| WO/1999/024579 | NOVEL ERA |
| JP7407176 | Treatment and prevention of house dust mite allergy |
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ASHIUCHI, M. ET AL.: "Enzymatic synthesis of high-molecular-mass poly-gamma-glutamate and regulation of its stereochemistry.", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 70, no. 7, July 2004 (2004-07-01), pages 4249 - 4255, XP002339209
CANDELA, T. ET AL.: "Poly-gamma-glutamate in bacteria.", MOL. MICROBIOL., vol. 60, no. 5, June 2006 (2006-06-01), pages 1091 - 1098, XP002468650
URUSHIBATA, Y. ET AL.: "Characterization of the Bacillus subtilis ywsC gene, involved in gamma-polyglutamic acid production.", J. BACTERIOL., vol. 184, no. 2, January 2002 (2002-01-01), pages 337 - 343, XP002339775
ASHIUCHI, M. ET AL.: "Physiological and biochemical characteristics of poly gamma- glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis.", EUR. J. BIOCHEM., vol. 268, October 2001 (2001-10-01), pages 5321 - 5328, XP008132387
ASHIUCHI, M. ET AL.: "A poly-gamma-glutamate synthetic system of Bacillus subtilis IFO 3336: gene cloning and biochemical analysis of poly-gamma-glutamate produced by Escherichia coli clone cells.", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 263, September 1999 (1999-09-01), pages 6 - 12, XP002986618
HARUO MISONO: "Biopolymer, Poly-gamma-glutamate no Seigosei Kiko", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY CHUSHIKOKU SHIBU DAI 6 KAI KOENKAI KOEN YOSHISHU, 31 May 2003 (2003-05-31), pages 10
ASHIUCHI, M. ET AL., APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 59, 2002, pages 9 - 14
ASHIUCHI, M. ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 70, 2006, pages 1794 - 1797
URUSHIBATA, Y. ET AL., J. BACTERIOL., vol. 184, 2002, pages 337 - 343
MAKOTO ASHIUCHI ET AL., MIRAI ZAIRYO, vol. 3, 2003, pages 44 - 50
ASHIUCHI, M. ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 268, 2001, pages 5321 - 5328
ASHIUCHI, M. ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 263, 1999, pages 5 - 12
JIANG, H. ET AL., BIOTECHNOL. LETT., vol. 28, 2006, pages 1241 - 1246
PRESECAN, E. ET AL., MICROBIOLOGY, vol. 143, 1997, pages 3313 - 3328
ITAYA, M. ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 63, 1999, pages 2034 - 2037
TADAYUKI IMANAKA ET AL.: "Biseibutsu Riyou no Daitenkai", 2002, pages: 657 - 663
SHIMIZU, K. ET AL., APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 73, 2007, pages 2378 - 2379
LIPMAN, DJ.; PEARSON, WR., SCIENCE, vol. 227, 1985, pages 1435 - 1441
JOSEPH SAMBROOK; DAVID W. RUSSELL: "Molecular Cloning - A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
YAMAGUCHI, F. ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 60, 1996, pages 255 - 258
OGAWA, Y. ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 61, 1997, pages 1684 - 1687
ASHIUCHI, M. ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 263, 1999, pages 6 - 12
KUBOTA, H. ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 57, 1993, pages 1212 - 1213
KIMURA, K. ET AL., MICROBIOLOGY, vol. 150, 2003, pages 4115 - 4123
LEENHOUTS, K. ET AL., MOL. GEN. GENET., vol. 253, 1996, pages 217 - 224
ITAYA, M.; TANAKA, T., MOL. GEN. GENET., vol. 223, 1990, pages 268 - 272
HORTON, RM. ET AL., GENE, vol. 77, 1989, pages 61 - 68
MOL. GEN. GENET., vol. 223, 1990, pages 268
CHAMG, S.; COHEN, SH., MOL. GEN. GENET., vol. 168, 1979, pages 111 - 115
YOUNG, FE.; SPIZIZEN, J., J. BACTERIOL., vol. 86, 1963, pages 392 - 400
HORINOUCHI, S.; WEISBLUM, B., J. BACTERIOL., vol. 150, 1982, pages 815 - 825
See also references of EP 2196534A4
| ポリ-ガンマ-グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入し、且つ、枯草菌における pgsA 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を上記宿主微生物に導入していない、ポリ-ガンマ-グルタミン酸生産能を有する組換え微生物。 |
| 上記 pgsB
遺伝子が以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1記載の組換え微生物 (a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質 (b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質 |
| 上記 pgsC
遺伝子が以下の(c)又は(d)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1または2記載の組換え微生物 (c)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質 (d)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、上記 pgsB 遺伝子がコードするPgsBタンパク質の存在下でポリ-ガンマ-グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質 |
| 上記 pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上記 pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、上記微生物の宿主細胞内で自己複製可能なプラスミド(ベクター)に組み込まれていることを特徴とする請求項1~3いずれか一項記載の組換え微生物。 |
| 上記 pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上記 pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、その上流に、微生物において機能を有する転写開始制御領域及び/又は翻訳開始制御領域を有する請求項1~4のいずれか一項記載の組換え微生物。 |
| 上記宿主微生物がバチルス( Bacillus )属細菌である、請求項1~5いずれか一項記載の組換え微生物。 |
| 上記バチルス( Bacillus )属細菌が枯草菌( Bacillus subtilis )である請求項6記載の組換え微生物。 |
| 請求項1~7いずれか一項記載の組換え微生物を培養し、生成されたポリ-ガンマ-グルタミン酸を取得することを特徴とするポリ-ガンマ-グルタミン酸の製造方法。 |
| ポリ-ガンマ-グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入して得られた組換え微生物を用いて、ポリ-ガンマ-グルタミン酸の生産性を向上させることを特徴とするポリ-ガンマ-グルタミン酸の生産性向上方法。 |
| 上記組換え微生物が請求項1~7のいずれか一項記載の組換え微生物であることを特徴とする請求項9記載のポリ-ガンマ-グルタミン酸の生産性向上方法。 |
| ポリ-ガンマ-グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入して得られた組換え微生物を用いて、ポリ-ガンマ-グルタミン酸の分子量を調整することを特徴とするポリ-ガンマ-グルタミン酸の分子量調整方法。 |
| 上記組換え微生物が請求項1~7のいずれか一項記載の組換え微生物であることを特徴とする請求項11記載のポリ-ガンマ-グルタミン酸の分子量調整方法。 |
