ESPECÍFICO PARA CÂNCER DE MAMA E USO”

Campo da invenção

[01]. A presente invenção refere-se à utilização de peptídeos sintéticos construídos a partir da seleção de peptídeos apresentados na superfície de fagos filamentosos e que se ligam ao fragmento de anticorpo FabC4 com relevância clínica no diagnóstico do Câncer de Mama (CM) e no prognóstico do Câncer de Mama Triplo-Negativo (CMTN) (Araújo T.G. et ai., Câncer Lett., 2014.). Os peptídeos foram específicos a proteínas tumorais e podem ser potencialmente usados em testes imunodiagnósticos, formulações acopladas a partículas fluorescentes ou radioativas para diagnóstico por imagem, carreadores de drogas terapêuticas e em composições imunogênicas para o manejo do CM. A tecnologia utilizada para a seleção dos peptídeos foi o sistema de expressão de peptídeos na superfície de bacteriófago filamentoso. A estratégia utilizada foi a seleção de peptídeos ligantes de proteínas tumorais presente em soro de pacientes com CMTN.

Estado da técnica

[02] O Câncer de Mama (CM) é considerado o tipo de tumor mais comum em mulheres, com cerca de 1 ,7 milhões de novos casos diagnosticados em 2012. Representa 25% de todos os cânceres que acometem o sexo feminino e a quinta maior causa de morte pela doença, mundialmente (WCRF- World Câncer Research Fund International, 2018). Também no Brasil, o CM é o mais incidente entre as mulheres, abstendo o câncer de pele não melanoma, e corresponde a 28% das novas lesões identificadas anualmente. São esperados para o biénio 2018-2019 cerca de 59.700 novos casos. Estima-se que no Brasil houve 15.403 óbitos por esta neoplasia em 2015 (INCA, 2018).

[03]. O Câncer de Mama é uma doença predominantemente genética, em que modificações genômicas herdadas ou oriundas de mutações ao longo da vida conduzem à transformação maligna. Diversos fatores têm sido correlacionados com surgimento dessa doença, tais como: predisposição genética relacionada à presença de mutações nos genes BRCA1 (Breast Câncer 1) e BRCA2 (Breast Câncer 2); a idade; características endócrinas/história reprodutiva da mulher, incluindo estímulo hormonal, menarca precoce, menopausa tardia e nuliparidade; e fatores ambientais/comportamentais como a ingestão de bebida alcoólica, sobrepeso e exposição à radiação ionizante (INCA, 2018; Anderson K. N. et al., Breast Câncer Research and Treatment, 2014).

[04] Após o diagnóstico, são classificados e estadiados. Desde a sua criação, em 1977, o padrão de estadiamento proposto pela International Union Against Câncer (IUAC) ainda permanece amplamente utilizado. O sistema TNM baseia- se em achados anatômicos e analisa três aspectos principais: o tamanho do tumor (T), o comprometimento dos linfonodos (N) e a ocorrência ou não de metástases (M) (Giuliano A. E. et al., Ann. Surg. Oncol., vol. 25, no. 7, pp. 1783-1785, 2018).

[05]. Contudo, são tumores altamente heterogéneos do ponto de vista clínico, biológico e morfológico. São descritos três subtipos moleculares principais, com diferentes perfis prognósticos e estratégias terapêuticas. Ensaios de expressão gênica em microarranjos e experimentos de imunohistoquímica os subclassificam os tumores mamários em: luminal (A e B); os que superexpressam o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER-2) e os triplo-negativos. Além disso, também são descritos os“claudin- low” e o molecular apócrino (De Barros A.C.S. e Leite K. R. M., Rev. Bras. Mastol, 2015).

[06]. O tumor triplo-negativo carece de receptor de estrógeno (RE), receptor de progesterona (RPg) e HER-2. Em geral são agressivos, de pior prognóstico e correspondem a cerca de 15% dos diagnósticos (Pala E. E. et al., Pathol. Oncol, 2015). Divergem morfologicamente, geneticamente, imunofenotipicamente e clinicamente, além de não possuírem uma estratégia terapêutica específica já definida (Carey L. A. et al., Clin. Câncer Res., 2007). Há diferentes perfis de expressão proteica e de mRNA, dificultando a definição de um único modelo de CM triplo-negativo (CMTN) (Gluz O. et al., Ann. Oncol., 2009). Portanto, é evidente a dificuldade em se classificar sistematicamente os tumores triplo-negativos.

[07] Nesse contexto, inúmeros esforços estão voltados para a busca de novas e promissoras abordagens terapêuticas, além de estratégias que possam melhor elucidar esse subtipo tumoral (Lehmann B. D. B. et al., J. Clin. Invest., 2011.).

