CEPA RECOMBINANTE, MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE PROTEASAS ASPARTICAS DE GALIUM VERUM Y USO EN LA INDUSTRIA LÁCTEA.

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología y de la biotecnología. Se refiere al uso de la tecnología del ADN recombinante para la producción de proteínas de uso industrial. Más particularmente, la presente invención se refiere a células o microorganismos que contienen polinucleótidos derivados de la especie vegetal Galium verum, que codifican proteasas aspárticas, y la producción de las proteasas aspárticas para su uso industrial.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La coagulación de la leche mediante enzimas es un paso básico en la manufactura de la mayoría de los quesos. La leche contiene principalmente dos tipos de proteínas: las caseínas, que precipitan durante el proceso de coagulación, y las proteínas del suero, que permanecen solubles; de la fracción proteica sólo las caseínas van a constituir el queso. Las caseínas constituyen aproximadamente el 80 % de las proteínas de la leche y existen de forma mayoritaria cuatro tipos: asi-, as2-, β- y κ- caseínas. Estas proteínas se encuentran formando parte de unas estructuras esféricas denominadas micelas, en cuya superficie se sitúan las κ-caseínas, que son las que confieren estabilidad a la estructura.

Todas las enzimas (cuajos y coagulantes) utilizadas industrialmente para la elaboración de quesos pertenecen al grupo de las proteasas aspárticas (PAs) (EC 3.4.23) e hidrolizan la k-caseína en el enlace Phe105-Met106.

El proceso de coagulación de la leche consta de dos fases, en la primera fase, las PAs hidrolizan la unión Phe105-Met106 de la k-caseína dividiendo la molécula proteica en dos: para-k-caseína hidrofóbica y una parte hidrofílica conocida como caseinmacropéptido; en la segunda fase se produce la coagulación de las micelas de las caseínas que fueron desestabilizadas por el ataque proteolítico.

El tipo de coagulante utilizado en la elaboración del queso tiene una gran influencia en las características organolépticas del producto final. l Los cuajos y coagulantes utilizados actualmente se pueden clasificar en cuatro tipos; cuajo animal (quimosina), microbiano PAs de Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus ó Endothia parasítica), quimosina producida por fermentación (FPC: fermentation produced chymosin) en levaduras (Saccharomyces cerevisiae y kluyveromyces lactis) y hongos (Aspergillus niger) y coagulantes vegetales (Kumar et al. 2010). Estas PAs son producidas como precursores inactivos, las cuales son convertidas en enzimas activas por división autocatalítica de la parte N-terminal denominada propéptido.

Dentro de la categoría de coagulantes vegetales se encuentran extractos acuosos de flores de distintas especies del género Cynara, en cuyos pistilos se expresan un gran número de PAs. Las investigaciones básicas realizadas sobre estas PAs y las pertenecientes a otras especies vegetales, han revelado que la estructura primaria de la mayoría de las PAs de plantas que han sido caracterizadas es similar a la de mamíferos y microorganismos e incluye: un péptido señal en el extremo amino terminal, un propéptido implicado en la inactivación o en el correcto plegamiento, estabilidad y señalamiento celular y un fragmento conocido como plant-specific inserí (PSI) localizado entre el extremo amino y carboxi terminal, que comprende aproximadamente 100 aminoácidos y mantiene su estructura gracias a tres puentes disulfuro. El PSI únicamente se ha identificado en plantas y es similar al precursor de saposinas de mamífero, su función biológica no ha sido totalmente establecida. Las PAs de plantas son sintetizadas como precursores inactivos y se convierten en enzimas activas mediante un procesamiento que implica varios pasos proteolíticos. El procesamiento incluye la eliminación del péptido señal y del propéptido, dando lugar a una enzima heterodimérica o monomérica. Las PAs heterodiméricas están constituidas por una cadena pesada (HC) y una cadena ligera (LC) que permanecen unidas mediante interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno o puentes disulfuro, el procesamiento de estas PAs a su forma activa generalmente incluye la eliminación total o parcial del PSI. La eliminación del propéptido para que la enzima sea activa puede ser desencadenado por moléculas accesorias o requerir una bajada de pH (Simoes and Faro, 2004). Antiguamente se utilizaban para la manufactura de quesos extractos de plantas que contenían diversas PAs, algunos siguen utilizándose hoy en día a nivel local como por ejemplo las bayas de la planta Solanum dobium o varias especies papilionoideae que han sido utilizadas para elaborar un queso tradicional en Sudán "Jibna beida" y otros productos lácteos en Angola (Kheir et al. 2011); el zumo extraído de Calotropis procera (manzana de sodoma) que es utilizado en regiones de Nigeria y Benin; en el sur de China la raíz de jenjibre se utiliza para producir una especie de "tofu" muy apreciado. Otras plantas que se han investigado como fuente de proteasas son: semillas de Balanites, Solanum, albizia, espárragos y frutas como kiwi y melón (Mazorra-Manzano et al.2013). Muchos de los extractos vegetales que se han estudiado hasta ahora no son útiles en la elaboración de quesos ya que presentan una elevada actividad proteolítica en relación a su actividad coagulante, lo cual resulta en una hidrólisis del coágulo demasiado rápida, causando una reducción en la producción y/o quesos defectuosos debido a la amargura generada por los péptidos hidrofóbicos liberados en la maduración. Otros inconvenientes que presenta el uso de los coagulantes vegetales son: el coste que supone la recolección y procesamiento del material vegetal y la estandarización de la fuerza coagulante entre lotes. Sin embargo otros como los extractos acuosos de las flores de Cynara cardunculus, C. humilis y C. scolymus, en cuyos pistilos se expresan un gran número de PAs (Sarmentó et al. 2009) han mostrado ser buenos coagulantes de la leche y se utilizan hoy en día a nivel artesanal en varias zonas de España y Portugal para la manufactura de quesos de cabra y oveja tales como Casar de Cáceres, Torta del Casar, La Serena, Los Ibores, Serra da estrela o Flor de Guía (Harboe et al., 2010).