| 請求項11又は12記載のポリ-ガンマ-グルタミン酸の分子量調整方法を用いた高分子量ポリ-ガンマ-グルタミン酸の製造方法。 |
| 微生物を用いてポリ-ガンマ-グルタミン酸を生産する際に、ポリ-ガンマ-グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入して得られた組換え微生物を用いて、ポリ-ガンマ-グルタミン酸のL-体比率を調整することを特徴とするポリ-ガンマ-グルタミン酸の光学純度調整方法。 |
| 上記組換え微生物が請求項1~7のいずれか一項記載の組換え微生物であることを特徴とする請求項14記載のポリ-ガンマ-グルタミン酸の光学純度調整方法。 |
| 請求項14又は15記載のポリ-ガンマ-グルタミン酸の光学純度調整方法を用いたL-体比率の高いポリ-ガンマ-グルタミン酸の製造方法。 |
| 請求項1~7のいずれか一項記載の組換え微生物の使用。 |
本発明は、ポリ-ガンマ-グルタミン酸産 能を付与された組換え微生物、及び当該組 え微生物を用いたポリ-ガンマ-グルタミン酸 の製造方法に関する。
ポリ-ガンマ-グルタミン酸は、グルタミン のγ-位のカルボキシル基とα-位のアミノ基 ペプチド結合によって結合した高分子化合 である。また、ポリ-ガンマ-グルタミン酸は γ-ポリグルタミン酸と呼称される場合もある 。ポリ-ガンマ-グルタミン酸は、納豆菌( Bacillus subtilis var. natto )が産生する粘性物質として知られており、 々の性質から近年新たな高分子素材として 目されている。以下の説明においてポリ-ガ マ-グルタミン酸をPGAと略称する。
PGAを生産する微生物としては、納豆菌を含 一部のバチルス( Bacillus )属細菌とその近縁種( Bacillus subtilis var. chungkookjang 、 Bacillus icheniformis 、 Bacillus megaterium 、 Bacillus anthracis 、 Bacillus halodurans )や、 Natrialba aegyptiaca 、 Hydra 等を挙げることができる(例えば、非特許文 1参照)。また、微生物の中でPGA生産性を有す る納豆菌は分類学上はPGA非生産性の枯草菌の 亜種とされるが、いずれの菌株もPGA合成酵素 をコードする pgsB 、 pgsC 及び pgsA 遺伝子は同一の転写開始制御領域、翻訳開始 制御領域の下流に存在し、クラスター構造( ペロン)を有していることが明らかにされて る(例えば、非特許文献3、6及び8参照)。さ に、納豆菌のPGA産生制御機構は、枯草菌の 質転換能獲得機構とともに細胞内の多くの 御因子が関与する複雑な制御を受けている 推察されている(例えば、非特許文献9及び10 照)。PGAの生産法としては、上記PGA生産菌の 育種によりその生産性を高めることが可能で あるが、野生株の厳密な制御機構の解除、野 生株の複雑な栄養要求性の解消、あるいは安 定な生産性を得るための最適化などに労力を 要することから、効率的なPGA生産法ではない と判断される。それ故に、これら野生株の育 種に代わる効率的な手法として遺伝子組換え 技術の利用が試みられていると考えられる。 これまでに知られている遺伝子組換え技術を 用いたPGA生産の例としては、プラスミドにて 遺伝子導入された組換え枯草菌( Bacillus subtilis ISW1214株)において約9.0g/L/5日(非特許文献2参 )、プラスミドにて遺伝子導入された組換え 大腸菌において約4g/L/1.5日(非特許文献7参照) あるいは2.5mg/40mg-乾燥菌体(非特許文献6参照 )の生産性が得られることが開示されている しかしながら、これら開示されている生産 では充分な生産性に達していないと判断さ る。
PGAは、納豆菌においてPgsBCAと称される膜 合型酵素系によってリボソーム非依存的に 産されることが示されている(例えば、非特 許文献4参照)。これらPGA合成酵素系PgsBCAのな で、PgsB(YwsCと別称)はグルタミン酸における γ-位のカルボキシル基に作用するアミドリガ ーゼ反応に関与することが知られている(例 ば、非特許文献3、5参照)。一方で、非特許 献3によれば、PgsC(YwtAと別称)は膜結合型タン パク質でPGAの細胞外への排出に関与すると推 定されているが、非特許文献4及び5によればP gsCはPgsBと共同してグルタミン酸の連結反応 関わるとされ、PgsCの機能は現在のところ明 にはなっていない。
さらに、非特許文献2において、染色体上の pgsB 遺伝子、 pgsC 遺伝子及び pgsA 遺伝子を欠損した枯草菌に、 pgsB 遺伝子、 pgsC 遺伝子及び pgsA 遺伝子から選ばれる1つの遺伝子を単独で発 するベクターもしくは複数を組み合わせて 現するベクターを導入し、PGA生産性を検討 た結果が開示されている。非特許文献2によ ば、 pgsB 遺伝子、 pgsC 遺伝子及び pgsA 遺伝子を全て発現しなければPGAが生産できな いと結論されている。また、非特許文献3に 、PGA生産能を有する納豆菌(IFO16449株)におい 、 pgsB 遺伝子( ywsC 遺伝子と別称)欠損株、 pgsC 遺伝子( ywtA 遺伝子と別称)欠損株及び pgsA 遺伝子( ywtB 遺伝子と別称)欠損株を構築し、それぞれの 損株におけるPGA生産能を検証している。こ なかで非特許文献3によれば、PGA生産能を有 る納豆菌において、PGA生産には pgsB 遺伝子及び pgsC 遺伝子が必須であり、さらにPGAを高生産する には pgsA 遺伝子が必要であると結論している。
またさらに、特許文献1においては、 pgsB 遺伝子、 pgsC 遺伝子及び pgsA 遺伝子をこの順で導入したベクターを用いて 大腸菌を形質転換することによって、本来、 PGA生産能を有しない大腸菌においてPGA生産能 を付与できることが開示されているが、非特 許文献6によれば、組換え大腸菌において pgsBCA 遺伝子を導入した条件ではPGA生産が認められ ているが、 pgsBC 遺伝子を導入した条件ではPGAが生産されない ことが明示されている。
また、特許文献2~5においては、納豆菌等 PGA産生微生物を種々の栄養塩培地で培養す ことによって平均分子量数千~200万のPGAが生 産されることが開示され、また特許文献6に いては納豆菌に外的ストレスを与えること よって300万以上のPGAが生産されることが開 されている。
一方、非特許文献11、特許文献7及び8におい ては、微生物により光学純度の高いPGAを生産 できることが開示されており、特許文献7に いてはバチルス メガテリウム( Bacillus megaterium )株を用いて、L-グルタミン酸含有量が90%以上 のPGAを約10g/L/5日で生産できることが示され 特許文献8においてはナトリアルバ エジプ アキア( Natrialba aegyptiaca )の変異株が分子量130万以上のポリ-ガンマ-L- ルタミン酸を約5g/L/6日で生産できることが 示されている。
しかしながら、上述した非特許文献1~3、7 及び特許文献1においても、PGAを高生産する めの技術は開示されておらず、従来知見に いてPGAを効率良く生産することができない いった問題があった。また、これまでに、 伝子工学的手法を用いてPGAの分子量を調整 ることは報告されていない。
本発明は、上述したような実情に鑑み、P GAを効率良く生産することができる組換え微 物、当該微生物を用いたPGAの製造方法、並 に、遺伝子導入によるPGAの生産性向上方法 PGAの分子量調整方法及びPGAの光学純度を調 する方法を提供するものである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、 pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、 pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿 主微生物に導入することによって得られる組 換え微生物を用いることで、PGAの高生産、PGA の分子量調整及び/又は光学純度の調整が可 であることを見い出した。本発明は、この 見に基づいて完成するに至った。
本発明に係る組換え微生物は、PGA合成に関 する遺伝子群( pgsBCA 遺伝子)のなかで、枯草菌における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、 枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿 主微生物に導入し、枯草菌における pgsA 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を当 該宿主微生物に導入していないものである。 すなわち、本発明に係る組換え微生物は、従 来の知見に反し、枯草菌における pgsA 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導 入しない方がPGAの生産性に優れるといった知 見に基づいている。
ここで、上記 pgsB
遺伝子は以下の(a)又は(b)のタンパク質をコー
ドする遺伝子であることが好ましい。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタン
ク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又
複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は
入されたアミノ酸配列を含み、アミドリガ
ゼ活性を有するタンパク質
また、上記 pgsC
遺伝子は以下の(c)又は(d)のタンパク質をコー
ドする遺伝子であることが好ましい。
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタン
ク質
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又
複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は
入されたアミノ酸配列を含み、上記 pgsB
遺伝子がコードするPgsBタンパク質の存在下
PGAを生成する機能を有するタンパク質
さらにまた、本発明に係る組換え微生物に いて、導入される遺伝子は上記 pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上 記 pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、 宿主細胞内において機能を有しており正的に 発現制御を受ける転写開始制御領域、翻訳開 始制御領域の下流に結合したものであること が好ましい。
さらにまた、本発明に係る組換え微生物は 宿主となる微生物がバチルス( Bacillus )属細菌であることが好ましい。バチルス( Bacillus )属細菌としては例えば枯草菌( Bacillus subtilis )を挙げることができる。
一方、本発明に係るPGAの製造方法は、上 した本発明に係る組換え微生物を培養し、 成されたPGAを取得する方法である。
一方、本発明に係るPGAの生産性向上方法は PGA合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草 における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、 枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿 主微生物に導入して得られた組換え微生物を 用いてPGAの生産性を向上させることを特徴と するものである。
