CONTRA A BRUCELOSE

A presente invenção pertence aos campos da imunologia e da biologia molecular/ microbiologia, em particular bacteriologia. Mais especificamente, esta invenção descreve o desenvolvimento de uma cepa recombinante da Brucella spp e seu uso como vacina para o controle da doença Brucelose em mamíferos.

A brucelose é uma zoonose causada por bactérias do género Brucella, que infectam o homem e animais domésticos (NICOLETTI, P.L. Relationship between animal and human disease. In: Brucellosis: clinicai and laboratory aspects. Young, E.J. and Corbel, MJ. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, p.41- 51 , 1989). A brucelose é considerada pela OMS como a mais generalizada de todas as zoonoses. Esta enfermidade traz duas preocupações: sanitária, devido à sua possibilidade de transmissão ao homem; e económica, devido à diminuição na produtividade animal, a invalidação dos produtos e derivados em consequência desta doença, restrições comerciais, descarte de animais, aumento na taxa de reposição de animais, morte de bezerros e aumento no intervalo entre os partos (FRENEY, J; RENAUD, F; HANSEN, W & BOLLET, C. Precis de bacteriologie Clinique. Paris: ESKA, p 1413-1423, 2000). De uma maneira geral, a brucelose causa perdas de 25% da produção de leite e carne e de 15% na produção de bezerros (BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Situação epidemiológica da brucelose bovina e bubalina no Brasil - Primeiro relatório parcial. 2006. 83p). O controle da brucelose humana baseia-se na vacinação, diagnóstico e eliminação dos animais infectados, além de medidas de higiene alimentar. Todas as tentativas de vacinação humana ainda se demonstraram ineficazes e perigosas, havendo a necessidade de se desenvolver uma vacina humana realmente eficaz no controle desta enfermidade (Freney et ai, 2000).

Atualmente, a vacinação contra a brucelose é feita através da administração das cepas lisas atenuadas S19 da B. abortus e Rev 1 da B. melitensis. Há também a cepa rugosa RB51 que recentemente foi introduzida em países como EUA, Chile e Canadá (WHO, 1998) para a prevenção contra a infecção pela B. abortus. A vacinação em massa de todas as fêmeas resulta em uma redução das perdas económicas, além de diminuir drasticamente o número de casos de brucelose humana (Roth F, Zinsstag J, Orkhon D, Chimed-Ochir G, Hutton G, Cosivi O, Carrin G, Otte J. Buli World Health Organ. Human health benefits from livestock vaccination for brucellosis: case study. 2003;81 (12):867-76. Epub 2004 Mar 1. Erratum in: Buli World Health Organ. 2004 Jan;82(1):76).

A cepa vacinai S19, foi desenvolvida na década de 20 para imunização bovina, é atenuada e possui uma deleção natural no gene EryC que é necessário para o metabolismo de eritritol. Esta cepa induz uma proteção em torno de 60% contra a infecção e protege cerca de 70% dos animais por 4 a 5 gestações, contra o aborto. Tanto a cepa S19 da B. abortus quanto a cepa Rev 1 da B. melitensis são efetivas na proteção contra os seus respectivos patógenos, mas estas cepas vacinais apresentam três grandes desvantagens: elas são patogênicas ao homem, podem causar aborto quando administradas em fêmeas gestantes e induzem a produção de anticorpos em animais imunizados, o que interfere no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas (CHEVILLE ,N.F.; JENSEN, A.E.; HALLING, S.M.; TATUM, F.M.; MORFITT, D.C.; HENNAGER, S.G.; FRERICHS, W.M. & SCHURIG, G. Bacterial survival, lymph node changes, and immunologic responses of cattle vaccinated with standard and mutant strains of Brucella abortus. American Journal of Veterinary Research, v. 53(10), p.1881-88, 1992; CHEVILLE, N.F.; STEVENS, M.G.; JENSEN, A.E.; TATUM, F.M. & HALLING, S.M. Immune responses and protection against infection and abortion in cattle experimentally vaccinated with mutant strains of Brucella abortus. American Journal of Veterinary Research, v. 54(10), p. 1591-97, 1993;CHEVILLE, N. F., OLSEN, S. C, JENSEN.A. E., STEVENS, A. M., FLORANCE, H. S., HOUNG, H. S., DRAZEK.E. S., WARREN, R. L, HADFIELDT. L. AND HOOVE, D. L. Bacterial persistence and immunity in goats vaccinated with a purE deletion mutant or the parental 16M strain of Brucella melitensis. Infection and Immunity. 64, p 2431- 2439, 1996). Já a cepa RB51 possui uma modificação na estrutura do LPS, pois não possui o antígeno-O, visto que possui uma mutação no gene wboA, que codifica uma glicosil-transferase envolvida da polimerização da N-formil- perosamina (MORIYÓN, I.; GRILLÓ, M.J.; MONREAL, D.; GONZALEZ, D.; MARÍN, C; LÓPEZ-GONI, I.; MAINAR- JAIME, R.C.; MORENO, E. & BLASCO, J.M. Rough vaccines in animal brucellosis: structural and genetic basis and present status. Veterinary Research, v. 35(1), p. 1-38, 2004). É uma cepa rugosa proveniente de uma cepa lisa e virulenta da B. abortus S2308. Foi desenvolvida pela passagem seriada em meio seletivo contendo concentrações sub-inibitórias do antibiótico rifampicina (SCHURIG, G.G.; ROOP, R.M. 2ND, BAGCHI, T.; BOYLE, S.; BUHRMAN, D. & SRIRANGANATHAN, N. Biological properties of RB51 ; a stable rough strain of Brucella abortus. Veterinary Microbiology, v. 28(2), p. 171-88, 1991). Esta cepa é mais sensível à lise mediada pelo complemento (UGALDE, J. E.; CZIBENER, C; FELDMAN, M. F. & UGALDE, R. A. Identification and characterization of the Brucella abortus phosphoglucomutase gene: role of lipopolysaccharide in virulence and intracellular multiplication. Infection and Immunity, v. 68, p 5716-5723, 2000). A cepa rugosa tem como vantagem o fato de ser menos virulenta e menos abortiva que a cepa vacinai lisa e não interferir no diagnóstico diferencial entre animais vacinados e infectados. A principal desvantagem da RB51 é o fato de ser resistente ao antibiótico rifampicina, que é muito utilizado em combinação com outros antibióticos no tratamento humano (WHO, 1998).