El uso de estos coagulantes alternativos favorece la obtención de quesos diferentes a los que habitualmente encontramos en el mercado, esto es debido a que la mayoría de PAs de plantas rompen las α-, β- y k- caseínas, mientras que la quimosina animal utilizada normalmente para la producción de quesos únicamente rompe la kappa caseína. PAs de la especie Cynara cardunculus han sido expresadas en diferentes microorganismos y se han estudiado sus propiedades como coagulantes vegetales de la leche: cyprosin B (Sampaio et al., 2008)) y cardosin B (Almeida et al. 2015). La producción de las PAs vegetales utilizando microorganismos permite su obtención en grandes cantidades, sin dependencia de la época de floración ni necesidad del almacenamiento del material vegetal y la posibilidad de estandarizar el coagulante obtenido, eliminando así los inconvenientes que presenta el uso de los extractos obtenidos a partir de la planta.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.

La especie vegetal Galium verum, cuyo nombre científico hace referencia a su capacidad coagulante (en griego gala, galaktos significa leche), también conocida como "cuajaleches" contiene en su genoma al menos dos genes que codifican para PAs las cuales han sido denominadas preprogaline A (GenBank: AFX73038.1) y preprogaline B (GenBank: AFX73039.1) (Feijoo-Siota et al. 2012). Estas proteasas aspárticas podrían ser utilizadas en la elaboración de productos lácteos, sobre todo quesos y en la maduración acelerada de los mismos debido al patrón de hidrólisis de las caseínas de la leche que presentan. Al igual que las proteasas de la especie Cynara cardunculus también se podrían utilizar en la elaboración de productos lácteos con péptidos bioactivos (Silva et al. 2006),

La presente invención se refiere a una cepa recombinante para la producción de PAs recombinantes de la especie Galium verum que han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con el número CECT 13141 , método de producción y uso en la industria láctea. Esta cepa recombinante secreta la enzima al medio de cultivo donde se activa, debido a esto y a que la levadura utilizada como hospedador secreta pocas proteínas endógenas al medio de cultivo, el proceso para su obtención y purificación es sencillo. La proteasa aspártica recombinante aquí descrita tiene actividad coagulante de la leche y su patrón de corte sobre las caseínas difiere de los coagulantes animales, microbianos o vegetales actualmente utilizados para la elaboración de productos lácteos. Según esto la proteasa aspártica podría producir quesos con características novedosas. Por tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende un polinucleotido con la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO:2, o una variante de las mismas que tiene un grado de identidad de al menos un 80% con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2, o secuencias incluidas en las SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO:2 que codifican fragmentos peptídicos de PAs de Galium verum que mantienen las propiedades de rotura de las α-, β- y κ- caseínas y que codifica un péptido con actividad proteasa aspártica de la especie vegetal Galium verum.

En esta memoria descriptiva se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia nucleotídica el porcentaje de coincidencias de los mismos nucleotidos entre dos secuencias alineadas, a lo largo de toda la longitud de ambas secuencias.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula o microorganismo que comprende dicho vector, o el péptido codificado por dicho vector, donde la célula o microorganismo hospedador es transfectado o transformado con el vector y cultivado en condiciones que promueven la expresión y recuperación del péptido. En esta memoria descriptiva se entiende como condiciones que promueven la expresión y recuperación del péptido como aquellas condiciones de medio de cultivo, temperatura, pH y tiempo de incubación necesarias para que se pueda obtener la correcta expresión del polinucleótido obteniéndose la proteína en su forma activa o inactiva.

Por otro lado, la invención también se relaciona con una célula o microorganismo que ha integrado en su genoma el polinucleótido con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO:2, o una variante de las mismas que tiene un grado de identidad de al menos un 80% con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2, o secuencias que codifican fragmentos peptídicos de proteasas aspárticas de Galium verum que mantienen las propiedades de rotura de las α-, β- y κ- caseínas y que codifica un péptido con actividad proteasa aspártica.