一方、本発明に係るPGAの分子量調整方法は PGA合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草 における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、 枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿 主微生物に導入して得られた組換え微生物を 用いてPGAの分子量を調整する(好ましくはPGA 高分子量化する)ことを特徴とするものであ 。
一方、本発明に係るPGAの光学純度調整方法 、PGA合成に関与する遺伝子群のなかで、枯 菌における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、 枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿 主微生物に導入して得られた組換え微生物を 用いてPGAの光学純度を調整する(好ましくはPG AのL-体比率を増加させる)ことを特徴とする のである。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、 付の図面とともに考慮することにより、下 の記載からより明らかになるであろう。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る組換え微生物は、宿主となる
生物にPGA合成に関与する遺伝子群のなかで
草菌における pgsA
遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を除
く、枯草菌における pgsB
遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、
枯草菌における pgsC
遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿
主微生物に導入して得られたものであって、
ポリ-ガンマ-グルタミン酸産生能を有するも
である。
ここで、PGA合成に関与する遺伝子群とは、 草菌においては、 pgsB 遺伝子(BG12531: ywsC 遺伝子、または capB 遺伝子と別称される)、 pgsC 遺伝子(BG12532: ywtA 遺伝子、または capC 遺伝子と別称される)及び pgsA 遺伝子(BG12533: ywtB 遺伝子、または capA 遺伝子と別称される)から構成されている。 伝子組換えの宿主微生物として広く利用さ ている Bacillus subtilis Marburg No.168系統株は、これら pgsB 遺伝子、 pgsC 遺伝子及び pgsA 遺伝子を染色体上に有しているが、PGA生産能 を有していない。同じく、納豆菌( Bacillus subtilis var. natto )は、これら pgsB 遺伝子、 pgsC 遺伝子及び pgsA 遺伝子を染色体(ゲノム)上に有しているが、P GA生産能を有している。尚、遺伝子の名称、 号は、JAFAN[Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)]でインターネット公開 (http://bacillus.genome.ad.jp/、2006年1月18日更新)の 草菌ゲノムデーターに基づき記載している
pgsB 遺伝子の塩基配列を配列番号1に示し、 pgsB 遺伝子によってコードされるPgsBタンパク質 アミノ酸配列を配列番号2に示す。尚、本発 において pgsB 遺伝子は、配列番号1に示す塩基配列からな 遺伝子に限定されず、配列番号2に示すアミ 酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠 失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列 を含み、グルタミン酸を基質とするアミドリ ガーゼ活性を有するタンパク質をコードする 遺伝子を含む意味である。ここで、複数個と は、例えば2~80個、好ましくは2~40個、より好 しくは2~20個、更に好ましくは2~10個、最も ましくは2~5個とすることができる
また、本発明において pgsB 遺伝子とは、配列番号1に示す塩基配列に対 て80%以上、好ましくは90%以上、より好まし は95%以上、さらに好ましくは96%以上、より らに好ましくは97%以上、最も好ましくは98% 上、特に好ましくは99%以上の同一性を有す 塩基配列を含み、アミドリガーゼ活性を有 るタンパク質をコードする遺伝子を含む意 である。ここで塩基配列の同一性は、Lipman-P earson法[Lipman,DJ.,Pearson,WR.:Science,227,pp.1435-1441(19 85)参照]によって計算される。具体的には、 伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウ ア開発)のホモロジー解析(Search homology)プロ ラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2と て解析を行うことにより算出される。また 上記アミドリガーゼ活性は、グルタミン酸 びATPを基質とし、これに塩化マンガン加え ものを反応溶液として用いた場合に、反応 液中にPGAの生成を確認することにより測定 ることができる[例えば、Urushibata,Y.,et al.:J. Bacteriol.,184,pp.337-343(2002)参照]。
さらに、本発明において pgsB 遺伝子とは、配列番号1に示す塩基配列の相 鎖に対してストリンジェントな条件下でハ ブリダイズし、アミドリガーゼ活性を有す タンパク質をコードする遺伝子を含む意味 ある。ここで、「ストリンジェントな条件 」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook,David W.Russell,C old Spring Harbor Laboratory Press(2001)]記載の条件 が挙げられる。例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15 M 塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウ 、pH7.0)、0.5% SDS、5×デンハート及び100mg/mL ニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに 65℃で8~16時間恒温し、ハイブリダイズさせる 条件が挙げられる。
また、上述したアミドリガーゼ活性とは、 細には後述する実施例で示すように、 pgsC 遺伝子とともに宿主微生物に導入された際に 菌体外にPGAを生産する能力を意味する。所定 の微生物におけるPGA生産能の評価は、例えば グルタミン酸又はその塩を含有するPGA生産寒 天培地に培養したときにコロニー周辺に形成 される半透明の粘性物質を目視によって観察 する方法、SDS-PAGEによってPGAを検出する方法[ 例えば、Yamaguchi,F.,et al.:Biosci.Biotechnol.Biochem.6 0,pp.255-258(1996)参照]、或いは酸加水分解後に ミノ酸分析装置を用いて定量する方法[例え 、Ogawa,Y.,et al.:Biosci.Biotechnol.Biochem.,61,pp.1684- 1687(1997)参照]、培養液から精製し乾燥重量を める定量法[例えば、Ashiuchi,M.,et al.:Biochem.Bi ophys.Res.Commun.,263:pp.6-12(1999)参照]、ゲルろ過カ ラムを用いたHPLC(高速液体クロマトグラフィ )による定量/定性法[例えば、Kubota,H.,et al.:B iosci.Biotechnol.Biochem.,57,pp.1212-1213(1993)参照]によ って行うことができる。
pgsC 遺伝子の塩基配列を配列番号3に示し、 pgsC 遺伝子によってコードされるPgsCタンパク質 アミノ酸配列を配列番号4に示す。尚、本発 において pgsC 遺伝子は、配列番号3に示す塩基配列からな 遺伝子に限定されず、配列番号4に示すアミ 酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠 失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列 を含み、前述のPgsBタンパク質の存在下でPGA 生成する機能を有するタンパク質をコード る遺伝子を含む意味である。ここで、複数 とは、例えば2~30個、好ましくは2~15個、より 好ましくは2~8個、更に好ましくは2~4個、最も 好ましくは2個とすることができる。
また、本発明において pgsC 遺伝子とは、配列番号3に示す塩基配列に対 て80%以上、好ましくは90%以上、より好まし は95%以上、さらに好ましくは96%以上、より らに好ましくは97%以上、最も好ましくは98% 上、特に好ましくは99%以上の同一性を有す 塩基配列を含み、前述のPgsBタンパク質の存 下でPGAを生成する機能を有するタンパク質 コードする遺伝子を含む意味である。ここ 塩基配列の同一性は上記と同じ定義である
さらに、本発明において pgsC 遺伝子とは、配列番号3に示す塩基配列の相 鎖に対してストリンジェントな条件下でハ ブリダイズし、前述のPgsBタンパク質の存在 でPGAを生成する機能を有するタンパク質を ードする遺伝子を含む意味である。ここで 「ストリンジェントな条件下」とは上記と じ定義を用いる。
また、前述のPgsBタンパク質の存在下でPGAを 生成するといったPgsCタンパク質の機能とは 宿主微生物にて pgsB 遺伝子とともに pgsC 遺伝子を発現させた際に菌体外にPGAを生産す る能力を意味する。詳細は後述の実施例及び 参考例で示すように、 pgsB 遺伝子を単独で発現させた宿主微生物ではPGA が生産されず、 pgsB 遺伝子とともに pgsC 遺伝子を発現させた場合に、PGAが生産される といった本発明者らが見出した知見に基づい ている。
一方、本発明に係る組換え微生物は、上述 たような枯草菌由来の pgsB 遺伝子及び pgsC 遺伝子を宿主微生物に導入したものに限定さ れず、例えば枯草菌以外の微生物に由来する PGA合成関連遺伝子を構成する遺伝子群のうち 、 pgsB 遺伝子に相当する遺伝子( pgsB 相同遺伝子)及び pgsC 遺伝子に相当する遺伝子( pgsC 相同遺伝子)を宿主微生物に導入したもので っても良い。 pgsB 相同遺伝子及び pgsC 相同遺伝子は、PGAを生産することが知られて いる微生物から常法に従って単離・同定する ことができる。PGA生産能を有する微生物とし ては、 Bacillus subtilis の他に、 Bacillus licheniformis 、 Bacillus megaterium 、 Bacillus anthracis 、 Bacillus halodurans や、 Natrialba aegyptiaca 、 Hydra 等を挙げることができ、これら微生物から pgsB 相同遺伝子及び pgsC 相同遺伝子を単離・同定することができる。 例えば、上記の微生物からゲノムDNAを抽出し 、上述した配列番号1に示した塩基配列から るポリヌクレオチドをプローブとしたサザ ハイブリダイゼーションによって pgsB 相同遺伝子を単離することができる。 pgsC 相同遺伝子についても同様に単離することが できる。さらに、近年の急速なゲノム解読の 進展によりPGA非生産微生物であってもそのゲ ノム配列情報を基に、前述のように定義した 枯草菌 pgsB 相同遺伝子を単離・同定することができる。 これはさらに、枯草菌 pgsC 相同遺伝子についても同様である。
本発明に係る組換え微生物は、上述した pgsB
遺伝子又は pgsB
相同遺伝子と pgsC
