La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología, y se refiere al receptor soluble IFNAR2.3 aislado, producido de manera recombinante, y a su uso en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune, en particular la esclerosis múltiple, y para su uso en el diagnóstico de dicha enfermedades. También se refiere a un método de diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, a un kit y a sus usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), presumiblemente autoinmune. Se caracteriza por la presencia de lesiones inflamatorias en la sustancia blanca y gris del SNC, denominadas placas, en las que se produce pérdida de mielina y cierto grado de degeneración axonal.

Aunque en los últimos años se han desarrollado numerosos fármacos para paliar los efectos de esta enfermedad, el interferon beta (IFNB) sigue siendo el tratamiento más ampliamente utilizado. Numerosos ensayos clínicos han demostrado que disminuye la frecuencia y gravedad de los brotes, el número y volumen de las lesiones cerebrales observadas por resonancia y la progresión en la escala de discapacidad física. Sin embargo, un porcentaje importante de pacientes (30-50%) no responden adecuadamente al tratamiento, ya que continúan con la presencia de brotes y progresan en la escala de discapacidad física.

El IFNB ejerce su actividad biológica a través de la interacción con el receptor de superficie IFNAR formado por dos subunidades, IFNAR1 e IFNAR2. Tras la unión del IFNB a IFNAR2, se produce la dimerización de las dos subunidades y la activación de la cascada de señalización intracelular cuya señal es transducida al núcleo a través de la vía Jak-Stat. De esta forma se ejercen las actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras del IFNB. La subunidad IFNAR2 del receptor sufre un procesamiento alternativo del ARNm que da lugar a tres isoformas distintas: una isoforma corta (IFNAR2b), una isoforma larga funcionalmente activa (IFNAR2c) y la isoforma soluble (slFNAR2, IFNAR2.3 o IFNAR2a). Solamente IFNAR2c actúa como receptor funcional junto con IFNAR1 y es capaz de mediar los efectos biológicos del IFNB. IFNAR2.3 que carece de dominios citoplasmáticos y transmembrana, ha sido identificada en fluidos biológicos humanos y aunque su papel no está definido, se ha sugerido que pueda tener capacidad neutralizante de la unión del IFNB con el receptor IFNAR2. De esta forma podría ejercer funciones moduladoras según la concentración a la que se encuentre; por un lado podría neutralizar la unión del IFNB al receptor IFNAR o por el contrario, prolongar la vida media del IFNB circulante, impidiendo su degradación o la formación de oligómeros. A día de hoy sigue siendo desconocida la función de la vanante soluble de IFNAR2.

El diagnóstico clínico de la EM es complejo. Éste se realiza teniendo en consideración la existencia de criterios clínicos de diseminación espacial (presenta de síntomas y signos que indiquen existencia de dos lesiones independientes en el SNC) y de diseminación temporal (dos o más episodios de disfunción neurológica).

Los estudios de conductividad nerviosa de los nervios ópticos, sensitivos y motores también proporcionan pruebas de la existencia de la enfermedad, ya que el proceso de desmielinización implica una reducción de la velocidad de conducción de las señales nerviosas. El estudio se realiza comparando los tiempos de reacción con mediciones preestablecidas.

El proceso de diagnóstico se completa con la realización de pruebas para excluir otras enfermedades que pueden imitar a la esclerosis como la Enfermedad de Devic, la sarcoidosis, la vasculitis y la enfermedad de Lyme.

Hasta el momento, la prueba paraclínica por excelencia para confirmar el diagnóstico de EM es la presencia de bandas oligoclonales (BOC) en líquido cefalorraquídeo, producidas por células situadas en el espacio subaracnoideo, que dan lugar a síntesis intratecal de IgG. El método más sensible para su detección es el isoelectroenfoque en gel de poliac lamida, que permite detectar BOC hasta en el 95% de los casos de EM. El principal inconveniente de esta técnica es la necesidad de realizar una punción lumbar al paciente, siendo un método invasivo para el paciente y costoso.

Sería útil, por tanto, encontrar una prueba paraclínica que consiga diagnosticar individuos con EM de una manera mucho menos invasiva, incruenta y por ello, más inocua para el paciente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante obtenible por un procedimiento que comprende:

a) integrar un inserto con la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 en un vector de expresión,

b) transformar un hospedador con el vector de expresión del paso (a),

c) inducir la expresión de la proteína recombinante,

d) extraer la proteína recombinante, y

e) opcionalmente purificar la proteína recombinante.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente una proteína recombinante según el primer aspecto de la invención.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende:

a) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2,

b) la proteína recombinante obtenida según el primer aspecto de la invención, c) La proteína SIFNAR2 (IFANR2.3 o IFNAR2 soluble), ó

d) el anticuerpo según el segundo aspecto de la invención.

Preferiblemente la composición es una composición farmacéutica, más preferiblemente además comprende un vehículo y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente puede comprender otro principio activo.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a la composición del tercer aspecto de la invención para su uso como medicamento. Un quinto aspecto de la invención se refiere a la composición del tercer aspecto de la invención para la prevención, control, tratamiento y/o alivio de una enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune, preferiblemente la enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune se selecciona de la lista que cosiste en: enfermedades desmielinizantes agudas del sistema nervioso central y enfermedades asociadas (sarampión, varicela, rubéola, enterovirus, Epstein-Barr, HTLV1 , Herpes tipo 6, Herpes simples e Influenza A y B), mielitis transversa aguda (MT), neuromielitis óptica de Devic, esclerosis múltiple, neuritis óptica, esclerosis difusa o enfermedad de Schilder, Polineuropatía Crónica Recidivante, leucodistrofia, síndrome de Hughes, o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente se refiere a la composición del tercer aspecto de la invención para la prevención, control, tratamiento y/o alivio de la esclerosis múltiple.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, para el diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar el producto de expresión de IFNAR2.3, y opcionalmente

c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (a)-(c) según el sexto aspecto de la invención, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con esclerosis múltiple cuando presentan un valor superior a 2, 14 por encima del punto de corte establecido en la curva ROC. En una realización preferida, comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos sin esclerosis múltiple cuando presentan un valor inferior a 1 , 14 por debajo del punto de corte establecido en la curva ROC.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar la evolución de un paciente que ha presentado un síntoma clínicamente aislado (CIS) a esclerosis múltiple, que comprende los pasos (a)-(c) el sexto aspecto de la invención, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuo que evolucionarán a esclerosis múltiple, cuando presentan niveles superiores y significativos con respecto a una muestra de referencia. Un noveno aspecto de la invención se refiere a la composición del tercer aspecto de la invención para la prevención, control, tratamiento y/o alivio de un individuo del paso (a) asignado al grupo de individuos con esclerosis múltiple o que evolucionan a esclerosis múltiple según el séptimo o el octavo aspecto de la invención.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para cuantificar el producto de expresión de IFNAR2.3, preferiblemente la proteína recombinante según el primer aspecto de la invención.

Un undécimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit según el décimo aspecto de la invención para llevar a cabo un método según se describe en el sexto, el sétimo o el octavo aspecto de la invención.

Un duodécimo aspecto de la invención se refiere un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según el sexto, el sétimo o el octavo aspecto de la invención.

Un último aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según el sexto, el sétimo o el octavo aspecto de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un método para ayudar al diagnóstico de la esclerosis múltiple, y han diseñado un ELISA sem ¡cuantitativo, tipo sándwich, para la determinación de IFNAR2.3 en suero. Para dar validez a este ensayo, han clonado y purificado la proteína IFNAR2.3, de forma que pueda servir como control positivo para incluir en el ensayo. Se ha realizado la optimización de cada uno de los pasos de la técnica y se ha calculado la variación intraensayo e interensayo de la misma. Una vez desarrollada y optimizada la metodología, se han determinado los valores de IFNAR2 soluble en suero de pacientes con EM y controles sanos. Además, los autores de la invención han comprobado, en un modelo animal para EM (modelo animal de encefalitis alérgica experimental, experimental allergic encephalitis o EAE) que el IFNAR2 soluble (IFNAR2.3 o SIFNAR2) es efectivo tanto en la prevención como en el tratamiento de la EM.

PROTEÍNA RECOMBINANTE DE LA INVENCIÓN

Los autores de la invención han clonado y purificado la proteína IFNAR2.3. Además, mediante el método de clonación empleado han añadido una cola de histidina- asparagina en el extremo carboxi terminal, quedando fusionado a la proteína recombinante como una etiqueta. Tras la producción de la proteína recombinante en la célula hospedadora, se hace pasar el lisado celular por una columna de afinidad para su purificación. La proteína de fusión con la etiqueta queda retenida en la columna mientras que las otras proteínas y otros contaminantes son afluidos a través de ésta.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante obtenible por un procedimiento que comprende:

a) integrar un inserto con la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 en una construcción genética o un vector de expresión,

b) transformar un hospedador con el vector de expresión del paso (a), c) inducir la expresión de la proteína recombinante,

d) extraer la proteína recombinante, y

e) purificar la proteína recombinante

El diseño del vector basado en técnicas de ingeniería genética y la elección de la célula hospedadora determinan, en gran parte, las características de la proteína recombinante.

La construcción génica de la invención puede comprender, además de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 , elementos que regulan la expresión de dicha secuencia. Dichos elementos reguladores incluyen promotores y potenciadores. Los promotores se encuentran típicamente posicionados en posición 5' con respecto al sitio de iniciación de la transcripción o traducción. Los potenciadores son capaces de influenciar la expresión de genes cuando se encuentran en posición 5Ό 3 'con respecto al ADNc o cuando se encuentran formando parte de un intrón. Secuencias reguladoras incluyen, además de promotores, secuencias que facilitan la traducción, señales de procesamiento para los intrones, codones de terminación, secuencias señales, sitios internos de unión al ribosoma (IRES) y señales de poliadenilación.

El vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 o una construcción génica de la invención, está operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicha secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 o de dicha construcción génica. El experto en la materia advertirá que el tipo de vector adecuado para la expresión de los ácidos nucleicos y construcciones génicas de la invención, dependerá del organismo en el que se desee expresar el polinucleótido de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el vector de expresión es el vector prelinearizado pEcoli-Cterm 6xHN Linear.

Una célula o un organismo hospedador puede comprender la construcción génica de la invención o un vector, tal como se ha definido en la invención. En principio, cualquier tipo de organismo hospedador conocido para el experto en la materia puede ser usado en la presente invención, tales como una cepa bacteriana (Escherichia coli, Bacillus subtilis y similares), una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha y similares), una planta transgénica (dicotiledóneas o monocotildoneas), una célula de insecto, por ejemplo, baculovirus, una célula de mamífero (células COS, CHO, C127, HeLa y similares) y un transgénico no humano (por ejemplo, un ratón, una vaca, una cabra, un conejo, un cerdo, etc.).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el hospedador del paso (b) son bacterias de expresión. Más preferiblemente las bacterias de expresión son BL21 (DE3). Las bacterias de expresión BL21 (DE2) son células de Escherichia coli químicamente competentes, que posee un genotipo adecuado para la transformación y la expresión de proteínas, y cuyo genoma se conoce (Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21 (DE3). Jeong H, et al. J Mol Biol 2009 Dec 1 1 ). Una bacteria competente, se caracteriza por tener una pared bacteriana debilitada y por tanto tiene más facilidad para captar un ADN foráneo mediante un proceso de choque térmico o eléctrico (transformación). Para la producción de la proteína se utilizan bacterias de expresión. En esta memoria, las bacterias de expresión son aquellas que poseen la maquinaria necesaria para sobrexpresar el cDNA insertado y producir la proteína recombinante.

