXZ701 以 E.coii ATCC 8739 基 因 组为 模板 ， PCR 扩增 基 因 (XZ-pck-up/XZ-pck-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。 pXZ702C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ701质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-pck-l/ XZ-pck-2扩增出的

DNA片段上。

pXZ703 以 pXZ701质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-pck-l/XZ-pck-2扩增出的 DNA 片段磷酸化并自连。

»7^ 基因敲除

pXZ704 以 E.coli ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 maeB 基因 (XZ-maeB-up/XZ-maeB-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ705C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ704质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-maeB-l/XZ-maeB-2扩增 出的 DNA片段上。

pXZ706 以 pXZ704质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-maeB-1/ XZ-maeB-2扩增出的

DNA片段磷酸化并自连。

ppc基因敲除

pXZ707 以 Ecoii ATCC 8739 基 因组为 模板 ， PCR 扩增 c 基 因 (XZ-ppc-up/XZ-ppc-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。 pXZ708C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ707质粒 DNA为模板，使用引物 XZ-ppc-l/ XZ-ppc-2扩增出的

DNA片段上。

pXZ709 以 pXZ707质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-ppc-l/XZ-ppc-2扩增出的 DNA 片段磷酸化并自连。

maeA基因敲除

pXZ710 以 E.coli ATCC 8739 基因组为模板， PCR 扩增 maeA 基因 (XZ-maeA-up/XZ-maeA-down) 并克隆到 pEASY-Blunt载体上。

pXZ711C 以 pXZ-CS为模板， PCR扩增 cat-sacB cassette (cat-sacB-up/cat-sacB-down) 并 克隆到以 pXZ710质粒 DNA为模板， 使用引物 XZ-maeA-l/ XZ-maeA-2扩增 出的 DNA片段上。

pXZ712 以 pXZ710质粒 DNA为模板，使用弓 I物 XZ-maeA-l/XZ-maeA-2扩增出的 DNA 片段磷酸化并自连。

整合

pTrc99A-M-Kan 从 pKD4上 PCR扩增 (Kan-up-PacI an-down-EcoRI)得到的 FRT- «片段克

隆到于 pTrc99A-M上。 pXZ174 以 HX-024 基 因 组 为 模 板 ， PCR 扩 增 IpdA

(8739-lpdA-up-SacI/8739-lpdA-down-PstI) 并克隆到 pTrc99A-M载体上。

pXZ177 从 pXZ174质粒上通过酶切获得 ti¾*(T82I P275S and A358V)片段， 连接至 实施例 2: 使用重组大肠杆菌 Suc-T110、 NZ-035、 NZ-036和 NZ-037生产丁二酸

种子培养基由以下成分组成 (溶剂为水)：

大量元素： 葡萄糖 20 g/L， KH ₂ P0 ₄ 3.5 g/L、 K ₂ HP0 ₄ 6.55 g/L、 (NH ₄ ) ₂ HP0 ₄ 3.5 g/L MgSO ₄ -7H ₂ O 0.12 g/L 和甜菜碱 -KC1 0.15 g/L。

微量元素： FeCl ₃ -6H ₂ 0 1.5 g/L、 CoCl ₂ '6H ₂ 0 0.1 g/L、 CuCl ₂ -2H ₂ 0 0.1 g/L、 ZnCl ₂ 0.1 g/L、 Na ₂ Mo0 ₄ -2H ₂ 0 0.1 g/L、 MnCl ₂ -4H ₂ 00.2 g/L, H ₃ BO ₃ 0.05 g/ L。

发酵培养基大部分和种子培养基相同， 区别是葡萄糖浓度为 50 g/L、 另外还加入了 100 mM KHCO _{3 o}

Suc-Tl lO, NZ-035, NZ-036和 NZ-037厌氧发酵， 包括以下步骤：

(1)种子培养： 250 ml三角瓶中种子培养基为 100 ml， 115°C灭菌 15 min。 冷却后将 重组大肠杆菌 Suc-TllO, NZ-035, NZ-036和 NZ-037按照 1% CV/V)的接种量接种于种子 培养基， 在 37°C和 lOO rpm的条件下培养 12小时得到种子液， 用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养： 500 ml 厌氧罐中发酵培养基体积为 250 ml, 将种子液按照终浓度 OD _55Q =0.1的接种量接种于发酵培养基， 37°C， 150 rpm, 发酵 4天， 得到发酵液。 中和 剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有 通任何 气体。

分析方法：使用安捷伦 (Agilent-1200)高效液相色谱仪对第 4天发酵液中的组分进行 测定。 发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐 (Biorad)公司的 Aminex HPX-87H 有机酸分析柱。

结果见表 4。Suc-T110发酵 96小时后，丁二酸产量达 280 mM，产率达 1.12 mol/mol; NZ-035发酵 96小时后， 丁二酸产量达 286 mM， 产率达 1.16 mol/mol; NZ-036发酵 96 小时后， 丁二酸产量达 298 mM， 产率达 1.19 mol/mol; NZ-037发酵 96小时后， 丁二 酸产量达 357 mM, 产率达 1.28 mol/mol。 表 4: 重组大肠杆菌 Suc-T108, Suc-TllO, NZ035, NZ036和 NZ037发酵生产丁

遗传修饰

细胞量 丁二酸产 丁二酸产率 发酵产物 （mM) 菌株 a

(g L) 率 (g/g) (mol/mol)

丁二酸 乙酸

Suc-Tl lO Ppck*-pck 1.53 0.73±0.02 1.12±0.03 280±10 96±10

NZ-035 Suc-Tl lO, AackA-pta 1.51 0.76±0.02 1.16±0.03 286±7 44±6

NZ-036 NZ-035, Ppck*-aceBA 1.48 0.78±0.02 1.19±0.03 298±6 27±4

NZ-037 NZ-036, Ppck*-dcuC 1.50 0.84±0.02 1.28±0.03 357±7 25±3 ^a 使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHC0 ₃ 。 使用的中和 剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 实施例 3 : 使用钠盐发酵重组大肠杆菌 NZ037生产丁二酸

种子培养基由以下成分组成 (溶剂为水)：

大量元素： 葡萄糖 20 g/L， H ₄ H ₂ PO ₄ 0.87g/L ( H ₄ ) ₂ HP0 ₄ 2.63 g/L MgS0 ₄ ·7Η ₂ 0 0.18 g/L、 甜菜碱 -KC1 0.15 g/L。

微量元素： FeCl ₃ -6H ₂ 0 2.4 μgfL, CoCl ₂ -6H ₂ 0 0.3 μgfL, CuCl ₂ -2H ₂ 0 0.15 μgfL, ZnCl ₂ 0.3 μgfL, Na ₂ Mo0 ₄ -2H ₂ 0 0.3 μgfL, MnCl ₂ -4H ₂ 00.5 g/L, H ₃ B0 ₃ 0.072 g/ L。

发酵培养基大部分和种子培养基相同， 区别是葡萄糖浓度为 100 g/L、 另外还加入 了 35 mM NaHC0 ₃ 。 使用 2.4 M Na ₂ C0 ₃ 禾 P 1.2 M NaOH为中和剂。

种子培养、 发酵培养以及分析方法和实施例 2相同。

结果： 发酵 96小时后， 丁二酸产量达 226 mM， 产率达 1.27 mol/mol。 实施例 4: 重组大肠杆菌 HX021的构建

从 NZ-037出发， 通过进化代谢同步提高细胞生长和丁二酸生产 能力。

进化代谢所使用的发酵培养基由以下成分组成 (溶剂为水)：

大量元素： 葡萄糖 100-120 g/L , H4H2PO4 0.87g/L ( H ₄ ) ₂ HP0 ₄ 2.63 g/L、 MgSO ₄ -7H ₂ O 0.18 g/L 甜菜碱 -KC1 0.15 g/L、 35 mM NaHC0 ₃ 。

微量元素： FeCl ₃ -6H ₂ 0 2.4 μgfL, CoCl ₂ -6H ₂ 0 0.3 μgfL, CuCl ₂ -2H ₂ 0 0.15 μgfL, ZnCl ₂ 0.3 μgfL, Na ₂ Mo0 ₄ -2H ₂ 0 0.3 μgfL, MnCl ₂ -4H ₂ 00.5 g/L, H3BO3 0.072 g/ L。

进化代谢过程使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 使用 2.4 M Na ₂ C0 ₃ 和

1.2 M NaOH为中和剂。

第 1-80代， 发酵培养基中葡萄糖浓度为 100 g/L(S卩 10%); 每 48小时， 将发酵液转 接到新的发酵罐中， 使初始 OD550达 0.05 ;

第 81-780代， 发酵培养基中葡萄糖浓度为 100 g/L; 每 24小时， 将发酵液转接到 新的发酵罐中， 使初始 OD550达 0.05 ;

第 781-1080代， 发酵培养基中葡萄糖浓度为 120 g/L(g卩 12%); 每 24小时， 将发酵 液转接到新的发酵罐中， 使初始 OD550达 0.05。

经过 1080代进化， 获得菌株 HX021 (图 2)。 实施例 5： 重组大肠杆菌 HX023的构建

从重组大肠杆菌 HX021出发， 使用和实施例 1中 (1)部分相同的方法敲除 mg^4基 因 (GenBank No: ACA78263.1), 获得重组大肠杆菌 HX023。 构建的质粒见表 3， 使用的 引物序列见表 2， 其中引物的命名对应于敲除 IdhA基因过程中所使用的引物的名称， 仅将 IdhA替换为 mgsA。 实施例 6: 重组大肠杆菌 HX024的构建 从 HX023出发， 通过进化代谢同步提高细胞生长和丁二酸生产 能力。