[08]. Um dos grandes desafios no CM consiste no desenvolvimento de terapias específicas para o subtipo triplo-negativo (Collignon J. et al., Breast câncer, Dove Med. Press, 2016). Tomao et al. (2015) descreveu a existência de características moleculares inerentes a esse tumor passíveis de abordagem terapêutica. O Phage Display, descrito pela primeira vez na década de 1985, consiste na busca de peptídeos ligantes a alvos específicos por meio da utilização de vetores virais (Scott J. K. and Smith G. P., Science, 1990). Essa técnica tem se mostrado promissora no mapeamento de epítopos-chave para desvendar os mecanismos inerentes ao surgimento e progressão de diversas doenças, uma vez que não exige conhecimento prévio de seus alvos (Moreira G. M. S. G. et al., in Methods in molecular biology, 2018).

[09]. Nosso grupo de pesquisa caracterizou em estudo anterior, por Phage Display, um novo anticorpo FabC4 com relevância clínica no diagnóstico do CM e no prognóstico do CMTN (T. G. Araújo et al., Câncer Lett., 2014). O anticorpo recombinante foi associado com idade mais jovem, ausência do receptor de progesterona, maiores graus histológicos e fenótipo não-luminal. Além disso, identificou um subgrupo de CM triplo-negativos de bom prognóstico. Por isso, a caracterização adicional de seu alvo é essencial para o manejo clínico dessa neoplasia.

[010]. Dada a natureza heterogénea, multifatorial e multifocal do CM, a busca por potenciais biomarcadores e suas associações moleculares envolvidas na ocorrência e desenvolvimento dessa doença é fundamental para um diagnóstico mais preciso e para esclarecer o fenótipo neoplásico (Mittal S. et al., Biosens. Bioelectron., 2017). Recentemente vários estudos vêm sendo realizados voltados para a identificação e validação de antígenos para detecção de tumor, sobretudo na busca de biomarcadores séricos (Gerasimov E. et al., BMC Bioinformatics 2017).

[011]. Realizamos então, um ensaio de bioprospecção contra o FabC4 utilizando uma biblioteca PH.D-12 a fim de mapear seus epítopos. Selecionamos e caracterizamos clones de fagos que mimetizam epítopos (mimotopos) correspondentes às proteínas Anexina A2 e Citoqueratina 10 (CK10). Além disso, nossos resultados abrem novas perspectivas no diagnóstico de CM e no desenvolvimento de novas terapias.

[012] No que tange ao diagnóstico, a patente W02013075059A1 refere-se ao desenvolvimento de método diagnóstico do CMTN baseados em perfil de expressão genica, que são biomarcadores para esse subtipo tumoral. A desvantagem desse modelo, frente ao apresentado neste pedido, é o custo elevado e a necessidade de avaliar um conjunto extenso de genes.

[013]. No desenvolvimento de biomoléculas com potencial diagnóstico e terapêutico, a tecnologia Phage Display possui grande relevância. Descrita pela primeira vez na década de 1985, consiste na busca de peptídeos ligantes a alvos específicos por meio da utilização de vetores virais (Scott J. K. and Smith G. P., Science, 1990). Essa técnica tem se mostrado promissora no mapeamento de epítopos-chave para desvendar os mecanismos inerentes ao surgimento e progressão de diversas doenças, uma vez que não exige conhecimento prévio de seus alvos (Moreira G. M. S. G. et al., in Methods in molecular biology, 2018).

[014] As patentes W02002020723A2, W02002020822A2, W02002020722A2 fazem referência ao isolamento de peptídeos ligantes a superfície de células tumorais, por Phage Display, expondo a sua utilização em composições in vitro e/ou in vivo em humanos.

[015]. Na busca de uma metodologia rápida, prática, eficiente e capaz de robustecer os métodos diagnósticos atualmente empregados para o câncer de mama, para o direcionamento do subtipo tumoral triplo-negativo, e fornecer plataforma para um tratamento mais eficaz para o CMTN, a presente invenção propõe a proteção para o uso das sequências peptídicas (Seq. ID N° 1 a Seq. ID N° 4), sendo estas fusionadas ou não a carreadores, tais como compostos fluorescentes/radioativos, fármacos, fagos filamentosos, ou a quaisquer outros tipos de carreadores, sejam estes associados com marcação de radioisótopos, conjugados a fluoróforos em geral, variantes de Alexa-fluor com seus distintos comprimentos de onda, a GFP (proteína fluorescente verde), PEG (polietileno glicol), biotina, quantum-dots, ou conjugados a grupamentos químicos, nanomateriais e moléculas quimioterápicas ou usados conjuntamente com anticorpos secundários marcados em geral para detecção, de modo a aumentar a estabilidade e utilização em diagnóstico e/ou tratamento de câncer de mama no geral e no subtipo triplo-negativo e demais doenças que se façam utilizáveis. Reivindicamos o uso destes peptídeos em testes imunoenzimáticos, tais como ELISA, imunohistoquímica, testes de imunoaglutinação e imunofenotipagem, sensores eletroquímicos, citometria de fluxo HPLC, ou qualquer outra forma de detecção relacionada direta ou indiretamente em amostras de sangue, urina ou saliva.