En otra realización preferida, la integración de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1 del paso (a) se realiza mediante un proceso de ligación.

Para la realización del proceso de ligación, la mezcla de inserto: plásmido fue resuspendida en el producto In-Fusion Dry-Down pellet (Clontech). In-Fusion Dry- Down pellet es un liofilizado que contiene la enzima In-Fusion, la cual favorece la unión del inserto al plásmido gracias a la homología en la secuencia nucleotídica presente en ambos.

Por tanto, en otra realización preferida de la invención, en la ligación se emplea un liofilizado que comprende la enzima In-Fusion. Ésta es una ADN polimerasa de Poxvirus con actividad exonucleasa 3 ^' -5 ^' , que es capaz de unir moléculas de ADN de cadena simple que presentan secuencias cortas y homologas en sus extremos, tales como un producto de PCR amplificado y un vector.

En otra realización preferida, el inserto se sintetizó empleando los cebadores de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

Otro aspecto se refiere a una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, o a la proteína recombinante de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3), o la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) obtenida por otros medios no recombinantes, para su uso como medicamento; o, alternativamente, al uso de una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o a la proteína recombinante de la invención, o la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) obtenida por otros medios no recombinantes, en la elaboración de un medicamento. Aunque es preferible que la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) sea recombinante, y aún más preferiblemente que se obtenga por el método descrito en la presente invención, ya que los métodos de obtención y purificación descritos son ventajosos, se puede obtener por cualquier método conocido en el estado de la técnica para la obtención de proteínas.

Otro aspecto se refiere a una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, la proteína recombinante de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3), o la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) obtenida por otros medios no recombinantes, para su uso en la prevención, control, tratamiento y/o alivio de una enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune, o alternativamente, al uso de una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, o a la proteína (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) recombinante de la invención, o la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) obtenida por otros medios no recombinantes, en la elaboración de un medicamento para el diagnóstico, prevención, control, tratamiento y/o alivio de una enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune.

En otra realización más preferida la enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune se selecciona de la lista que consiste en: enfermedades desmielinizantes agudas del sistema nervioso central y enfermedades asociadas (sarampión, varicela, rubéola, enterovirus, Epstein-Barr, HTLV1 , Herpes tipo 6, Herpes simples e Influenza A y B), mielitis transversa aguda (MT), neuromielitis óptica de Devic, esclerosis múltiple, neuritis óptica, esclerosis difusa o enfermedad de Schilder, Polineuropatía Crónica Recidivante, leucodistrofia, síndrome de Hughes, o cualquiera de sus combinaciones. Aún mucho más preferiblemente, la enfermedad inflamatoria desmielinizante es la esclerosis múltiple.

Otro aspecto se refiere a una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, la proteína recombinante de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3), o la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) obtenida por otros medios no recombinantes, para su uso en el diagnóstico de la esclerosis múltiple, y más preferiblemente, en el diagnóstico diferencial de la esclerosis múltiple. ANTICUERPOS Y COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN, Y USOS

Tal y como se demuestra en los ejemplos de la invención, la proteína recombinante de la invención, y/o la proteína SIFNAR2, pueden emplearse para la prevención y el tratamiento de las enfermedades inflamatorias desmielinizantes autoinmunes como la esclerosis múltiple. Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de unirse a la proteína recombinante de la invención son también un objeto de la presente invención. Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden obtener fácilmente a partir de antisueros.

Los antisueros para la proteína recombinante descrita en la presente invención pueden ser generados por técnicas estándar, por ejemplo, por inyección de la proteína recombinante de la invención en un animal apropiado y recogida y purificación de los antisueros de los animales. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a la SEQ ID NO: 2, o una secuencia vanante de la misma de acuerdo con la invención pueden ser identificados por inmunoensayos estándar. Los anticuerpos así obtenidos (en lo sucesivo, anticuerpos de la invención) se pueden usar para el método de diagnóstico de la invención. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos son anticuerpos monoclonales.

Así pues, en otro aspecto la invención se relaciona con un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce específicamente la proteína recombinante de la invención, de ahora en adelante anticuerpo de la invención. Anticuerpos contemplados en el contexto de la presente invención incluyen antisueros policlonales, moléculas de IgG purificadas, sobrenadantes o líquido ascítico que contiene anticuerpos monoclonales, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab') ₂ , ScFvdiabodies, triabodies, tetrabodies y anticuerpos humanizados.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende:

a) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, b) la proteína recombinante de la invención,

c) la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) obtenida por otros medios no recombinantes, y/o c) el anticuerpo, o un fragmento del mismo, de la invención.

Dicha composición puede ser una composición farmacéutica. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas, de ahora en adelante composiciones farmacéuticas de la invención, que comprenden al menos uno de los polinucleótidos de la invención, polipéptidos de la invención o su forma madura, un anticuerpo de la invención, o un fragmento del mismo, la proteína recombinante de la invención, la proteína de la invención (IFNAR2 soluble, SIFNAR2 o IFNAR2.3) obtenida por otros medios no recombinantes, y/o acompañado de un excipiente farmacéuticamente aceptable. Para uso en medicina, los compuestos y combinaciones de compuestos de la invención pueden ser formulados conjuntamente con un excipiente que es aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Excipientes preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas, proteínas y otros. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica de administración sólida (p.ej., comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, etc.) o líquida (p.ej., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), pero sin limitarnos. En otra realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, ¡ntrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención o la comosición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento, o alternativamente, al uso de la composición de la invención o la composición farmacéutica de la invención en la elaboración de un medicamento.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades o prevención de estados fisiológicos no deseados en el hombre y los animales. Otro aspecto se refiere a la composición de la invención o a la composición farmacéutica de la invención para su uso en uso en la prevención, control, tratamiento y/o alivio de una enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune, o alternativamente, al uso de la composición de la invención o de la composición farmacéutica de la invención en la elaboración de un medicamento para la prevención, control, tratamiento y/o alivio de una enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune.

En otra realización más preferida la enfermedad inflamatoria desmielinizante autoinmune se selecciona de la lista que cosiste en: enfermedades desmielinizantes agudas del sistema nervioso central y enfermedades asociadas (sarampión, varicela, rubéola, enterovirus, Epstein-Barr, HTLV1 , Herpes tipo 6, Herpes simples e Influenza A y B), mielitis transversa aguda (MT), neuromielitis óptica de Devic, esclerosis múltiple, neuritis óptica, esclerosis difusa o enfermedad de Schilder, Polineuropatía Crónica Recidivante, leucodistrofia, síndrome de Hughes, o cualquiera de sus combinaciones. Aún mucho más preferiblemente, la enfermedad inflamatoria desmielinizante es la esclerosis múltiple.

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la invención han visto que la capacidad discriminante de la detección en suero de IFNAR2.3 por sí sola, entre pacientes con EM y controles es elevada teniendo en cuenta que estamos ante un indicador univariante, y han desarrollado una técnica de ELISA para la detección de IFNAR2 soluble en suero, que sirve como prueba paraclínica para diagnóstico de la EM. Es una técnica mucho menos invasiva para el paciente y menos costosa que las bandas oligoclonales, y podría utilizarse como un método de screening previo, de forma que solo en el caso de pacientes que obtengan valores de ELISA que puedan dar lugar a duda, sería necesario realizar las bandas oligoclonales. Para ello, tras la normalización de los datos de absorbancias y el establecimiento de un punto de corte para distinguir entre positivo y negativo, se ha obtenido una curva COR con un área bajo la curva de 0.820, y se han establecido diferentes puntos de corte que darán diferente sensibilidad y especificidad según los requerimientos que se le exija al test. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de IFNAR2.3 para el diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante primer método de la invención, para el diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar el producto de expresión de IFNAR2.3

En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende: c) comparar el producto de expresión de IFNAR2.3 obtenido en el paso (b) con una cantidad de referencia

La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión constitutiva de IFNAR2.3, en un grupo de individuos sanos o, alternativamente, que no presentan esclerosis múltiple. Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen la enfermedad que se pretende diagnosticar. Preferiblemente, el producto de expresión de IFNAR2.3 cfel paso (b) del primer método de la invención es la proteína IFNAR2.3. En otra realización más preferida, el paso (c) de la invención comprende comparar la detección de la proteína IFNAR2.3 en la muestra biológica de (a) con la detección de la proteína IFNAR2.3 en una población de referencia.

Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).

El método de la invención es un método in vitro, y la muestra sobre la que se miden los parámetros es una muestra aislada. Así, una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es suero. En otra realización preferida, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es líquido cefalorraquídeo.

El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

La detección del producto de expresión de IFNAR2.3 puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica.

La medida del producto de expresión de IFNAR2.3, aunque puede ser cualitativa, también puede determinarse la cantidad o la concentración de dicho producto de expresión, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, y puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de la detección de la proteína. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes o de los anticuerpos, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de los productos de expresión de IFNAR2.3 en una muestra problema frente a la población de referencia, o alternativamente, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de los genes o de la cantidad de anticuerpos frente a IFNAR2.3 de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de los genes o con una cantidad de anticuerpos frente a IFNAR2.3 de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (c) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

Los interferones tipo I (alpha, beta and omega), ejercen su acción a través de la interacción con el receptor de membrana IFNAR, formado por dos subunidades IFNAR1 e IFNAR2. La subunidad IFNAR2 del receptor sufre un procesamiento alternativo del ARNm que da lugar a tres formas distintas: una forma corta (IFNAR2b), una forma larga funcionalmente activa (IFNAR2c) y la forma soluble (slFNAR2, IFNAR2.3 o IFNAR2a). Solamente IFNAR2c actúa como receptor funcional junto con IFNAR1 y es capaz de mediar los efectos biológicos del IFNB, a través de la activación de la cascada de señalización JAK-STAT.