Por otro lado, la invención también se refiere a un método para producir PAs que consiste en el cultivo de la célula o microorganismo que contiene un vector o ha integrado en su genoma el polinucleótido con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO:2, o una variante de las mismas que tiene un grado de identidad de al menos un 80% con respecto a dicha SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2, o secuencias que codifican fragmentos peptídicos de PAs de Galium verum que mantienen las propiedades de rotura de las α-, β- y k- caseínas y que codifica un péptido con actividad proteasa aspártica cuando se incuba en un medio de cultivo a un pH, temperatura y agitación que promueven la expresión y recuperación del péptido.

Por otro lado, la invención se refiere a un método para producir PAs en su forma inactiva mediante su obtención a partir del cultivo de la célula o microorganismo que contiene un vector o ha integrado en su genoma las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionadas mediante su cultivo en un medio tamponado a pH básico. Estas PAs pueden ser activadas antes de su uso mediante su incubación a pH ácido.

Por otro lado, la invención también se refiere al uso del coagulante obtenido directamente a partir de una célula o microorganismo hospedadores transformados o transfectados con el vector o que hayan integrado el polinucleótido en su genoma, para la coagulación de la leche, de mezclas de leche de distinto origen animal o bebidas compuestas en parte por leche. Por otro lado, la invención también se refiere al uso del coagulante obtenido directamente a partir de una célula o microorganismo hospedadores transformados o transfectados con el vector o que hayan integrado el polinucleótido en su genoma mezclado con otros coagulantes, para la coagulación de la leche, de mezclas de leche de distinto origen animal o bebidas compuestas en parte por leche.

En esta memoria descriptiva se entiende como leche el producto obtenido a partir de las hembras de los mamíferos, en particular de mamíferos domésticos como vaca, cabra, oveja, camella, búfala, dromedaria, yegua, etc. La coagulación se puede llevar a cabo en los tipos de leche aquí descritos o en cualquiera de sus mezclas.

Otra realización preferida de la presente invención comprende el uso del coagulante recombinante activo de Galium verum para la elaboración de productos lácteos, donde los productos lácteos pueden ser obtenidos a partir de cualquier tipo de leche, de sus mezclas o de bebidas compuestas en parte por leche, más preferiblemente para la elaboración de queso.

En esta memoria descriptiva se entiende como coagulante recombinante activo a una proteasa aspártica de origen vegetal producida en un organismo hospedador transformado con el ADN que codifica para dicha proteasa y que tiene la capacidad de producir la coagulación enzimática de la leche sin necesidad de un proceso de activación previo.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. RACE PCR a partir del ADN complementario de G.verum. Los productos fueron separados en un gel de agarosa al 1 %. Línea 1 : 5 ^' RACE realizada con los oligonucleótidos (AP1/pMgv2r) y línea 2: 3 ^' RACE (pMgv2f/AP1). La línea 3 corresponde al marcador de pesos moleculares.

Figura 2. Representación esquemática de la proteína preprogaline B codificada por el gen gv2AP. Péptido señal (SP); propéptido (Pro); dominio N-terminal con dos sitios catalíticos (DTG y DSG); plant specific inserí (PSI) conteniendo dos dominios saposinas tipo B (Sap_B2 and Sap_B1) y dominio C-terminal; el símbolo de la horquilla indica un sitio de N-glicosilación; las líneas conectadas indican puentes disulfuro predichos (S-S). El triángulo indica la región de la proteína frente a la cual se generó el anticuerpo PV13 utilizado en los Western Blot. Figura 3. Vector de expresión pGAPZa - gv2AP utilizado para la obtención de la cepa de Pichia pastoris productora de la progaline B (CECT13141). La construcción se realizó utilizando los sitios de restricción EcoRI y Xbal de manera que el péptido señal del gen gv2AP fuese sustituido por el factor α que porta el vector y bajo el control del promotor constitutivo pGAP y el terminador de la transcripción del gen AOX1 (AOX1TT). La construcción fue linealizada mediante la enzima de restricción BspHI e integrada en el genoma de Pichia mediante recombinación homologa.

Figura 4. Análisis de la expresión de la progaline B recombinante en el sobrenadante de P. pastoris concentrado mediante precipitación con TCA. Al SDS PAGE. Líneas 2-4: Sobrenadantes de la cepa recombinante productora de progaline B transcurridos 1 día, 2 días y 3 días de cultivo. Líneas 5-7: Sobrenadante de la cepa sin transformar (control negativo) transcurridos 1 día, 2 días y 3 días de cultivo. B/ Western Blot. El sobrenadante de un cultivo de 3 días se analizó utilizando tampón de carga con (línea 2) y sin (línea 3) β-mercaptoetanol mediante un anticuerpo (fig.2 PV13) generado contra un péptido de la cadena pesada de la progaline B. Las bandas de la progaline B se indican con flechas (HC:cadena pesada ; LC:cadena ligera; glic:glicosilada) Figura 5. Análisis mediante Western Blot realizado al sobrenadante del medio de cultivo de la cepa recombinante. Progaline B antes (línea 2) y después (línea 1) de ser tratada con endoglicosidasa H. Las muestras fueron preparadas sin agente reductor (β-ΜΕ) en el tampón de carga. M: marcador biotinilado (Sigma B2787).