[016]. Visa-se ainda a proteção sobre o uso dos peptídeos conjugados a agentes fluorescentes, colorométricos, radioisótopos, luminescentes, nanocristais, nanopartículas magnéticas e outros para obtenção de imagens in vitro ou in vivo, detecção por fluorescência, luminescência ou colorimetria em equipamentos estáticos ou portáteis, e visualização em microscópio. Bem como a formulação de composições imunogênicas contendo um ou mais compostos definidos pelas sequências peptídicas (Seq. ID N° 1 a Seq. ID N° 4) e quaisquer adjuvantes fisiologicamente e farmaceuticamente aceitável.

[017] A invenção poderá ser melhor compreendida por meio da descrição detalhada através dos exemplos 1 , 2, 3, 4, 5, 6 e 7 dos resultados experimentais obtidos. Os procedimentos experimentais são detalhados no tópico “Metodologia experimental” ao final desse relatório descritivo. A metodologia empregada na seleção caracterização e utilização de peptídeos foi aplicada em amostras de pacientes com CM, Doença Benigna da Mama (DBM) e Controle normais (CO), comprovando a aplicabilidade de sua utilização no diagnóstico e possível tratamento do CMTN.

Exemplo 1

[018]. Este exemplo se refere a seleção de peptídeos ligantes ao fragmento de anticorpo FabC4 e miméticos de seus alvos. Com o intuito de atingir esse objetivo, foi realizado o ensaio de bioprospecção utilizando a tecnologia do Phage Display com o uso de vírus bacteriófagos que expressavam na superfície de seu capsídeo, peptídeos randômicos de 12 aminoácidos, para a seleção de clones específicos ao FabC4. Após a seleção, procedeu-se com a realização de ensaios de Phage-ELISA com o objetivo de verificar quais os bacteriófagos foram mais específicos para o FabC4.

[019]. A FIGURA 1 demonstra o gráfico representativo das diferentes reatividades dos clones ao FabC4 e ao FabIR (Irrelevante, usado como controle negativo). Apesar de vários clones apresentarem elevada reatividade ao FabC4 (absorbância acima do fago selvagem), apenas cinco foram selecionados, considerando o parâmetro baseado na absorbância acima de 0,2 para o FabC4 e inferior a 0,1 para o FabIR. Essa estratégia permitiu a identificação de fagos com elevada afinidade ao FabC4.

Exemplo 2

[020]. Com o intuito de investigar a sensibilidade desses fagos a IgGs circulantes de pacientes com CM, DBM e CO e os seus possíveis papeis como biomarcadores, testes imunoenzimáticos foram conduzidos em duas etapas concentradas na FIGURA 2. Primeiramente, foi utilizado três pools de soros constituídos por 10 amostras de cada grupo para uma avaliação preliminar dos cinco clones escolhidos, mostrados na Figura 2A. As reatividades dos fagotopos em soros agrupados diferenciaram significativamente o CM do grupo DBM em três dos cinco clones testados. O fago A7 foi mais reativo ao soro de CM apenas quando comparado ao das pacientes CO (P<0,001 ). [021] Em um segundo momento, os fagos A5, A7, C4 e D6 foram conduzidos a ensaios de ELISA com um número maior de pacientes (50 de cada grupo). Todos os valores foram normalizados com a absorbância obtida para o fago selvagem. Os resultados demonstraram uma seleção por afinidade bem- sucedida de quatro mimotopos capazes de reconhecer, significativamente, IgGs presentes no soro de pacientes com CM.

[022] Todos os clones selecionados foram capazes de discriminar as amostras tumorais das de doença benigna da mama e de amostras normais. As absorbâncias relativas dos fagos A5, A7, C4 e D6 são apresentadas nas FIGURAS 2A-2B-2C-2D-2E respectivamente. Para nenhum dos clones foram verificadas diferenças estatisticamente significantes entre amostras DBM e CO.