进化代谢所使用的发酵培养基和实施案例 4相同。

第 1-360代， 发酵培养基中葡萄糖浓度为 120 g/L (即 12%); 每 24小时， 将发酵液 转接到新的发酵罐中， 使初始 OD550达 0.05;

经过 360代进化， 获得菌株 HX024(图 3)。 实施例 7: 不同浓度的碳酸氢根离子供给对重组大肠杆菌 HX024发酵的影响

使用不同的碳酸氢根离子供给对重组大肠杆菌 HX024进行发酵。

种子培养基和实施例 3相同。

使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基基本上和种子培养基相 同， 区别是葡萄糖浓度为 120 g/L, 另外还加入了 35 mM NaHC0 ₃ 。 使用的中和剂有 5 种不同的配比方式， 6M氢氧化钠和 3M碳酸钠的配比组成分别是 1 :4、 1 :2、 1 :1、 3 :2、 2: 1。

HX024在 500 ml发酵罐中的厌氧发酵， 包括以下步骤：

(1)种子培养： 250 ml三角瓶中种子培养基为 100 ml， 115°C灭菌 15 min。 冷却后将 重组大肠杆菌 HX024按照 1% (V/V)的接种量接种于种子培养基， 在 37°C和 100 rpm的 条件下培养 12小时得到种子液， 用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养： 500 ml中发酵培养基体积为 250 ml， 115°C灭菌 25 min。 将种子液按 照终浓度 OD _55Q =0.1的接种量接种于发酵培养基， 37°C厌氧培养 4天，搅拌转速 150 rpm， 得到发酵液。 发酵液为发酵罐内所有物质。 培养过程没有通任何气体。

结果： 发酵结果见表 5。 在氢氧化钠和碳酸钠不同配比中， 当 C0 ₂ 在碱液中的摩尔 比例低于 33.3%时， 丁二酸转化率明显下降， 而高于 33.3%时， 丁二酸转化率没有明显 差别。

表 5 : 不同的碳酸氢根离子供给对重组大肠杆菌 HX024发酵的影响

NaOH: C0 ₂ (% mol) 碱消耗 (ml) C0 ₂ 消耗 丁二酸产 丁二酸转化

b

Na ₂ C0 ₃ ^a (mM) 量 （mM) 率 (mol/mol)

1 :4 67% 88± 3 880士 29 813± 28 1.36± 0.04

1 :2 50% 78± 4 659士 32 785± 40 1.30± 0.01

1 : 1 33.3% 72± 2 467士 12 798± 21 1.33± 0.02

3:2 25% 67士 1 357± 5 781士 12 1.15± 0.03

2: 1 20% 63± 2 287± 8 739士 23 1.08± 0.03 ^a 使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 35 mM NaHC0 ₃ 。 不同比例的 NaOH (6 M)和 Na ₂ C0 ₃ (3 M)组成的碱液自动控制 pH， 使 pH保持在 7.0。

b C0 ₂ (% mol)表示 C0 ₂ 在碱液中的摩尔比例。 实施例 8: 重组大肠杆菌 HX021, HX023和 HX024在 500 ml发酵罐中的发酵

种子培养基和实施例 3相同。

使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基基本上和种子培养基相 同， 区别是葡萄糖浓度为 120 g/L、 另外还加入了 35 mM NaHC0 ₃ 。 使用的中和剂为 1.5 M Na ₂ C0 ₃ 和 3 M NaOH。

结果： HX021发酵 96小时后，丁二酸产量达 618 mM,产率达 1.24 mol/mol; HX023 发酵 96小时后， 丁二酸产量达 594 mM, 产率达 1.25 mol/mol; HX024发酵 96小时后， 丁二酸产量达 798 mM, 产率达 1.33 mol/mol (表 6)。 表 6: 重组大肠杆菌 HX021, HX023和 HX024发酵生产丁

细胞量 丁二酸产率 丁二酸产率 发酵产物 (mM) 菌株 培养基 ^a

(g L) (g/g) (mol/mol) 丁二酸 乙酸

HX021 12%, AMI 2.4 0.81 ± 0.01 1.24± 0.02 618 ± 3 18± 3

HX023 12%, AMI 2.1 0.82 ± 0.01 1.25± 0.01 594士 33 16士 1

HX024 12%, AMI 2.72 0.87 ± 0.01 1.33± 0.02 798 ± 21 23± 2 ^a 使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 35 mM NaHC0 ₃ 。 使用的中和 剂为 1.5 M Na ₂ C0 ₃ 和 3 M NaOH。 实施例 9: 重组大肠杆菌 HX024在 5 L发酵罐中的发酵

种子培养基、 发酵培养基、 分析方法和实施例 8相同

HX024在 5L发酵罐 (上海保兴， BIOTECH-5BG)中的厌氧发酵， 包括以下步骤：

(1)种子培养： 500 ml三角瓶中种子培养基为 150 ml， 115 °C灭菌 15 min。 冷却后将 重组大肠杆菌 HX024按照 1% (V/V)的接种量接种于种子培养基， 在 37°C和 100 rpm的 条件下培养 12小时得到种子液， 用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养： 5L中发酵培养基体积为 3L， 115 °C灭菌 25 min。 将种子液按照终浓 度 OD _55Q =0.2的接种量接种于发酵培养基， 37°C厌氧培养 4天， 搅拌转速 200rpm， 得到 发酵液。 发酵液为发酵罐内所有物质。 培养过程没有通任何气体。

结果： 发酵 96 小时后， 丁二酸产量达 915 mM (相当于 108 g/L), 产率达 1.37 mol/mol(相当于 0.9 g/g)(图 4) 实施例 10: 重组大肠杆菌 HX041-HX044的构建和发酵

(1)重组大肠杆菌 HX041-HX044的构建

按照实施例 1 中（1-2)部分的方法， 对 HX024 菌株中的 pck基因 (GenBank No:

ACA75988.1) 、 maeA 基 因（GenBank No:ACA77817.1) 、 maeB 基因（； GenBank No:ACA76880.1)和 ppc基因 (GenBank No:ACA79659.1)分别进行单基因敲除， 得到菌株 HX041-HX044 (表 1)。 构建的质粒见表 3， 使用的引物序列见表 2， 其中引物的命名对 应于敲除 IdhA基因过程中所使用的引物的名称， 仅分别将 ldhA替换为 pck、 maeA, maeB或者 ppc。

(2)重组大肠杆菌 HX041-HX044的发酵

使用和实施例 8相同的方法发酵重组大肠杆菌 HX041-HX044生产丁二酸。

结果： 发酵结果见表 7。 HX041菌株中的 基因被敲除后， 细胞仍然能够产生 大量的丁二酸； 说明大肠杆菌菌株可以不使用 PCK酶进行 PEP羧化反应生产丁二酸。 另一方面， HX024菌株中的 ae 基因被敲除后， 丁二酸产量下降 29%， 表明 MaeB在 HX024中起一定作用， 有一部分碳代谢流通过 MaeB进行丁二酸合成。 HX024菌株中 的 a^4基因被单敲除后， 丁二酸产量下降 49%， 表明 MaeA在 HX024中起一定作用， 有一部分碳代谢流通过 MaeA进行丁二酸合成。

此外， HX024菌株中的^ ^；基因单敲除后， 不能在无机盐培养基中进行种子培养; 用 LB培养基进行种子培养， 再在无机盐发酵培养基中发酵， 丁二酸产量下降 70%， 表 明 PPC在 HX024中起到了重要的催化作用，这可能与其优� ��的酶动力学催化特性有关。 表 7: 重组大肠杆菌 HX041-HX044发酵生产丁

细胞 丁二酸产率 丁二酸产率

发酵产物 (mM) 菌株 a 遗传修饰 里 (g/g) (mol/mol)

(g/L) 丁二酸 乙酸

HX024 2.72 0.87 ± 0.01 1.33± 0.02 798 ± 21 23± 2

HX041 HX024, Apck 2.00 0.86± 0.02 1.31± 0.03 492士 18 22士 2

HX042 HX024, AmaeA 1.92 0.86± 0.01 1.31± 0.02 405士 44 25± 3

HX043 HX024, AmaeB 2.18 0.87± 0.01 1.33± 0.01 566± 31 20± 1

HX044 HX024, Appc - - - - -

HX044 ^b HX024, Appc 1.49 0.79± 0.03 1.21± 0.04 241±19 10士 1 ^a 使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 35 mM NaHC0 ₃ 。 使用的中和 剂为 1.5 M Na ₂ C0 ₃ 和 3 M NaOH

b HX044使用 LB培养基准备种子， 再在无机盐发酵培养基中发酵； 其他菌株使用的种子培养基为 无机盐培养基 +2%葡萄糖。 实施例 11： 重组大肠杆菌 HX027和 HX028的构建和发酵