Múltiples vanantes de la transcripción que codificaban por lo menos dos isoformas diferentes se han encontrado para este gen. La secuencia aminoacídica de IFNAR2.3 se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) L41943.1 y en la SEQ ID NO: 2. Dicha SEQ ID NO2 está representada por la siguiente secuencia aminoacídica:

(MLLSQNAFIFRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNH

SIVPTHYTLLYTIMSKPEDLKWKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNT

TLFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEEELQFDLSLVIEEQS EGI

VKKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQ ES

EFS). En el contexto de la presente invención, IFNAR2.3 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas vanantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 60%, un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IFNAR2.3. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) L41943.1 y la SEQ ID NO: 1 . Dicha SEQ ID NO1 está representada por la siguiente secuencia nucleotídica:

(agatgtaaaagtcaagagaagactctaaaaatagcaaagatgcttttgagccagaa tgccttcatcttcagatcactta atttggttctcatggtgtatatcagcctcgtgtttggtatttcatatgattcgcctgatt acacagatgaatcttgcactttcaaga tatcattgcgaaatttccggtccatcttatcatgggaattaaaaaaccactccattgtac caactcactatacattgctgtata caatcatgagtaaaccagaagatttgaaggtggttaagaactgtgcaaataccacaagat cattttgtgacctcacagat gagtggagaagcacacacgaggcctatgtcaccgtcctagaaggattcagcgggaacaca acgttgttcagttgctca cacaatttctggctggccatagacatgtcttttgaaccaccagagtttgagattgttggt tttaccaaccacattaatgtgatg gtgaaatttccatctattgttgaggaagaattacagtttgatttatctctcgtcattgaa gaacagtcagagggaattgttaag aagcataaacccgaaataaaaggaaacatgagtggaaatttcacctatatcattgacaag ttaattccaaacacgaac tactgtgtatctgtttatttagagcacagtgatgagcaagcagtaataaagtctccctta aaatgcaccctccttccacctgg ccaggaatcagaattttcataactttttagcctggccatttcctaacctgccaccgttgg aagccatggatatggtggaggt catttacatcaacagaaagaagaaagtgtgggattataattatgatgatgaaagtgatag cgatactgaggcagcgcc caggacaagtggcggtggctataccatgcatggactgactgtcaggcctctgggtcaggc ctctgccacctctacagaa tcccagttgatagacccggagtccgaggaggagcctgacctgcctgaggttgatgtggag ctccccacgatgccaaag gacagccctcagcagttggaactcttgagtgggccctgtgagaggagaaagagtccactc caggacccttttcccgaa gaggactacagctccacggaggggtctgggggcagaattaccttcaatgtggacttaaac tctgtgtttttgagagttcttg atgacgaggacagtgacgacttagaagcccctctgatgctatcgtctcatctggaagaga tggttgacccagaggatcc tgataatgtgcaatcaaaccatttgctggccagcggggaagggacacagccaacctttcc cagcccctcttcagaggg cctgtggtccgaagatgctccatctgatcaaagtgacacttctgagtcagatgttgacct tggggatggttatataatgaga tgactccaaaactattgaatgaacttggacagacaagcacctacagggttctttgtctct gcatcctaacttgctgccttatc gtctgcaagtgttctccaagggaaggaggaggaaactgtggtgttcctttcttccaggtg acatcacctatgcacattccc agtatggggaccatagtatcattcagtgcattgtttacatattcaaagtggtgcactttg aaggaagcacatgtgcacctttc ctttacactaatgcacttaggatgtttctgcatcatgtctaccagggagcagggttcccc acagtttcagaggtggtccagg accctatgatatttctcttctttcgttcttttttttttttttttgagacagagtctcgtt ctgtcgcccaagctggagcgcaatggtgtg atcttggctcactgcaacatccgcctcccgggttcaggtgattctcctgcctcagcctcc ctcgcaagtagctgggattaca ggcgcctgccaccatgcctagcaaatttttgtatttttagtggagacaggattttaccat gttggccaggctggtctcgaact cctgacctcaagtgatctgccctcctcagcctcgtaaagtgctgggattacaggggtgag ccgctgtgcctggctggccc tgtgatatttctgtgaaataaattgggccagggtgggagcagggaaagaaaaggaaaata gtagcaagagctgcaaa gcaggcaggaagggaggaggagagccaggtgagcagtggagagaaggggggccctgcaca aggaaacaggg aagagccatcgaagtttcagtcggtgagccttgggcacctcacccatgtcacatcctgtc tcctgcaattggaattccacc ttgtccagccctccccagttaaagtggggaagacagactttaggatcacgtgtgtgacta atacagaaaggaaacatg gcgtcggggagagggataaaacctgaatgccatattttaagttaaaaaaaaaaaa).

En otra realización preferida, la detección de la cantidad de producto de expresión de IFNAR2.3 se realiza mediante un inmunoensayo. El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el ELISA es un ELISA sándwich. El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a IFNAR2.3. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como ³² P o ³⁵ S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto- radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico, pronóstico y de clasificación de individuos, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos (a)-(c) según el primer método de la invención, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con o sin esclerosis múltiple, en función del punto de corte establecido para el índice de muestra. Valores con el índice de muestra por encima de 2, 14 (en la curva COR) nos permite clasificar a los sujetos como pacientes con EM, mientras que valores inferiores a 1 ,24 (en la curva COR) son clasificados como individuos sanos.

En el inicio de la esclerosis múltiple existe una fase preclínica en la que hay lesiones, pero no hay manifestaciones de síntomas. La sospecha de la presencia de la enfermedad se inicia con la aparición del primer síntoma clínicamente aislado (CIS, del inglés clinically isolated syndrome).

Adicionalmente, tal y como se demuestra en el EJEMPLO 4 de la invención, SIFNAR2 puede emplearse para predecir o pronosticar la evolución de los pacientes CIS (del inglés clinically isolated syndrome) y poder determinar con antelación si el brote va a revertir o va a convertirse en esclerosis múltiple.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de s¡FNAR2 en la elaboración de un marcador para predecir o pronosticar la evolución de un paciente CIS a esclerosis múltiple.

Tal como se demuestra en el EJEMPLO 4, sIFNAR tiene la capacidad para predecir o pronosticar que pacientes tienen más probabilidad de convertir a una EM clínicamente definida (EMCD) después de un síndrome clínico aislado (CIS). Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un método, de ahora en adelante cuarto método de la invención, para predecir o pronosticar la evolución de un paciente CIS a esclerosis múltiple, que comprende los pasos (a)-(c) según el primer método de la invención, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuo que evolucionarán a EM, cuando presentan niveles superiores y significativos con respecto a una muestra de referencia. Preferiblemente, la muestra de referencia se obtiene de los pacientes que no evolucionan a EM.

KIT O DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO Y USOS

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para cuantificar el producto de expresión de IFNAR2.3.

Preferiblemente, el kit o dispositivo de la presente invención comprende al menos un anticuerpo anti-IFNAR2.3. En otra realización preferida, el kit de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. En una realización mucho más preferente el kit comprende el polipéptido de la invención, producido por tecnología recombinante, como control positivo. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. En otra realización preferida, el kit de la invención comprende:

a) un soporte sólido que lleva unido un anticuerpo primario

b) anticuerpo secundario

c) una solución del anticuerpo de detección, marcado con un marcador enzimático;

d) un reactivo.

En una realización aún más preferida, el anticuerpo de primario es un anticuerpo que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3

(MLLSQNAFIVRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNH SIVPTHYTLLYTIMSKPEDLKWKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNT TLFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEEELQFDLSLVIEEQSEGI VKKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQES ESAESAKIGGIITVFLIALVLTSTIVTLKWIGYICLRNSLPKVLRQGLTKGWNAVAIHRC S HNALQSETPELKQSSCLSFPSSWDYKRASLCPSD).

En otra realización más preferida, el anticuerpo secundario es un anticuerpo que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4

(MLLSQNAFIVRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWEL KNH SIVPTHYTLLYTIMSKPEDLKWKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNT TLFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEEELQFDLSLVIEEQSEGI VKKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQES ESAESAKIGGIITVFLIALVLTSTIVTLKWIGYICLRNSLPKVLRQGLTKGWNAVAIHRC S HNALQSETPELKQSSCLSFPSSWDYKRASLCPSD)

Otro aspecto se refiere al uso del kit de la invención, para el diagnóstico, pronóstico, y clasificación de individuos que tienen esclerosis múltiple.

Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención (del primer o del segundo método de la invención). Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

El primer y/o el segundo método de la invención pueden incluir etapas adicionales, como por ejemplo, la separación de proteínas mediante electroforesis mono y bidimensional (2D-PAGE), o la digestión previa con tripsina de una mezcla de proteínas (de la muestra) para después purificar y analizar los péptidos mediante espectrometría de masas (MS), como el MALDI-TOF, o mediante cromatografía multidimensional, mediante ICAT (Isotope-coded affinity tags), DIGE (Differential gel electrophoresis) o arrays de proteínas.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméhcas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).

Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma poliméhca de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1 : Esquema de trabajo de la clonación, producción y purificación la proteína recombinante.

Fig. 2: Estructura del vector pEcoli-Cterm 6xHN Linear. Fig. 3: Estructura de las estructuras flanqueantes al inserto.

Fig. 4: Electroforesis en gel de agarosa del amplificado obtenido por PCR.

Fig. 5: Alineamientos de las secuencias nucleotídicas en sentido 5 ^' -3 ^' . En la primera línea se muestra la secuencia nucleotídica de IFNAR2.3, en la segunda y tercera línea las secuencias nucleotídicas con los cebadores flanqueantes del inserto T7UP y

T7terminal, obtenida tras el proceso de secuenciación del plásmido.

Fig. 6: Gráficas de la puesta a punto de las concentraciones de anticuerpos para el

ELISA para determinar IFNAR2.3 en suero. (A). Absorbancias obtenidas con 1 .2pg/ml de anticuerpo primario frente a diferentes concentraciones de anticuerpo secundario

(B). Absorbancias obtenidas con 1 .pg/ml de anticuerpo primario frente a diferentes concentraciones de anticuerpo secundario. (C). Absorbancias obtenidas con 0,8 pg/ml de anticuerpo primario frente a diferentes concentraciones de anticuerpo secundario

(D). Gráfica que muestra la relación lineal entre la absorbancia y la concentración de proteína IFNAR2.3.

Fig. 7. Análisis de los valores de IFNAR2.3 en suero en pacientes tratados con INFp, sin tratamiento y controles.

Fig. 8. Análisis de los valores de IFNAR2.3 en suero en pacientes tratados con INFp, sin tratamiento, controles y pacientes tratados con Copaxone®.

Fig. 9. Curva COR (ROC) pacientes sin tratamiento y controles.

Fig. 10. (A) SDS-PAGE 12% y el Western Blot de SIFNAR2 purificada (30 kDa). M muestra el peso molecular. SDS-PAGE de SIFNAR2 purificado (columna 1 ) y Western Blot de la misma secuencia (columna 2). (B) Relación entre la concentración de slFNAR2 purificada y la densidad óptica obtenida por ELISA.

Fig. 11. Resultado del análisis de la huella peptídica por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF.

Fig. 12. Análisis estadístico no paramétrico de los niveles de SIFNAR2 de pacientes CIS que convierten a esclerosis o no. NO EM= pacientes que no convierten a Esclerosis. SI EM= pacientes que convierten a una esclerosis múltiple definida.

Fig. 13. Varias secuencias de alineación del dominio extracelular de IFNAR2 con la isoforma IFNAR2.3 y con las secuencias que reconocen los anticuerpos utilizados en

ELISA. La alineación se ha realizado con la herramienta de alineación múltiple basado en restricciones (cobalto).

Fig. 14. Niveles slFNA2R2 suero se determinaron en dos cohortes independientes de pacientes no tratados (NT) EM y controles sanos (HC) (A y B). El análisis realizado con cohortes mixtas y otras enfermedades neurologicas inflamatorias (OIND) (C) Los datos se analizaron con el uso de la prueba de Kruskal-Wallis de una vía de la varianza seguido por la prueba de la U de Mann-Whitney.

Fig. 15. Evaluación de SIFNAR2 como un marcador de diagnóstico

(A) los valores sem ¡cuantitativos de SIFNAR2 en el suero de los pacientes no tratados (NT) EM y los controles sanos (HC) de cohortes combinadas.

(B) Receptor operador de la curva característica correspondiente para el diagnóstico de la EM basado en los niveles séricos de SIFNAR2 (ROC).

Fig. 16. Evaluación de IFN gamma y TNF alfa en pacientes con EM no tratada El análisis de IFN gamma (A) y TNF alfa (B) expresión en células CD3 + de pacientes con EM no tratados con alto y bajo nivel de SIFNAR2, por citometría de flujo.

Los ejemplos representativos de la expresión de IFN gamma en un paciente con niveles bajos (C) y alta (E) de SIFNAR2. Los ejemplos representativos de la expresión de TNF-alfa en un paciente con bajos (D) y alta (F) los niveles de SIFNAR2.