[023]. A curva ROC foi então construída para predizer o valor global de cada fago selecionado como ferramenta diagnóstica. A área sob a curva (AUC) foi calculada, assim como a sensibilidade, a especificidade e a razão de verossimilhança, mostrados na TABELA 1. Como no ensaio de ELISA, os quatro clones apresentaram comportamento semelhante com AUC acima de 0,70, exceto o fago C4 quando seus dados para DBM foram comparados aos CO.

TABELA 1

[024] O clone A7 se destacou pelo conjunto de valores: AUC=0.767 (P=0.01 ), sensibilidade de 88% e especificidade de 50%, comparando CM com DBM e AUC=0.805 (P=0.01 ), sensibilidade de 92% e especificidade de 50%, comparando CM e CO. O clone A5 apresentou uma menor especificidade ao se diferenciar pacientes malignos dos diagnosticados com doença benigna. A análise do odds ratio (OR) suporta o valor preditivo dos nossos fagos A5 (OR = 4,32 (IC 95% 1 ,8 a 9,8), P = 0,0004), A7 (OR = 7,78 (IC 95% 3,36 a 17,23), P = 0,0001 ) , C4 (OR = 6,52 (IC 95% 2,78 a 14,95), P = 0,0001) e D6 (OR = 4,66 (IC 95% 2,22 a 9,59), P = 0,0001), os quais atribuem maior chance de o paciente possuir tumor ao ser discriminado no teste imunoenzimático.

[025]. Os quatro fagos selecionados exibiram um perfil de reatividade semelhante nos resultados dos ELISAs. Foi avaliada, então, a correlação entre as absorbâncias para o grupo CM, com o objetivo de demonstrar o sinergismo no comportamento desses clones. Como visto na FIGURA 3 as análises de correlação linear corroboraram essa hipótese. Verificamos uma correlação positiva significante em todas as análises (p<0,05). Para cada uma das duplas de clones: A5xA7 (R= 0,5917, p= 0.000228), A5xC4 (R= 0,734, p= 7,7e-07), A5xD6 (R= 0,806, p= 8,841e-09), C4xA7 (R= 0,554, p= 0,000127), D6xA7 (R= 0,61 , p= 0,000127) e D6xC4 (R= 0,71 , p= 2,62e-06).

Exemplo 3

[026]. Fragmentos de ssDNA circular dos quatro clones validados foram extraídos, sequenciados e traduzidos pelo programa ExPASy. Foram obtidas sequências distintas, apresentadas na TABELA 2. As análises no banco de dados SAROTUP confirmou a não redundância dessas sequências.

TABELA 2

[027] Uma vez que se objetivou mapear o epitopo do FabC4, os peptideos foram então quimicamente sintetizados (GenScript) e avaliados quanto à sua capacidade de se ligarem ao fragmento de anticorpo FabC4 por ELISA, visto na FIGURA 4. Todos foram reativos ao alvo. O peptídeo pC4 apresentou a maior absorbância quando comparado aos demais (p<0,05 para todas as comparações), seguido pelo pD6 (também p<0,05 para todas as comparações).

[028]. Os quatro peptídeos foram então testados quanto à sua capacidade diagnóstica contra o soro de 150 pacientes (50 de cada grupo de estudo). Exemplificado pelo peptídeo sintético pD6, observa-se que este apresentou reatividade diferencial entre as amostras, evidenciado na FIGURA 5A. As FIGURAS 5B e 5C mostram que curva ROC foi significativa para CM x DBM (AUC= 0,68) e CM x CO (AUC = 0,78), com sensibilidades de 88,10% e 44,4% e especificidades de 94% e 44,4%, respectivamente, confirmando o potencial diagnóstico.

Exemplo 4

[029]. Este exemplo se refere à validação da capacidade do anticorpo FabC4 de se ligar aos alvos ANXA2 e CK10, apresentado na FIGURA 6. Em um primeiro momento, foi avaliado o comportamento dessas proteínas nas linhagens celulares tumorais MCF-7 (fenótipo luminal) e MDA-MB-231 (fenótipo triplo-negativo), FIGURA 6A-B. A ANXA2 foi encontrada, predominantemente, no citoplasma das células MCF7. Essa marcação se mostrou menos intensa do que em MDA-MB-231 , visto na FIGURA 6A-B.

[030]. Identificada no citoplasma, a marcação para a CK10 também foi diferente entre as duas linhagens, mostrando-se mais intensa na MDA-MB-231. Nestas células, a proteína também foi visualizada no núcleo. Interessantemente, nesse modelo celular, as duas proteínas co-localizaram no citoplasma, visualizado na FIGURA 6A-seta, comportamento ainda não descrito em tumores mamários.