遺伝子又は pgsC
相同遺伝子を宿主微生物に導入することで作
製される。
ここで本発明において用いられる宿主微生物
は特に限定されないが、具体的には、 Bacillus
licheniformis
、 Bacillus
megaterium
、 Bacillus
anthracis
、 Bacillus
halodurans
、 Bacillus
subtilis
等のバチルス( Bacillus
)属細菌や、クロストリジウム( Clostridium
)属細菌、コリネバクテリウム( Corynebacterium
)属細菌、大腸菌( Escherichia
coli
)或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス( Bacillus
)属細菌が好ましい。さらに、全ゲノム情報
明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技
が確立されている点、宿主微生物として安
且つ優良と認められた微生物菌株として開
されている点から、特に枯草菌( Bacillus
subtilis
)が好ましい。
さらに、選択される宿主細胞は、野生型の 胞、あるいは野生型に対して所定の変異を 入した変異株のいずれも使用することがで る。さらに、変異株のなかでも、特にPGA分 酵素をコードする遺伝子(PGA分解酵素遺伝子 )を欠失させた変異株を宿主として使用する とで、より良好な効果が期待できる。枯草 におけるPGA分解酵素遺伝子としては、 ggt 遺伝子が知られている[例えば、Kimura,K.,et al. :Microbiology,150,pp.4115-4123(2004)参照]。 ggt 遺伝子の塩基配列を配列番号7に示し、 ggt 遺伝子によりコードされるPGA分解酵素のアミ ノ酸配列を配列番号8に示す。また、枯草菌 外の微生物を宿主として使用する場合にも ggt 遺伝子に相当する遺伝子を欠失させた変異株 を使用することが好ましい。尚、本発明にお いて ggt 遺伝子は、配列番号7に示す塩基配列からな 遺伝子に限定されず、配列番号8に示すアミ 酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠 失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列 を含み、PGA分解活性を有するタンパク質をコ ードする遺伝子を含む意味である。ここで、 複数個とは、例えば2~120個、好ましくは2~60個 、より好ましくは2~30個、更に好ましくは2~15 、最も好ましくは2~8個とすることができる また、本発明において ggt 遺伝子とは、配列番号7に示す塩基配列に対 て80%以上、好ましくは90%以上、より好まし は95%以上、さらに好ましくは96%以上、より らに好ましくは97%以上、最も好ましくは98% 上、特に好ましくは99%以上の同一性を有す 塩基配列を含み、PGA分解活性を有するタン ク質をコードする遺伝子を含む意味である ここで塩基配列の同一性は上記と同じ定義 ある。
さらに、本発明において ggt 遺伝子とは、配列番号8に示す塩基配列の相 鎖に対してストリンジェントな条件下でハ ブリダイズし、PGA分解活性を有するタンパ 質をコードする遺伝子を含む意味である。 こで、「ストリンジェントな条件下」とは 述と同じ定義を用いる。 ggt 遺伝子或いはその相同遺伝子を欠失させる方 法としては、従来公知の手法を適宜使用する ことができる。例えば、 ggt 遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミ ド(ベクター)にクローニングして得られる環 の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取 込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相 組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺 子を分断して不活性化することが可能であ [例えば、Leenhouts,K.,et al.:Mol.Gen.Genet.,253,pp.21 7-224(1996)参照]。
特に、本発明微生物を構築するための親微 物として枯草菌を用いる場合、相同組換え より標的遺伝子を欠失又は不活性化する方 については、既にいくつかの報告例があり[ 例えば、Itaya,M.,Tanaka,T.:Mol.Gen.Genet.,223,pp.268-272 (1990)参照]、こうした方法を繰り返すことに って、目的の宿主微生物を得ることができ 。また、ランダムな遺伝子の不活性化方法 しては、変異誘発剤の使用や親微生物への 外線、ガンマ線等の照射によっても実施可 である。この場合、 ggt 構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは 一部欠失といった変異導入の他に、プロモー ター領域等の制御領域への同様の変異導入、 または ggt 遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様 の変異導入によっても同等の効果が期待でき る。さらに、より効率的な手法として、 ggt 遺伝子の上流、下流領域を含むが ggt 遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をSOE(splicing by overlap extension)-PCR法[例えば、Horton,RM.,et al.:Gene,77,pp.61-68(1989)参照]によって構築し、こ れを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物 ゲノム上の ggt 遺伝子の外側の2箇所で二重交差の相同組換 を起こさせることにより、ゲノム上の ggt 遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能 である(図1参照)。
また、選択される宿主細胞は、本来的にPGA 産能を有している微生物であっても良いし 本来的にPGA生産能を有していない微生物で っても良い。すなわち、 pgsBCA 遺伝子を染色体(ゲノム)上に有し、かつPGA生 能を有する微生物、 pgsBCA 遺伝子を染色体上に有しているが、PGA生産能 を有していない微生物、 pgsBCA 遺伝子を有していない微生物の何れでも良い 。PGA生産能を有している微生物に上述した pgsB 遺伝子又は pgsB 相同遺伝子と pgsC 遺伝子又は pgsC 相同遺伝子を導入した場合には、PGA生産能を 強化及び/又はPGAを高分子量化することにな 。一方で、PGA生産能を有しない微生物に上 した pgsB 遺伝子又は pgsB 相同遺伝子と pgsC 遺伝子又は pgsC 相同遺伝子を導入した場合には、PGA生産能を 付与することとなる。
宿主細胞としては、染色体(ゲノム)上に有 ている枯草菌における pgsBCA 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上 流に、微生物において機能を有する転写開始 制御領域及び/又は翻訳開始制御領域を導入 ること等によってPGA生産能を有している微 物を用いることもできる。
本発明の宿主微生物において機能を有す 転写開始制御領域及び/又は翻訳開始制御領 域(以下、単に「制御領域」ともいう。)とし は、これらが適正な形で結合されているこ が望ましく、転写開始制御領域及び翻訳開 領域が結合されていることが好ましい。
当該制御領域は、結合した下流遺伝子を構 的に発現させ、当該遺伝子の発現を宿主細 内において高めることができるものである とがより好ましい。このような制御領域と てはバチルス( Bacillus )属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領 、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、 aprE 遺伝子の制御領域、 spoVG 遺伝子の制御領域、 rapA 遺伝子の制御領域、 Bacillus sp.KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域 Staphylococcus aureus 由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、 クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域 などが挙げられる。
pgsBCA 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲ ノム上における上流への当該制御領域の導入 は、枯草菌の pgsBCA 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の本 来の制御領域の一部又は全部を置換すればよ い。
当該制御領域への置換は、例えば相同組 えによる公知の方法(Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記 載の方法等)を用いて行うことができる。
例えば、まず、係る制御領域を含むDNA断片 上流に pgsBCA 遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域 を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方 、下流に pgsBCA 遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域 の一部又は全部、或いは pgsBCA 遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含 むDNA断片を、SOE-PCR法(前述)などの通常の方法 により結合させる。この様にして、 pgsBCA 遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域 を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該制 御領域を含むDNA断片、 pgsBCA 遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域 の一部又は全部、或いは pgsBCA 遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含 むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る(図3 照)。
次に、係るDNA断片を、通常の方法により親 生物細胞内に取り込ませることにより、親 生物ゲノムの pgsBCA 遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域 、及び pgsBCA 遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域 の一部又は全部、或いは pgsBCA 遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含 む領域の2箇所において、二重交差の相同組 えが起こる。その結果、本来の制御領域が 該制御領域に置換された形質転換体を、上 薬剤耐性遺伝子を指標として分離すること できる。これにより、ゲノム上の pgsBCA 遺伝子上流へ導入された制御領域は、遺伝的 に安定に保持されることとなる。