Com o objetivo de superar as desvantagens das vacinas atualmente utilizadas, várias novas cepas recombinantes foram desenvolvidas. O documento WO9937783 - Live vaccine against brucellosis - descreve cepas recombinantes de Brucella construídas por deleção do gene rfbU da Brucella. Esta cepa recombinante é atenuada e induz imunidade protetora semelhante à induzida pelas cepas comerciais.

O documento CN 101092605 - Mutant strain of Brucella bacterin with weak poison, constructing method, and application - descreve cepas recombinantes de Brucella construídas por deleção dos genes Bp26, wboA, omp31, e P39 ou pgm da Brucella S19. Estas cepas induzem imunidade protetora, apresentam a mesma virulência da vacina comercial e são incapazes de interferir no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas.

O documento US7364745 - Development of a live, attenuated, recombinant vaccine for Brucellosis - descreve cepas recombinantes de Brucella construídas por deleção do gene TspA da Brucella. Estas cepas recombinantes são atenuadas e induzem imunidade protetora superior à induzida pelas cepas comerciais.

O documento CN 101185756 - Brucella molecule marking and virulence deletion attenuated vaccine and preparation method - descreve cepas recombinantes de Brucella construídas por deleção dos genes Bp26 e Bmp 18 da Brucella S19, tornando a vacina obtida a partir destas cepas recombinantes da Brucella incapaz de interferir no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas.

O documento CN101386833 - Recombinant bacterium of Brucella abortus and use thereof - descreve cepa recombinante de Brucella construída por deleção do gene que codifica para a proteína de choque frio (cold shock protein) de Brucella S19. Esta cepa recombinante é atenuada, apresenta menor virulência que a cepa comercial e é incapaz de interferir no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas.

O documento CN101386831 - Recombinant bacterium of Brucella abortus with immunity labeling and use thereof - descreve cepa recombinante de Brucella construída por deleção do gene que codifica para a enzima perosamina sintetase de Brucella S19. Esta cepa recombinante é atenuada, apresenta menor virulência que a cepa comercial e é incapaz de interferir no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas.

O documento US7541447 - Process for the preparation of an improved Brucella strain plasmid to develop the strain and the vaccine comprising the said strain - descreve cepas recombinantes de Brucella construídas por deleção do gene pgm da Brucella. Esta cepa recombinante é atenuada e induz imunidade protetora superior à induzida pelas cepas comerciais. O documento CN101575587 - Abortus Brucella vaccine recombinant strain and application thereof in preparing vaccine - descreve cepa recombinante da Brucella construída por deleção do gene que codifica para a proteína de síntese de polissacarídeo capsular e do gene que codifica para a enzima carboxil-uridina fosfato descarboxilase de Brucella S19. Esta cepa recombinante é atenuada e é incapaz de interferir no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas.

O documento CN101575589 - Abortus Brucella vaccine strain S19 marked recombinant strain and application thereof - descreve cepa recombinante de Brucella construída por deleção do gene que codifica para a enzima glicosiltransferase da Brucella S19. Esta cepa recombinante é atenuada e é incapaz de interferir no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas.

A presente invenção envolve o desenvolvimento de uma cepa recombinante da bactéria Brucella S2308 que apresenta deleção parcial ou completa do gene pgk, que codifica a enzima fosfoglicerato cinase (PGK). PGK é uma importante enzima da via glicolítica que catalisa reversivelmente a transferência de um fosfato do 1 ,3 bisfosfosfoglicerato para o ADP, formando assim 3-fosfoglicerato e ATP (BERNSTEIN, B.E.; MICHELS, P.A. & HOL, W.G. Synergistic effects of substrate-induced conformational changes in phosphoglycerate kinase activation. Nature, v. 385(6613), p. 275-8, 1997). Demonstramos que bactérias com deleção deste gene são atenuadas e induzem imunidade protetora superior à induzida pelas cepas comerciais.

A cepa S19 da B. abortus e a cepa Rev 1 da B. melitensis são efetivas contra os seus respectivos patógenos, mas estas cepas vacinais apresentam três grandes desvantagens: elas são patogênicas ao homem, podem causar aborto quando administrado em fêmeas gestantes e induzem a produção de anticorpos em animais imunizados, o que interfere no diagnóstico de indivíduos ou populações infectadas (Cheville er a/., 1992, 1993 e 1996).

A cepa RB51 rugosa tem como vantagem o fato de ser menos virulenta que a cepa vacinai lisa, ser menos abortiva que a outra cepa vacinai e não interferir no diagnóstico diferencial entre animais vacinados e infectados. A principal desvantagem da RB51 é o fato dela ser resistente ao antibiótico rifampicina, que é muito utilizado em combinação com outros antibióticos no tratamento humano (WHO, 1998).