Fig. 17. Tratamiento preventivo. One way ANOVA + Newman-Keuls.

Fig. 18. Tratamiento preventivo. T-Test de datos pareados.

Fig. 19. Tratamiento clínico. One way ANOVA + Newman-Keuls.

Fig. 20. Tratamiento clínico. T-Test de datos pareados.

EJEMPLOS

A continuación se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.

Materiales y métodos

Producción de la proteína recombinante IFNAR2.3

Elección del vector de clonación

El sistema de expresión procariota escogido, es el vector prelinearizado pEcoli-Cterm 6xHN Linear (Clontech). La proteína resultante tendrá fusionada una cola histidina- asparagina en el extremo carboxi terminal que servirá para su purificación. En las imágenes que se muestran a continuación se detalla la estructura del vector donde se integró el inserto con la secuencia nucleotídica de nuestra proteína de interés.

El sistema de expresión de pEcoli Cterm 6xHN Linear está basado en el sistema de expresión del promotor fuerte T7, controlado por el operón LacZ que a su vez es inducible por IPTG (Isopropil-p-D-tiogalactopiranósido). Además, el plásmido posee un gen de resistencia a la ampicilina que permite la selección de los clones que contienen el plásmido.

Para la producción de la proteína, se utilizó la maquinaría de las bacterias de expresión BL21 (DE3), que utilizan el promotor T7. Las bacterias BL21 (DE3) contienen una copia cromosomal del gen de la T7 ARN polimerasa, que a su vez está bajo el control del promotor de lacUV5 inducible por IPTG.

Síntesis del inserto de ADN

El primer punto en el diseño de la estrategia de clonación fue la síntesis del inserto. Para ello se recabó toda la información sobre la secuencia de IFNAR2.3, como la secuencia señal del péptido, las modificaciones postraduccionales, las características bioquímicas de la proteína, los dominios de la misma etc. Toda esta información se obtuvo de la base de datos UNIPROT (http://www.uniprot.org/uniprot/P48551 ), que alberga las secuencias aminoacídicas de las proteínas y sus características bioquímicas.

La secuencia del ARNm de IFNAR2.3 se obtuvo a partir de la base de datos NUCLEOTIDE del NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore.)

Siguiendo las directrices del fabricante, los cebadores debían de cumplir los siguientes requisitos:

El extremo 5 ^' :

• Contener 15 bases homologas con las 15 bases del final del fragmento de ADN del vector donde va a ser insertado.

El extremo 3 ^' : • Poseer 15 bases homologas con los extremos del gen que va a ser insertado.

• Una longitud entre 18-25 pb y un contenido de GC del 40-60%.

• Ausencia del codón de inicio (ATG) y de parada en la secuencia a amplificar.

• Ausencia de la secuencia señal.

Teniendo en cuenta estas premisas, los cebadores daban un producto tras la amplificación de 638 pb. Las secuencias de los cebadores fueron:

Sentido (secuencia SEQ ID NO. 3):

5TAAGGCCTCTGTCGACATTTCATATGATTCGCCTGATTACACGATG 3 ^' Antisentido (secuencia SEQ ID NO. 4):

5 ^' CAGAATTCGCAAGCTTTGAAAATTCTGATTCCTGGCCAGGTGGAA 3 ^'

El inserto se sintetizó mediante PCR convencional a partir de los cebadores diseñados en el punto anterior, empleando una Taq de alta fidelidad y utilizando como molde un ADNc proveniente de una mezcla de ADNc humano comercial. Las condiciones óptimas de concentraciones, temperatura y tiempos para la síntesis del inserto fueron las siguientes:

Tabla 1 : resumen de los reactivos de la PCR convencional para la síntesis del inserto.

Reactivos Volumen/ Concentración

muestra final/ muestra

Agua libre de Rnasas 40 μΙ

Cebador sentido (20 μΜ) 1 μΙ 0,4 μΜ

Cebador antisentido (20 μΜ) 1 μΙ 0,4 μΜ

Dntp (10 μΜ) 1 μΙ 0,2 μΜ

Tampón 5X 5 μΙ 1Χ

Pfu High Fidelity 1 μΙ

cDNA 1 μΙ Condiciones de temperatura:

Tabla 2: resumen de las condiciones de temperatura para la síntesis del inserto mediante PCR convencional.

Etapa Temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95°C 3 min 1

Desnaturalización 95°C 20 seg

Anillamiento 60,4 °C 20 seg 40 ciclos

Extensión 72°C 30 seg

Extensión final 72°C 10 min

Etapa final 4°C Infinito

El producto final obtenido de la PCR, fue separado en función de su tamaño mediante la técnica de electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 2% disuelta en tampón TAE, junto con el intercalante Gold View Nucleic Acid Satín (Sbs Genetech) a una dilución 1/20. El gel fue sometido a una corriente constante de 80 V y fue visionado en un transiluminador de ultavioleta, que permitió localizar la banda de interés en función del número de pares de bases. La banda localizada a la altura de 638 pb fue recortada del gel de agarosa con la ayuda de un bisturí.

La secuencia del inserto amplificada contenida en la agarosa, fue purificada con el kit comercial QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) siguiendo las indicaciones del fabricante. Al final del proceso se obtuvo un eluido, que fue cuantificado con un espectrofotómetro (Nanodrop, Thermo) antes de ser almacenado a -20°C.

Proceso de ligación

Siguiendo el esquema de trabajo, el siguiente punto en el proceso de clonación, fue el proceso de ligación, es decir, "pegar" al plásmido, la secuencia nucleotídica de IFNAR2.3, que dará lugar a la proteína recombinante.

Para determinar las concentraciones y los volúmenes del inserto y del plásmido, la casa comercial Clontech, en su web ofrece una herramienta informática (http://bioinfo.clontech.com/infusion) para calcular las cantidades óptimas del vector y del inserto, para el proceso de ligación a partir de las variables conocidas longitud del vector y del inserto.

Para la realización del proceso de ligación, la mezcla de inserto: plásmido fue resuspendida en el producto In-Fusion Dry-Down pellet (Clontech). In-Fusion Dry- Down pellet es un liofilizado que contiene la enzima In-Fusion, la cual favorece la unión del inserto al plásmido gracias a la homología en la secuencia nucleotídica presente en ambos. La reacción de ligación fue llevada a cabo en un termociclador, a 37°C durante 15 minutos seguida de 15 minutos a 50°C y posteriormente fue transferido a hielo. Finalmente, el producto de ligación fue resuspendido en 40 μΙ de tampón TE (Tris-HCI, EDTA) a pH 8.

Transformación en bacterias replicativas

Las bacterias competentes utilizadas fueron MAX Efficiency DH5a™ Competent Cells (Invitrogen) las cuales fueron transformadas con el plásmido, siguiendo el siguiente protocolo:

Como control positivo de la técnica de transformación, se añadieron 5 μΙ del plásmido pUC19 (control positivo) en una alícuota de bacterias competentes y se resuspendió suavemente esta mezcla. De forma paralela, se transformaron las bacterias con el producto de ligación. Para ello, se añadieron 2,5 μΙ a una alícuota de bacterias competentes y se mezcló suavemente. A continuación, ambas alícuotas de bacterias (control y problema) fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. Pasado este tiempo, las muestras se sometieron a un choque térmico a 42°C durante 45 segundos. Rápidamente, las muestras fueron transferidas a hielo durante 2 minutos y posteriormente se añadieron 900 μΙ de medio SOC (el cual favorece el proceso de transformación). Para que el plásmido expresara la resistencia a ampicilina, las muestras fueron incubadas a 37°C, con agitación de 225 rpm durante 1 hora. Finalmente las bacterias transformadas, fueron sembradas a diferentes volúmenes en placas de LB-Agar suplementadas con ampicilina 100 μg/ml e incubadas toda la noche a 37°C.

Purificación del ADN plasmídico y verificación del marco de lectura Trascurrida una noche en el incubador, las bacterias habían formando UFC (unidades formadoras de colonias). Para evaluar las características de cada UFC, éstas fueron aisladas de forma independiente con la ayuda de un hilo de siembra y sembradas en tubos con 4 mi de medio LB Broth suplementados con 100 pg/ml de ampicilina. Estas suspensiones fueron incubadas a 37°C durante toda la noche con una agitación de 220 rpm junto con un control negativo que fue un tubo de LB Broth sin bacterias. Posteriormente, se procedió a la purificación del plásmido contenido en las bacterias, siguiendo las indicaciones del kit de Promega (PureYield™ Plasmid Miniprep System) como se explican a continuación:

El cultivo de bacterias fue alicuotado en tubos de 1 .5 mi y centrifugado a 16000g durante 30 segundos en una microcentrifuga. Del producto obtenido, se descartó el sobrenadante y el precipitado fue resuspendido en 600 μΙ de agua, al cual se le añadió 100μΙ de tampón de lisis celular y fue mezclado por inversión. A esta mezcla se le añadieron 350μΙ de solución neutralizante y se mezcló de nuevo por inversión. A continuación, se centrifugó a 16000g durante 3 minutos. El sobrenadante obtenido fue transferido a una de las minicolumnas que proporciona el kit que retiene el ADN. Se volvió a centrifugar a 16000g durante 15 segundos. A continuación, se le añadieron 200μΙ de solución de lavado a la minicolumna y se volvió a centrifugar durante 15 segundos. Posteriormente, se añadieron 400μΙ de solución de lavado a la minicolumna y se centrifugó durante 30 segundos. Finalmente para eluir el ADN que había quedado retenido en la membrana, se transfirió la minicolumna a un tubo de microcentrifuga limpio de 1 .5 mi, se le añadieron 30μΙ de agua estéril al centro de la membrana y se incubó durante 1 minuto a temperatura ambiente. Finalmente, para obtener el ADN plasmídico purificado se centrifugó a 16000g durante 15 segundos. El ADN plasmídico fue cuantificado mediante absorbancia en el espectrofotometro (Nanodrop, Thermo) y fue almacenado a -20°C hasta el momento de su uso.

En este punto teníamos diferentes UFC aisladas y congeladas, pero se desconocía si el plásmido poseía el inserto, su secuencia completa, la orientación en el marco abierto de lectura etc, por tanto se debía comprobar que el plásmido cumplía con todos los requisitos deseados. Para ello se realizaron dos pruebas:

• PCR convencional utilizando como ADN molde el ADN plasmídico. • Secuenciación de ADN: Los plásmidos positivos en la PCR, fueron secuenciados para obtener la secuencia nucleotídica que nos permitiría evaluar la secuencia del inserto y comprobar la orientación del mismo.