[031]. A marcação para o FabC4 foi citoplasmática e também mais intensa na linhagem MDA-MB-231 , seguindo o perfil de seus alvos, FIGURA 6B-C. A co- localização com a ANXA2, mostrado na FIGURA 6B-seta e CK10 na FIGURA 6C-seta, confirmam a capacidade desse anticorpo recombinante em reconhecer essas proteínas. Exemplo 5

[032] Este exemplo se refere modelagem tridimensional, interação ( Docking ) entre os peptídeos selecionados e o FabC4, e alinhamento tridimensional a fim de caracterizar, in silico, os epítopos do FabC4. Para melhor elucidar as interações e em função das correlações observadas nos ensaios de Phage- ELISA, os peptídeos (pA5, pA7, pC4 e pD6) foram modelados de maneira individual e em combinações.

[033]. Os peptídeos foram modelados pelo software PEPFOLD 2.0, enquanto o FabC4 foi modelado pelo RAPTORX. O PEPFOLD 2.0 forneceu 100 modelos mais prováveis para cada um dos quatro peptídeos e suas combinações. O melhor resultado individual foi submetido como input no formato .pdb, juntamente com a estrutura tridimensional modelada do FabC4, na ferramenta online HPEPDOCK. Este software gerou outros 100 modelos de simulação das interações FabC4-Peptídeos e suas combinações, os quais foram ranqueados e avaliados individualmente pelo software Fast Interaction REfinement in molecular DOCKing (FIREDOCK). Os melhores encontram-se representados na FIGURA 7A.

[034] Os valores de RMSD ( Root Mean Square Deviation of atomic positions) foram usados para determinar o quão específicas e consistentes são as previsões e as posições de interação no sítio do FabC4. Ressaltamos na FIGURA 7B os peptídeos que apresentaram o melhor escore, avaliados quanto à coerência e estabilidade físico-espacial. Desta forma, os peptídeos pA7 e pC4 foram mais propensos a interagir com FabC4 e, portanto, selecionados para análises posteriores.

Exemplo 6

[035]. Este exemplo se refere à capacidade dos peptídeos mimetizarem as proteínas ANXA2 e CK10. Considerando a ANXA2 (PDB: 1W7B) e CK10 (PDB: 4ZRY) como alvos do FabC4, fez-se necessário validar, in silico a capacidade dos peptídeos selecionados em mimetiza-los.

[036]. O alinhamento por sobreposição e comparação dos aminoácidos, foram realizados no programa PyMOL, localizando as regiões com maior identidade (> 30%) e cobertura. Após a análise os resultados demonstraram que o pC4 (Peptídeo expresso no fago C4) mimetizou a ANXA2 e a CK10 em duas posições diferentes, como visto na Figura 8. Na FIGURA 8A é visto o alinhamento entre os peptídeos e ANXA2, enquanto na FIGURA 8B a identidade tridimensional entre os peptídeos e a CK10. Os melhores alinhamentos para o pC4, e a descrição dos aminoácidos semelhantes entre as estruturas são mostrados na FIGURA 8C. Para a primeira a região mimetizada foi PPASY (Prolina-Prolina-Alanina-Serina-Tirosina) e, para a segunda

ALKQSL (Alanina-Leucina-Lisina-Glutamina-Serina-Leucina).

Exemplo 7

[037] Esse exemplo se refere à comprovação do sucesso dos peptídeos enquanto miméticos dos epítopos do FabC4, para tal, os alvos ANXA2 e CK10 foram modelados e ancorados ( Docking molecular) ao anticorpo FabC4 e as regiões de interação foram comparadas às do complexo pC4-FabC4. Os dockings proteicos foram realizados utilizando o software PATCHDOCK 1.3 sem sítio de direcionamento para que as simulações cobrissem toda a superfície do ligante. O software forneceu dez modelos, os quais, também pelo FIREDOCK, foram classificados termodinamicamente pelo melhor escore. A FIGURA 9A mostra a representação das interações do FabC4 com a ANXA2 e na FIGURA 9B com a CK10. O tracejado amarelo indica a interação não- covalente entre os aminoácidos. As estruturas se mostraram estáveis e através da FIGURA 9 é possível observar que os aminoácidos envolvidos com a interação FabC4-ANXA2 e FabC4-CK10 coincidiram com os aminoácidos envolvidos na interação FabC4-pC4, confirmando a seleção bem-sucedida de peptídeos miméticos ao epítopo do fragmento de anticorpo de interesse.