(1)重组大肠杆菌 HX-027的构建

按照实施例 1中（1)部分的方法，从 HX-024菌株出发，先敲除 基因 (Genbank No: ACA78022.1), 得到重组菌株 HX-026(表 1); 再敲除 tifcZ)£基因簇 (tofcD基因： GenBank No:ACA76259.1; tdcE基因 GenBank No: ACA76260.1),得到重组菌株 HX-027(表 1)。构 建的质粒见表 3， 使用的引物序列见表 2， 其中引物的命名对应于敲除 /^¾4基因过程中 所使用的名称， 仅分别将 ldhA替换为 adhE或 tdcDE

(2)重组大肠杆菌 HX-028的构建

从 HX027出发， 通过进化代谢同步提高细胞生长和丁二酸生产 能力。

进化代谢所使用的发酵培养基和实施案例 4相同。

第 1-650代， 发酵培养基中葡萄糖浓度为 120 g/L (即 12%); 每 24小时， 将发酵液 转接到新的发酵罐中， 使初始 OD550达 0.05 (图 5);

经过 650代进化， 获得菌株 HX028 (图 5)。

(3)重组大肠杆菌 HX-028的发酵

使用和实施例 9相同的方法， 在 5L发酵罐中对重组大肠杆菌 HX-028进行发酵。 发酵结果见图 6。 发酵 96小时， 丁二酸产量达到 1042 mM (相当于 123 g/L)， 产率 达 1.02 g/g (相当于 1.56 mol/mol)。 实施例 12: 重组大肠杆菌 HX024的转录组分析

对重组大肠杆菌 HX024的转录组分析， 包括以下步骤：

(1)发酵培养

HX024的种子培养和发酵培养与实施例 8中的方法相同。 共设 3个平行厌氧发酵， 野生型 ATCC 8739菌株的种子培养和发酵培养基本上与实施� � 5中的方法相同， 区别是使用的葡萄糖浓度为 50 g/L。

(2) RNA制备：

HX024发酵至 OD550=3.9时三个平行发酵样品分别取样， 混匀， 抽提 RNA。 野生型 ATCC 8739发酵至 OD550=2.5时三个平行发酵样品分别取样， 混匀， 抽提

RNA抽提使用的 RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒完成， DNase经由 The RNase-Free DNase Set (Qiagen)试剂盒处理完成。

(3)转录组测序：

转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成 。 每个样品产生 1Gb清单数据 (clean data) 。 序 列 分 析 的 参 考 序 列 为 ATCC 8739 的 基 因 组 序 列 (http：〃 www. ncbi . nlm . nih . gov/nuccore/NC_010468.1 )。

HX024菌株和丁二酸合成相关的基因表达变化见� �� 8和图 7。 表 8 : 重组大肠杆菌 HX024的转录组分析

基因 蛋白 相对表达水平 ^a

模块 1: 葡萄糖的利用

galP 半乳糖透性酶 72.5

glk 葡萄糖激酶 2.2

模块 2: 羧化反应

pck 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 74.0

maeB NADPH依赖苹果酸酶 3.0

模块 3: 还原型 TCA

mdh 苹果酸脱氢酶 6.5

fumA 富马酸水合酶， 酶 I 6.0

frdA 富马酸还原酶黄素蛋白亚基 3.6

frdB 富马酸还原酶硫铁蛋白亚基 4.0

frdC 富马酸还原酶 C亚基 3.9

frdD 富马酸还原酶 D亚基 3.7

模块 4: TCA

gltA 柠檬酸合成酶 2.1

模块 5: 乙醛酸支路

aceB 苹果酸合成酶 160.9 aceA 异柠檬酸裂解酶 292.0

模块 6: 磷酸戊糖途径

tktA 转酮醇酶 2.0

模块 7: 糖酵解

ρβΑ 6-磷酸果糖激酶 0.43

pykF 丙酮酸激酶 0.12

gapA 3-磷酸甘油脱氢酶 2.0

模块 8: 转氢酶

sthA 嘧啶核苷酸转氢酶 2.3

模块 9: 丁二酸运输

dcuB 厌氧 C ₄ 双羧酸转运蛋白 DcuB 2.0

dcuC ( ₄ 双羧酸转运蛋白 DcuC 45.3

dctA 好养 C4双羧酸转运蛋白 9.8

a相对表达水平表示 HX-024对野生型大肠杆菌 ATCC 8739基因表达强度倍数。 根据转录组分析， 表明 HX024菌株中以下基因的表达显著提高了。

1)磷酸戊糖途径 (PPP)相关基因 tktA 的表达提高， 糖酵解途径 (EMP)相关基因 pfkA 的表达降低， 表明碳代谢流更多地流入磷酸戊糖途径。利用 磷酸戊糖途径， 相对糖酵解 途径， 能产生更多的还原力， 并且是 NADPH形式。 苹果酸酶基因 ^ ?的表达提高， 表明细胞通过 maeB进行羧化反应的能力提高了。细胞产生更� �的 NADPH,有利于 maeB 的羧化反应。

2)转氢酶基因 sthA的表达提高，表明细胞将 NADPH转化为 NADH的能力提高了。 细胞产生更多的 NADPH, 这些 NADPH再被转化为 NADH, 用于提供丁二酸合成所需 的还原力。 实施例 13 : 重组大肠杆菌 HX024的 !pdA基因序列分析

对重组大肠杆菌 HX024进行基因组测序， 由深圳华大基因科技有限公司完成。 测 序发现 IpdA基因 (GenBank No:ACA79157.1)含有 3个点突变： C242T 823T和 C1073T, 导致 LpdA蛋白的 3个氨基酸位点突变 T81I、 P275S和 A358VC图 8)。 实施例 14: 激活 TktA和 SthA提高丁二酸生产能力

(1)重组大肠杆菌 ZT-251 , ZT-252和 ZT-253的构建

将 Suc-Tl 10菌株中 tktA基因 (GenBank No: ACA76448.1)的原始调控元件替换为人 工调控元件 M1-37(SEQ ID No. : 109)， 得到菌株 ZT-251。

重组菌 ZT-251的构建方法如下：

第一步同源重组：以 pXZ-CS质粒为模板，使用引物 tktA-cat-sacB-up (SEQ ID No. :79) 禾口 tktA-cat-sacB-down (SEQ ID No.:80)扩增 DNA片段 I， 用于第一次同源重组。 引物序 列见表 2; 得到 2717 bp DNA片段 I， 将所得 DNA扩增片段 I电转至带有 pKD46质粒 的大肠杆菌 Suc-Tl lO中， 筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落， 得到中间重组菌； 第二步同源重组： 以重组大肠杆菌 Ml-37(Lu et al.， 2012, Appl Microbiol Biotechnol. 93:2455-2462； SEQ ID No.:109)的基因组 DNA为模板， 使用引物 tktA-P-up (SEQ ID No.:81)和 tktA-RBS-down (SEQ ID No. :82),得到包含 tktA启动子两侧同源臂和人工调控 元件 M1-37的 193bp的 DNA片段 tktA-Ml-37; 引物序列见表 2。

将所述 193 bp的片段 tktA-Ml-37电转入整合 DNA片段 I的中间重组菌，得到重组 菌。 电转化和筛选方法与实施例 1中 (1-2)部分 敲除步骤中第六步相同。

重组菌的 PCR 验证的引物 tktA-YZ-up(SEQ ID No.： 83)/tktA-YZ-down(SEQ ID No.:84), 得到测序正确的阳性菌落， 将其命名为菌株 ZT-251;

使用同样的方法， 将 Suc-TllO菌株中 sthA基因 (GenBank No:ACA79653.1)的原始 调控元件替换为人工调控元件 M1-37, 得到菌株 ZT-252, 所使用的引物见表 2， 其中所 使用的引物的命名对应于 tktA调控元件替换过程中所使用的引物的名称� � 仅将 tktA替 换为 sthA;

使用同样的方法，将 Suc-TllO菌株中 sthA和 tktA基因的原始调控元件都替换为人 工调控元件 Ml-37CSEQIDNo.:109;>， 得到菌株 ZT-253, 所使用的引物见表 2。

(2)重组大肠杆菌 ZT-251， ZT-252和 ZT-253的发酵

按照实施例 2的方法，对菌株进行培养发酵。发酵结果见� � 9。结果表明，在 Suc-TllO 菌株中增强磷酸戊糖途径中 tktA基因的表达强度，使得丁二酸产量和转化� �分别提高了 4%和 13%; 增强 基因的表达强度可以增强流经磷酸戊糖途径的 碳代谢流， 提高还 原力的生产， 有利于丁二酸合成。

增强转氢酶编码基因 sthA的表达强度，使得丁二酸的产量和转化率� �别提高了 5% 和 13%; 增强 基因的表达强度可以催化细胞中部分 NADPH转变成 NADH, 有利 于丁二酸合成。

同时增强 和^^基因的表达强度， 使得丁二酸产量和转化率分别提高了 10% 和 19%。协同利用 和 基因，可以将磷酸戊糖途径产生的 NADPH转变成 NADH, 更有利于丁二酸合成。 将获得的丁二酸高产菌株 ZT-253在含糖浓度更高 (7%葡萄糖)的 BS发酵培养基中发酵， 丁二酸产量达到 506 mM， 糖酸转化率达到 1.36 mol/mol。 表 9 激活 sthA和 tktA对丁二酸生产的影响