La secuenciación del inserto abarcaba secuencias aguas arriba que coincidían con el promotor del T7 y aguas abajo con la secuencia T7 terminal. Las secuencias obtenidas fueron alineadas en sentido 5 ^' 3 ^' con la secuencia de referencia del NBCI de número de GeneBank: CAA61940.1 mediante el programa bioinformático Multalin. A continuación se muestra los resultados obtenidos tras el alineamiento que nos cercioraba la integridad de la secuencia y orientación en el marco de lectura correcto:

Transformación en bacterias de expresión BL21 (DE3)

Una vez verificado el clon que contenía el plásmido con las condiciones correctas, el plásmido se transformó en las bacterias de expresión BL21 (DE3) para la producción de la proteína recombinante IFNAR2.3, siguiendo el mismo protocolo descrito anteriormente para la transformación en bacterias replicativas y detección del plásmido . inducción de la expresión de la proteína recombinante IFNAR2.3

En condiciones normales, en las bacterias BL21 (DE3) transformadas con el plásmido, la proteína recombinante no se está expresando porque su expresión está reprimida por el represor Lac (Lacl) que se encuentra unido al operon Lac. Para permitir su expresión, es necesario la adicción de IPTG que actúa como inductor secuestrando al represor y permitiendo que la T7 ARN polimerasa se una al promotor T7 y realice el proceso de transcripción. Para inducir la expresión de la proteína recombinante IFNAR2.3 se siguió el siguiente protocolo:

En el día previo a la inducción de la producción de la proteína, se preparó un precultivo de la siguiente manera:

• Las bacterias BL21 (DE3) con el plásmido fueron cultivadas en 4ml de LB-Broth suplementados con ampicilina a una concentración final de 100pg/ml e incubadas toda la noche a 37°C con una agitación de 220 rpm.

• Al día siguiente, se realizó la inducción de la expresión de la proteína. Para ello, el cultivo del día anterior fue diluido 1/10 en un volumen final de 50 mi de medio LB-Broth suplementado con ampicilina e incubado a 37°C con una agitación de 220 rpm hasta alcanzar una densidad óptica (D.O.) de 0.80-1 nm. Llegado este momento se añadió el inductor IPTG a una concentración final de 0.5mM (previamente establecida) y el cultivo fue incubado durante 4 horas a 37°C con una agitación de 220 rpm. A partir de este momento comenzó el proceso de transcripción para la expresión de la proteína. Transcurridas las 4 horas de inducción (optimizada previamente) se recogió el cultivo y se centrifugó a 1600g a 4°C durante 20 minutos. El sobrenadante fue descartado y el pellet guardado a -80°C hasta su posterior uso.

Extracción de la proteína recombinante

La proteína recombinante expresada se localizaba en el interior de la bacteria. Para acceder a ella y poder purificarla se debía romper la pared bacteriana mediante procesos físicos y químicos que a continuación se detallan:

El precipitado de bacterias almacenado a -80°C fue descongelado a temperatura ambiente. Seguidamente, se le añadieron 0.5ml de tampón de lisis bacteriana por cada mililitro de cultivo inicial y se resuspendió on la ayuda de una pipeta. La suspensión resultante fue incubada durante 1 hora a temperatura ambiente en rotación. Transcurrido este tiempo la muestra fue sometida a ultrasonidos en ciclos de 5 pulsos de 30 segundos en hielo, y con una intensidad del 40%. A continuación fue ultracentrifigada a 15000 g durante 20 minutos a 4°C y con ello se separaron las membranas de las proteínas liberadas de la bacteria. Tras la ultracentrifugación se recogió el sobrenadante y se pasó a través de un filtro de 0.45 pm.

Purificación de la proteína recombinante IFNAR2.3

El producto obtenido tras la extracción contenía la proteína recombinante junto con otras proteínas bacterianas. Para purificar y aislar la proteína recombinante IFNAR2.3, se utilizó la técnica de cromatografía de afinidad, de forma que la proteína recombinante IFNAR2.3 queda retenida por la cola de histidina-asparagina que contiene. Las columnas elegidas se presentan en un volumen de 1 mi y están llenas de resina de sefarosa que llevan unidas iones de níquel. Los iones de níquel le confieren la capacidad de retener proteínas ricas en histidina y por tanto la proteína recombinante IFNAR2.3 va a quedar retenida, entre otras. La liberación de la proteína de la resina se produce por la adicción de un tampón rico en imidazol que compite con el sitio de unión al níquel. A continuación se detalla el protocolo seguido:

Antes de iniciar el proceso de purificación con la cromatografía de afinidad, la resina fue lavada y equilibrada con 10 mi de tampón de equilibrado. Seguidamente, el extracto proteico que contiene nuestra proteína de interés, fue puesto en contacto con la resina en rotación a 4°C durante 1 hora y posteriormente, la resina fue empaquetada en la columna. Para eliminar las proteínas no unidas a la resina, ésta se lavó con 10ml de tampón de equilibrado. Finalmente, las proteínas retenidas por el níquel fueron eluidas con 5 mi de tampón de elución rico en imidazol y recogidas en alícuotas de 1 mi.

Detección de la proteína recombinante: Electroforesis y Western blot

El primer paso para la detección de la proteína fue la realización de la electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente la transferencia de las proteínas a una membrana. El protocolo seguido fue:

Las muestras fueron resuspendidas en tampón de carga 5x y hervidas a 100°C durante 3 minutos en un termobloque. A continuación, éstas fueron cargadas en un gel de poliacrilamida al 12%, sumergidas en tampón de electroforesis y sometidas a una corriente constante de 130 V. Una vez finalizada la electroforesis, el gel obtenido fue sumergido en tampón de transferencia durante unos minutos.

La transferencia se realizó en un sistema semi-seco en planchas de grafito que previamente habían sido humedecidas con agua. A continuación la membrana de nitrocelulosa con tamaño de poro de 0.45 pm fue activada sumergiéndola en agua y posteriormente equilibrada en tampón de transferencia. Posteriormente, se procedió a montar el sándwich; sobre la plancha de grafito; se dispusieron 9 papeles de transferencia previamente humedecidos en tampón de transferencia, a continuación la membrana encima y sobre ésta el gel que iba a ser transferido. Para terminar con el sándwich, se volvieron a poner 9 papeles de transferencia humedecidos en tampón de transferencia. La transferencia se realizó durante 45 minutos con una intensidad de 0.8 mA/cm2. Una vez terminada la transferencia, la membrana fue separada y bloqueada con tampón de bloqueo durante 2h a temperatura ambiente y con agitación. El bloqueo es una etapa que evita la unión no específica de los anticuerpos a los sitios libres de la membrana, quedando éstos bloqueados con la caseína de la leche. Tras el bloqueo, la membrana fue puesta en contacto con el anticuerpo primario anti-IFNAR2 Human producido en conejo (Abnova) 1/5000, previamente establecida la dilución, en solución de bloqueo durante toda la noche a 4°C en rotación. Al día siguiente, la membrana fue retirada de la solución con anticuerpo y lavada con tampón de lavado. La membrana fue incubada durante una hora y media con el anticuerpo anti-lgG de conejo (Sigma-Aldrich) marcado con fosfatasa alcalina, a una dilución 1/10000 en solución de bloqueo. Se procedió a lavar como en el punto anterior. Para ver el resultado del western blot, se reveló la membrana poniéndola en contacto con una mezcla formada por 200 μΙ de NBT/BCIP + 10ml de solución de revelado a temperatura ambiente hasta la aparición un producto coloreado. Para finalizar, la reacción fue parada desechando la solución de revelado y sumergiéndola en solución de parada, rica en iones magnesio que bloquean el desarrollo de la reacción colorimétrica retirando el NBT/BCIP.

Análisis de la proteína recombinante

Tras la purificación de la proteína recombinante SIFNAR2, se procedió a su análisis. Para ello, se escindieron las la/s proteínas/bandas de un gel de acrilamida SDS/PAGE y se fragmentaron para realizar el análisis posterior de la huella peptídica por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF. Los resultados obtenidos se pueden ver en las Fig. 10 y 1 1 .

Tras la purificación de la proteína, se hicieron los ensayos de puesta a punto de la técnica de ELISA tal y como se detalla a continuación.

Técnica de ELISA para cuantificación del fragmento soluble IFNAR2.3

Podemos considerar la técnica de ELISA (enzyme linked immunosorben assay) como una de las herramientas más poderosas para la detección y cuantificación de proteínas específicas en una mezcla compleja de ellas. Originalmente descrito por Engvall y Perlmann en 1971 (Engvall & Perlmann Immunochemistry. 1971 Sep;8(9):871 -4) como una alternativa más sencilla e igualmente sensible a la metodología de detección de sustancias por RIA (Radioimmuno assay).

Se ha puesto a punto un ELISA tipo sándwich que requiere dos anticuerpos diferentes que se unen al mismo antígeno. El primer anticuerpo (unido a la placa) es el llamado anticuerpo primario, mientras que el segundo anticuerpo detecta el antígeno inmovilizado por el primero y se denomina anticuerpo de secundario) Dado que este último no está marcado, hemos recurrido a un tercer anticuerpo (especie-específico) conjugado a una enzima a la que posteriormente enfrentaremos con su sustrato que dará lugar a una reacción colorimétrica.

Se sensibiliza la placa con un anticuerpo específico que reconocerá e inmovilizará nuestro antígeno objeto de estudio (IFNAR2.3). En este estudio hemos optimizado la concentración de anticuerpo primario en combinación con la concentración de anticuerpo secundario para incrementar la relación entre señal/ruido de fondo. Para esto, hemos realizado la sensibilización de las placas con tres diferentes concentraciones de anticuerpo de primario (0.8, 1 y 1 .2 pg/ml) en tampón carbonato/bicarbonato a pH 9.6 e incubado 16 horas a 4°C. Posteriormente se procede a la retirada del anticuerpo de primario y el lavado de la placa tres veces con tampón de lavado TBS/Tween (TBS, 1 .5mM MgCI ₂ , 0.05% Tween 20)

En todos los experimentos se bloqueó la unión no específica por medio de la adición de una solución de bloqueo (TBS/Tween/1 % BSA), incubando durante 1 hora a 37 °C, tras lo cual procedemos a realizar de nuevo tres lavados con TBS-Tween.

Para optimizar la concentración de anticuerpo de detección, la placa se sensibilizó con el anticuerpo primario como acabamos de describir. Como antígeno (y control positivo de la técnica) se empleó la proteína recombinante IFNAR2.3 producida en bacterias y purificada por medio de cromatografía de afinidad. Se utilizaron distintas diluciones de la proteína recombinante IFNAR2.3 (1/20, 1/50, 1/100 y 1/200); además se incluyó un control negativo en cada placa que consistió en solución de bloqueo (TBS/Tween 20/1 % BSA). Las muestras se incubaron a 37°C durante 1 hora, tras lo cual se procedió a lavar la placa tres veces con tampón TBS/Tween. Tras este paso se añadió el anticuerpo secundario a distintas concentraciones (400, 600 y 800 ng/ml en solución de bloqueo) y se incubó de nuevo durante 1 hora a 37°C, procediendo de nuevo al lavado de la placa 3 veces con tampón TBS/Tween. Posteriormente, se recurrió a la incubación con un anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina, siguiendo las especificaciones del proveedor, que detecta específicamente la IgG de ratón y se incubó de nuevo durante 1 hora a 37°C, lavando la placa tras la incubación con TBS/Tween. Finalizado este proceso se añadió a cada pozo de la placa la solución sustrato de fosfatasa alcalina. Tras incubar la placa durante 30 min a 37°C se detuvo la reacción con 3 M NaOH. Como fruto de la reacción enzima-sustrato, los pozos en los que hay una identificación del antígeno aparecen amarillo brillante. La intensidad del color se cuantificó por la lectura de la densidad óptica de cada pocilio a 405 nm en un lector de placas.

El resultado obtenido en este tipo de experimentos permitió fijar la concentración óptima de anticuerpo de primario y secundario para mantener la mejor relación entre señal y ruido de fondo (figuras), eligiendo como mejor condición, la sensibilización de la placa con 0.8 pg/ml de anticuerpo de primario y 400 ng/ml de anticuerpo secundario.