尚、本発明に係る組換え微生物は、PGA合成 関与する遺伝子群のなかでも pgsA 遺伝子を宿主微生物に導入していない。 pgsA 遺伝子の塩基配列を配列番号5に示し、 pgsA 遺伝子によりコードされるタンパク質のアミ ノ酸配列を配列番号6に示す。 pgsA 遺伝子にコードされるタンパク質は、PGAの菌 体外排出に関与するタンパク質であることが 示唆されているが(例えば、非特許文献5参照) 、現在までにその機能は明確にされていない 。一方で、本発明に係る組換え微生物は、 pgsA 遺伝子を導入していないにも拘わらず、PGAの 生産性に優れるといった特徴を有している。 本発明において pgsA 遺伝子とは、配列番号5に示す塩基配列から る遺伝子に限定されず、配列番号6に示すア ノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が 欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配 列を含み、PgsB及びPgsCと共同してPGA合成活性 有すると推定されるタンパク質をコードす 遺伝子を含む意味である。ここで、複数個 は、例えば2~80個、好ましくは2~40個、より ましくは2~20個、更に好ましくは2~10個、最も 好ましくは2~5個とすることができる。また、 本発明において pgsA 遺伝子とは、配列番号5に示す塩基配列に対 て80%以上、好ましくは90%以上、より好まし は95%以上、さらに好ましくは96%以上、より らに好ましくは97%以上、最も好ましくは98% 上、特に好ましくは99%以上の同一性を有す 塩基配列を含み、PgsB及びPgsCと共同してPGA合 成活性を有すると推定されるタンパク質をコ ードする遺伝子を含む意味である。ここで塩 基配列の同一性は前述と同じ定義である。
さらに、本発明において pgsA 遺伝子とは、配列番号5に示す塩基配列の相 鎖に対してストリンジェントな条件下でハ ブリダイズし、PgsB及びPgsCと共同してPGA合成 活性を有すると推定されるタンパク質をコー ドする遺伝子を含む意味である。ここで、「 ストリンジェントな条件下」とは前述と同じ 定義を用いる。
ここで「 pgsA 遺伝子を宿主微生物に導入しない」とは、PGA 合成過程において機能するPgsAタンパク質を ードする遺伝子を導入しないことを意味し いる。従って、配列番号5に示される遺伝子 同一性の高い遺伝子を導入したとしても、 の遺伝子が発現しない場合や、その遺伝子 発現により産生されるタンパク質がPGA合成 程において機能しないものであれば、本発 の技術範囲に含まれる。
また、本発明に係る組換え微生物は、上述 た pgsB 遺伝子又は pgsB 相同遺伝子と pgsC 遺伝子又は pgsC 相同遺伝子は、その上流に、宿主細胞内にお いて機能を有しており正的に発現制御を受け る転写開始制御領域、翻訳開始制御領域が結 合されたものであることが好ましい。当該制 御領域は、結合した下流遺伝子を発現させ、 当該遺伝子の発現を宿主細胞内において高め ることができるものであることがより好まし く、下流遺伝子を構成的に発現又は/及び高 現させるものが特に好ましい。このような 御領域として、バチルス( Bacillus )属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領 、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、 aprE 遺伝子の制御領域、 spoVG 遺伝子の制御領域、 rapA 遺伝子の制御領域、 Bacillus sp.KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域 Staphylococcus aureus 由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、 クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域 などが例示されるが特に限定されない。
上述した Bacillus sp.KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域 あるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点上流0.4~1 .0kb領域由来の制御領域の塩基配列を配列番 9に示す。また当該制御領域としては、配列 号9に示す塩基配列に限定されず、例えば配 列番号9に示す塩基配列に対して70%以上、好 しくは80%以上、より好ましくは90%以上、さ に好ましくは96%以上、よりさらに好ましく 97%以上、最も好ましくは98%以上、特に好ま くは99%以上の同一性を有する塩基配列の意 である。ここでの塩基配列の同一性とは前 と同じ定義を用いる。
また、枯草菌に由来する spoVG 遺伝子(BG10112)の当該制御領域の塩基配列を配 列番号10に示す。当該制御領域としては、配 番号10に示す塩基配列に限定されず、例え 配列番号10に示す塩基配列に対して70%以上、 好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、 さらに好ましくは96%以上、よりさらに好まし くは97%以上、最も好ましくは98%以上、特に好 ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列の 意味である。ここでの塩基配列の同一性とは 前述と同じ定義を用いる。
さらに、枯草菌に由来する rapA 遺伝子(BG10652)の当該制御領域の塩基配列を配 列番号11に示す。また、当該制御領域として 、配列番号11に示す塩基配列に限定されず 例えば配列番号11に示す塩基配列に対して70% 以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90% 以上、さらに好ましくは96%以上、よりさらに 好ましくは97%以上、最も好ましくは98%以上、 特に好ましくは99%以上の同一性を有する塩基 配列の意味である。ここでの塩基配列の同一 性とは前述と同じ定義を用いる。
上述した pgsB 遺伝子又は pgsB 相同遺伝子と pgsC 遺伝子又は pgsC 相同遺伝子を宿主微生物に導入する際は、通 常のプラスミド(ベクター)を使用することが きる。また、プラスミドは、遺伝子導入対 の宿主微生物の種類に応じて適宜選択する とができる。枯草菌を宿主とする場合、例 ば、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等 を例示することができる。選択されるプラス ミドは、宿主細胞内で自己複製可能なプラス ミドであることが好ましく、そのプラスミド が多コピーであることがより好ましい。さら に、そのプラスミドのコピー数が宿主ゲノム (染色体)に対し、2以上100コピー以下であれば 良く、好ましくは2以上50コピー以下、より好 ましくは2以上30コピー以下であれば良い。ま た、発現ベクターを用いた形質転換には、通 常の手法、例えばプロトプラスト法[例えば Chamg,S.,Cohen,SH.:Mol.Gen.Genet.,168,pp.111-115(1979)参 ]やコンピテントセル法[例えば、Young,FE.,Spizi zen,J.:J. Bacteriol.,86,pp.392-400(1963)参照]を適用す ることができる。
以上で説明した本発明に係る組換え微生 を用いることによって、PGAを優れた生産性 製造することができる。製造されたPGAは、 粧品、医薬品、食品、水質浄化剤、保水材 、増粘剤等の様々な用途に使用することが きる。特に本発明に係る組換え微生物にお ては、従来の遺伝子組換え技術によるPGA生 法と比較して優れた生産性が得られること ら上記用途で利用されるPGAの生産コストを 幅に低減することができる。
特に、本発明に係る組換え微生物を用い PGAを製造する際には、先ず、適切な培地に いて当該組換え微生物を培養し、菌体外に 産されたPGAを培地から回収する。培地とし は、グリセロール、グルコース、フルクト ス、マルトース、キシロース、アラビノー 、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、 リペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウ や尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機 類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等 含有する組成の培地を使用できる。また、 地としては合成培地でも良いし、天然培地 も良い。
特に、PGAの生産性を向上させるには、培 対象の組換え微生物が生育に必要とするグ タミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が 加された培地を使用することが好ましい。 体的には培地中へはグルタミン酸ナトリウ として添加することが好ましいが、その濃 は、例えば0.005~600g/L、好ましくは0.05~500g/L より好ましくは0.1~400g/L、最も好ましくは0.5~ 300g/Lとする。培地中のグルタミン酸ナトリウ ム濃度が低すぎる場合には、培地中のグルタ ミン酸が組換え微生物の生育に消費されPGAの 生産性が向上しないおそれがある。また、培 地中のグルタミン酸濃度が高すぎる場合には 、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超 えることから、グルタミン酸ナトリウムやそ の他の培地成分が析出してしまうといった問 題が生じるおそれがある。
培地中に蓄積されたPGAを回収する際には PGAを生産させた微生物菌体を除去する必要 あるが、これには遠心分離による方法、限 濾過膜を用いる方法、電気透析法、pHをPGA 等電点付近に維持することで沈殿として回 する方法等が挙げられ、さらに上記手法を み合わせて用いることも可能である。
以上のようにして、本発明に係る組換え微 物を利用することによってPGAの製造を行う とができる。また、後述する実施例に示す うに本発明に係る組換え微生物は1.5g/L以上 高い生産性を示し、従来公知の遺伝子組換 技術を利用したPGA生産微生物と比較して、 草菌における pgsB 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、 枯草菌における pgsC 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導 入し、且つ、枯草菌における pgsA 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導 入していない組換え微生物でありながら、PGA 生産性に優れることから、PGAの工業的生産に 有用である。
後記実施例に示すように、PGA生産能を付与 た微生物に、枯草菌における pgsB 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 及び pgsC 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 を導入するとPGAを高分子化できることから、 PGA生産能を付与した微生物にこれらの遺伝子 を導入すればPGAの分子量を調整することがで き、更に得られた組換え微生物を用いれば所 望の分子量のPGAを効率良く製造することがで きる。
特に、 pgsBCA 遺伝子上流の制御領域に上記 Bacillus sp.KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域 結合させた微生物を用いた場合には、重量 均分子量約7,000,000~7,800,000の高分子PGAを生産 ることができ、当該微生物に、枯草菌にお る pgsB 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 及び pgsC 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 を導入すれば、PGAの分子量を調整することが でき、そのPGAを好ましくは110~115%に高分子化 きる。