细胞量 丁二酸产 丁二酸产率 发酵产物 nM) 菌株 a 遗传修饰

(gL) 率 (g/g) (mol/mol) 丁二酸 乙酸

Suc-T110 ^b 1.53 0.73± 0.02 1.12±0.03 280士 10 96士 10

ZT-251 ^b Suc-TllO, Ml-37-tktA 1.36 0.83±0.01 1.26±0.02 290±11 74±6

ZT-252 ^b Sue -Ύ HO, Ml -37-sthA 1.24 0.83±0.01 1.27±0.02 293士 13 64±2

ZT-253 ^b Suc-ΎΙΙΟ, Ml-37-tktA, 1.22 0.87±0.01 1.33±0.01 307±4 56±7

Ml -37-sthA

ZT-253 ^c Suc-ΎΙΙΟ, Ml-37-tktA, 1.24 0.89±0.01 1.36±0.02 506±8 85士 10

Ml -37-sthA

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHC0 ₃ 。 使用的中和 剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。

b 初始葡萄糖浓度为 5%。

c初始葡萄糖浓度为 7%。 实施例 15 : 激活 TktA、 SthA和丙酮酸脱氢酶提高丁二酸生产能力

(1)重组大肠杆菌 ZT-273的构建

使用和实施例 14中 (1)部分相同的方法， 将 ZT-253菌株中 基因的原始调控 元件替换为人工调控元件 M1-93 ; 调控元件替换引物的命名对应于 tktA基因过程中所 使用的引物名称， 仅将 tktA替换为 aceEF (表 2); 得到中间重组菌株 ZT-273A, 用引物 APl-up(SEQ ID No.:95)/aceEF-l(SEQ ID No. :96)验证。

在中间重组菌株 ZT-273A的 ackA位点整合 !pdA*， 得到中间重组菌株 ZT-273B。 具体包括以下步骤：

第一步： 构建整合载体 pTrc99A-M-Kan。

具体步骤如下： 以 pKD4质粒 （Datsenko and Wanner 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645; 质粒购买于美国耶鲁大学 CGSC大肠杆菌保藏中心) DNA为模板， 用引 物 Kan-up-PacI (SEQ ID No. :97)/Kan-down-EcoRI (SEQ ID No. :98) 进行 PCR扩增，扩增 体系和扩增条件参考实施例 1 中 (1-1)部分质粒 pXZ-CS 构建步骤中的第一步。 得到 FRT-Km的 DNA片段， 用限制性内切酶 PacI/EcoRI (NEB公司） 在 37°C处理 30分钟； 用相 同 的酶禾 B条件酶切质粒 pTrc99A-M(Zhao et al 2013, Met Eng doi: 10.1016/j .ymben.2013.02.002; 本实验室构建， 其序列为 SEQ ID No. : l l l)。 用 PCR纯化 试剂盒清洗 (Gel/PCR Extration Kit， 购自 BioMIGA生物技术有限公司）； 取 50ng纯化后 的 FRT-Km的 DNA片段和 30 ng pTrc99A-M载体片段，加入 2μ1 10XT4连接缓冲液 (NEB 公司）、 1μ1 Τ4多核苷酸激酶 (NEB公司）， 补充蒸熘水至 20μ1， 37°C反应 30分钟； 加入 Ιμΐ Τ4连接酶 (NEB公司， 400,000 cohesive end units/ml),室温反应 2小时得到连接产物。 酶连产物取 10ul， 用氯化钙转化法转入 TranslO, 同实施例 1 中 (1-1)部分质粒 pXZ-CS 构建步骤中的第四步。 取 200μ1菌液涂在含有卡那霉素 (终浓度 50μ _§ /ιη1)和氨苄霉素 (终 浓度为 50μ _§ /ιη1)的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 2-3个克隆， 用引物 Kan-F (SEQ ID No. :99)/pTrc99A-R (SEQ ID No. : 100)进行 PCR验证，正确的质粒命名为 pTrc99A-M-Kan。

第二步， 将 连接到整合型载体 pTrc99A-M-Kan上， 获得质粒 pXZ177。

具体步骤如下：取质粒 pXZ174，用限制性内切酶 cl和 Hz ¾fflI( EB公司)在 37°C 酶切 30 分钟， 胶回收得到大小 1455bp 的片段； 用相同的限制性内切酶处理 pTrc99AM-Kan, 用 PCR纯化试剂盒清洗 (Gel/PCR Extration Kit, 购自 BioMIGA生物技 术有限公司；)； 取 50ng胶回收的片段， 20ng载体 pTrc99AM-Kan片段， 加入 2μ1 10XT4 连接缓冲液 (NEB公司）、 Ιμΐ T4多核苷酸激酶 ( EB公司)， 补充蒸熘水至 20μ1， 37°C反 应 30分钟； 加入 Ιμΐ T4连接酶 ( EB公司， 400,000 cohesive end units/ml)， 室温反应 2 小时得到连接产物；取 5μ1连接产物化转于 50μ1 Trans 1-T1感受态细胞 (；购自北京全式金 生物技术有限公司）中， 取 200μ1菌液涂在含有卡那霉素 (终浓度为 50μ _§ /ιη1)和氨苄霉素 (终浓度为 100μ _§ /ιη1)的 LB平板上， 过夜培养后， 挑选 5个阳性单菌落， 进行菌落 PCR 验证， 弓 I物为 Kan-F/lpdA-R-170 CSEQ ID No. : 10i;)。 测序结果证明质粒构建正确， 得到 质粒 pXZ 177。

第三步， 将 片段整合于重组大肠杆菌 ZT-273A菌株的 ackA位点。

一步法整合片段的准备： 以 pXZ177 为模板， 用引物 ackA-FRT-up (SEQ ID No. : 102)/pta-rrnB-down (SEQ ID No. : 103)进行 PCR扩增， 获得一步法整合片段。 一步法 整合片段包括： ac 4左同源臂 50bp; FRT-km-lpdA*序列； pto右同源臂 50bp。

一步法整合： 首先将 pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至 ZT-273A, 然后将一步 法整合片段电转至带有 pKD46质粒的 ZT-273A。 电转条件同实施例 1中 (1 -2)部分 IdhA 基因敲除步骤中的第四步。取 200 μΐ菌液涂在含有氯霉素 (终浓度为 17ug/ml)的 LB平板 上， 37°C过夜培养后，挑选 5个单菌落进行 PCR验证，引物 XZ-ackA-up (SEQ ID No. :39) /lpdA-R-170 (SEQ ID No. : 101)进行 PCR验证， 挑选一个正确的单菌落， 将其命名为 ZT-273B。

使用和实施例 14 中 (1)部分相同的方法， 将人工调控元件 M1-93插入到 ZT-273B 的 基因前， 调控元件替换引物的命名对应于 tktA基因过程中所使用的引物名称， 仅将 tktA替换为 ackA或 lpdAC表 2)， 得到菌株 ZT-273。

(2)重组大肠杆菌 ZT-273的发酵

按照实施例 2 的方法， 对菌株进行培养发酵。 发酵结果见表 10。 结果表明， 在 Suc-Tl lO菌株中同时增强 tktA和 sthA基因的表达强度， 使得丁二酸产量和转化率分别 提高了 10%和 19%。 在此基础上激活丙酮酸脱氢酶， 获得额外的还原力供给丁二酸合 成。相比 Suc-Tl lO，重组大肠杆菌 ZT-273的丁二酸产量提高了 24%;转化率提高了 34%， 达到 1.5 mol/mol。 将获得的丁二酸高产菌株 ZT-273在含糖浓度更高 (7%葡萄糖)的发酵 培养基中发酵， 丁二酸产量达到 566 mM， 糖酸转化率达到 1.48 mol/mol。 表 10 : 激活 SthA、 TktA和丙酮酸脱氢酶对丁二酸生产的影响

细胞量 丁二酸产 丁二酸产率 发酵产物 nM) 菌株 a 遗传修饰

(g L) 率 (g/g) (mol/mol) 丁二酸 乙酸

Suc-T110 ^b 1.53 0.73± 0.02 1.12± 0.03 280士 10 96士 10

ZT-253 ^b Suc-ΎΙ ΙΟ, Ml -37-tktA, 1.22 0.87± 0.01 1.33± 0.01 307± 4 56± 7

Ml-37-sthA

ZT-273 ^b ΖΎ-253, Ml -93-aceEF, 1.52 0.98± 0.01 1.50± 0.02 346士 10 18± 2 ackA::Ml-934pdA*

ZT-273 ^C ZT-253, Ml-93-aceEF, 1.65 0.97± 0.01 1.48± 0.02 566士 12 29± 5 ackA::Ml-93-lpdA*

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHC0 ₃ 。 使用的中和 剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。

b 初始葡萄糖浓度为 5%。

c初始葡萄糖浓度为 7%。 将本发明获得的重组大肠杆菌和他人获得的重 组大肠杆菌进行比较 (表 11)，可以到 得如下结论：

1) 相同发酵条件下， 本发明获得的高产菌株 HX028的产量和转化率是最高的。 与 使用钾盐培养的 KJ073、 KJ122菌株相比， 本发明的发酵中使用的是钠盐， 比钾盐的成 本要低很多。另外，由于激活的磷酸戊糖途径 自身能产生二氧化碳，本发明获得的 HX024 禾口 HX028对碳酸氢根离子的需求量比较低。 中和剂组成由 2.4 M Na ₂ C0 ₃ +1.2 M NaOH 改为 1.5 M Na ₂ C0 ₃ +3 M NaOH, 丁二酸产量和转化率基本保持一致。 这就减少了碳酸 钠的使用量， 降低了生产成本。