Figura 6. Curva de crecimiento (--·--) y actividad enzimática (— ) del sobrenadante de la cepa de P. pastoris productora de progaline B (CECT13141).

La cepa fue incubada en medio YPD a un temperatura de 28 °C y agitación de 230 rpm durante 195 h; en la gráfica también se indica la variación del pH del medio (...x... ). Los datos presentados en la gráfica representan la media de tres medidas realizadas sobre tres matraces diferentes. El tiempo de incubación con FTC-k-caseína para determinar la actividad enzimática fue de 2 horas.

Figura 7. Análisis SDS-PAGE de la actividad proteolítica de la progaline B y coagulantes comerciales sobre κ-(Α/), α-(Β/) y β- (C/) caseínas durante 2 horas a 35°C. Línea 1 marcador de pesos moleculares. En todas las figuras la línea 2 se corresponde con la hidrólisis de la caseína mediante la progaline B incubada con pepstatina, líneas 3-9 degradación de las caseínas con los siguientes coagulantes: (3) progaline B, (4) quimosina de ternero, (5) quimosina bovina producida por fermentación, (6) cuajo de ternera, (7) cuajo bovino adulto, (8) coagulante microbiano, (9) quimosina de camello producida por fermentación. La línea 10 corresponde a la κ-, α- y β- caseínas incubadas 2 horas a 35°C sin ningún coagulante. Figura 8. Efecto de la temperatura y del pH sobre la actividad de la progaline B.

Izquierda:la temperatura óptima de la progaline B semipurificada fue determinada utilizando como sustrato FTC-k-caseína en tampón 100 mM acetato sódico a pH 5.5 a temperaturas de incubación en el rango de 4 a 80 °C durante 1 hora. Derecha: el pH óptimo fue determinado utilizando azocaseína al 1 % como sustrato disuelta en una concentración 100 mM de tampones a pHs comprendidos en el rango (4.4-7) durante 2 horas a 37°C. La actividad relativa es expresada como un porcentaje de la mayor actividad en la temperatura (izq) o pH (drch) examinados.

Figura 9. Efecto de el pH del medio de cultivo en el procesamiento de la progaline B secretada por Pichia pastoris después de tres días de cultivo a 28°C. Al Western blot de los sobrenadantes de la cepa recombinante cultivada en YPD, YPD tamponado a pH 7 (YPD7) e YPD tamponado a pH4 (YPD4). B/ El pH de los sobrenadantes mostrados en A fue ajustado a pH 3.5 con HCI e incubados 4,30 horas a 37°C. Las muestras fueron preparadas en presencia (+) o ausencia (-) de agente reductor en el tampón de carga del SDS PAGE. C/ Actividades de los sobrenadantes de la cepa recombinante y la cepa sin transformar (control negativo) en YPD, YPD4 y YPD7 antes (C.1) y después (C.2) de la bajada de pH. El tiempo de incubación con FTC-K-caseína fue de 1 ,30 horas. Los valores mostrados son la actividad media con la desviación estándar obtenida a partir de tres medidas.

Figura 10. Efecto del pH sobre la activación de la progaline B recombinante. Al La cepa de P. pastoris recombinante fue cultivada en YPD tamponado a pH7 (YPD7) durante 72 horas. El cultivo fue centrifugado, se añadió a alícuotas del sobrenadante (A/ línea 1) un volumen de tampón 0,2 M a diferentes pHs 3,5, 4,3, 4,6, 5,0, 5,8, 6,6 and 7 (líneas 2-8 respectivamente) y se incubaron a 28°C. Las muestras tomadas transcurridos 30, 150 y 270 minutos fueron analizadas mediante Western blot en condiciones reductoras (A.1 , A.2 and A.3 respectivamente). B/ Actividad sobre k- caseína de los sobrenadantes incubados 270 minutos a diferentes pHs. El pH de todas las muestras fue ajustado a 5,5 mediante la adición de NaOH o HCI antes de añadir la FTC-k-caseína y el tiempo de incubación fue de 2,30 horas. MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ilustra adecuadamente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.