A cepa recombinante S2308Apg/ da Brucella abortus S2308 é capaz de induzir imunidade protetora em camundongos 129/Sv e IRF-1 KO maior do que as linhagens comerciais S19 ou RB51 , e proteção igual à cepa S19 em camundongos BALB/c e C57BL/6, apresentando potencial para ser utilizada como uma nova vacina viva contra a brucelose. Ademais, como as mutações geradas nas cepas S19 e RB51 não são totalmente conhecidas, uma grande vantagem da cepa S2308Apgk é possuir uma alteração genética definida e conhecida. Além disso, em todos os modelos testados in vitro e in vivo a cepa S2308Apg é muito mais atenuada do que a cepa lisa S19.

BREVE DECRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Análise de Western blot da expressão de pgk em B. abortus S2308 (canaleta 1), S2308Apg/ (canaleta 2) e S2308Apgr/c complementada com pBBR1-pgk (canaleta 3). A presença da banda de aproximadamente 42 kDa nas canaletas 1 e 3 indica expressão de pgk nas cepas B. abortus S2308 e S2308Apgr f complementada com pBBR1-pgk. Figura 2 - Replicação intracelular das cepas mutantes S230SApgk e S"\9Apgk em macrofagos derivados da medula óssea. Células aderentes foram infectadas com MOI de 50 da B. abortus S2308, RB51 , S2308_dpg/ ou S19Apgk conforme descrito. Após 2, 24, 48, 72, 120 e 168 horas, os macrofagos foram lisados e enumerados por diluição seriada. Os pontos representam Iog10 CFU por poço, são a média e o desvio padrão de dois experimentos independentes. Asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas (P<0.05).

Figura 3 - Suscetibilidade de camundongos IRF-1 ^" ' ^" inoculados com as cepas mutantes S2308Apgfr e S19Apgk, com as cepas vacinais RB51 e S19 e com a cepa virulenta B. abortus S2308. Oito camundongos por grupo foram infectados com uma dose de 1x10 ⁶ UFC. Os camundongos foram diariamente acompanhados durante 28 dias.

Figura 4- Proteção de camundongos IRF-1 ^" ' ^" contra o desafio com a cepa virulenta S2308 da B. abortus após imunização com a cepa S2308Ápgfr , S Sàpgk, RB51 e S19. Camundongos foram imunizados intraperitoneaimente com uma dose de 1x10 ⁵ UFC de cada cepa separadamente, exceto cepa RB51 que foram vacinados com 1x10 ⁷ UFC. Doze semanas após foram desafiados pela mesma via com 1x10 ⁶ UFC da cepa virulenta S2308. Os camundongos foram acompanhados diariamente, durante 30 dias.

Figura 5 - Persistência da cepa mutante S19Apg/r e da cepa vacinai S19 em camundongos C57BL/6 (A) e 129/Sv (B). Oito camundongos por grupo foram infectados com uma dose de 1x10 ⁶ UFC de cada cepa separadamente. Os baços foram coletados 1, 2, 3, 4 6 semanas após a infecção e o número de UFC foi determinado nos tecidos macerados por diluição serial e plaqueamento. Os valores são expressos como média de UFC. Os asteriscos representam a diferença estatisticamente significativa do grupo S19Apgr/ comparada ao grupo que recebeu a cepa B. abortus S2308 (p<0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

A cepa recombinante da bactéria Brucella caracterizada por apresentar o gene pgk modificado por deleção parcial ou completa é obtida por introdução de um plasmídio contendo o gene pgk interrompido por um fragmento que contém um gene que confere resistência ao antibiótico canamicina. Para tal, utilizou-se a metodologia detalhada a seguir.

Extração do DNA genômico de B. abortus S2308:

A extração do DNA genômico da B. abortus S2308 foi feita de acordo com Halling et al. (1991), com algumas modificações. A partir de uma alíquota estoque de S2308, foi feita uma estriação em meio BB/Agar. As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 37°C contendo 5% de CO ₂ . Uma colónia isolada foi inoculada em 2 ml_ de meio BB e incubada a 37° C sob agitação de 200 rpm durante 48 horas. Após este tempo a cultura foi inativada por 1 hora a 65° C. Em seguida foi submetida à centrifugação a 7000 rpm por 10 minutos e o sedimento foi ressuspendido em 1 ,5 ml_ de TE. Logo após a total ressuspensão, foi adicionado 90 μΙ_ de SDS e 15 μί. de proteinase k (20 mg/mL). Esta mistura foi incubada a 37° C durante 12 a 18 horas. Após este período, foi adicionado 300 μΙ_ de NaCI 5M e 240 μΙ_ de CTAB/NaCI, a mistura foi homogeneizada e incubada a 65° C por 20 minutos. Em seguida, foi adicionado volume igual, isto é, aproximadamente 2,145 ml_, de clorofórmio e a mistura foi incubada em gelo e agitada delicadamente por 15 minutos. Logo em seguida a mistura foi submetida a centrifugação a 7000 rpm por 10 minutos. A fase aquosa foi recuperada e a ela foi adicionado igual volume de fenol. A mistura foi incubada em gelo e agitada delicadamente por 30 minutos, e posteriormente submetida a centrifugação a 7000 rpm por 10 minutos. O processo de recuperação da fase aquosa foi repetido por duas vezes. Após a última repetição, adicionou-se o mesmo volume de fenol-clorofórmio (1 :1), a mistura foi incubada em gelo e agitada delicadamente por 30 minutos, e posteriormente submetida a centrifugação a 7000 rpm por 10 minutos. A fase aquosa foi mais uma vez recuperada e a ela adicionada 0,6 mL de isopropanol para que o DNA genômico se precipitasse. Após a precipitação do DNA, este foi retirado e lavado duas vezes com etanol 70%, em seguida foi seco à temperatura ambiente e ressuspendido em 100-200 μί de água mili-Q estéril. A qualidade e concentração de DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% e análise em espectrofotômetro nos comprimentos de onda 260 e 280 nm (UV mini 1240 UV-VIS Spectrophotometer Shimazdu).