2) AFP11 K SBS550MG这两个菌株， 虽然转化率达到 1.68禾 P 1.61 mol/mol， 但其 都是使用丰富培养基， 一方面增加了生产成本； 另一方面， 丰富培养基本身含有碳源， 导致得到的转化率偏高。 例如， AFP111菌株， 其丁二酸产量达 99.2 g/L, 丁二酸转化 率达 1.68 mol/mol(l . l gig),乙酸产量达 10 g/L,乙醇产量达 5 g/L(Vemuri et al.， 2002, J Ind Microbiol Biotechnol 28:325-332),推算出其消耗的葡萄糖为 90.2 g/L。然而，生产 99.2 g/L 丁二酸， 需要消耗葡萄糖 88.6 g/L(l g葡萄糖转化为 1.12 g丁二酸)； 生产 10 g/L乙酸， 需要消耗葡萄糖 15 g/L(l mol葡萄糖转化为 2 mol乙酸)； 生产 5 g/L乙醇， 需要消耗葡 萄糖 9.2 g/L(l mol葡萄糖转化为 2 mol乙醇 总共需要消耗 88.6+15+9.2=112.8 g/L的 葡萄糖。 实际消耗的葡萄糖比理论上需要消耗的葡萄糖 少了 112.8-90.2=22.6 g/L, 是因 为发酵培养基中还添加了 10 g/L酵母膏和 20 g/L蛋白胨。 如果葡萄糖是发酵培养基中 的唯一碳源， 那么丁二酸的转化率会降低很多。 推算最多只有 88.6/112.8=78.5%的葡萄 糖用于丁二酸合成， 另外 21.5%的葡萄糖用于乙酸和乙醇的合成。 丁二酸的转化率最多 只有 78.5% X 1.71=1.34 mol/moL

另外， AFP111、 SBS550MG这两个菌株还使用了好氧-厌氧两步法发 酵工艺， 好氧 培养使菌株生长的过程需要通空气， 增加了能量损耗， 降低了发酵罐的使用率， 提高了 生产成本。

3)菌株 KJ073在丁二酸合成过程中主要使用 PCK进行羧化反应， 单独敲除 pck基 因， 丁二酸产量降低 88%; 其他三个羧化酶对丁二酸合成的贡献不大， 分别敲除其他三 个羧化酶基因 (f!pc, maeA, maeB),丁二酸产量分别降低 4%， 7%和 7%(Zhang et al.， 2009a,

Proc Natl Acad Sci USA 106:20180-20185)。

本发明获得的高产菌株 HX024, 四个羧化酶对丁二酸合成都有一定的贡献， PPC 的贡献最大。 单独敲除^ c基因， 种子不能在无机盐培养基中生产； 使用 LB培养基准 备种子，再在无机盐发酵培养基中发酵，丁二 酸产量下降 70%。单独敲除 maeA, maeB 基因， 丁二酸产量分别降低 38%， 49%和 29%。

4) 和 Suc-Tl lO 系列菌株背景最相似的是 XZ721 (Zhang et al.， AEM, 2009b,

75 :7807-7813), 它们都没有经过进化代谢。

和 Suc-Tl lO相比， 本发明通过组合改造 和 W/^， 获得重组大肠杆菌 ZT-253 , 将丁二酸的产量提高了 10%， 转化率提高了 19%。 和 Suc-Tl lO相比， 本发明通过组合 改造 tktA、 sthA和丙酮酸脱氢酶， 获得重组大肠杆菌 ZT-273 , 将丁二酸的产量提高了 24%, 转化率提高了 34%。

本发明获得的重组菌株 ZT-273发酵 50 g/L葡萄糖， 能生产 40.8 g/L(346 mM)丁二 酸， 转化率达 0.98 g/g(1.50 mol/mol), 丁二酸生产能力优于 XZ721。 重组菌株 ZT-273 发酵 70 g/L葡萄糖， 能生产 66.8 g/L(566 mM)丁二酸， 转化率达 0.97 g/g(1.48 mol/mol) ₀ 表 11 : 比较不同重组大肠杆菌生产丁二酸的能力 菌株 修饰 发酵条件 丁二酸 丁 二 文献

浓 度 酸 转

(mM) 化 率

(mol/m

ol)

高产菌株的比较

HX024 ATCC 8739, MdhA, ApflB, 无机盐培养基， 915 1.37 本发明

Aptsl, Ppck*-galP, pck*, 厌氧批式，

AackA-pta, Ppck*-aceBA, 12%葡萄糖

Ppck*-dcuC, AmgsA

钠盐中进化代谢

HX028 ATCC 8739, MdhA, ApflB, 无机盐培养基， 1042 1.56 本发明

Aptsl, Ppck^-galP, pck^, 厌氧批式，

AackA-pta, Ppck^-aceBA, 12%葡萄糖

Ppck^-dcuC, AmgsA, AadhE,，

AtdcDE

钠盐中进化代谢

KJ073 MdhA, Z^adhE, 无机盐培养基，厌 668 1.2 Jantama et

AfocA-pflB, A ckA, AmgsA, 氧批式， al, 2008a

ΔροχΒ, 10%葡萄糖

钾盐中进化代谢

KJ122 MdhA, AadhE, 无机盐培养基， 680 1.36 Jantama et

AfocA-pflB, AackA, AmgsA, 厌氧批式， al" 2008b

ApoxB, AtdcDE, AaspC, AsfcA 10%葡萄糖

钾盐中进化代谢

AFP111 ApflAB, MdhA, AptsG, 丰 Θ培养基， 841 1.68 Vemuri et al.,

¾¾¾ Rhizobium etli的丙酉同 好氧 -厌氧两步法 2002 酸羧化酶

SBS550M MdhA, AadhE, AiclR, 丰 S培养基， 339 1.61 Sanchez et

G AackA-pta, 好氧 -厌氧两步法 al. 2005

过表达 Lactococcus

lactis的丙酮酸羧化酶 关键基因改造后的菌株

XZ721 pck*, Aptsl, ApflB 无机盐培养基， 327 1.25 Zhang et al., 厌氧批式， 2009a

5%葡萄糖 Suc-Tl lO MdhA, ApflB, Aptsl, 无机盐培养基， 280 1.12 本发明 Ppck*-galP, Ppck*-pck 厌氧批式，

5%葡萄糖

ZT-253 uc-TUQ, Ml-37-tktA, 无机盐培养基， 307 1.33 本发明

Ml-37-sthA 厌氧批式，

5%葡萄糖

ZT-273 ΖΎ-253, Ml -93-aceEF, 无机盐培养基， 346 1.50 本发明

ackA::Ml-93-lpdA* 厌氧批式，

5%葡萄糖

ZT-253 uc-TUQ, Ml-37-tktA, 无机盐培养基， 506 1.36 本发明

Ml-37-sthA 厌氧批式，

7%葡萄糖

ZT-273 ΖΎ-253, Ml -93-aceEF, 无机盐培养基， 566 1.48 本发明

ackA::Ml-93-lpdA* 厌氧批式，

7%葡萄糖 实施例 16: 重组大肠杆菌 NZ-512、 NZ-513、 NZ-514和 NZ-517的构建

(1) 重组大肠杆菌 NZ-512的构建 (表 1)， 分为以下 2个步骤：

醇脱氢酶基因 adhE的敲除： 按照实施例 1中 (1)部分的方法， 从 Suc-Tl lO菌株出 发， 敲除 αί/ 基因 (GenbankNo: ACA78022.1)， 得到重组菌株 NZ-511(表 1); 构建的质 粒见表 3， 使用的引物序列见表 2， 其中引物的命名对应于敲除 /^¾4基因过程中所使用 的名称， 仅将 ldhA替换为 adhE。

丙酮酸甲酸裂解酶基 的恢复： 从重组菌株 NZ-511(表 1)出发， 按照实施例 1 中 (1)部分的方法，将 Δρ 基因恢复为野生型大肠杆菌 ATCC 8739的 pflB基因 (GenBank No: ACA78322.1), 仅在第二次同源重组时， 以野生型大肠杆菌 ATCC 8739菌 DNA为 模板， 用引物 XZ-pflB-up/XZ-pflB-down扩增出 2260bp的 DNA片段； 得到重组菌株 NZ-512 (表 1)。 构建的质粒见表 3， 使用的引物序列见表 2， 其中引物的命名对应于敲 除 ldhA基因过程中所使用的名称， 仅将 ldhA替换为 pflB。

(2) 激活 TktA和 SthA构建重组大肠杆菌 NZ-513、 NZ-517和 NZ-514

按照实施例 14 中（1)部分的方法， 将 NZ-512 菌株中 tktA 基因（GenBank

No:ACA76448.1)的原始调控元件替换为人工调控� ��件 M1-37(SEQ ID No. : 109), 得到菌 株 NZ-513(表 1)； 使用同样的方法， 将 NZ-512 禾 P NZ-513 中 sthA 基因 (GenBank No:ACA79653.1)的原始调控元件替换为人工调控元� �� M1-37 , 得到菌株 NZ-517 和 NZ-514 (表 1)， 所使用的引物见表 2， 其中所使用的引物的命名对应于 基因调控元 件替换过程中所使用的引物的名称， 仅将 tktA替换为 sthA。 实施例 17: 重组大肠杆菌 NZ-512、 NZ-513、 NZ-514和 NZ-517的发酵