Ejemplo 1. Obtención de la secuencia génica que codifica para las proteasas aspárticas preprogaline A y preprogaline B de Galium verum

Para obtener la secuencia génica de las PAs a la que se refiere esta invención se diseñaron dos oligonucleótidos, pAPF (sentido) y pAPR (antisentido), (tabla 1), en base a dos regiones conservadas de secuencias génicas depositadas en la base de datos Genbank, que codifican para proteasas aspárticas vegetales (Laloi et al. 2012). Éstos oligonucleótidos se utilizaron para realizar una RT-PCR, utilizando ARN total extraído de la planta en flor Galium verum (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen). La enzima BioScript MMLV (Bioline) fue utilizada para sintetizar la primera hebra de ADN complementario siguiendo las recomendaciones del fabricante. La mezcla de la reacción de la RT-PCR (50μΙ) consistió en 4 μΙ de ADN complementario, 3,75 unidades de ADN polimerasa Accuzyme (Bioline), 1 mM dNTPs, 10 pmol de cada primer (pAPF y pAPR) y el programa de amplificación constó de 30 ciclos a una temperatura de hibridación de 46°C. Los productos de la amplificación fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa, obteniéndose una banda del tamaño esperado (aproximadamente 1 kb) que fue purificada (Gel band Purification kit; GE Healthcare) desde el gel y el ADN obtenido fue clonado en el vector pCR Blunt II TOPO utilizando el kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning (Invitrogen). Se realizó la extracción de ADN plasmídico desde varias colonias obtenidas en la transformación y se realizó la secuenciación empleando los oligonucleótidos universales SP6 y T7.

Así se obtuvieron dos secuencias parciales de proteasas aspárticas de G. verum a partir de las cuales se diseñaron los oligonucleótidos específicos pMgv1f/pMgv1 r para obtener la secuencia nucleotídica completa del gen que denominaremos gvlAP que codifica para la proteasa aspártica preprogaline A (código de acceso: AFX73038.1) y los oliglonucleóticos pMgv2f/pMgv2r para obtener la secuencia del gen gv2AP que codifica para la proteasa aspártica preprogaline B (código de acceso: AFX73039.1). La secuencia nucleotídica de los oligonucleótidos empleados figura en la tabla 1. Las reacciones RACE PCR se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del kit Marathón® cDNA Amplification (Clontech). La secuencia que codifica para el extremo N-terminal (5 ^' RACE PCR) se obtuvo utilizando la pareja de oligonucleotidos AP1/pMgv1 r en el caso del gen gvlAP y AP1/ pMgv2r en el caso del gen gv2AP; el extremo C- terminal (3 ^' RACE PCR) mediante la pareja de oligonucleotidos pMgvlf/ AP1 para el gen gvlAP y pMgv2f/ AP1 para el gen gv2AP. Las PCRs fueron desarrolladas sobre ADN de doble cadena en volúmenes de 50μΙ_ con la ADN polimerasa Accuzyme (Bioline) y el programa de amplificación (94°C, 30s)1x (94°C 5s, 72°C 3 min) 30x (72°C, 7min) 1x.

Tabla 1. Secuencias de oligonucleotidos.

*Y= C, T; R= A, G; V= A, G, C; M= A, C; N= A, C, G, T

Los fragmentos amplificados fueron clonados utilizando el kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning (Invitrogen) y secuenciados. Las secuencias de ambos extremos se ensamblaron mediante el programa informático VectorNTI obteniéndose así la secuencia completa de dos genes gvlAP (Genbank: JQ434478.1) y gv2AP (Genbank: JQ434479.1) que codifican para las proteasas aspárticas preprogaline A y preprogaline B respectivamente. En la figura 2 se muestra una representación esquemática de la preprogaline B. Ejemplo 2. Construcción del vector de expresión pGAPZa-gv2AP.

Para la expresión de la preprogaline B sin el péptido señal (que denominaremos progaline B) en la levadura Pichia pastoris X-33(GRAS), se utilizó el vector integrativo pGAPZaA (Invitrogen). Este vector contiene el promotor constitutivo pGAP, una secuencia que codifica para el péptido señal del factor α de Saccharomyces cerevisiae que permite la secreción extracelular del enzima, el terminador del gen AOX1 y el gen de resistencia a zeocina.

Para la construcción de pGAPZa-gv2AP (fig.3) se diseñaron una pareja de oligonucleótidos pGV2-EcoRI/pGV2-Xbal (tabla 1) para amplificar el gen gv2AP sin el péptido señal del mismo e introducir las dianas de restricción adecuadas para su introducción en el vector pGAPZaA con el fin de clonar el gen en pauta de lectura con el péptido señal (factor a) de S. cerevisiae que porta el vector. La reacción de PCR para amplificar el fragmento del gen fue llevada a cabo con 1 ,25 U PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (Takara) utilizando el tampón suministrado con la misma suplementado con 200 μΜ de cada dNTP; 0,3 μΜ oligonucleótidos (pGV2- EcoRI/pGV2-Xbal) y ADN complementario obtenido mediante el kit Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis (Roche) en un volumen final de 50μΙ siguiendo un programa de: 98°C 10s, 58°C 5s, 72°C 1 ,40 min durante 30 ciclos. El producto de PCR fue purificado desde un gel de agarosa 1 % y se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y Xbal. El vector pGAPzaA se digirió con las mismas enzimas y los fragmentos se ligaron con enzima ligasa (Takara) toda la noche a 16°C. Se transformaron células de E.coli TOP10 competentes con la construcción obtenida y se seleccionaron utilizando el marcador de resistencia a la Zeocina que porta el vector. El vector pGAPZa-gv2AP fue purificado desde E. coli mediante el kit Plamid Midiprep (Qiagen) y utilizado para la tranformación de P. pastoris.