Ensayo en pacientes

Una vez optimizada la técnica se ha determinado la presencia de IFNAR2.3 en suero en una primera cohorte de pacientes de EM y de controles sanos.

Frecuencia Porcentaje

Válidos Sin tratar 81 60,4

CONTROLES 53 39,6

Total 134 100,0

A continuación se presenta una tabla (Tabla 3) como ejemplo de las absorbancias obtenidas: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0,999 0,876 0,813 0,812 0,709 0,722 0,928 0,939 0,862 0,835 0,743 0,778

B 0,747 0,665 0,672 0,733 0,787 0,768 0,8 0,776 0,686 0,702 0,995 1 ,056

C 0,882 0,85 0,841 0,829 0,729 0,735 1 ,032 0,845 0,706 0,759 1 ,045 1 ,012

D 0,71 1 0,721 0,701 0,7 0,915 0,906 0,6 0,618 0,726 0,966 0,96 0,983

E 0,89 0,832 0,925 0,877 0,897 0,866 0,709 0,676 0,843 0,949 0,917 0,892

F 0,872 0,814 0,839 0,825 1 , 106 1 , 1 18 0,639 0,661 0,767 0,776 0,764 0,75

G 0,941 0,954 0,839 0,86 0,933 0,94 0,758 0,743 0,984 1 ,014 0,842 0,827

H 0,967 0,972 0,874 0,89 0,808 0,817 0,88 0,919 4,000 3,909 0,208 0,205

Se ha calculado la variación intraensayo de la técnica, determinando la DO la misma muestra en el mismo ensayo 12 veces y se ha obtenido un coeficiente de variación de 12,2%. Para el cálculo de la variación interensayo se determinó la DO de la misma muestra en 7 ensayos diferentes realizados en diferentes días, obteniéndose un coeficiente de variación de 17, 1 %.

Todas las muestras han sido analizadas por duplicado. En el caso que el porcentaje del coeficiente de variación entre las duplicas exceda el 25%, la determinación para esa muestra es considerada como no válida.

Análisis estadístico de los datos

Los datos obtenidos en los diferentes experimentos se normalizaron para obtener el "índice de muestra" como se describe en el apartado siguiente y sobre ellos se aplicaron test no paramétricos para muestras independientes. La expresión de IFNAR2.3 en suero muestra diferencias significativas en pacientes tratados con IFN, pacientes de EM sin tratamiento y controles sanos, tal y como se observa en la Fig. 7.

Según los datos, el tratamiento con IFNB aumenta los niveles séricos de IFNAR2.3 respecto a pacientes no tratados y controles sanos. Las diferencias encontradas entre pacientes no tratados y controles sanos, sin intervenir el tratamiento con IFNB, son probablemente debidas a la patogenia de la enfermedad. Para comprobar que las diferencias encontradas no se deben exclusivamente al tratamiento con IFNB, se han incluido pacientes tratados con Copaxone®. No se han encontrado diferencias significativas entre los pacientes tratados con Copaxone® y los pacientes sin tratamiento (presentan medianas muy similares) y se mantienen las diferencias entre los tratados con Copaxone® y los controles sanos.

Análisis de la sensibilidad y especificidad del ELISA

Para normalizar y homogeneizar los datos crudos de absorbancias obtenidos en el ELISA para la determinación de IFNAR2.3 en suero, se estableció un punto de corte a partir del control negativo obtenido en cada placa, mediante los siguientes cálculos:

Cut off: 3(DO NEG+Desv. St neg); Cut off: 3(0.089+0.0136) = 0.307

Las absorbancias de los sueros fue divido entre el cut off. A este nuevo valor resultante, se le denominó "INDICE DE LA MUESTRA" con la cual realizaríamos todos los análisis estadísticos.

SENSIBILIDAD: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo que se ha definido como positivo respecto a la condición que estudia la prueba. Probabilidad de que un sujeto enfermo obtenga en la prueba un resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la enfermedad.

En este ensayo se ha definido como positivo ser paciente.

S= VP/(VP+FN) ^* 100

ESPECIFICIDAD: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo que se ha definido como negativo. Probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que un sujeto sano obtenga un resultado negativo.

Es igual a restar a 1 la fracción de falsos positivos.

En nuestro caso se ha definido como negativo ser control.

E= VN/ (VN+FP) ^* 100 Con el índice de muestra se ha establecido de forma arbitraria diferentes puntos de corte. Se ha creado una variable nueva para cada punto de corte, clasificando las muestras como:

- verdaderos positivos (pacientes por encima del punto de corte)

- falsos positivos (control por encima del punto de corte),

- verdaderos negativos (control por debajo del punto de corte)

- falsos negativos (pacientes por debajo del punto de corte).

Análisis de pacientes tratados, no tratados y controles sanos

En este primer análisis se incluyen pacientes de EM (sin tratamiento, tratados con IFN y tratados con Copaxone®) y controles sanos (Fig. IX)

Este análisis no sirve para discriminar entre controles sanos y pacientes, porque dentro del grupo de pacientes de EM se incluyen los pacientes tratados con IFN y previamente se ha visto que el tratamiento con IFN incrementa los niveles de IFNAR2.3, por lo que es necesario excluir a los pacientes tratados con IFNB del análisis.

Análisis de pacientes sin tratamiento - Controles sanos

Para establecer si el test permite discriminar entre pacientes de EM y controles sanos, se han excluido del análisis los pacientes con tratamiento. (Fig. 10)

A continuación, se muestran las sensibilidades y especificidades para distintos puntos de corte, según las siguientes fórmulas

Sensibilidad= VP/(VP+FN) ^* 100

Especificidad= VN/ (VN+FP) ^* 100 Tabla 4. positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1 .45

Frecuencia Porcentaje

Válidos verdadero

30 22,4

negativo

verdadero

74 55,2

positivo

falso negativo 8 6,0 falso positivo 22 16,4

Total 134 100,0

Sensibilidad= 90%

Especificidad= 57%

Tabla 5. positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1.50

Frecuencia Porcentaje

Válidos verdadero

36 26,9

negativo

verdadero

67 50,0

positivo

falso negativo 14 10,4 falso positivo 17 12,7

Total 134 100,0

Sensibilidad = 82.7%

Especificidad = 67.9%

positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1.55

Frecuencia Porcentaje

Válidos verdadero

36 26,9

negativo

verdadero

65 48,5

positivo falso negativo 17 12,7

falso positivo 16 1 1 ,9

Total 134 100,0

Sens¡bil¡dad= 79.2%

Especificidad = 69.0% positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1.70

Frecuencia Porcentaje

Válidos verdadero

39 29, 1 negativo

verdadero

49 36,6 positivo

falso negativo 33 24,6 falso positivo 13 9,7

Total 134 100,0

Sensibilidad= 59.7%

Especificidad = 75%

Resumen de los resultados

Teniendo en cuenta los grupos de los pacientes sin tratamiento y los controles sanos.

Tabla 6 resumen de frecuencias

TABLA 7 RESUMEN Sensibilidad y especificidad de la variable índice de la muestra (ELISA) con distintos puntos de corte establecidos (pacientes sin tratamiento y controles sanos)

Punto de corte Sensibilidad Especificidad

(Test positivo) (tasa de (tasa de aciertos

aciertos con con los controles)

los

enfermos)

>1.24 100% 25% Se clasifican bien los pacientes

>1.45 90.0% 57.0%

>1.50 82.7% 68.0%

>1.55 79.2% 69.0%

>1.70 59.7% 75.0%

<2.14 24% 100% Se clasifican bien los controles TABLA 8 RESUMEN: Valores predictivos positivo y negativo de la variable índice de la muestra (ELISA) con distintos puntos de corte establecidos

Valor predictivo positivo: VP/VP+FP

Valor predictivo negativo: VN/FN+VN

^* Valores sujetos a la prevalencia obtenida en consulta.

Estaríamos ante un indicador (univariante) que sin otro tipo de información multivariante presenta buena capacidad discriminante entre pacientes de EM y controles sanos.

Hasta aquí, quedan reflejados los resultados obtenidos en la primera cohorte de pacientes analizada.

Ejemplo 2: Validación de SIFNAR2 como marcador diagnóstico de EM

Tras los resultados obtenidos en la primera cohorte de pacientes, donde se evaluaron los niveles séricos de SIFNAR2 en 305 pacientes con esclerosis múltiple (EM) (224 tratados con IFNB y 81 no tratada) y 53 controles sanos, se incluyó una segunda cohorte para comprobar si se replicaban los datos. Esta segunda cohorte comprendió 208 pacientes con esclerosis múltiple (136 tratados y 72 no tratados) y 64 controles sanos. SIFNAR2 recombinante se clonó y se expresó en células BL21 (DE3) de bacterias y se purificó con columnas de afinidad. Esta proteína se utilizó para optimizar un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas semicuantitativo no comercial para detectar SIFNAR2 y se incluyó como un control positivo en cada serie. La absorbancia se normalizó y los datos se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney y la curva ROC {receiver operating characteristics).

NIA TERIAL Y MÉTODOS

Sujetos del estudio

La cohorte inicial incluyó 305 pacientes, reclutados del Hospital Universitario Regional Carlos Haya (Málaga, España), con la EM definida según el criterio revisado de McDonald (McDonald et al., 2001 . Ann Neurol 50:121 -7; Polman et al., 2005. Ann Neurol 58:840-6; Polman et al., 201 1 . Ann Neurol 69:292-302). Ochenta y un pacientes fueron tratados previamente y nunca habían recibido IFNB, acetato de glatiramer (GA) o mitoxantrona, o corticosteroides en los tres meses anteriores a la toma de muestras de sangre. En total, 224 pacientes habían recibido tratamiento con IFNB 1 a o 1 b durante al menos un año, y 47 pacientes habían sido tratados con GA. Como controles, se seleccionaron 53 individuos sanos.

Para validar los anteriores resultados se incluyó a una segunda cohorte de 136 pacientes con EM tratados con 72 pacientes con EM no tratados y 64 controles sanos.

El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Ética (CEI Málaga Nordeste) y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.

Recogida de muestras

Para los pacientes no tratados, se recogieron 5 mi de sangre periférica antes de iniciar el tratamiento con IFNB. Para los pacientes tratados, se obtuvieron muestras después de más de un año de tratamiento con IFNB o GA. En todos los casos, los controles incluidos, se obtuvo el suero por centrifugación a 1800xg durante 5 min y se almacenaron a -20 ⁰ C hasta su análisis.

Clonación y expresión de IFNAR2 soluble recombinante

El sistema de expresión procariota elegido fue pEcoli - Cterm 6xHN lineal (Clontech ^® ). El inserto se sintetizó por reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores específicos. La banda específica se purificó con el "QIAquick Gel Extraction" kit (QIAGEN®) y se ligó con el "In- Fusión Dry -Down pellet " kit ( Clontech ^® ) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células competentes DH5a™ ( Invitrogen ^® )) se transformaron , se siembran en placas de agar LB suplementado con ampicilina (100 mg/ml) y se incubaron durante la noche a 37 °C. La unidades formadoras de colonias se aislaron, se sembraron en caldo lisogénico suplementado con ampicilina y se incubó durante la noche con agitación. Después de la purificación del plásmido (PureYield™ ( Promega ^® )) y una vez que la secuencia de nucleótidos y el marco de lectura correcto se había verificado, bacterias BL21 (DE3) ( Invitrogen ^® ) se transformaron para producir la proteína recombinante SIFNAR2 . Una vez que el cultivo alcanzó una densidad óptica (DO) de 0,8 (λ = 600 nm) , expresión de la proteína se indujo mediante la adición de 0,5 mM de isopropil β-D-l - tiogalactopiranósido con la posterior incubación durante 4 horas a 37 °C con agitación. Las bacterias se recogieron y se resuspendieron en tampón de lisis que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche ^® ), se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitación constante y se sonicaron. La suspensión se centrifugó a 20.000 χ g durante 20 min a 4 ⁰ C y el sobrenadante se filtró.