また、 pgsBCA 遺伝子上流の制御領域に上記 rapA 遺伝子の制御領域を結合させた微生物を宿主 細胞として用いた場合には、重量平均分子量 約590,000~600,000の中分子PGAを生産することがで き、当該微生物に、枯草菌における pgsB 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 及び pgsC 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 を導入すればPGAの分子量を調整することがで き、PGAを好ましくは1,200~1,600%に高分子化する ことができる。
さらには、PGA生産能を有していない微生物 、枯草菌における pgsB 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 及び pgsC 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子 を導入することにより、L-グルタミン酸含有 が好ましくは80%以上、より好ましくは90%以 とすることができる。また、本発明によれ 、光学純度の高いPGA(例えば、光学純度が好 ましくは80~100%、より好ましくは90~100%)を製造 することができる。
本発明に係る組換え微生物は、各用途に じた分子量の異なるPGAを適宜生産すること でき、また様々な用途で利用されるPGAの生 コストを大幅に低減することができ、さら 光学純度の高いPGAを生産することができる とから、PGAの工業的生産にも有用である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細 説明するが、本発明の技術的範囲は以下の 施例に限定されるものではない。表1には、 本実施例で使用したプライマーの名称、その 配列及び配列番号をまとめて示した。尚、表 1に示す塩基配列において、下線部分は付加 た制限酵素認識配列を示している。
〔製造例1〕ベクターの構築(1)
本製造例には、PGA合成に関与する遺伝子群
クローニング方法を示した(図1参照)。
先ず、 Bacillus
sp.KSM-366株(FERM BP-6262)から調製した染色体DNA
を鋳型とし、表1に示したpgsB-F(配列番号12)とp
gsA-R(配列番号13)のプライマーセットを用いて
、 pgsBCA
遺伝子2.9kbのDNA断片(A)を調製した。なお、 Bacillus
sp.KSM-366株の pgsB
遺伝子の塩基配列を配列番号47に、上記 pgsB
遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配
列を配列番号48に、 pgsC
遺伝子の塩基配列を配列番号49に、上記 pgsC
遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配
列を配列番号50に、 pgsA
遺伝子の塩基配列を配列番号51に、上記 pgsA
遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配
列を配列番号52に示す。また、表1に示したpgs
B-FとpgsC-R(配列番号14)のプライマーセットを
いて、 pgsBC
遺伝子1.7kbのDNA断片(B)を調製した。さらに、 Bacillus
sp.KSM-S237株(FERM BP-7875)から調製した染色体DN
Aを鋳型とし、表1に示したP_S237-FW(配列番号16)
とP_S237-RV(配列番号17)のプライマーセットを
いて、KSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子(特
2000-210081号公報参照)プロモーター領域0.6kbの
DNA断片(C)を調製した。
次に、得られた断片(A)及び(C)を鋳型とし、P _S237-FWとpgsA-Rとのプライマーセットを用いたS OE-PCR法にて(A)及び(C)を1断片化した3.5kbのDNA断 片(AC)を得た。同様に、断片(B)及び(C)を鋳型 しP_S237-FWとpgsC-Rとのプライマーセットを用 たSOE-PCR法にて、(B)及び(C)を1断片化した2.3kb DNA断片(BC)を得た。これらDNA断片(AC)及び(BC) それぞれ制限酵素 Bam HI及び Hind IIIにて制限酵素処理し、同様の制限酵素処理 を施したプラスミドベクターpHY300PLK(Takara)とD NA Ligation kit Ver.2(Takara)を用いてライゲーシ ン反応(結合化)を行なった。
上記ライゲーション試料を用いて、大腸菌( HB101株)をコンピテントセル法にて形質転換し 、テトラサイクリン-塩酸塩(SIGMA-ALDRICH)を15ppm 添加したLB寒天培地(LBTc寒天培地)上に出現し コロニーを形質転換体とした。得られた形 転換体を再度LBTc寒天培地にて生育させ、得 られた菌体からハイピュア プラスミドアイ レーションキット(ロッシュ・ダイアグノス ティックス)を用い組換えプラスミドを調製 た。これらを制限酵素 Bam HI及び Hind IIIにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラ スミドベクター上の Bam HI及び Hind III制限酵素認識部位に目的とする上記DNA断片 (AC)及び(BC)が挿入していることを確認した。
本製造例において、DNA断片(AC)及び(BC)の 入が確認できた組換えプラスミドを、それ れPGA組換え生産用ベクターpHY-P_S237/pgsBCA、pHY -P_S237/pgsBCとした。尚、PCR反応はGeneAmp9700(PE A pplied Biosystems)とTaKaRa LA Taq(Takara)を用い、キ ット添付のプロトコールに従い実施した。
〔製造例2〕ベクターの構築(2)
本製造例には、PGA合成に関与する遺伝子群
クローニング方法を示した(図3参照)。
先ず、 Bacillus
subtilis
Marburg No.168株(枯草菌168株)から調製した染
体DNAを鋳型とし、表1に示したP_spoVG FW2(配列
番号24)とP_spoVG/Cm R(配列番号25)のプライマー
ットを用いて、 spoVG
遺伝子ORFより約0.6kb上流にプラスミドpC194[例
ば、Horinouchi,S.,Weisblum,B.:J.Bacteriol.,150,pp.815-82
5(1982)参照]由来のクロラムフェニコール耐性
伝子(Cm r
)を挿入するための上流側0.9kbのDNA断片(spoVG-UP
)を調製した。同様に、表1に示したP_spoVG/Cm F
(配列番号26)とP_spoVG RV(配列番号27)のプライ
ーセットを用いて、下流側0.6kbのDNA断片(spoVG
-DW)を調製した(尚、この際にP_spoVG RVのプラ
マーは spoVG
遺伝子ORFの開始コドンgtgをatgに変更するよう
にデザインした)。また、プラスミドpC194を鋳
型とし、表1に示したcomp_Cm FW(配列番号28)とco
mp_Cm RV(配列番号29)のプライマーセットを用
て、クロラムフェニコール耐性遺伝子0.9kbの
DNA断片(comp_Cm)を調製した。
次に、得られた断片(spoVG-UP)、(spoVG-DW)及 (comp_Cm)を鋳型とし、P_spoVG FW2とP_spoVG RVとの プライマーセットを用いて、SOE-PCR法にて上 3断片を1断片化した2.4kbのDNA断片(Cm-P_spoVG)を た。さらに、このようにして得られたDNA断 を用いてコンピテントセル法(前述)により 草菌168株の形質転換を行ない、クロラムフ ニコール(SIGMA-ALDRICH)を10ppm添加したLB寒天培 (LBCm寒天培地)上に生育したコロニーを形質 換体として分離した。
次に、得られた形質転換体から抽出したゲ ムDNAを鋳型として、表1に示したcomp_Cm FWとP _spoVG RVのプライマーセットを用いたPCRによ てクロラムフェニコール耐性遺伝子と spoVG 遺伝子プロモーター領域からなる1.5kbのDNA断 (P-spoVG-Cm2)を調製した。さらに、comp_P-spoVG R /BSpgsB atg FW(配列番号30)とpgsC FW(配列番号31) プライマーセットを用いて、枯草菌168株か 調製したゲノムDNAを鋳型とするPCRによって pgsB 遺伝子1.2kbのDNA断片(pgsB1)を、pgsB/Cm F(配列番 32)とpgsB RV(配列番号33)のプライマーセット 用いて pgsB 遺伝子ORFの上流側1.1kbのDNA断片(pgsB-UP)を調製 た。さらに、得られた上記(pgsB1)、(P-spoVG-Cm2 )及び(pgsB-UP)の3断片を鋳型として、pgsC FWとpg sB RVのプライマーセットを用いて、SOE-PCRに り3.6kbのDNA断片を調製した。
続いて、このようにして得られたDNA断片を いてコンピテントセル法にて枯草菌168株の 質転換を行い、LBCm寒天培地上に生育したコ ロニーを形質転換体として分離した(以下、 られた組換え枯草菌を1cp-P_spoVG/pgsBCAcm株とす る)。得られた形質転換体から抽出したゲノ DNAを鋳型として、pgsC-RとBamHI_PspoVG FW(配列番 号34)のプライマーセットを用いて、枯草菌 pgsBC 遺伝子の上流に枯草菌 spoVG 遺伝子プロモーターを有する2.3kbのDNA断片(P_s poVG/pgsBC)を調製した。さらに、得られたDNA断 を製造例1と同様の手順にてプラスミドベク ターにクローニングし、取得したPGA組換え生 産用ベクターをpHY-P_spoVG/pgsBCとした。
〔製造例3〕ベクターの構築(3)
本製造例には、製造例2と同様にPGA合成に関
与する遺伝子群のクローニング方法を示した
(図3参照)。
枯草菌168株から調製した染色体DNAを鋳型とし
、表1に示したrapA FW(配列番号35)とP_rapA/Cm R(
列番号36)のプライマーセットを用いて、 rapA
遺伝子ORFより約0.5kb上流にプラスミドpC194由
のクロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入
るための上流側0.5kbのDNA断片(rapA-UP)を調製し
た。同様に、表1に示したP_rapA/Cm F(配列番号3
7)とP_rapA RV(配列番号38)のプライマーセット
用いて、下流側0.5kbのDNA断片(rapA-DW)を調製し
た(尚、この際にP_rapA RVのプライマーは rapA
遺伝子ORFの開始コドンttgをatgに変更するよう
にデザインした)。
次に、得られた断片(rapA-UP)、(rapA-DW)及び 造例2にて調製したDNA断片(comp_Cm)を鋳型とし 、rapA FWとP_rapA RVとのプライマーセットを用 いて、SOE-PCR法にて上記3断片を1断片化した1.9 kbのDNA断片(Cm-P_rapA)を得た。さらに、このよ にして得られたDNA断片を用いてコンピテン セル法により枯草菌168株の形質転換を行な 、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質 換体として分離した。