Ejemplo 3. Transformación de Pichia pastoris X-33 con pGAPZa-gv2AP.

La transformación de la cepa P. pastoris X-33 se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del manual pGAPZa A, B, and C (Invitrogen). Así, el vector pGAPZa- gv2AP se linearizó con la enzima de restricción BspHI, tras lo cual se inactivo el enzima 20 min a 65°C y limpió el ADN mediante fenol cloroformo. Se obtuvieron 9 μg de la construcción pGAPZa-gv2AP lineales que se introdujeron en células de Pichia pastoris mediante electroporación: se utilizó un electroporador Gene Pulser® II (BioRad), la cubeta de electroporación fue de 0.2 cm (BioRad) y el pulso de 25uF, 200 Ω y 1.8 kv. Los fragmentos lineales se integraron en el genoma de Pichia pastoris mediante eventos de recombinación homologa, esta integración puede producirse en varias copias, como consecuencia se pueden obtener cepas que sintetizan el enzima de manera estable y en gran cantidad. Las colonias fueron seleccionadas en placas de YPDS (extracto de levadura 1 %, peptona 2%, dextrosa, 1 M sorbitol, 2% agar) suplementado con 10C^g/ml de zeocina. La integración del cassette de expresión en el genoma de Pichia fue confirmado mediante PCR utilizando como molde el ADN genómico extraído con el kit Epicenter MasterPure y con los oligonucleótidos pGAP (GTCCCTATTTCAATCAATTGAA) y 3ΆΟΧ1 (GCAAATGGCATTCTGACATCC).

Ejemplo 4. Análisis de la producción de progaline B mediante P. pastoris recombinante. Se realizó un ensayo para determinar la capacidad para hidrolizar la kappa caseína de los clones que habían integrado en su genoma el cassette utilizando k-caseína etiquetada con isotiocianato de fluoresceína (FTC-K-caseína) siguiendo el método de Ageitos et al. 2006. Los clones seleccionados se cultivaron en medio YPD a una temperatura de 28°C y agitación 230 rpm; la cepa sin tranformar se cultivó en las mismas condiciones para ser usada como control negativo. Los cultivos fueron centrifugados y los sobrenadantes almacenados a -70°C hasta que se midió su actividad kappa caseinolítica. La mezcla de reacción se realizó en un tubo eppendorf y contenía 10 de los sobrenadantes obtenidos a diferentes tiempos de cultivo, 4.2 de FTC-k-caseína y 50 de tampón 0.1 M acetato sódico, pH 5.5. La incubación se realizó a 37°C durante 2 horas en oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 120 de TCA 5% frío. Una vez detenida la reacción se mantuvo durante un mínimo de una hora a temperatura ambiente protegida de la luz. Los viales se centrifugaron a 4°C y 18000g durante 10 min y 50 L del sobrenadante se mezclaron con 350 μί de 0.5 M Tris-HCI 500mM, pH 8.5 en una placa. La fluorescencia en un fluorímetro Perkin Helmer Luminiscence Spectrometer LS50B con una λ de excitación de 490 nm y de emisión de 525 nm. La cepa que presentó una mayor actividad proteolítica de la k- caseína fue seleccionada y se cultivó en YPD a 28°C, 230 rpm. El sobrenadante de esta cepa fue analizado después de 72 horas de cultivo mediante SDS PAGE al 12% y Western Blot (fig.4). Como anticuerpo primario para realizar el Western Blot se utilizó un anticuerpo policlonal producido en conejo frente a un péptido sintético de 13 aminoácidos (PSHFKGEHVYAKV) cuya secuencia se corresponde a los aminoácidos 243-255 de la preprogaline B (GenBank: AFX73039.1).

En el análisis mediante SDS PAGE del sobrenadante del cultivo de la cepa recombinante se observa que a partir del segundo día de cultivo aparece una banda de 30,7 kDa que no aparece en el sobrenadante de la cepa sin tranformar (fig.4A). En el Western Blot se observaban dos bandas de 51.2 kDa y 46 kDa cuando al tampón de carga no se le añadía β-ΜΕ (fi. 4B línea 3), mientras que una única banda de 30.7 kDa aparecía cuando el tampón de carga contenía el agente reductor (fig. 4B línea 2). Esto confirma la estructura predicha por diferentes programas bioinformáticos y por homología con otras proteasas aspárticas de origen vegetal. La progaline B es secretada por la levadura P. pastoris al medio de cultivo y sufre un procesamiento proteolítico de manera que el propéptido y parte del PSI son eliminados dando lugar a una proteína formada por dos cadenas unidas mediante puentes disulfuro (bandas de 51.2 y 46 kDa) en la cual la cadena pesada (HC) quedaría unida a la cadena ligera (LC) mediante puentes disulfuro; la progaline B se secretaría en forma glicosilada (banda de 51 ,2 kDa) y no glicosilada (banda de 46 kDa) (comprobado mediante ensayo de deglicosilación cuyos resultados se muestran a continuación). Cuando añadimos β-ΜΕ al tampón de carga únicamente detectamos la cadena pesada (30,7 kDa), ya que se rompen los puentes disulfuro que unen ambas unidades y el anticuerpo utilizado (PV13) reconoce un péptido que se sitúa en la cadena pesada (figura 2).