La SIFNAR2 recombinante se purificó en columnas de resina N¡ ⁺² - de ácido iminodiacético de alta capacidad y detectado por Western Blot utilizando el anticuerpo anti-IFNAR2 humano MaxPab (Abnova ®) (Tabla S1 ). La SIFNAR2 recombinante también fue identificada por ionización MALDI (desorción/ionización mediante láser asistida por Matriz), acoplada a un analizador TOF (tiempo de vuelo) (MALDI-TOF).

SOLUCIONE s CO M POSI Cl( N

Tampón de l¡ sis 50 m M Tr¡5 5, 5 00 mM NaCI, 10% glicerol, 1 % NP-40, pH 7 Tampón equilibrador 50 mM fosfato de sodio, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol; pH

7.4

50 mM fosfato de sodio, 300 mM NaCI, 40 mM imidazol; pH

Tampón de lavado 7.4

Tampón de elución 50 mM fosfato de sodio, 300 mM NaCI,, 300 mM imidazol;

pH 7.4

Tabla 10. Soluciones uti izadas para la clonación, expresión y purificación de IFNAR2 soluble (slFNAR2) recombinante.

Determinación de IFNAR2 soluble en suero por ELISA

El slFNAR2 sérico fue detectado por un ELISA sandwich semi-cuantitativo no comercial (Tabla S2). Las placas se recubrieron con anticuerpo policlonal humano anti- IFNAR2 MaxPab producido en conejo (Abnova ^® ), a una concentración final de 800 ng/pocillo y se incubaron a 4 °C durante la noche . Después de lavar la placa, se añadieron 200 I de tampón de bloqueo por pocilio y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 50 I de las muestras de suero por duplicado. Después de una hora, se añadió un anticuerpo secundario policlonal humano anti- IFNAR2 MaxPab producido en ratón (Abnova ^® ) (400 ng/pocillo) y se incubó durante 1 hora. Más detalles acerca de la especificidad de los anticuerpos utilizados se incluyen a continuación y en la Fig.13.

Especificidad de los anticuerpos utilizados SIFNAR2 ELISA Información acerca de las isoformas de IFNAR2 se encuentra en: http://www.uniprot.org/uniprot/P48551 ANTI IFNAR2 HUMAN MAXPAB H00003455-D01 P (ABNOVA)

Rabbit polyclonal antibody raised against a full-length human IFNAR2 protein.

IMMUNOGEN: IFNAR2 (AAH02793.1 , 1 a.a. ~ 331 a.a) full-length human protein. SEQUENCE:

MLLSQNAFIVRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELK NHSIVPTHYTLLYTIMSKPEDLKWKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGF SGNTTLFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEEELQFDLSLVI EEQSEGIVKKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKC TLLPPGQESESAESAKIGGIITVFLIALVLTSTIVTLKWIGYICLRNSLPKVLRQGLTK GWNAVAIHRCSHNALQSETPELKQSSCLSFPSSWDYKRASLCPSD ANTI IFNAR2 HUMAN MAXPAB H00003455-B01 P (ABNOVA)

Mouse polyclonal antibody raised against a full-length human IFNAR2 protein.

IMMUNOGEN: IFNAR2 (AAH02793.1 , 1 a.a. ~ 331 a.a) full-length human protein. SEQUENCE:

MLLSQNAFIVRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNHS

IVPTHYTLLYTIMSKPEDLKWKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNTT

LFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEEELQFDLSLVIEEQSE GIV

KKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQE SE

SAESAKIGGIITVFLIALVLTSTIVTLKWIGYICLRNSLPKVLRQGLTKGWNAVAIH RCSH

NALQSETPELKQSSCLSFPSSWDYKRASLC

Después de lavar la placa de nuevo, se añadió un anticuerpo anti-lgG de conejo fosfatasa alcalina producido en cabra (Sigma - Aldrich ^® ) diluido 1/1000 y se incubó durante una hora. Para desarrollar la reacción de color, se añadió solución de fosfato de p - nitrofenilo (1 mg/ml) y se incubó durante 30 minutos. Después, el OD se midió a 405 nm. El valor fue llevado a ser directamente proporcional a la cantidad de slFNAR2 presente en el suero.

abla 1 1 . Soluciones utilizadas en SIFNAR2 ELISA Se incluyeron en cada placa un control positivo sin diluir con SIFNAR2 recombinante purificada obtenida como se ha descrito anteriormente y un control negativo que contenía sólo tampón de bloqueo.

El punto de corte se estableció de acuerdo con la siguiente ecuación:

3 (Media O.D. _ne gat¡vo + desviación estándar (SD) Media).

La absorbancia de las muestras de suero se normalizaron como sigue:

O. D. muestra / 3 (Media O. D. negativo + SD) y el resultado fue designado como el índice SIFNAR2.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como mediana y rango intercuartil. Como se estableció una distribución no normal en la prueba de Kolmogorov-Smirnov, se utilizaron métodos no paramétricos para las comparaciones estadísticas.

Se calcularon las diferencias estadísticas entre los grupos independientes usando el test de Kruskal Wallis (más de dos variables independientes) con la prueba U de Mann-Whitney (dos variables independientes). La significación estadística se estableció en p < 0.05.

Se utilizó el análisis de la curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para evaluar la capacidad diagnóstica de SIFNAR2 para identificar a los pacientes con EM. Los valores de sensibilidad, especificidad y de corte se calcularon usando el área bajo la curva (AUC) de acuerdo con las fórmulas estándar.

RESULTADOS

Características del paciente

Las características demográficas y clínicas se resumen en la Tabla 12. Cohorte original Cohorte de

no tratada validación no tratada p-value

81 72

mujer/hombre 53/28 42/30 0,41

Media de edad al inicio de 26 (5.91 ) 29 (10.75) 0.89 los síntomas (años)

Duración de la enfermedad 10.13 (6.61 ) 9.67 (8.65) 0.32 (años)

Forma clínica RR/SP 47/34 62/10 0.914

Puntuación de EDSS al inicio 2(2.0) 1 .75 (1 .69) 0.123

a. Los datos se expresan como media (desviación estándar) p-valores se obtuvieron las siguientes comparaciones entre los medios de prueba de chi-cuadrado (sexo y presentación clínica) y RR: Relapsing-Remitting; SP: Secondary Progressive; EDSS: Expanded Disability Status Scale

ELISA sandwich para la detección de SIFNAR2 en suero

Las concentraciones de anticuerpos usados en el ELISA fueron optimizados para obtener la mejor relación señal/ruido. La especificidad del ELISA se confirmó mediante la obtención de resultados positivos en los pocilios que contienen los slFNAR2 recombinante y resultados negativos a partir de muestras sin ella. La absorbancia disminuyó linealmente con diluciones mayores de SIFNAR2 (Figura 1 1 ).

Se evaluó la variabilidad intra e ¡nter-ensayo, obteniendo un coeficiente de variación de 5,3% y 14,8%, respectivamente.

Evaluación de los niveles séricos de SÍFNAR2 en pacientes con EM y controles sanos. La comparación de los pacientes con EM y controles sanos en la primera cohorte mostró un aumento significativo en los niveles séricos de SIFNAR2 en los pacientes en comparación con los controles sanos (P < 0,001 ) (Fig. 2). Los valores de SIFNAR2 obtenidos para los diferentes grupos de estudio se resumen en la Tabla 13.

Tabla 13. La mediana y el rango intercuartil de SIFNAR2 determinado por ELISA. IFNB: interferón beta; GA: Acetato de glatiramero

Pacientes con EM fueron divididos en dos grupos, IFNB tratados y IFNB - no tratado, para evaluar el efecto del tratamiento con IFN en los niveles séricos de SIFNAR2 . IFNB pacientes tratados muestran un aumento significativo en los niveles séricos de slFNAR2 en comparación con los pacientes no tratados (P < 0,001 ) y con los controles sanos (P < 0,001 ). Para confirmar que el aumento de SIFNAR2 observado en los pacientes tratados fue debido a la acción de IFNB , hemos incluido un grupo de pacientes tratados con GA . Estos pacientes muestran menores niveles séricos de slFNAR2 significativas en comparación con los pacientes tratados con IFNB (P < 0,001 ) y los niveles séricos mayores en comparación con los controles sanos (P < 0,001 ) . Sin embargo, no se observaron diferencias entre los pacientes no tratados y los pacientes GA - tratados (Fig. 15A ) .

Curiosamente, los pacientes no tratados tenían valores significativos más altos de slFNAR2 que los controles sanos (P <0,001 ). Esto sugiere que este receptor soluble podría ser un biomarcador de diagnóstico potencial para la EM. Para corroborar estos resultados, SIFNAR2 se determinó en suero en una segunda cohorte independiente. Se reproducen las diferencias en los niveles séricos de SIFNAR2 entre pacientes no tratados y controles sanos en este segundo estudio (P <0.001 ) (Fig. 15B). Sin embargo, las diferencias entre los pacientes tratados y no tratados que se observan en la primera cohorte no alcanzaron significación en la segunda cohorte estudiada, probablemente debido a la dispersión de los datos en este subestudio. En el análisis combinado de ambas cohortes, los pacientes tratados habían aumentado los niveles de SIFNAR2 en comparación con los pacientes no tratados (P <0,001 ) y los controles sanos (P <0,001 ). Como era de esperar, los resultados combinados mostraron los niveles más altos de SIFNAR2 en pacientes no tratados en comparación con los controles sanos (P <0,001 ) (Fig. 15A).

Evaluación de IFNAR2 soluble como un biomarcador de diagnóstico para MS

Las diferencias observadas entre pacientes no tratados y controles sanos en la primera cohorte, replicados en la segunda cohorte independiente, sugirieron que los niveles séricos de SIFNAR2 son un biomarcador de diagnóstico para la EM. Para evaluarlo se llevó a cabo, el análisis de la curva ROC de las cohortes combinadas para evaluar la precisión y la capacidad de discriminación de la prueba de diagnóstico. El AUC obtenido fue de 0,79 (95% límites de confianza de área = 0,74 hasta 0,85, p <0.001 ) (Fig15B)

El rango de especificidad y sensibilidad obtenida en esta prueba dependerá de la línea de corte establecida por el observador. El valor de corte óptimo para discriminar entre los pacientes con EM y controles sanos fue de 1 ,4, lo que resultó en una sensibilidad (tasa de verdaderos positivos) de 80.55% y una especificidad (tasa de falsos positivos) del 70,52% .En este estudio, la sensibilidad se define como el porcentaje de pacientes con EM identificó correctamente. Este punto de corte óptimo prioriza la sensibilidad sobre la especificidad ya que la utilidad clínica de la determinación es SIFNAR2 como método de cribado para identificar a los pacientes con EM.