Amplificação do gene pgk de B. abortus por PCR

O gene pgk foi amplificado a partir do DNA genômico da B. abortus

S2308, com os seguintes iniciadores, desenhados a partir de sequências de B. abortus depositadas pelo nosso grupo no Gene Bank com número AF256214, utilizando o programa OLIGO 4.0 (Wojciech Rychlik). Os iniciadores utilizados foram os seguintes:

PGKF: 5' GTA GGA TCC ATG ATG TTC CGC ACC CTT 3' (TM =67, 64) PGKR: 5' GGG GGT ACC TCA CTT CTT CAA TAC ATC 3'(TM=66,12) Em itálico estão destacadas os sítios de restrição inseridos no fragmento amplificado. Para a reação de amplificação utilizou-se 10ng de DNA genômico, 1 μΐ de cada iniciador (õpmoles^L), 1 μΙ_ de tampão Taq DNA polimerase 10X concentrado (500mM Tris-HCI pH 9,0 e 1% de Triton X-100), 0,8 μΙ_ de MgCI ₂ 25mM, 0,25 μΙ_ de dNTPs 10mM, 1 μΙ_ de Taq DNA polimerase 5 ΙΙ/μΙ_ e água q.s.p. para 10μΙ_ de reação.

A reação de PCR foi realizada seguindo o seguinte programa:

- primeira desnaturação: 95° C por 3 minutos;

- 30 ciclos de: desnaturação - 95° C por 30 segundos,

anelamento - 75° C por 45 segundos,

extensão - 72° C por 1 minuto;

- extensão final: 72° C por 10 minutos.

Após a reação de PCR, o produto foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8% e o fragmento de interesse foi purificado do gel através do kit Wizard SV Gel and Clean-Up PCR System (Promega), conforme orientações do fabricante. Logo em seguida, o fragmento foi dosado em gel de agarose 0,8% com fragmentos de DNA de concentração conhecida.

Obtenção do plasmídio recombinante pBluescript-pg c

O produto amplificado e o plasmídeo pBluescript-KS(+) foram duplamente digeridos, em tubos separados, com as enzimas de restrição Bam Hl e Kpn I. Após a digestão, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TAE corado com brometo de etídeo. O vetor pBluescript-KS(+) e o fragmento de interesse de 1191 pb foram retirados do gel, purificados através do kit Wizard Wizard SV Gel and Clean-Up PCR System (Promega) e, em seguida, submetidos à eletroforese com 1 Kb Ladder (Invitrogen) e DNA de concentração conhecida.

A ligação do fragmento de 1191pb no vetor pBluescript-KS(+), foi feita obedecendo a razão molar vetor/fragmento de 1 :3. Para a reação de ligação utilizou-se 2 μΙ_ do tampão de ligação 5X e 1 ,5 μΙ_ da enzima T4 DNA Ligase 1ΙΙ/μΙ_ (Promega) em volume final de 10 μΙ_. As ligações foram realizadas por 16 horas à 16° C. O produto da ligação passou a ser denominado pBluescript-

Transformação de células eletrocompetentes de E. coli DH5 com o vetor pBluescript- pgk:

As células competentes de E. coli DH5a foram preparadas através da técnica de cloreto de cálcio descrita por Sambrook et al, 1989. Para a transformação com o vetor pBluescript:pg/c foi utilizado 5 μΙ_ do vetor para 100 μΙ_ de células competentes. Após eletroporação, as células foram centrifugadas, ressuspendidas em 100 μΐ_ de LB e plaqueadas em LB ágar suplementado com 100 μg/mL de ampicilina, 50 μg/mL de X-gal e 0,5mM de IPTG e incubadas a 37°C por 16 horas. As colónias brancas foram selecionadas e inoculadas em meio LB suplementado com ampicilina (100 μg/mL). O cultivo foi crescido por 16 horas à 37° C sob agitação constante.

O DNA das colónias recombinantes foi submetido à análise de restrição com as enzimas Bam Hl e Kpn I. A clonagem foi confirmada através do sequenciamento do DNA plasmidial das colónias recombinantes usando os mesmos iniciadores utilizados na amplificação do gene pgk. As sequências obtidas foram posteriormente analisadas e editadas manualmente para a eliminação de ambiguidades, regiões de vetor e dados de baixa qualidade existentes no final das sequências.

Construção do vetor pBlue-pgk-kan a partir do plasmídio pBluescript-pgft;

O gene que confere resistência a canamicina foi obtido do plasmídeo pUC-4K (GE Healthcare). A enzima Eco RI foi utilizada para a extração da ORF do gene da canamicina do plasmídeo. A reação de digestão foi feita com ^g do vetor de acordo com orientações do fabricante da enzima, a New England Biolabs. Após a digestão, a amostra foi submetida à eletroforese em gel de agarose 0,8%. O fragmento foi retirado do gel e purificado através do kit Wizard SV Gel and Clean-Up PCR System (Promega). Utilizou-se a enzima Eco RI para a clonagem do gene da canamicina no vetor pBluescript-pgr . O produto da ligação passou a ser denominado pBluescript-pg/c -Kan.