La cepa productora de progaline B se ha depositado según el Tratado de Budapest en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo) con el número de registro CECT13141. Ejemplo 5. Deglicosilación con EndoH de la progaline B expresada en Pichia pastoris.

La progaline B fue incubada con endoglicosidasa H para comprobar si las dos bandas observadas cuando se realizaba el Western Blot a muestras a las que no se le añadía β-ΜΕ eran debidas a la presencia de un sitio de N-glicosilación predicho al final de la región PSI (fig.5). La deglicosilación se realizó incubando 10 μΙ del sobrenadante de la cepa recombinante crecida durante 3 días en medio YPD a 28°C y 230 rpm y concentrado 20 veces con 2 μΙ de endoglicosidasa H (1 U/mL) de Streptomyces griseus (Sigma) en 50mM tampón fosfato pH5 en un volumen final de 50 μΙ; como control negativo se utilizaron 2ml de agua milliQ en lugar de endoH. Después de incubar 4 horas a 37°C la reacción se detuvo añadiendo 10 I de tampón de carga de SDS- PAGE sin β-ΜΕ a 10 I de las muestras, la mezcla fue calentada a 95°C 7 minutos y se analizaron mediante Western Blot.

Mediante este ensayo se confirmó que la progaline B es secretada por P. pastoris en dos formas, una glicosilada y otra no glicosilada (fig.5. línea 2, bandas 51.2 y 46 kDa ), cuando la progaline B es tratada con endoH vemos como únicamente aparece una banda (la forma deglicosilada, fig.5, línea 1).

Ejemplo 6. Producción de progaline B a pequeña escala.

Se realizó un ensayo para para determinar el tiempo de incubación para obtener la máxima cantidad de progaline B activa en el sobrenadante del medio de cultivo YPD (1 % extracto de levadura, 2% peptona, 2% dextrosa). Se utilizaron 100ml de medio en matraces de 500 mi con un inoculo inicial para que la DO600 fuese de 0,02 y las condiciones de cultivo fueron 28°C y 230 rpm. Se analizó el crecimiento mediante la medición de la absorbancia a 600 nm utilizando un espectrofotómetro modelo Beckman DU-640 (DO600); la actividad enzimática utilizando FTC-K-caseína mediante el método de Ageitos et al., 2006 y la variación de pH en el medio de cultivo (fig. 6).

La actividad fue máxima transcurridas 70-92 horas de cultivo, en la fase estacionaria de crecimiento, luego la actividad decreció progresivamente. La actividad de los sobrenadantes de un cultivo procedente de la cepa sin tranformar de P. pastoris (control negativo) fue próxima a cero en todas las muestras analizadas. El pH del medio de cultivo YPD cambiaba con el crecimiento de la levadura, inicialmente era de 6,4 y decrecía hasta un valor de 4,6 transcurridas 27 horas de incubación, luego se fue incrementando gradualmente hasta 7,58 después de 195 h de incubación. Ejemplo 7. Hidrólisis de caseínas de leche bovina.

El patrón de degradación de las caseínas es un factor importante a la hora de evaluar un nuevo coagulante debido a que este patrón puede afectar al rendimiento, textura y a la evolución de la proteólisis durante la maduración del queso.

Para analizar el patrón de corte de las caseínas se utilizaron a-caseina, β-caseina y κ- caseína bovinas comerciales (Sigma-Aldrich) disueltas en 100 mM fosfato sódico pH 6 a una concentración final de 1 mg/ml y se incubaron independientemente con 20μΙ de cada uno de los siguientes coagulantes: progaline B semipurificada mediante DEAE- BioGel A, coagulante microbiano producido por Rhizomucor miehei Mucorzyme "L" (Biostar S.A.), quimosina de ternero(Sigma R4877) Chymax P (quimosina bovina) y Chymax M (quimosina de camello) producidas en Aspergillus niger var. awamori, (CHR Hansen), preparación de cuajo de ternera y cuajo bovino adulto (Calf and Bovine REMCAT Standards for rennet testing, CHR Hansen).