Aunque la determinación de SIFNAR2 en el suero, como muestran los ejemplos de la invención, ya tiene un alto poder discriminatorio para un indicador univariante, otro marcador adicional podría mejorar la capacidad de discriminación de SIFNAR2 y la especificidad de diagnóstico de la EM, como se ha descrito con otros biomarcadores. Por ejemplo, SIFNAR2 suero y la proteína C-reactiva podría mejorar el diagnóstico de los pacientes con cáncer gastrointestinal y hepatobiliar-pancreático cáncer. Otro ejemplo es el aumento de dos veces en la detección de la anemia por deficiencia de hierro cuando se utilizaron tres parámetros en combinación (ferritina, RsTf , y el índice de RsTf) en lugar de ferritina solo.

Los niveles de SIFNAR2 podrían añadirse al panel de otros potenciales biomarcadores de diagnóstico de laboratorio descrito en EM como CSF OCB IgG y / o KFLC (Kappa gratuito Cadenas Ligeras Libres) LCR, reacción MRZ (sarampión- rubéola-Zoster Endothecal Reaction) o los niveles en suero de vitamina D.31 Estos biomarcadores tienen valores de sensibilidad y especificidad cercanos a los valores obtenidos con SIFNAR2 y con la ventaja de que su determinación se hace en el suero.

EJEMPLO 3. La isoforma soluble de la subunidad IFNAR2 (slFNAR2) puede modular la actividad de ΙΡΝβ y por lo tanto la respuesta inmune asociada.

Se han seleccionado cinco pacientes con niveles altos de SIFNAR2 y cinco pacientes con niveles bajos de SIFNAR2 y se ha analizado, partiendo de células mononucleares de sangre periférica, los perfiles de citoquinas proinflamatorias.

Los pacientes con altos niveles de SIFNAR2, mostraron bajos niveles de TNF alpha e IFN ganma, mientras que en los pacientes con bajos niveles de SIFNAR2, se encontraron niveles mas elevados de TNF alpha e IFN ganma (Fig. 16)

El incremento de SIFNAR2 podría deberse a un intento de neutralizar la respuesta proinflamatoria anormal que ocurre en la enfermedad.

EJEMPLO 4. Evaluación de SIFNAR2 en pacientes CIS En el inicio de la esclerosis múltiple existe una fase preclínica en la que hay lesiones, pero no hay manifestaciones de síntomas. La sospecha de la presencia de la enfermedad se inicia con la aparición del primer síntoma clínicamente aislado (CIS, del inglés clinically isolated syndrome). Estos síntomas indican una sospecha, pero no una confirmación de padecer esclerosis múltiple. La confirmación de la enfermedad o, como se denomina en clínica, el cambio a una esclerosis múltiple clínicamente definida (CDMS del inglés múltiple sclerosis clinically defined), se produce cuando el paciente presenta otro síntoma clínico en el que se confirme una diseminación espacial de las lesiones (presencia de síntomas y signos que indiquen la existencia de dos lesiones independientes en el SNC) y una dispersión temporal (dos o más episodios de disfunción neurológica).

Desde la aparición de un CIS hasta que se diagnostica la enfermedad (CDMS) transcurre un tiempo. Descartar la enfermedad o diagnosticarla desde la manifestación de algún síntoma es de suma importancia para el paciente y el clínico. Por ello, se valoraron los niveles de SIFNAR2 en suero de pacientes con CIS.

A partir del ELISA desarrollado, se incluyeron en el estudio 43 pacientes que tenía un CIS de los cuales, 27 convertían a esclerosis múltiple.

En la Fig. 12 y la Tabla 9 se observa que los pacientes que tienen un CIS y van a evolucionar a EM tienes niveles superiores y significativos con respecto a los que no evolucionarán a EM (p= 0.047) con sus respectivas medianas y rangos intercuartílicos.

Tabla 9. Mediana y rango intercuartílico de los valores en suero de SIFNAR2 en pacientes que con CIS que convierten a EM o no

No EM Si EM

N 16 27

Mediana 0.82 0.92

P25-P75 0.79-0.89 0.85-1.08 EJEMPLO 5. Eficacia terapéutica de IFNAR2 soluble (slFNAR2)

Para medir la eficacia terapéutica de SIFNAR2 en la EM, se emplearon como modelo animal ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) crónica progresiva (CP). Se dividieron los modelos animales, con un tamaño de n=5, en cuatro grupos:

El tratamiento consistió en la administración crónica, por vía intraperitoneal, de cada uno de los compuestos, desde el día 8 después de la inmunización (8dp¡) (antes de la aparición de la sintomatología) y cada 3 días hasta el fin de la experimentación.

La administración combinada del IFN beta + IFNAR sol (slFNAR2) en un mismo animal, se ha realizado administrando primero el IFNb y, 15-20 min después, el slFNAR2, ambos también por vía intraperitoneal.

Los datos se muestran como la media ± el Error estándar de la media de los valores obtenidos de 5 animales en cada grupo experimental. a) Tratamiento preventivo

Los resultados se muestran en la Fig. 17 y 18 y en las Tablas 15 y 16

Tabla 15. Resultados del Test Newman-Keuls de comparación múltiple. Tratamiento preventivo.

T-Test

Tabla 16. "End- Point" tratamiento preventivo.

Resultados

- Todas las terapias administradas de forma preventiva, incluido el suero salino (vehículo), modifican el curso normal de la EAE crónica progresiva. El brote es más moderado y escalonado en el tiempo, y la cronificación de la enfermedad no es tan evidente hasta día 31 -32 DPI.

- El IFNb administrado antes del inicio de la sintomatología, parece agravar la enfermedad, desarrollando una EAE más severa que en los animales tratados con salino (El score máximo y el acumulativo que sufren los animales, es mayor que en los tratados con el resto de compuestos)

- El slFNAR2 retrasa la aparición de la sintomatología y, tanto el score máximo como el acumulativo, es considerablemente menor que los tratados con salino. Esto indica que la EAE (brote) es más moderada en los animales tratados con IFNAR sol. Sin embargo, con el tiempo (cronificación), el score clínico de los animales es similar al de los tratados con salino.

- Administración combinada: El SIFNAR2 y el IFNb se antagonizan, en alguna medida, sus efectos. Los animales con esta terapia, desarrollan una CP-EAE más moderada que los animales tratados con salino y con IFNb solo. Tanto el score máximo como el acumulativo de los animales con esta doble terapia es menor. Con el tiempo (cronificación), el score clínico es similar al de los tratados con salino y con SIFNAR2 como terapia única.

Conclusiones del tratamiento preventivo:

1 . Los compuestos administrados de forma preventiva, alteran el curso clínico del modelo de EAE crónica progresiva.

2. El IFNb no ejerce un efecto terapéutico beneficioso en los animales con CP-EAE inducida, sino que interviene agravando la enfermedad.

3. El slFNAR2 modula el desarrollo de la CP-EAE inducida: modera su gravedad y retrasa tanto el inicio de la enfermedad como la cronificación de la sintomatología clínica. Sin embargo, el efecto terapéutico parece limitado en el tiempo, ya que en la cronificación de la enfermedad el déficit neurológico de los animales se ¡guala al de los tratados con salino.

4. Administración combinada: el IFNb y el SIFNAR2 interaccionan (de algún modo) ejerciendo sus efectos. Los resultados tienen dos lecturas:

A. El slFNAR2 antagoniza el efecto del IFNb, moderando la gravedad de la EAE, e igualando, en la cronificación de la enfermedad, el déficit neurológico a los valores alcanzados por los animales tratados con salino

B. El IFNb antagoniza el efecto del SIFNAR2, disminuyendo su efecto terapéutico, antes de la cronificacióin de la enfermedad. b) Tratamiento clínico El tratamiento ha consistido en la administración crónica, por vía intraperitoneal, de cada uno de los compuestos desde la manifestación clínica de la enfermedad (14 DPI) y cada 3 días hasta el fin de la experimentación.

Grupos experimentales:

La administración del IFN beta + SIFNAR2 en un mismo animal, se ha realizado administrando pnmero el IFNb y, 15-20 min después, el SIFNAR2, ambos también por vía intraperitoneal.

Los datos se muestran como la media ± el Error estándar de la media de los valores obtenidos de 5 animales en cada grupo experimental. FIG, 19 y 20 y Tablas X y X

Tabla 17. Resultados del Test Newman-Keuls de comparación múltiple. Tratamiento clínico.

Tabla 18. "End- Point" tratamiento clínico.

Resultados

Los resultados indican que:

- la EAE crónica progresiva se desarrolla con un curso clínico normal, tal y como está descrito. La cronificación de la enfermedad es evidente a partir de los días 17-19 DPI, en todos los grupos experimentales.

- Desde la primera dosis (a día 14 dpi), tanto el IFNb como el SIFNAR2, no solo administrados como "terapia única" sino también cuando se administran como "terapia combinada", disminuyen la gravedad de la EAE, mostrando estos animales scores máximos y acumulativos mucho menores que los tratados con suero salino.

- El grupo de animales tratados con SIFNAR2 sólo, experimentan un leve aumento del score clínico al final de la experimentación, acercándose a los valores alcanzados por los animales tratados con salino.

Administración combinada:

- El IFNb parece "antagonizar", en alguna medida, este leve aumento de la gravedad de la EAE que sufren los animales tratados con SIFNAR2 al final de la experimentación. - El slFNAR2 NO potencia ni antagoniza el efecto beneficioso del IFNbeta sobre el curso clínico de la EAE (no hay sinergia ni bloqueo de efectos entre ellos al administrarse de forma conjunta; la curva de IFNb+slFNAR2 es prácticamente paralela a la del IFNb solo).

Conclusiones:

1 . El IFNb ejerce un efecto beneficioso en los animales con CP-EAE inducida disminuyendo la gravedad y el déficit neurológico de los animales a lo largo del curso de la enfermedad.

2. El slFNAR2 ejerce un efecto terapéutico similar al del IFNb. Disminuye la gravedad y el déficit neurológico de los animales a lo largo del curso de la enfermedad. De nuevo, el efecto terapéutico parece limitado en el tiempo, ya que en la etapa final de la cronificación, el déficit neurológico de los animales tiende a igualarse al de los tratados con salino.

3. Administración combinada: el IFNb y el IFNAR soluble interaccionan (de algún modo) ejerciendo sus efectos:

A) Es el IFNb el que "potencia" el efecto beneficioso del IFNAR soluble en la etapa tardía de la cronificación de la enfermedad, evitando el leve aumento del déficit neurológico que sufren los animales tratados solo con IFNAR soluble.

B) Sin embargo, el IFNAR sol. NO potencia ni antagoniza el efecto beneficioso del IFNb sobre el curso clínico de la EAE (no hay sinergia de efectos al administrarse de forma conjunta).

CONCLUSIONES FINALES

1 . El IFNAR soluble interviene modulando la EAE crónica progresiva, ejerciendo un efecto beneficioso sobre el curso clínico y el déficit neurológico que sufren los animales con la EAE inducida. 2. El slFNAR2 ejerce un efecto terapéutico mayor al del IFNb al ser administrado de forma preventiva. Al ser administrados de forma conjunta, ambos fármacos interaccionan antagonizando sus efectos.

3. El slFNAR2 ejerce un efecto terapéutico similar al del IFNb al ser administrado de forma clínica. El mecanismo de acción de este efecto beneficioso parece estar relacionado más con su modulación del IFNb endógeno que con su interacción con el IFNb exógeno ya que, al ser administrado de forma conjunta, no se modifica el efecto de ninguno.