Transformação de células eletrocompetentes de E. Coli DH5a com o vetor pBluescript- pgk -kan:

As células competentes de E. coli DH5 foram preparadas através da técnica de cloreto de cálcio descrita por Sambrook et al. em 1989. Para a transformação com o vetor pBluescript- pgk -Kan foram utilizados 5 μΙ_ do vetor para 100 μΙ_ de células competentes.

Extração do DNA plasmidial pBluescript- pgk -kan de E. Coli DH5a:

O vetor pBluescript:pg//Kan foi extraído da E. coli DH5a através do método de lise alcalina utilizando o kit Wizard mini prep (Promega). A quantificação de plasmídeo foi estimada em gel de agarose 0,8%.

Eletroporação de B. abortus S2308 e S19 com o plasmídio pBlue-pgk-fcan:

As células eletrocompetentes de S2308 e S19 foram preparadas de acordo com Halling et al. (1991), implementando algumas modificações. A partir do estoque de S2308 e de outro de S19, foram feitas estriações em meio BB/ágar, as placas foram crescidas por 72 horas em estufa a 37°C contendo 5% de C0 ₂ . Uma colónia isolada de cada cepa foi inoculada em 2ml_ de meio BB e incubada a 37° C sob agitação de 200 rpm durante 48 horas. Após este período, as culturas saturadas foram adicionada a 200 ml_ de meio BB em erlenmeyer de 1000 ml_ e novamente incubado a 37° C sob agitação de 200 rpm até atingir a ϋθβοο em torno de 0,4 a 0,5. As culturas foram centrifugadas a 7000 rpm durante 10 minutos e os sedimentos foram lavados com 100 mL de água mili-Q estéril. Foi realizada mais uma etapa de centrifugação e lavagem. Mais uma centrifugação foi realizada e os sedimentos lavados com 2 mL de água mili-Q acrescida de 10% de glicerol. Outra centrifugação foi realizada e os sedimentos foram ressuspendidos em 500 μΙ_ de água mili-Q acrescida de 10% de glicerol, as células foram imediatamente utilizadas. A eletroporação foi baseada no protocolo proposto por Drazek et ai, 1995, com algumas modificações. As células eletrocompetentes de B. abortus S2308 e S19 foram colocadas no gelo para descongelarem lentamente. Após total descongelamento foi acrescida 5 μg do vetor pBluescript-pg -/ an. As misturas foram colocadas em cubetas de eletroporação de 0,2 cm resfriadas e estéreis, estas foram deixada no gelo ate o momento da eletroporação. O eletroporador (Gene-Pulser/ Pulse Coltroller, BioRad CA, USA) foi ajustado com os seguinte parâmetros: 25 μΡ de capacitância, 2,5 KV de voltagem e 400 Ω de resistência. Após a eletroporação as células foram ressuspensas em 1ml_ de meio SOC (Invitrogen) e incubadas sob agitação constante de 200rpm a 37° C por 16 horas. Após este período as suspensões foram plaqueadas em meio BB ágar contendo canamicina. As placas forma crescidas durante 72 horas a 37° C em estufa com 5% de C0 ₂ .

As colónias isoladas da placa original foram repicadas em meio BB/ágar acrescido de canamicina e BB/ágar acrescido de ampicilina com a ponta de ponteiras estéreis. As placas foram crescidas durante 72 horas a 37° C em estufa com 5% de CO ₂ . Os clones que cresceram em ambos meios seletivos foram caracterizados como simples recombinantes (Kan ^r Amp ^r ) e os clones crescidos somente em meio contendo canamicina foram caracterizados como duplo recombinantes (Kan ^r Amp ^s ). As cepas Kan ^r Amp ^s foram selecionadas e foi feito PCR de colónia com primers que amplificam o gene da canamicina para uma confirmação inicial da mutação. Após esta confirmação inicial os DNAs das cepas selvagens foram extraídos para confirmação da mutação através da técnica de Southern blot.

Caracterização de colónias Kan ^r Amp ^s e Kan ^r Amp ^r , nas quais ocorreu recombinação homóloga dupla ou simples, respectivamente:

A comprovação genética de que o gene selvagem foi trocado pelo gene interrompido pelo cassete da canamicina foi realizada através da técnica de "Southern blot" para diferenciação entre os transformantes simples- recombinantes e os transformantes duplo-recombinantes. O isolamento do DNA genômico dos clones recombinantes foi realizado de acordo com a metodologia descrita anteriormente. Aproximadamente 10 μg do DNA genômico de cada transformante foram submetidos à digestão com a enzima de restrição Eco RV, conforme o protocolo estipulado pelos fabricantes. Como controle foi utilizado o DNA genômico da cepa parental S2308 de B. abortus e S19 digeridos com a mesma enzima de restrição.

Após a digestão, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 0,8% e transferidas para membrana de nitrocelulose Hybond-N+ (GE Healthcare).

Foram construídas sondas para o gene pgk e para os genes de resistência a canamicina e ampicilina de acordo com a tabela a seguir:

Tabela 1 : Sondas utilizadas no Southern blot

Sonda Origem Enzimas de restrição Tamanho da sonda utilizadas 9k Gene pgk 1191 pb

Ampicilina pAT 153 Pst I e Ssp I 546 pb

Canamicina pUC 4K Eco RI 1208 pb

Para marcação dos fragmentos obtidos para sonda foi utilizado o kit AlkPhos Direct (GE Healthcare). As membranas foram pré-hibridizadas (Alkphos Direct Labeling and Detection Systems) durante 30 minutos a 65°C sob agitação moderada, em 15 mL de solução de hibridização. As sondas marcadas foram adicionadas após 30 minutos de pré-hibridização. A hibridização foi feita a 65°C durante 16 horas em forno de hibridização (Techne hybridiser HB-1 D, Techne, Cambridge, U.K.), sob agitação branda.