Metodologia empregada

[038]. Para melhor compreensão dos exemplos utilizados no presente invento, este tópico segue com uma descrição detalhada dos procedimentos adotados. Extração de proteínas totais de pacientes

[039]. Os fragmentos de tecidos das pacientes foram macroscopicamente dissecados e macerados em nitrogénio líquido utilizando cadinho com bastão de porcelana em tampão de extração (Tris-HCL 20mM pH7,2, EDTA 10mM, EGTA 2mM, sacarose 250mM, DTT 1 mM, Benzamidina 1 mM). O material resultante foi transferido para um microtubo e centrifugado a 20.000 x g durante 30 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e a concentração de proteínas totais foi quantificada pelo método de Bradford ^[23] . Para a preservação de sua integridade foram adicionados os inibidores de protease benzamidina (100mM) e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) (150 mM). Foram extraídas proteínas de tecidos de pacientes (cinco para cada grupo) diagnosticadas com CM, Doença Benigna da Mama (DBM) e amostras provenientes de mamoplastia, consideradas normais (CO).

Phaae disolav

[040]. Foi utilizada uma biblioteca de peptídeos aleatórios de 12 aminoácidos fusionados à proteína de revestimento menor (plll) dos bacteriófagos M13 - PhD-12 (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA). Nesta abordagem de bioprospecção foram utilizadas 1 ,5 ^x 1011 partículas virais em três ciclos de seleção contra o anticorpo FabC4, amplificadas como descrito anteriormente ^[24] , com modificações. O desenho experimental encontra-se demonstrado na FIGURA 10.

[041] Para a seleção foram utilizados 10pg do FabC4 e do FabIR imobilizados em uma placa de 96 poços por 24h a 4°C. O bloqueio foi realizado por 1 h a 37°C com PBS1X-BSA3%, seguido de duas lavagens com 300mI_ de TBS- T0,1 % (solução salina tamponada com Tris e 0,1% de Tween 20). Em uma estratégia de seleção subtrativa, o FabIR foi incubado com 1 ,5 x 10 ¹¹ partículas de fagos geneticamente modificados, para expressão de peptídeos em sua superfície, da biblioteca de PhD-12 em 200mI_ de solução de TBS à temperatura ambiente (T.A). durante 30 min. Posteriormente, o sobrenadante contendo os fagos não ligantes foram expostos ao FabC4 por 1 hora a T.A. [042] Após esse período, o poço contendo o FabC4 foi lavado dez vezes com TBS-T0,1 % e as partículas que não se ligaram foram descartadas. Em seguida os fagos recombinantes que reconheceram o FabC4 foram desligados do alvo por meio de uma eluição em duas etapas objetivando selecionar peptídeos relacionados e específicos ao CM. Em um primeiro momento, o complexo FabC4-Fago foi incubado com proteínas extraídas de tecidos benignos e normais (30 min a T.A.) eluindo-se competitivamente, os peptídeos miméticos a proteínas não-tumorais. Estas foram descartadas. Os vírus que permaneceram ligados ao FabC4 foram submetidos a uma segunda eluição competitiva com proteínas extraída de tecidos com CM (30 min a T.A.)

desligando, assim, os peptídeos miméticos a proteínas tumorais. Estes foram amplificados em Escherichia coli ER2738 (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA), purificados com PEG-NaCI (20% de Polietilenoglicol 8000 e 2,5 M de NaCI - solução estéril) e utilizados em um novo ciclo de seleção. A partir do segundo aumentou-se a estringência do tampão de lavagem de 0,1 % para 0,5%, de Tween 20. Após o terceiro round, colónias bacterianas individuais contendo clones de fagos amplificados foram cultivadas em uma placa deep well para validação do biopanning e seleção de clones promissores.

Amplificação e purificação dos fagos recombinantes

[043]. Os fagos foram amplificados utilizando uma colónia de E. coli da linhagem ER2738 previamente inoculada em 20mL de meio Luria-Bertani (LB) estéril contendo tetraciclina (20 pg/mL); mantido sob agitação a 37°C até OD600nm = 0.3. Esta cultura foi diluída em novo meio LB contendo tetraciclina (1 mL de cultura/120mL de meio) sendo esta, distribuída em uma placa deep well (1 mL/poço).

[044] Usando palitos esterilizados, colónias azuis (bactérias infectadas com fagos) foram retiradas da placa de petri (referente ao terceiro round não- amplificado) e transferidas para um poço da placa deep well contendo a cultura previamente diluída. Esta foi vedada com um adesivo e incubada, por 5 horas, sob forte agitação a 37°C. Para segurança, 100pL de cada poço foram estocados em uma placa de microtitulação (Falcon® -Thermo Fisher) acrescidos de 100mI_ de glicerol 50%. Após a incubação, a placa deep well foi centrifugada por 20 minutos a 3700 rpm e os sobrenadantes transferidos para outra placa estéril. A esta foi adicionado 1/6 do volume em PEG/NaCI com incubação por 14 horas a 4°C. Transcorrido esse período, a placa foi centrifugada por 1 hora a 3700 rpm e todo o sobrenadante dispensado. O precipitado foi ressuspendido em 200mI_ de PBS1X.