按照实施例 2的方法， 对菌株进行培养发酵。 发酵结果见表 12。 结果表明， 在敲 除 αί/ 和恢复 的菌株 NZ-512中，丁二酸的产量为 289 mM，转化率为 1.18 mol/mol, 和 Suc-Tl lO相比无显著差异。

在 NZ-512的基础上单独激活 基因的表达， 得到菌株 NZ-513 , 其丁二酸的产 量和转化率比 NZ-512提高了 4%和 6%;在 NZ-512的基础上单独激活 sthA基因的表达， 得到菌株 NZ-517, 丁二酸的产量和转化率比 NZ-512提高了 7%和 5%; 在 NZ-512的基 础上同时激活 和 基因的表达强度， 得到的菌株 NZ-514, 其丁二酸的产量和转 化率比 NZ-512提高了 9%和 11%。 这些结果说明协同利用 tktA和 sthA基因， 可以将磷 酸戊糖途径产生的 NADPH转变成 NADH, 更有利于丁二酸合成。 表 12 ：: 重组大肠杆菌 NZ-512、 NZ-513、 NZ-514和 NZ-517发酵生产丁二酸

遗传修饰 细胞量 丁二酸产 丁二酸产率 发酵产物 M) 菌株 a

(g L) 率 (g/g) (mol/mol)

丁二酸 乙酸 甲酸

Suc-Tl lO ATCC 8739, MdhA, 1.53 0.73±0.02 1.12±0.03 280±10 96±10 0

ApflB, Aptsl,

Ppck*-galP, Ppck*-pck

NZ-512 ATCC 8739, MdhA, 1.5 0.77±0.01 1.18±0.02 289±6 89±10 58±2

Aptsl, Ppck*-galP,

Ppck*-pck, ^adhE

NZ-513 ATCC8739, MdhA, 1.54 0.82±0.01 1.25±0.01 300±2 60±4 60±4

Aptsl, Ppck*-galP,

Ppck*-pck, ^adhE,

Ml -37 -tktA

NZ-517 ATCC 8739, MdhA, 1.6 0.8±0.01 1.24±0.01 310±3 84±2 68±2

Aptsl, AadhE,

Ppck*-galP,

Ppck*-pck,

Ml -37 -sthA

NZ-514 ATCC8739, MdhA, 1.59 0.86±0.02 1.31±0.02 315±2 52±4 52±4

Aptsl, Ppck*-galP,

Ppck*-pck,

AadhE ^-37-tktA,

Ml-37-sthA

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHC0 ₃ 。 使用的中和 剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 初始葡萄糖浓度为 5%。 实施例 18 : 提高 Suc-Tl lO菌株的 Zwf酶活对丁二酸生产的影响

( 1 ) 调控 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 zw/基因的重组大肠杆菌的构建

将 Suc-Tl lO菌株中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 ZH/基因 (GenBank No:ACA77430. i;>的原始 调控元件替换为人工调控元件， 重组菌株的构建方法如下：

第一步同源重组： 以 pXZ-CS 质粒为模板， 使用引物 zwf-cat-sacB-up 和 zwf-cat-sacB-down扩增 DNA片段 I，用于第一次同源重组。引物序列见表 2;得到 2717 bp DNA片段 I， 将所得 DNA扩增片段 I电转至带有 pKD46质粒的大肠杆菌 Suc-Tl lO 中， 筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落， 得到中间重组菌；

第二步同源重组：以重组大肠杆菌 Ml-93(Lu et al.2012, Appl Microbiol Biotechnol 93 : 2455-2462； SEQ ID No. : 110)的基因组 DNA 为模板， 使用引物 zwf-P-up 禾口 zwf-RBSL-down, 得到包含 zw/启动子两侧同源臂和人工调控元件的 189 bp的 DNA片 段 RBSL-zwf; 引物序列见表 2。

将所述 189 bp的片段 R5ffi-zw/电转入整合 DNA片段 I的中间重组菌， 得到重组 菌。 电转化和筛选方法与 敲除步骤中第六步相同。

重组菌的 PCR验证的引物 zwf-YZ-up/zwf-YZ-down，随机挑选 10个得到测序正确 的阳性菌落用于后续 Zwf酶活的测定。

(2) 重组大肠杆菌 Zwf酶活的测定

取 30 ml 对数生长中后期的发酵液于 50 ml 离心管中， 在 4°C下 10000 rpm 离心 5 min, 弃去上清液， 收集菌体， 用 15 ml 100 mM Tris-HCl buffer洗涤 2次后， 将菌体悬 浮 3 ml 100 mM Tris-HCl， 冰浴超声 （功率： 25W; 开： Is; 关： 3s)破碎 3-5 min至澄 清， 4°C下 10000 rpm离心 20 min, 收集上清用于酶活测定。

Zwf酶活检测反应体系为： 反应缓冲液 990 μ1 ( 100 mM Tris、 10 mM MgCl ₂ 、 1 mM DTT、 0.5 mM NADP ⁺ 、 2 mM 6-磷酸葡萄糖； pH 7.5 )， 加入 10 μΐ上述超声离心后的上 清液， 混匀后置于比色皿中， 记录 Α340 的变化情况 (Lamed et al. 1980, J Bacterid 141 : 1251-1257; Kabir and Shimizu, 2003, J Bacterid 105: 11-31)。 空白对照为反应缓冲液 液加入 10 μΐ的 dd¾0。 NAD(P)H在 340 nm处的消光系数为 6.22 cm ^-1 mM ^_1 。 酶活力 单位 （U) 定义为： 每分钟每 mg蛋白形成 1 μιηοΐ 的 NADPH。

( 3 ) 重组大肠杆菌发酵生产丁二酸

从 （2) 中筛选出 Zwf酶活有差异的重组菌株 ZT-311、 ZT-312、 ZT-313、 ZT-314, 其中， 菌株 ZT-311是将 Suc-Tl lO菌株中 zw/基因的原始调控元件替换为人工调控元件 RBSLl-zwf(SEQ JD NO: 142)； ZT-312将 Suc-Tl lO菌株中 zw/基因的原始调控元件替换 为人工调控元件 RASZ2-«； SEQ ID NO: 143)； ZT-313是将 Suc-T110菌株中 zw/基因的 原始调控元件替换为人工调控元件 RASZ3-zw SEQ ID NO: 144)； ZT-314是将 Suc-Tl lO 菌株中 zw/基因的原始调控元件替换为人工调控元件 R5ffi¥-zw/(SEQ ID N0: 145)。

按照实施例 2的方法对 Suc-Tl lO以及重组菌株 ZT-311、 ZT-312、 ZT-313、 ZT-314 进行厌氧发酵。 发酵结果见表 13。 结果表明， 在一定范围内， 随着 Zwf酶活的提高， 丁二酸的产量和转化率均显著提高 （图 9)， 其中最优值出现在当 Zwf酶活处于中等活 性 （1.50 U/mg) 时， 此时菌株 ZT-312的丁二酸产量和转化率分别为 338 mM和 1.44 mol/mol, 比出发菌株 Suc-Tl lO分别提高了 29%和 29%。 表明， Zwf酶活的提高， 有利 于 PPP的激活， 能够提供更多的还原力供给菌株丁二酸的合成 。

但是， 在此基础上继续提高 Zwf 的酶活， 丁二酸产量和转化率均有不同程度的降 低 （图 9)。 拥有更高 Zwf酶活的菌株 ZT-313 (Zwf: 2.16 U/mg) 的丁二酸产量和转化 率分别为 322 mM和 1.37 mol/mol, 比 ZT-312降低了 5%和 5%。 表 13 : 提高 Suc-Tl lO菌株的 Zwf酶活对丁二酸生产的影响 细胞量 丁二酸产率 丁二酸产率 Zwf酶活 发酵产物 nM) 菌株 a 遗传修饰

(g L) (g/g) (mol/mol) (U/mg) 丁二酸 乙酸

Suc-Tl lO 1.53 0.73±0.02 1.12±0.03 0.13±0.01 263±2 90±6

Suc-Tl lO,

ZT-311 1.21 0.90±0.01 1.37±0.01 0.80±0.02 322±3 85±3

RBSLl-zwf

Suc-Tl lO,

ZT-312 1.47 0.94±0.02 1.44±0.02 1.50±0.03 338±4 79±3

RBSL2-zwf

Suc-Tl lO,

ZT-313 1.36 0.90±0.01 1.37±0.01 2.16±0.01 322±3 76±4

RBSL3-zwf

Suc-Tl lO,

ZT-314 1.38 0.89±0.01 1.36±0.02 2.47±0.03 320±4 84±5

RBSL4-zwf

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHCO: 使用的中和剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 初始葡萄糖浓度为 235 mM。 实施例 19: 提高 Suc-Tl lO菌株的 Pgl酶活对丁二酸生产的影响

( 1 ) 调控 6-磷酸葡糖酸内酯酶；g/基因的重组大肠杆菌� �构建

将 Suc-Tl lO菌株中 6-磷酸葡糖酸内酯酶/g/基因 (GenBank No:ACA78522.1)的原始 调控元件替换为人工调控元件，重组菌株的构 建方法同实施例 18，所使用的引物见表 2， 其中所使用的引物的命名对应于 zw/调控元件替换过程中所使用的引物的名称， 仅将 zwf替换为 pgl。 随机挑选 10个得到测序正确的阳性菌落用于后续 Pgl酶活的测定。