A sonda da ORF do gene pgk apresentou hibridização com um fragmento de aproximadamente 5800 pb para B. abortus S2308 e um fragmento de aproximadamente 7082 pb para os clones duplo recombinantes, denominados S2308Apg/ . O transformante simples recombinante mostrou um fragmento de aproximadamente 10042 pb, que corresponde à inserção de todo o plasmídeo suicida dentro de seu genoma. Este resultado foi confirmado quando se utilizou o gene da ampicilina como sonda, onde só se observou hibridização no transformante simples recombinante. A sonda para o gene de resistência a canamicina hibridizou no DNA genômico dos transformantes e não hibridizou no DNA genômico da cepa selvagem S2308.

Após a confirmação de que a ORF do gene pgk havia sido substituída pelo gene pgk interrompido pelo cassete de canamicina no mutante duplo recombinante, este foi denominado S2308Apgr/ . O mesmo perfil foi observado para a cepa transformante de S19, e o mutante obtido foi denominado S19Apg7.

Construção do vetor pBBR1-pg/c:

O gene pgk foi amplificado com o seguinte par de iniciadores desenhados a partir de seqiiências de B. abortus:

PGK 2F: 5' GCG GGTACC CAT GAT GTT CCG CAC CCT T 3'(TM=63,25) PGK 2R: 5' GCG GGA TCC AAC AGA TCG GAA TCA AAA CC 3'(TM=59, 13)

Em itálico estão destacadas os sítios de restrição para as enzimas Kpnl e BamHI inseridos no fragmento amplificado. Para a reação de amplificação utilizou-se o DNA genômico da B. abortus.

A reação de PCR foi realizada seguindo o seguinte programa:

- primeira desnaturação: 95° C por 3 minutos;

- 30 ciclos de: desnaturação - 95° C por 30 segundos,

anelamento - 61° C por 45 segundos,

extensão - 72° C por 1 minuto;

- extensão final: 72° C por 10 minutos.

Após a reação de PCR, o produto foi resolvido em gel de agarose 0,8% e o fragmento de interesse foi purificado do gel através do kit Wizard SV Gel and Clean-Up PCR System (Promega), conforme orientações do fabricante. Logo em seguida, o fragmento foi dosado em gel de agarose 0,8%. O produto amplificado e o plasmídeo pBBR1-MCS foram digeridos com as enzimas de restrição Kpn I e Bam Hl, purificados de gel de agarose através do kit Wizard SV Gel and Clean-Up PCR System (Promega) e ligados com a enzima T4 DNA Ligase (Promega). Após a ligação, células competentes de E. coli DH5 foram transformadas. O DNA das colónias recombinantes foi submetido à análise de restrição com as enzimas Kpn I e Bam Hl e seqijenciamento usando os mesmos iniciadores utilizados na segunda amplificação do gene pgk. Após a confirmação da correta clonagem do gene pgk no plasmídeo pBBR1-MCS esta construção gênica passou a ser denominada pBBR1- pgk.

Transformação das cepas recombinantes com o plasmídeo pBBR1 - pgfc;

O vetor pBBR1- pgk foi extraído da E. coli DH5a através do método de lise alcalina utilizando o kit Wizard mini prep (Promega). Células eletrocompetentes das cepas mutantes S2308Apgk e S19Apg/ da B. abortus foram transformadas com a construção pBBR1-po/ f.

Obtenção da proteína recombinante MBP-PGK:

Com o objetivo de obter anticorpos anti-PGK para avaliação da produção da proteína fosfoglicerato cinase nas diferentes cepas, foi produzida a proteína recombinante MBP-PGK.

O gene pgk foi amplificado utilizando o mesmo par de iniciadores citado anteriormente, purificado do gel de agarose através do kit Wizard SV Gel and Clean-Up PCR System (Promega), digerido com as enzimas de restrição Bam Hl e Hind III e ligado ao plasmídeo pMAL-C2. Após a ligação, células eletrocompetentes de E. coli DH5 foram transformadas e o DNA das colónias recombinantes foi submetido à análise de restrição com as enzimas Bam Hl e Hind III. A clonagem foi confirmada através do seqijenciamento do DNA plasmidial das colónias recombinantes usando os mesmos iniciadores utilizados na amplificação do gene pgk. Após a confirmação da correta clonagem do gene pgk no plasmídeo pMAL-C2, esta construção gênica passou a ser denominada pMAL: pgk. A expressão da proteína recombinante MBP-PGK utilizando o pMAL-c2 foi realizada segundo o manual do fabricante (New England Biolabs). Para purificar a proteína de fusão foi utilizada uma resina de amilose (New England Biolabs).

Obtenção do anticorpo anti-PGK:

Camundongos C57BL/6 foram imunizados com a proteína recombinante MBP-PGK. Foram realizadas três imunizações com o intervalo de quinze dias entre cada uma. Sete dias após cada imunização foi extraído 250 μΙ_ de sangue do plexo retro-orbital, para obtenção do soro contendo os anticorpos anti-MBP- PGK. Para analisar a produção de anticorpos específicos contra a proteína recombinante foi realizado o ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos de acordo com Lunde e colaboradores (1979). Para o controle negativo dos ELISAs foram usados soros de camundongos imunizados com PBS.