Extração de DNA e sequenciamento

[045]. Para extração do DNA dos fagos 10mI de bactérias infectadas com cada clone foram inoculados em 1 mL de meio LB em placas Deep well. Esta foi incubada por 16 horas a 37°C sob agitação e posteriormente centrifugada a 3700 rpm durante 50 min a 4°C. O sobrenadante foi transferido para uma nova placa e incorporado 1/6 do volume de PEG/NaCI mantido a 4°C por 10 min. Após nova centrifugação durante 1 hora a 3700 rpm a 4°C, o sobrenadante foi descartado e em cada well foram adicionados 100mI de tampão iodeto (10mM de Tris-HCI pH 8,0, 1mM de EDTA e 4M de Nal). Após breve agitação foram adicionados 250mI de etanol absoluto e a solução permaneceu incubando durante 10 min T.A. Posteriormente, a placa foi centrifugada por 40 min a 3700 rpm a 20°C. Descartou-se o sobrenadante, adicionou-se 150mI de etanol 70% com nova centrifugada por 10 min a 3700 rpm. O sobrenadante foi dispensado e o DNA dos fagos ressuspendido em 15ul de água ultrapura.

[046]. As reações de sequenciamento foram conduzidas em sequenciador automático ABI3500 ( Applied Biosystem, Califórnia, USA), seguindo-se as recomendações do fabricante e utilizando o primer -96M13 (5’-

CCCTCATTAGTTAGCGCGTAACG-3'). As sequências de aminoácidos foram deduzidas a partir das sequências nucleotídicas com o auxílio do software ExPASy (http://www.expasy.org). Foi feita ainda uma análise dos peptídeos utilizando o software SAROTUP (http://immunet.cn/sarotup/index.html) para validar os peptídeos como não ligantes às superfícies de adsorção. O alinhamento via BLASTp (NCBI) permitiu a análise de similaridade dos peptídeos selecionados.

Reatividade ao FabC4

[047] Para confirmar o reconhecimento dos peptídeos selecionados pela molécula alvo foram realizados ensaios de Phage-EUSA em duplicata. Placas de microtitulação de 96 poços ( Nunc MaxiSorp-Sigma®) foram revestidas com 1 pg/poço de FabIR e FabC4 diluídos em tampão carbonato/bicarbonato (50mM pH 9,6); mantidas por 16 horas a 4°C. Os poços foram lavados com PBS-T0,1% e bloqueados durante 1 h a 37°C com PBS-BSA3%.

[048]. Posteriormente, a placa foi lavada duas vezes com PBS-T0,1 % e o sobrenadante de cultura contendo partículas virais amplificadas (-1010 pfu/mL) foi adicionado, com posterior incubação por 1 h a 37°C. Foram realizadas quatro lavagens com PBS-T0,1 % para então ser pipetado o anticorpo anti-M13 conjugado com peroxidase ( Roche Applied Science) diluído 1 :5000 em PBS1X-BSA3%. A placa foi mantida por 1 h a 37°C seguida de quatro lavagens com PBS-T0,1 %.

[049]. A reação com o substrato OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina) SigmaFast® (Sigma- Aldrich), interrompida com H2S04 (2N), foi analisada em espectrofotômetro no comprimento de 492 nm ( TP-Reader ThermoPlate). O fago M13 sem exibir qualquer peptídeo (selvagem) foi utilizado como controle negativo e normalizador dos valores obtidos. Para os ensaios posteriores foram escolhidos os fagos cuja reatividade ao irrelevante foi inferior a 0,1 e ao FaC4 foi superior a 0,2.

Phaae-EUSA em soro de pacientes

[050]. Ensaios de ELISA foram realizados para identificar os antígenos como circulantes. Microplacas de poliestireno ( Nunc MaxiSorp-Sigma®) foram revestidas com 10 ¹⁰ pfu de cada clone de fago diluído em tampão carbonato/bicarbonato (50mM pH 9,6), incubadas por 16 horas a 4°C. Após sensibilização, as microplacas foram lavadas uma vez com PBS-T0,05% e bloqueadas a 37°C por 1 hora com 300pL de PBS-T0,05%M5% (PBST0,05% acrescido de leite desnatado a 5% - PBSTM). Em seguida, amostras de soro diluídas 1 :400 em PBSTM foram incubadas por 1 hora a 37°C. Foram utilizados três pools de soro correspondentes a cada um dos grupos: CM (10 pacientes com carcinoma ductal invasivo); DBM (10 pacientes) e CO (10 pacientes).