(2) 重组大肠杆菌 Pgl酶活的测定

重组菌株粗酶液的制备方法同实施例 18。

Pgl酶活检测反应体系为： 反应缓冲液 990 μΐ (25 mM HEPES、 2 mM MgCl ₂ 、 1 mM NADP ⁺ 、 0.5 mM 6-磷酸葡萄糖、 1 U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶； pH 7.1 )，室温静置 8分钟后， 加入 1.5 U 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和 10 μΐ上述超声离心后的上清液， 混匀后置于比色 皿中， 记录 Α340的变化情况 (Stanford et al. 2004, Genetics 168: 117-127)。 空白对照为反 应缓冲液液加入 10 μΐ的 ddH20。 NAD(P)H在 340 nm处的消光系数为 6.22 cm ^-1 mM ^_1 。 酶活力单位 （U) 定义为： 每分钟每 mg蛋白形成 1 μιηοΐ 的 NADPH。

( 3 ) 重组大肠杆菌发酵生产丁二酸

从 （2) 中筛选出 Pgl酶活有差异的重组菌株 ZT-321、 ZT-322 ZT-323、 ΖΤ-324, 其中， 菌株 ΖΤ-321是将 Suc-Tl lO菌株中 pg/基因的原始调控元件替换为人工调控元件 RBSLl-pgl (SEQ ID NO: 146)； ZT-322将 Suc-Tl lO菌株中 pgl基因的原始调控元件替换 为人工调控元件 RAST^pg/ CSEQ ID NO: 147)； ZT-323是将 Suc-T110菌株中 pg/基因的 原始调控元件替换为人工调控元件 R55Z3-/^/ (SEQ ID NO: 148)； ZT-324是将 Suc-Tl lO 菌株中 pg/基因的原始调控元件替换为人工调控元件 RBSL4-pgl (SEQ ID NO: 149)。

按照实施例 2的方法，对 Suc-Tl lO以及重组菌株 ZT-321、 ZT-322 ZT-323、 ZT-324 进行厌氧发酵， 发酵结果见表 14。 结果表明， 在一定范围内， 随着 Pgl酶活的提高， 丁 二酸的产量和转化率均显著提高 （图 10)， 其中最优值出现在当 Pgl酶活处于中等活性 (Pgl: 2.44 U/mg)时， 此时菌株 ZT-321的丁二酸产量和转化率分别为 321 mM和 1.33 mol/mol, 比出发菌株 Suc-Tl lO分别提高了 19%和 19%。 表明， Pgl酶活的提高， 有利 于 PPP的激活， 能够提供更多的还原力供给重组菌株丁二酸的 合成。

但是， 在此基础上继续提高 Pgl的酶活， 丁二酸产量和转化率均有不同程度的降低 (图 10)， 拥有更高 Pgl酶活的菌株 ZT-323 (Pgl: 5.34 U/mg) 的丁二酸产量和转化率 分别为 308 mM和 1.28 mol/mol, 比 ZT-321降低了 4%和 4%。 表 14: 提高 Suc-Tl lO菌株的 Pgl酶活对丁二酸生产的影响

细胞量 丁二酸产率 丁二酸产率 Pgl酶活 发酵产物 M) 菌株 a 遗传修饰

(g L) (g/g) (mol/mol) (U/mg) 丁二酸 乙酸

Suc-Tl lO 1.53 0.73±0.02 1.12±0.03 0.71±0.02 270±5 89±5

Suc-Tl lO,

ZT-321 1.39 0.87±0.01 1.33±0.01 2.44±0.05 321±3 69±4

RBSLl-pgl

Suc-Tl lO,

ZT-322 1.68 0.86±0.01 1.31±0.02 3.05±0.03 316±4 63±4

RBSL2-pgl

Suc-Tl lO,

ZT-323 1.57 0.84±0.01 1.28±0.01 5.34±0.09 308±3 69±5

RBSL3-pgl

Suc-Tl lO,

ΖΤ-324 1.87 0.83±0.01 1.26±0.02 5.74±0.11 294±4 75±7

RBSL4-pgl

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHCO: 使用的中和剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 初始葡萄糖浓度为 241 mM。 实施例 20: 提高 Suc-Tl lO菌株的 Gnd酶活对丁二酸生产的影响

( 1 ) 调控 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 gm/基因的重组大肠杆菌的构建

将 Suc-Tl lO菌株中 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 gm/基因 (GenBank No:ACA76645. i;>的原 始调控元件替换为人工调控元件， 重组菌株的构建方法同实施例 18， 所使用的引物见 表 2， 其中所使用的引物的命名对应于 zw/调控元件替换过程中所使用的引物的名称， 仅将 zwf替换为 gnd。 随机挑选 10个得到测序正确的阳性菌落用于后续 Gnd酶活的测 定。

(2) 重组大肠杆菌 Gnd酶活的测定

重组菌株粗酶液的制备方法同实施例 18。

Gnd酶活检测反应体系为： 反应缓冲液 990 μΐ ( 100 mM Tris、 10 mM MgCl ₂ 、 1 mM DTT、 0.5 mM NADP ⁺ 、 2 mM 6-磷酸葡萄糖酸； pH 7.5 )， 加入 10 μΐ上述超声离心后的 上清液， 混匀后置于比色皿中， 记录 Α340的变化情况 (Padilla et al. 2004, Appl Environ Microbiol70:370-376)。空白对照为反应缓冲液液加� �� 10 μΐ的 ddH20。NAD(P)H在 340nm 处的消光系数为 6.22 cm" ¹ m T ¹ 。酶活力单位（U)定义为：每分钟每 mg蛋白形成 1 μιηοΐ 的 NADPHo

( 3 ) 重组大肠杆菌发酵生产丁二酸

从 （2) 中筛选出 Gnd酶活有差异的重组菌株 ZT-331、 ΖΤ-332、 ΖΤ-333、 ΖΤ-334, 其中，菌株 ΖΤ-331是将 Suc-Tl lO菌株中 gm/基因的原始调控元件替换为人工调控元件 RBSLl-gnd (SEQ ID NO: 150)； ZT-332将 Suc-Tl lO菌株中 gm/基因的原始调控元件替 换为人工调控元件 RASZ2-gm/ (SEQ ID NO: 151)； ZT-333是将 Suc-Tl lO菌株中 gm/基 因的原始调控元件替换为人工调控元件 R55Z3-gm/ (SEQ ID NO: 152)； ZT-334是将 Suc-Tl lO菌株中 gm/基因的原始调控元件替换为人工调控元件 R5ffi¥-gm/ (SEQ ID NO: 153)。

按照实施例 2的方法，对 Suc-Tl lO以及重组菌株 ZT-331、 ZT-332、 ZT-333、 ZT-334 进行厌氧发酵， 发酵结果见表 15。 结果表明， 在一定范围内， 随着 Gnd酶活的提高， 丁二酸的产量和转化率均显著提高 （图 11 )， 最优值出现在当 Gnd酶活处于中等活性

( Gnd: 5.71 U/mg)时，此时菌株 ZT-333的丁二酸产量和转化率分别为 320 mM和 1.31 mol/mol, 比出发菌株 Suc-Tl lO分别提高了 17%和 17%。 表明， Gnd酶活的提高， 有利 于 PPP的激活， 能够提供更多的还原力供给重组菌株丁二酸的 合成。

但是在此基础上继续提高 Gnd 的酶活， 丁二酸产量和转化率均有不同程度的降低

(图 11 )。拥有更高 Gnd酶活的菌株 ZT-334 ( Gnd: 11.3 U/mg)的丁二酸产量和转化率 分别为 278 mM和 1.24 mol/mol, 比 ZT-333降低了 13%和 5%。 表 15 : 提高 Suc-Tl lO菌株的 Gnd酶活对丁二酸生产的影响

丁二酸产 发酵产物 (mM) 细胞量 丁二酸产 Gnd酶活

菌株 a 遗传修饰

(g/L) 率 (g/g) (U/mg) 丁二酸 乙酸

(mol/mol)

Suc-Tl lO 1.53 0.73±0.02 1.12±0.02 0.42±0.02 273±4 93±4

Suc-Tl lO,

ZT-331 1.46 0.83±0.01 1.27±0.02 2.41±0.06 308±5 62±5

RBSLl-gnd

Suc-Tl lO,

ΖΤ-332 1.39 0.85±0.01 1.29±0.01 4.90±0.10 314±3 80±7

RBSL2-gnd

Suc-Tl lO,

ZT-333 1.75 0.86±0.01 1.31±0.01 5.71±0.16 320±2 78±6

RBSL3-gnd

Suc-Tl lO,

ZT-334 1.16 0.81±0.01 1.24±0.02 11.3±0.23 278±5 82±10

RBSL4-gnd

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHC0 ₃ 。 使用的中和剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 初始葡萄糖浓度为 244 mM。 实施例 21 : 提高 Suc-Tl lO菌株的 Tkt酶活对丁二酸生产的影响

( 1 ) 调控转酮醇酶 基因的重组大肠杆菌的构建

将 Suc-Tl 10菌株中转酮醇酶 基因 (GenBank No: ACA76448.1；)的原始调控元件替 换为人工调控元件， 重组菌株的构建方法同实施例 18， 所使用的引物见表 2， 其中所使 用的引物的命名对应于 zw/调控元件替换过程中所使用的引物的名称， 仅将 zwf替换为 tktA。 随机挑选 10个得到测序正确的阳性菌落用于后续 Tkt酶活的测定。