次に、得られた形質転換体から抽出したゲ ムDNAを鋳型として、表1に示したcomp_Cm FWとP _rapA RVのプライマーセットを用いたPCRにより 、クロラムフェニコール耐性遺伝子と rapA 遺伝子プロモーター領域からなる1.4kbのDNA断 (P-rapA-Cm2)を調製した。また、comp_P-rapA R/BSpg sB atg FW(配列番号39)とpgsC FWのプライマーセ トを用いて、枯草菌168株から調製したゲノ DNAを鋳型とするPCRによって pgsB 遺伝子1.2kbのDNA断片(pgsB2)を調製した。さらに 、得られた上記(pgsB2)、(P-rapA-Cm2)及び製造例2 て調製したDNA断片(pgsB-UP)の3断片を鋳型とし て、pgsC FWとpgsB RVのプライマーセットを用 て、SOE-PCRにより3.5kbのDNA断片を調製した。
続いて、製造例2と同様の手順により得られ たDNA断片を用いて、コンピテントセル法にて 枯草菌168株の形質転換を行なった(以下、得 れた組換え枯草菌を1cp-P_rapA/pgsBCAcm株とする) 。得られた形質転換体からゲノムDNAを調製し 、このゲノムDNAを鋳型としてpgsC-RとBamHI_PrapA FW(配列番号40)のプライマーセットを用いて 枯草菌 pgsBC 遺伝子の上流に枯草菌 rapA 遺伝子プロモーターを有する2.2kbのDNA断片(P_r apA/pgsBC)を調製した。さらに、得られたDNA断 を製造例1と同様の手順にてプラスミドベク ーにクローニングし、得られた組換えプラ ミドをPGA組換え生産用ベクターpHY-P_rapA/pgsBC とした。
〔製造例4〕ベクターの構築(4)
本製造例では、製造例2と同様に、PGA合成に
関与する遺伝子群のクローニング方法を示し
た(図4参照)。
製造例1において調製したpHY-P_S237/pgsBCAを鋳
とし、表1に示したpgsC-R及びtet4-1(配列番号41
)のプライマーセットを用いて、プラスミド
のテトラサイクリン耐性遺伝子(Tet r
)を含みS237セルラーゼプロモーター配列を上
に有する pgsB
遺伝子DNA断片3.3kb(tet-P_B)を調製した。また、
草菌168株から調製した染色体DNAを鋳型とし
tet4-1_comp/pgsB FW(配列番号42)及びpgsB RVとの
ライマーセットを用いて、枯草菌ゲノム上
pgsBCA
遺伝子の上流1.0kbのDNA断片(pgsB-DW1)を調製した
。
これら断片(tet-P_B)及び(pgsB-DW1)を鋳型として pgsC-R及びpgsB RVのプライマーセットを用いてS OE-PCR法にて2断片を結合し、枯草菌ゲノム上 pgsBCA 遺伝子オペロンの上流プロモーター置換用DNA 断片(tet-P_S237)を得た。さらに、得られたDNA断 片(tet-P_S237)を用いコンピテント法にて枯草菌 168株の形質転換を行い、LBTc寒天培地上に生 したコロニーを形質転換体として分離した 尚、得られた形質転換体からはゲノムDNAを 出し、これを鋳型とするPCRによって pgsBCA 遺伝子オペロンの上流にS237セルラーゼプロ ーターが導入された枯草菌変異株(以下、1cp- P_S237/pgsBCAtet株とする)であることを確認した
次に、 Bacillus sp.KSM-S237株(FERM BP-7875)から調製した染色体DN Aを鋳型とし、P_S237-RV及びP_S237-Fのプライマー セットを用いて、PCR法にてS237セルラーゼプ モーター領域約0.6kbのDNA断片(PS237-Cm)を調製 た。また、プラスミドpC194を鋳型とし、P_S237 _comp/Cm FW(配列番号43)とCm RV(配列番号23)のプ イマーセットを用いて、クロラムフェニコ ル耐性遺伝子0.9kbのDNA断片(Cm-PS237)を調製し 。
続いて、上記DNA断片(PS237-Cm)、(Cm-PS237)及 後述製造例6において調製したDNA断片(BCA-UP) 混合して鋳型とし、P_S237-RV及びpgsB RVのプラ イマーセットを用いたSOE-PCRにより3.2kbのDNA断 片を得た。この得られたDNA断片を用いて、枯 草菌変異株(1cp-P_S237/pgsBCAtet)をコンピテント ル法により形質転換し、LBCm寒天培地上に生 したコロニーを形質転換体として分離した( 以下、得られた形質転換体を1cp-P_S237/pgsBCAcm とする)。
次に、得られた形質転換体から調製した染 体DNAを鋳型として、pgsC-R及びpC194CmRV/HindIII RV(配列番号44)のプライマーセットを用いて、 クロラムフェニコール耐性遺伝子を含みS237 ルラーゼプロモーター配列を上流に有する pgsBC 遺伝子断片3.4kbを調製した。得られたDNA断片 精製・回収後、制限酵素 Hind IIIにて処理し、同様の制限酵素処理を施した プラスミドベクターpHY300PLKとDNA Ligation kit V er.2を用いてライゲーション反応(結合化)を行 なった。上記ライゲーション試料を用いて、 枯草菌168株をプロトプラスト法にて形質転換 し、クロラムフェニコール5ppmを添加したプ トプラスト再生培地(DM3培地)上に出現したコ ロニーを形質転換体とした。得られた形質転 換体を再度LBCm寒天培地にて生育させ、得ら た菌体からハイピュア プラスミドアイソレ ーションキットを用いてプラスミドを調製し 、得られたプラスミドをPGA組換え生産用ベク ターpHY-P_S237/pgsBC-Cmとした。
〔製造例5〕枯草菌改変体の作製(1)
本製造例では、製造例1で得られたベクター
を導入するための枯草菌変異株の作製方法を
示した(図2参照)。
先ず、枯草菌168株から調製したゲノムDNAを
型とし、表1に示したggt-F(配列番号18)とggt/Cm
-R(配列番号19)とのプライマーセット及びggt/Cm
-F(配列番号20)とggt-R(配列番号21)とのプライマ
ーセットを用いて、ゲノム上の ggt
遺伝子の上流に隣接する1.0kbのDNA断片(D)及び
流に隣接する1.0kbのDNA断片(E)をそれぞれ調
した。一方、プラスミドpC194を鋳型とし、表
1に示したCmFW(配列番号22)とCmRVのプライマー
ットを用いて、クロラムフェニコール耐性
伝子を含む0.9kbのDNA断片(F)を調製した。
次に、得られた3つのDNA断片(D)、(E)及び(F)を 混合して鋳型とし、ggt-Fとggt-Rとのプライマ セットを用いたSOE-PCRにて3断片を(D)-(F)-(E)の になる様に結合し、2.9kbの遺伝子欠失用DNA 片を得た。次に、このDNA断片を用いてコン テントセル法により枯草菌168株の形質転換 行ない、LBCm寒天培地上に生育したコロニー 形質転換体として分離した。さらに、得ら た形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これ 鋳型とするPCRによって ggt 遺伝子の構造遺伝子(ORF)がクロラムフェニコ ル耐性遺伝子(断片F)と置換した目的とする 草菌変異株(以下、δggt株とする)であること を確認した。
〔製造例6〕枯草菌改変体の作製(2)
本製造例では、製造例1で得られたベクター
を導入するための枯草菌変異株の作製方法を
示した(図2参照)。
先ず、枯草菌168株から調製したゲノムDNAを
型とし、表1に示したpgsA FW(配列番号45)とpgs
A/Cm R(配列番号46)とのプライマーセットを用
てゲノム上の pgsBCA
遺伝子の下流に隣接する1.0kbのDNA断片(BCA-UP)
さらにpgsB/Cm FとpgsB RVとのプライマーセッ
を用いてゲノム上の pgsBCA
遺伝子の上流に隣接する1.0kbのDNA断片(BCA-DW2)
それぞれ調製した。
次に、得られたDNA断片(BCA-UP)、(BCA-DW2)及び 造例5にて調製したDNA断片(F)を混合して鋳型 し、pgsA FWとpgsB RVとのプライマーセットを 用いたSOE-PCRにて3断片を(BCA-UP)-(F)-(BCA-DW2)の順 になる様に結合し、2.9kbの遺伝子欠失用DNA断 を得た。次に、この遺伝子欠失用DNA断片を いてコンピテントセル法により枯草菌168株 形質転換を行ない、LBCm寒天培地上に生育し たコロニーを形質転換体として分離した。さ らに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽 出し、これを鋳型とするPCRによって pgsBCA 遺伝子オペロンがクロラムフェニコール耐性 遺伝子(断片F)と置換した目的とする枯草菌変 異株(以下、δBCA株とする)であることを確認 た。
〔製造例7〕プラスミド導入による形質転換
本製造例では、宿主となる枯草菌株及びそ
変異株、その他バチルス( Bacillus
)属細菌の形質転換法を示した。
枯草菌( Bacillus
subtilis
Marburg No.168株、NCIMB11623株及びIFO3215株)、製
例5で作製した枯草菌変異株(δggt株)、製造
6で作製した枯草菌変異株(δBCA株)、製造例4
作製した1cp-P_S237/pgsBCAcm株及び製造例3で作製
した1cp-P_rapA/pgsBCAcm株、さらに、 Bacillus
megaterium
ATCC14581株及びWH320株に対し、製造例1、2及び
3で得られたPGA組換え生産用ベクター(pHY-P_S237
/pgsBCA、pHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_spoVG/pgsBC及びpHY-P_ra
pA/pgsBC、)及びコントロールベクター(pHY300PLK)
用い、形質転換を行なった。上記野生株及
変異体からリゾチーム処理により調製した
ロトプラスト10 5
~10 6
個に上記プラスミドDNAを20~100ngを供し、プラ
ミド導入を行なった。テトラサイクリン-塩
酸塩20ppmを添加したDM3プロトプラスト再生培
(DM3培地)上に生育したコロニーをプラスミ
を導入した目的とする枯草菌形質転換体と
て選抜した。
Bacillus
licheniformis
ATCC9945a株においては、製造例4で得られたPGA
組換え生産用ベクター(pHY-P_S237/pgsBC-Cm)を用い
て形質転換を行ない、15ppmクロラムフェニコ
ルを添加したDM3プロトプラスト再生培地(DM3
培地)を用い、再生培地上に生育したコロニ
をプラスミドを導入した目的の形質転換体
して選抜した。
〔実施例1〕生産性評価(1)
枯草菌168株において、製造例7にて調製した
pHY-P_S237/pgsBCA又はpHY-P_S237/pgsBCを導入した形質
転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30
℃で一晩静置培養を行なった後、このLBTc寒
培地上に生育した枯草菌形質転換体を、予
滅菌した2.0mL容微量遠心チューブ内で0.8~1.6mL
の改変2xL/Maltose培地(2.0%トリプトン、1.0%酵母
キス、1.0%塩化ナトリウム、7.5%マルトース
7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイ
クリン-塩酸塩)中で攪拌/懸濁し、静置した後
の上清液を種培養液とした。この種培養液を
、新たな改変2xL/Maltose培地に1%(v/v)接種し、坂
口フラスコにて、37℃、120rpm、3日間の往復振
盪培養(TB-20R-3F、高崎科学機器)を行なった。
価培養終了後、下記測定例に示す分析条件
てPGA生産量を測定し、評価結果を表2に示し
た。
表2に示したように、対照となる pgsBCA 遺伝子を導入した株に比べて pgsBC 遺伝子を導入した株において高いPGA生産性が 得られた。
〔実施例2〕生産性評価(2)
枯草菌168株において、製造例7にて調製した
pHY-P_S237/pgsBCA又はpHY-P_S237/pgsBCを導入した形質