[051]. As placas foram lavadas cinco vezes com PBS-T0,1 % e foi adicionado o anticorpo anti-lgG humano marcado com peroxidase (Sigma) diluído 1 : 5000 em PBSTM. Após 1 hora de incubação a 37°C e lavagem com PBS-T0,1%, foi acrescido o substrato OPD e a reação interrompida com H2S04 (2N). As densidades ópticas foram determinadas a 492 nm em leitor de ELISA ( TP - Reader ThermoPlate) e os experimentos foram conduzidos em triplicata.

[052] As absorbâncias foram normalizadas com os valores obtidos para o fago M13 selvagem, utilizado como controle. Quatro clones foram, em seguida, testados individualmente em triplicata contra um novo grupo de 150 pacientes (50 CM; 50 DBM; 50 CO). O ponto ótimo de reação ( cut-off) foi determinado baseando-se nos dados da curva ROC.

Peotídeos sintéticos como eoítooos do fabc4

[053]. Os clones A5, A7, C4 e D6, que foram capazes de discriminar o soro de indivíduos com CM de DBM e CO por Phage-EUSA, foram sintetizados quimicamente pela GenScript USA Inc. Para aumentar a imunogenicidade, os peptídeos foram acoplados ao BSA. Ensaios imunoenzimáticos foram conduzidos para avaliar a capacidade do anticorpo FabC4 em reconhecer esses peptídeos.

[054] Uma placa de microtitulação foi sensibilizada com 2,5 pg/poço de cada um dos peptídeos diluídos em tampão de carbonato/bicarbonato (50mM pH 9,6) e mantida por 16 horas a 4°C. Após bloqueio com PBS1X-BSA3% (1 hora a 37°C) uma única lavagem com PBS1X precedeu à adição do FabC4 (1 ug), incubado por 1 hora a 37°C. Após lavagem com PBS1X, foi adicionado o anticorpo anti-HA marcado com peroxidase (Roche Applied Science) diluído 1 :5000 em PBS-BSA3% por 1 h a 37°C. Após lavagem com PBS1X, a reação com o substrato OPD SigmaFast® (Sigma-Aldrich), interrompida com H2S04 (2 N), foi analisada em espectrofotômetro no comprimento de 492 nm (TP- Reader ThermoPlate).

[055]. As mesmas condições foram utilizadas para analisar a capacidade diagnóstica dos peptídeos frente ao soro dos 150 pacientes previamente descritos. Novamente o teste ANOVA e Mann Whitney foram utilizados para fins comparativos entre grupos com o auxílio do software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc. - La Jolla, CA, USA). Foram considerados significativos valres de P<0,05.

Modelaqem molecular e dockinq

[056]. Para determinar a estrutura tridimensional do FabC4, assim como as possíveis interações e ligações entre os peptídeos e o anticorpo recombinante foram realizados ensaios in silico de modelagem molecular e docking. A estrutura tridimensional do fragmento de anticorpo FabC4 foi modelada a partir da construção em FASTA das cadeias leves e pesadas das porções variáveis e constantes utilizando o software RaptorX

(http://raptorx.uchicago.edu/StructurePrediction/predict/ ). O modelo foi escolhido com base nos escores apresentados bem como com o auxílio do software Verify3D (http://servicesn.mbi.ucla.edu/Verify3D/) e RAMPAGE: Ramachandram Plot Assessment

(http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampaqe.php).

[057] Os peptídeos foram modelados pelo método de novo utilizando o software PEPFOLD2.0 - RPBS (http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi- bin/portal.py#forms::PEP-FOLD) e os filtros do programa. As interações (docking molecular) entre os peptídeos e o FabC4 foram preditas pelo software FIPEPDOCK (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/). Já os arquivos de visualização tridimensionais dos alvos ANXA2 e Ck10 foram localizados em banco de dados de proteínas, mais especificamente o Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/pdb).

[058]. Foram realizados, ainda, dockings moleculares, via PATCHDOCK (https://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/), entre proteínas previamente descritas como alvos do FabC4 (ARAÚJO, 2014) e o anticorpo recombinante. Finalmente, a predição para avaliar se os epítopos selecionados correspondem a regiões específicas dessas proteínas, e todas as visualizações e análises foram realizadas no software PyMol.