(2) 重组大肠杆菌 Tkt酶活的测定

重组菌株粗酶液的制备方法同实施例 18。

Tkt酶活检测反应体系为：反应缓冲液 990 μ1( 50 mM Tris、0.24 mM MgCl ₂ 、0.01 mM TPP、 0.25 mM NADH、 3 U 3-磷酸甘油脱氢酶、 10 U磷酸丙酮异构酶、 0.5 mM D-5- 磷酸木酮糖、 0.5 mM D-5-磷酸核糖； pH 7.5 )， 加入 10 μΐ上述超声离心后的上清液， 混匀后置于比色皿中， 记录 A340的变化情况。 空白对照为反应缓冲液液加入 10 μΐ的 ddH ₂ O o NAD(P)H在 340 nm处的消光系数为 6.22 cm ^-1 rnMT ¹ ₀ 酶活力单位（U)定义为： 每分钟每 mg蛋白消耗 1 μιηοΐ 的 NADH。

( 3 ) 重组大肠杆菌发酵生产丁二酸

从 （2) 中筛选出 Tkt酶活有差异的重组菌株 ZT-361、 ΖΤ-362、 ΖΤ-363 , 其中， 菌 株 ZT-361 是将 Suc-Tl lO 菌株中 tktA 基因的原始调控元件替换为人工调控元件 RBSLl-tktA (SEQ ID NO: 154)； ZT-362将 Suc-Tl 10菌株中 tktA基因的原始调控元件替 换为人工调控元件 RASZ2-tA (SEQ ID NO: 155)； ZT-363是将 Suc-Tl lO菌株中 tktA基 因的原始调控元件替换为人工调控元件 R55Z3-tA (SEQ ID NO: 156)； ZT-251是将 Suc-Tl lO菌株中 tktA基因的原始调控元件替换为人工调控元件 (SEQ ID NO: 157)。

按照实施例 2的方法，对 Suc-Tl lO以及重组菌株 ZT-361、 ZT-362、 ZT-363 ZT-251 进行厌氧发酵。 发酵结果见表 16。 结果表明， 在一定范围内， 随着 Tkt酶活的提高， 丁二酸的产量和转化率均显著提高 （图 12)， 其中最优值出现在当 Tkt酶活处于中等活 性 （Tkt: 0.61 U/mg) 时， 此时菌株 ZT-361的丁二酸产量和转化率分别为 326 mM和 1.37 mol/mol, 比出发菌株 Suc-Tl lO分别提高了 22%和 22%。 表明， Tkt酶活的提高， 有利于 PPP的激活， 能够提供更多的还原力供给重组菌株丁二酸的 合成。

但是， 在此基础上继续提高 Tkt的酶活， 丁二酸产量和转化率均有不同程度的降低 (图 12)。 拥有更高 Tkt酶活的菌株 ZT-251 ( Tkt: 1.20 U/mg) 的丁二酸产量和转化率 分别为 300 mM和 1.26 mol/mol, 比 ZT-361降低了 8%和 8%。 表 16: 提高 Suc-Tl lO菌株的 Tkt酶活对丁二酸生产的影响

细胞量 丁二酸产 丁二酸产率 发酵产物 (mM) 菌株 a 遗传修饰

(g L) 率 (g/g) (mol/mol) 丁二酸 乙酸

Suc-Tl lO 1.53 0.73±0.01 1.12±0.01 0.07±0.02 267±3 91±4

Suc-Tl lO,

ZT-361 1.43 0.90±0.01 1.37±0.01 0.61±0.01 326±2 60±5

RBSLl-tktA

Suc-Tl lO,

ZT-362 1.39 0.90±0.01 1.36±0.01 0.68±0.02 324±3 61±4

RBSL2-tktA

Suc-Tl lO,

ZT-363 1.57 0.88±0.01 1.34±0.01 1.10±0.05 319±2 62±6

RBSL3-tktA

Suc-Tl lO,

ZT-251 1.36 0.83±0.01 1.26±0.02 1.20±0.07 300±5 77±6

Ml -37 -tktA

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHC0 ₃ 。 使用的中和剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 初始葡萄糖浓度为 238 mM。 实施例 22: 提高 Suc-Tl lO菌株的 TalB酶活对丁二酸生产的影响

( 1 ) 调控转醛醇酶 toffi基因的重组大肠杆菌的构建

将 Suc-Tl lO菌株中转醛醇酶 toffl基因 (GenBank No:ACA79258.1)的原始调控元件替 换为人工调控元件， 重组菌株的构建方法同实施例 18， 所使用的引物见表 2， 其中所使 用的引物的命名对应于 zw/调控元件替换过程中所使用的引物的名称， 仅将 zwf替换为 talB。 随机挑选 10个得到测序正确的阳性菌落用于后续 Tal酶活的测定。

(2) 重组大肠杆菌 Tal酶活的测定

重组菌株粗酶液的制备方法同实施例 18。 唯一不同之处在于所使用的缓冲液是 50 mM HEPES buffer (pH 8.5)。

Tal酶活检测反应体系为： 反应缓冲液 990 μΐ ( 50 mM HEPES 0.24 mM MgCl ₂ 、 0.5 mM NADP ⁺ 、 10 U 6-磷酸葡萄糖异构酶、 3 U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、 0.5 mM D-7-景 天庚糖、 0.5 mM 3-磷酸甘油醛； pH 8.5 )， 加入 10 μΐ上述超声离心后的上清液， 混匀后 置于比色皿中， 记录 Α340的变化情况 (Sprenger et al. 1995, J Bacterid 177:5930-5936)。 空白对照为反应缓冲液液加入 10 μΐ的 ddH ₂ 0。NAD(P)H在 340nm处的消光系数为 6.22 cm" ¹ mMT 酶活力单位 （U) 定义为： 每分钟每 mg蛋白产生 1 μιηοΐ 的 NADPH。

( 3 ) 重组大肠杆菌发酵生产丁二酸

从 （2) 中筛选出 Tal酶活有差异的重组菌株 ZT-371、 ΖΤ-372、 ΖΤ-373、 ΖΤ-374, 其中，菌株 ZT-371是将 Suc-Tl lO菌株中 talB基因的原始调控元件替换为人工调控元件 RBSLl-talB (SEQ ID NO: 158)； ZT-372将 Suc-Tl 10菌株中 talB基因的原始调控元件替 换为人工调控元件 RBSL2-talB (SEQ ID NO: 159)； ZT-373是将 Suc-Tl lO菌株中 talB基 因的原始调控元件替换为人工调控元件 RBSU-talB (SEQ ID NO: 160)； ZT-374 是将 Suc-Tl lO菌株中 toffl基因的原始调控元件替换为人工调控元件 RASZ¥-toffi (SEQ ID NO: 161) o

按照实施例 2的方法，对 Suc-Tl lO以及重组菌株 ZT-371、 ZT-372、 ZT-373、 ZT-374 进行厌氧发酵。 发酵结果见表 17。 结果表明， 在一定范围内， 随着 Tal酶活的提高， 丁 二酸的产量和转化率均显著提高 （图 13 )， 其中最优值出现在当 Tal酶活处于中等活性 ( Tal: 0.20 U/mg)时， 此时菌株 ZT-372的丁二酸产量和转化率分别为 338 mM和 1.42 mol/mol, 比出发菌株 Suc-Tl lO分别提高了 27%和 27%。 Tal酶活的提高， 有利于 PPP 的激活， 能够提供更多的还原力供给重组菌株丁二酸的 合成。

但是， 在此基础上继续提高 Tal的酶活， 丁二酸产量和转化率均有不同程度的降低 (图 13 )。 拥有更高 Tal酶活的菌株 ZT-374 ( Tal: 0.26 U/mg) 的丁二酸产量和转化率 分别为 309 mM和 1.30 mol/mol, 比 ZT-372降低了 8%和 8%。 表 17: 提高 Suc-Tl lO菌株的 TalB酶活对丁二酸生产的影响

细胞量 丁二酸产 丁二酸产率 Tal酶活 发酵产物 nM) 菌株 a 遗传修饰

(g/L) 率 (g/g) (mol/mol) (U/mg) 丁二酸 乙酸

Suc-Tl lO 1.53 0.73±0.01 1.12±0.01 0.054±0.001 267±3 90±4

Suc-Tl lO,

ZT-371 1.46 0.90±0.01 1.36±0.01 0.14±0.02 324±3 68±7

RBSLl-talB

Suc-Tl lO,

ZT-372 1.40 0.90±0.01 1.42±0.01 0.20±0.03 338±5 62±9

RBSL2-talB

Suc-Tl lO,

ZT-373 1.55 0.88±0.01 1.35±0.01 0.23±0.01 321±3 55±4

RBSL3-talB

ZT-374 Suc-Tl lO, 1.54 0.83±0.01 1.30±0.02 0.26±0.03 309±4 75±7 RBSL4-talB

a使用 500 ml的发酵罐， 发酵培养基为 250 ml。 发酵培养基中加入了 100 mM KHC0 ₃ 。 使用的中和剂为 2.4 M K ₂ C0 ₃ 和 1.2 M KOH。 初始葡萄糖浓度为 238 mM。 参考文献：

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