Avaliação do crescimento das cepas mutantes em macrofagos derivados da medula óssea:

Macrofagos foram obtidos a partir da medula óssea de camundongos C57BL/6. Cada fémur e tíbia foram lavados com 5 ml of Hank's Balanced Salt Solution (HBSS- GIBCO). O resultado da suspensão celular foi centrifugado e ressuspenso em Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM, Gibco) contendo 10% soro fetal bovino (FBS, Gibco) e 10% de meio condicionado de células L929 (LCCM), como uma fonte de M-CSF (fator estimulador de colónias de monócitos). As células foram distribuídas em placas de 24 poços e incubadas a 37 °C em estufa contendo 5% de CO ₂ . Após 3 dias foram adicionas 0.1 ml de LCCM por poço. No 7° dia de cultura o meio foi renovado. No 10° dia de cultura, quando as células já haviam se diferenciado em macrofagos, estas foram infectadas com B. abortus. Suspensões bacterianas de B. abortus S2308, RB51 , 2308Apg/ e S^9Apgk correspondentes à multiplicidade de infecção (MOI) de 50 bactérias/célula foram adicionadas aos macrofagos. As placas foram centrifugadas 600 g por 10 min a 4 °C para sincronizar a infecção e as células foram incubadas a 37 °C por 30 min. Após este tempo o meio foi removido e as células lavadas 3 vezes com HBSS. Depois da lavagem as células foram incubadas por 90 min a 37 °C em meio contendo 50 Mg/ml de gentamicina (Sigma) para matar as bactérias as bactérias extracelulares. Em seguida as bactérias livres foram removidas com 3 lavagens com HBSS e o tempo zero foi determinado conforme descrito a seguir. Nos demais poços, o meio foi removido e substituído por DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino e 12.5 mg/mL de gentamicina. Células infectadas foram lavadas 3 vezes com PBS e então lisadas com 1 ml de 0.1% Triton-X 100 em ddH ₂ 0. O número de bactérias intracelulares viáveis foi determinado 2h, 24h, 48h, 72h, 120h e 168h após a infecção. Diluições seriadas da suspensão bacteriana em PBS forma plaqueadas em duplicata em BB com e sem canamicina (25 pg/ml). CFU foi determinada após 3 dias de incubação em estufa a 37 °C contendo 5% de CO ₂ . Este experimento foi feito em triplicatas e repetido duas vezes.

EXEMPLO 1 : Análise de que a cepa recombinante da bactéria Brucella é incapaz de sintetizar a enzima fosfoglicerato quinase

Para análise de que a cepa recombinante da bactéria Brucella é incapaz de sintetizar a enzima fosfoglicerato quinase, a cepa selvagem, a cepa recombinante e a cepa recombinante complementada com pBBRI-pg/c foram crescidas em meio líquido, fervidas e seu conteúdo foi submetido a Western blot com anticorpo monoclonal anti-PGK. A cepa selvagem e a complementada apresentaram expressão do gene para a proteína PGK, enquanto a cepa recombinante não apresentou tal expressão (figura 1).

EXEMPLO 2: Demonstração de que a cepa recombinante de B. abortus é atenuada em macrófagos

Para demonstrar que a cepa recombinante de B. abortus é atenuada em macrófagos, avaliou-se a multiplicação da cepa selvagem e da recombinante em macrófagos derivados de medula óssea. O número de bactérias viáveis foi contado nos intervalos de 2, 24, 48, 120 e 168 horas após infecção. Para inibir o crescimento bacteriano extracelular, adicionou-se gentamicina ao meio 30 minutos após a infecção. 24 horas após infecção observou-se uma diferença de 2 log (P < 0,05) no número de organismos sobreviventes nos macrófagos. A bactéria recombinante apresentou uma taxa de replicação intracelular nos macrófagos menor que a bactéria selvagem em todos os tempos estudados após 24 horas de incubação (figura 2), demonstrando que a bactéria recombinante tem habilidade limitada de replicar em macrófagos.

Para determinar se o crescimento das bactérias não havia sido alterado pela ausência do gene pgk, uma curva de crescimento bacteriano B. abortus S2308, S2308Apgr/c, S19 e S19Apgk em meio completo foi realizada. As cepas S2308Apg/c e S19Apgk foram crescidas na presença de canamicina (25 mg/ml), Nenhum dos mutantes apresentou defeito detectável na habilidade de crescer em meio completo.

EXEMPLO 3: Avaliação da virulência residual dos mutantes S2308Ápg/r e S19Apg/r em diferentes modelos murinos

- Avaliação da virulência em camundongos IRF-1

Para determinar se a virulência dos mutantes S2308Apgk e S19Apg/ havia sido alterada, foram realizados experimentos que verificaram a sobrevivência dos camundongos IRF-1 ^~ ' ^~ infectados com Brucella. A virulência das cepas mutantes S2308Apg e S ^* \ 9Apgk foi comparada com a cepa selvagem S2308 de B. abortus e com as cepas vacinais RB51 e S19, em grupos de camundongos IRF-1 ^" ' ^" inoculados intraperitonealmente com 1x10 ⁶ UFC das respectivas cepas. Durante 4 semanas os camundongos tiveram sua sobrevida observadas diariamente.

Todos os camundongos inoculados com a cepa selvagem S2308 morreram entre o quinto e décimo primeiro dia após a infecção, o que era esperado devido à alta virulência desta cepa. Oitenta por cento dos inoculados com a cepa vacinai S19 sobreviveram durante o período de observação este fato pode ser devido à virulência residual que a cepa vacinai ainda detém (Banai et ai, 2002). Todos os camundongos inoculados com as cepas mutantes S2308Apgk e S19Apg e com a cepa vacinai RB51 sobreviveram por quatro semanas após a inoculação indicando assim uma atenuação na virulência das cepas mutantes (Figura 3).