転換体をそれぞれLBTc寒天培地上に接種し、30
℃で一晩静置培養を行なった後、改変2xL/Malto
se+MSG培地(2.0%トリプトン、1.0%酵母エキス、1.0
%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、8.0%グルタ
ミン酸ナトリウム一水和物、7.5ppm硫酸マンガ
ン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩)
で攪拌/懸濁し、静置した後の上清液を種培
液とした。この種培養液を、新たな改変2xL/
Maltose+MSG培地に1%(v/v)接種し、坂口フラスコに
て、37℃、120rpm、3日間の往復振盪培養(TB-20R-3
F、高崎科学機器)を行なった。評価培養終了
、下記測定例に示す分析条件にてPGA生産量
測定し、評価結果を表3に示した。
表3に示したように、培地中に過剰なグル タミン酸が含有されている場合には、特にPGA の生産性が向上することが明らかとなった。 さらに、培地中に過剰なグルタミン酸が含有 されている場合には、培養開始から3日後で ってもPGA生産性が低下せず高い値を示すこ が明らかとなった。
〔実施例3〕生産性評価(3)
枯草菌168株及び製造例5で作製した枯草菌変
異株(δ ggt
株)において、製造例7にて調製したpHY-P_S237/pg
sBCを導入した形質転換体を、実施例1と同様
手順にてPGA生産性評価を行なった。評価培
終了後、下記測定例に示す分析条件にてPGA
産量を測定し、評価結果を表4に示した。
表4に示したように、δ ggt 株を宿主とした場合には、野生株である枯草 菌168株を宿主とした場合と比較して、PGA生産 性に優れ、且つ培養開始から3日後であって 高い生産性が維持できることが明らかとな た。
〔実施例4〕生産性評価(4)
枯草菌168株及び製造例6で作製した枯草菌変
異株(δ BCA
株)において、製造例7にて調製したpHY-P_S237/pg
sBCを導入した形質転換体を、実施例1と同様
手順にてPGA生産性評価を行なった。評価培
終了後、下記測定例に示す分析条件にてPGA
産量を測定し、評価結果を表5に示した。
表5に示したように、PGA生産能は有していな いが、 pgsBCA 遺伝子を染色体上に有している枯草菌168株の みならず、 pgsBCA 遺伝子を欠損したδ BCA 株においても、高いPGA生産性が得られた。
〔実施例5〕生産性評価(5)
枯草菌168株において、製造例7にて調製した
pHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_spoVG/pgsBC、又はpHY-P_rapA/pgsB
Cを導入した形質転換体を、実施例2と同様の
順にてPGA生産性評価を行なった。評価培養
了後、下記測定例に示す分析条件にてPGA生
量を測定し、評価結果を表6に示した。
表6に示したように、S237セルラーゼプロモ ターのみならず、枯草菌由来の spoVG 遺伝子及び rapA 遺伝子プロモーター用いて、 pgsBC 遺伝子を有するPGA組換え生産ベクターを導入 した枯草菌形質転換体にて高いPGA生産性が得 られた。
〔実施例6〕生産性評価(6)
枯草菌(NCIMB11623株及びIFO3215株)において、製
造例7にて調製したpHY-P_S237/pgsBCを導入した形
転換体を用いて、実施例2と同様の手順にて
PGA生産性評価を行なった。評価培養終了後、
下記測定例に示す分析条件にてPGA生産量を測
定し、評価結果を表7に示した。
表7に示したように、枯草菌168株のみならず 、その他の枯草菌においても pgsBC 遺伝子のみを有するPGA組換え生産ベクターを 導入することによりPGA生産が可能であること が明らかとなった。
〔実施例7〕生産性評価(7)
Bacillus
licheniformis
ATCC9945a株において、製造例7にて調製したpHY
-P_S237/pgsBC-Cmを導入した形質転換体を用いて
実施例2と同様の手順にてPGA組換え生産性評
を行なった(尚、使用する抗生物質は15ppmテ
ラサイクリンを5ppmクロラムフェニコールに
変更した)。評価培養終了後、下記測定例に
す分析条件にてPGA生産量を測定し、評価結
を表8に示した。
表8に示したように、枯草菌のみならず、そ の他のバチルス( Bacillus )属細菌において pgsBC 遺伝子を有するPGA組換え生産ベクターを導入 することによりPGA生産性が高められることが 明らかとなった。
〔実施例8〕生産性評価(8)
Bacillus
megaterium
ATCC14581株において製造例7にて調製したpHY-P_
spoVG/pgsBCを導入した形質転換体、 Bacillus
megaterium
WH320株において製造例7にて調製したpHY-P_S237
/pgsBCを導入した形質転換体を各々用いて、実
施例2と同様の手順にてPGA組換え生産性評価
行なった。評価培養終了後、下記測定例に
す分析条件にてPGA生産量を測定し、評価結
を表9に示した。
表9に示したように、枯草菌のみならず、そ の他のバチルス( Bacillus )属細菌において pgsBC 遺伝子のみを有するPGA組換え生産ベクターを 導入することによりPGA生産性が高められるこ とが明らかとなった。
〔実施例9〕生産性評価(9)(分子量評価)
製造例3及び4にて作製した1cp-P_rapA/pgsBCAcm株
び1cp-P_S237/pgsBCAcm株において、製造例7にお
て調製したpHY-P_S237/pgsBCを導入した形質転換
を用いて、実施例2と同様の手順にてPGA組換
え生産性評価を行なった。評価培養終了後、
下記測定例に示す分析条件にてPGA生産量及び
分子量を測定し、評価結果を表10及び11に示
た。
表10に示したように、PGAを産生する枯草菌 変体において、 pgsBC 遺伝子のみ有するPGA組換え生産ベクターを導 入することにより遺伝子導入前に比べてPGA生 産性が向上することを確認した。
表11に示したように、PGAを産生する枯草菌 変体において、 pgsBC 遺伝子のみ有するPGA組換え生産ベクターを導 入することにより遺伝子導入前に比べて生産 されるPGAが高分子量化することを確認した。
〔測定例〕PGAの定量及び分子量測定法
実施例1~9に示した評価培養終了後の培養液
料を、室温にて14,800rpmで30分間遠心分離(商
名himacCF15RX、日立工機)に供し、遠心分離に
得られた培養液上清中の組換えPGA生産量の
定を行なった。上清試料中のPGA検出はYamaguc
hiらの方法(前述)に準じ、試料をアガロース
ル電気泳動に供した後、メチレンブルーに
るゲルの染色を行ない、PGAに由来する染色
質の有無による組換えPGA生産を確認した。
らに、組換えPGAが検出された試料について
、TSKGel G4000PWXL及びTSKGel G6000PWXLゲルろ過カ
ム(商品名、東ソー)を用いたHPLC分析を実施
た。尚、分析条件は溶離液に0.1M硫酸ナトリ
ウムを使用し、流速1.0mL/分、カラム温度50℃
UV検出波長を210nmとした。また、濃度検定に
は分子量80万のPGA(明治フードマテリアル)を
いて検量線を作成した。さらに、分子量検
にはプルラン(Shodex STANDRD P-82、商品名、昭
電工)を用いて予め重量平均分子量を求めた
各種分子量の異なるポリグルタミン酸[和光
薬工業(162-21411、162-21401)、SIGMA-ALDRICH(P-4886、P
-4761)、明治フードマテリアル(分子量88万)]を
いた。尚、評価結果を示した表中のPGA生産
を表す数値の単位は(g/L)である。また、評
結果を示した表中の記号“ND”は検出限界以
下であることを示している。
〔実施例10〕生産性評価(10)(PGA組成の光学純
測定)
実施例2においてpHY-P_S237/pgsBCAを導入した枯
菌168株形質転換体から得られた培養液、実
例4においてpHY-P_S237/pgsBCを導入した枯草菌
異株(δ BCA
株)形質転換体から得られた培養液を試料と
て用いた。培養液上清に等量のエタノール
添加し、遠心分離にて生成した沈殿を回収
た。続いて、回収した沈殿生成物を乾固さ
、これに6N塩酸を加えて窒素封入し、115~120
にて24時間の加熱処理を行なった。加熱処理
後、窒素ガス気流下で塩酸及び水分を留去し
加水分解試料として回収した。続いて、全自
動アミノ酸分析計L-8500(商品名、日立計測機
)及びL-グルタミン酸測定キット(ヤマサ醤油)
を用いて、上記加水分解物試料のアミノ酸組
成とL-グルタミン酸の定量分析を行なった。
、全自動アミノ酸分析計による分析におい
光学活性異性体(D-体及びL-体)の総量が定量
果として得られ、これよりL-体測定キット
ら得られた定量結果を差し引いた差分をD-体
量とした。また、 Bacillus
sp.KSM-366株(FERM BP-6262)より調製したPGAを Bacillus
属細菌の野生株が産生するPGA標品として上記
分析に供した。さらに、加水分解反応におけ
るアミノ酸のラセミ化率を検証するために、
D-グルタミン酸及びL-グルタミン酸(和光純薬
業)を標品として使用した。その結果を表12
示す。
表12に示したように、 pgsBC 遺伝子のみ有するPGA組換え生産ベクターを導 入した組換え枯草菌により生産されたPGAはL- ルタミン酸含量が90%以上の純度を有する光 純度の高いPGAであることを確認した。また 同時に検討した加水分解処理条件でのアミ 酸のラセミ化率が約10%であったことから、 pgsBC 遺伝子のみを導入した組換え枯草菌から得ら れたPGAの光学純度は80~100%であると推定され 。
〔参考例〕
製造例1と同様に Bacillus
sp.KSM-366株(FERM BP-6262)から調製した染色体DNA
を鋳型とし、表1に示したpgsB-FとpgsB-R(配列番
15)のプライマーセットを用いて、 pgsB
遺伝子1.2kbのDNA断片(G)を調製した。これとKSM-
S237株由来のセルラーゼ遺伝子プロモーター
域のDNA断片(C)を鋳型としP_S237-FWとpgsB-Rとの
ライマーセットを用いたSOE-PCR法にて(G)及び(
C)を1断片化した1.8kbのDNA断片(GC)を得た。以下
、製造例1に示した同様の実験方法によりプ
スミドベクターpHY300PLK(Takara)の Bam
HI及び Hind
III制限酵素認識部位内に、上記DNA断片(GC)の
入が確認できた組換えプラスミドをPGA組換
生産用ベクターpHY-P_S237/pgsBとした。
PGA合成遺伝子導入前のpHY300PLK、並びに上記 pgsB 遺伝子単独発現プラスミド(pHY-P_S237/pgsB)を用 て、実施例1及び2に示したPGA生産性評価を 施したところ、いずれの実験条件において PGA生成が認められなかった。
本発明の組換え微生物は、ポリ-ガンマ- ルタミン酸生産能を有する。したがって、 発明の組換え微生物は、ポリ-ガンマ-グルタ ミン酸の製造に好適に用いることができる。 である。また、本発明の組換え微生物を用い ることで、所望の分子量および構造を有する ポリ-ガンマ-グルタミン酸を製造することが きる。したがって、本発明の組換え微生物 、ポリ-ガンマ-グルタミン酸、生産性の向 、分子量調整方法、および光学純度調整方 に好適に用いることができる。
本発明をその実施態様とともに説明した 、我々は特に指定しない限り我々の発明を 明のどの細部においても限定しようとする のではなく、添付の請求の範囲に示した発 の精神と範囲に反することなく幅広く解釈 れるべきであると考える。
本願は、2007年9月20日に日本国で特許出願 された特願2007-244023に基づく優先権を主張す ものであり、ここに参照してその内容を本 細書の記載の一部として取り込む。