A sobrevivência dos camundongos IRF ^"7" infectados com as cepas mutantes S2308Apg e S19Apgk indica que a proteína fosfoglicerato cinase possui algum efeito na virulência da β. abortus, sendo que a ausência desta enzima na cepa mutante ocasionou uma atenuação em sua virulência. Para confirmar a atenuação da virulência das cepas mutantes S2308Apg/ e S19Apgk outros modelos murinos foram utilizados (figura 4).

- Avaliação da virulência em camundongos BALB/c, C57BL/6 e 129/ Sv Com o objetivo de avaliar a persistência do mutante S2308Apg/ comparada à cepa selvagem S2308 e as cepa mutante S19Apgr/c comparada à cepa vacinai S19 em camundongos BALB/c, C57BI_/6 e 129/Sv, os grupos foram inoculados intraperitonealmente com 1x10 ⁶ UFC da cepa selvagem S2308, ou a cepa vacinai S19 ou com as cepas mutantes S2308Apg/c e S 9Apgk. Após 1 , 2, 3, 4, 6 e 10 semanas os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e seu baço foi retirado, processado e plaqueado em diluição seriada em meio Brucella broth (BB). As placas foram crescidas em estufa a 37°C contendo 5% de CO ₂ . Ao término do terceiro dia as placas foram contadas e foi determinado o número de UFC no baço destes animais.

A cepa mutante S2308Apg/ demonstrou ter a sua virulência reduzida em todos os tempos analisados quando comparada à cepa selvagem S2308, sendo que em todos os pontos esta diferença foi significativa (p< 0.05), em todas as linhagens de camundongos (Figura 5).

Em camundongos BALB/c a menor diferença de UFC entre S2308Apg/ e S2308 foi observada na primeira semana (0.4 log) e a maior diferença foi na sexta semana (3.36 log), como pode ser observado na Figura 5 A.

Em camundongos C57BL/6 a menor diferença de UFC entre S2308Apgr/c e S2308 foi observada na primeira semana (1.17 log) e a maior diferença foi na sexta semana (2.11 log), como pode ser observado na Figura 5 B. E em camundongos 129/Sv a menor diferença de UFC entre S2308Apgk e S2308 foi observada na primeira semana (1.45 log) e a maior diferença foi na sexta semana (3.24 log), como pode ser observado na Figura 5 C.

Através destes diferentes modelos murinos confirmou-se a atenuação da virulência da cepa S2308Apg já que esta foi eliminada mais rapidamente nos camundongos que sua a cepa parental S2308.

EXEMPLO 4: Avaliação da capacidade das cepas mutantes em induzir resposta imune protetora em modelo murino

Camundongos BALB/c, C57BL/6 e 129/Sv, com 6 a 9 semanas de idade, e camundongos IRF-1 ^" ' ^" , com 6 a 12 semanas de idade foram vacinados intraperitonealmente com 100 μί de PBS contendo 1x10 ⁵ UFC das seguintes cepas: S2308Apg/c, S19Apgk, S19 e RB51. No grupo controle foram inoculados 100 μί de PBS. Após 12 semanas os camundongos foram desafiados com 100 μί de PBS contendo 1x10 ⁶ UFC da cepa virulenta S2308. Quinze dias após o desafio, os camundongos BALB/c, C57BL/6 e 129/Sv foram sacrificados por deslocamento cervical e seu baço foi retirado, processado e plaqueado em diluição seriada em meio Brucella broth (BB), conforme descrito anteriormente. As placas foram crescidas em estufa a 37°C contendo 5% de C0 ₂ . Ao término do terceiro dia as placas foram contadas e foi determinado o número de UFC no baço destes animais. Animais IRF-1 ^" ' ^" tiveram sua sobrevivência observada diariamente.

Todos os camundongos vacinados, tanto com as cepas vacinais quanto com as cepas mutantes, apresentaram menor número de Brucella no baço comparado aos animais do grupo controle imunizados com PBS, demonstrando que todas as cepas foram eficientes em ativar o sistema imune e induzir proteção (Tabela 2) Tabela 2 - Imunidade protetora induzida por S2308Apgk, S19Apgk, S19 e RB51

Nos camundongos BABL/c e C57BL/6 a cepa mutante S2308Apg/c demonstrou um nível de proteção similar a cepa S19 (p>0,05) e superior proteção que a cepa vacinai RB51 (p<0,05). Nestes camundongos a cepa mutante S19Apgr/ demonstrou um nível de proteção similar ao da cepa vacinai RB51 (p>0,05), que se demonstrou menos eficiente que a cepa vacinai S19 (p<0,05).

No camundongo 129/Sv a cepa mutante S2308Apg/f demonstrou induzir um nível de proteção superior ao das cepas vacinais S19 e RB51 (p<0,05), a cepa mutante S19Apg demonstrou um nível de proteção similar ao da cepa vacinai S19 (p>0,05), e ambas demonstraram-se mais eficiente que a cepa vacinai RB51 (p<0,05).

Os resultados demonstraram que a cepa mutante S2308Apg/ é capaz de induzir um aumento de resistência contra a infecção causada pela B. abortus S2308 superior às cepas vacinais S19 e RB51 em alguns modelos murinos, tendo como principal vantagem em relação às cepas vacinais comercialmente disponíveis uma maior atenuação na virulência residual que a cepa vacinai S19 com uma excelente capacidade de induzir proteção.

A cepa mutante S19Apg c aumentou a resistência contra a infecção a níveis comparáveis a cepa vacinai RB51 , tendo como principal benefício uma menor virulência residual que a cepa vacinai S19.