El volumen de los coagulantes utilizados en el ensayo fue calculado para que todos ellos tuviesen la misma fuerza. La fuerza (SU) se definió como el número de volúmenes de leche coagulados por volumen de coagulante en 40 minutos a 35°C. SU= 2400V/tv, donde v es el volumen de coagulante (mi), V volumen de leche (mi) y t el tiempo de coagulación en segundos. La leche utilizada en el ensayo fue 10% leche desnatada en polvo Nestle Sveltesse suplementada con 10mM CaCI2 a pH 6. El tiempo de coagulación se determinó visualmente. Así el volumen añadido de cada coagulante se calculó aplicando la fórmula v= 0.120/SU y se añadió agua hasta un volumen final de 20 I ul.

Como control negativo se incubó la progaline B semipurificada en presencia de pepstatina A (inhibidor de proteasas aspárticas) a una concentración final 2μΜ durante 30 min a 37°C antes de añadir la α-, β- o κ- caseína; también se realizó un blanco con agua.

La reacción con las diferentes caseínas se llevó a cabo a 35°C durante 2 horas transcurridas las cuales la reacción se detuvo añadiendo a un volumen de muestra un volumen de tampón de carga (200 mM Tris-HCI, pH 6.8, 40% glicerol, 2% SDS, 0.04% Coomassie Blue G-250, 2% β-ΜΕ) y calentando a 95°C durante 7 minutos. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE 16.5% según el método de Laemmli pero utilizando como tampón de electroforesis Tris-Tricina (100mM Tris, 100mM Tricina, 0.1 % SDS). Las proteínas fueron fijadas con una solución metanol/ácido acético/agua (4:1 :5); teñidas con 0.025% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio- Rad) en 10% ácido acético y desteñidas con 10% ácido acético. La hidrólisis de las α- ,β- y κ-caseínas bovinas mediante la progaline B y varios coagulantes comerciales se muestra en la figura 7. El patrón de corte de la progaline B sobre la k-caseína presenta la misma especificidad que el resto de los coagulantes comerciales utilizados normalmente para la elaboración de quesos (fig.7A líneas 3-9). La digestión de la k-caseína da lugar a la aparición de un producto de unos 13.5 kDa que se correspondería con el peso molecular esperado para la para-k-caseína que resulta de la hidrólisis en el enlace Phe105-Met106 que desencadena el proceso de coagulación de la leche. Estas bandas no se observan en la k-caseína a la que no se le ha añadido ningún coagulante (fig7A línea 10), ni a la que se ha incubado con progaline B tratada con pepstatina (fig7A línea 2). La actividad proteolítica de la progaline B sobre la a- y β-caseínas es mayor que la de los coagulantes testados. Así podemos observar como cuando la progaline B se incuba con α-caseína (fig.7B, línea 3) o β-caseína (fig.7C, línea 3) durante 2 horas el patrón de hidrólisis es mayor que el generado con el resto de coagulantes. Este ensayo indica que la progaline B hidroliza la k-caseína igual que el resto de coagulantes utilizados hoy en día para la elaboración de quesos y que tiene una mayor actividad proteolítica sobre las a- y β-caseínas que estos.

Ejemplo 8. Temperatura y pH óptimos Para determinar si la progaline B tenía unas características adecuadas para ser utilizada como coagulante de la leche para la elaboración de quesos se determinó su temperatura y pH óptimos.

La temperatura óptima fue determinada midiendo la actividad sobre FTC-K-caseína según el método de Ageitos et al. 2006. Se utilizó progaline B semipurificada mediante columna de DEAE Biogel A y como tampón 100 mM acetato sódico a pH 5.5. La temperatura en la que la progaline B presenta una mayor actividad sobre la k-caseína en estas condiciones fue de 50°C presentando entre 30°C y 35°C (temperaturas habituales en la elaboración del queso) el 50% y el 69% de actividad relativa respectivamente. Para analizar el pH óptimo: 20 μΙ de progaline B semipurificada fueron incubados con 480 I ul una solución de azocaseína (Sigma) al 1 % utilizando una concentración 100 mM de tampones a diferentes pHs (4.4 - 7) durante 2 horas a 37°C: el tampón utilizado en el rango de pH 4.4 a 5.6 fue tampón acetato sódico y tampón fosfato sódico en el rango 6.0-7.0. El pH óptimo de la progaline B fue observado a pH 5, la actividad era menor cuando el tampón era más alcalino, así a pH 7 únicamente se conservaba un 21.7% de la actividad. Los valores son similares a los obtenidos para proteasas aspárticas de la especie vegetal Cynara cardunculus utilizada para la elaboración de quesos (Sampaio et al., 2008; Almeida et al. 2015). La quimosina presenta una temperatura óptima de coagulación de la leche a pH 6.6 aprox. 45°C y un pH óptimo entre 3.5-5.5 dependiendo del sustrato utilizado para el análisis.

Ejemplo 9. Coagulación de la leche usando progaline B recombinante.

El sobrenadante de un cultivo de 3 días de P. pastoris expresando la progaline B se concentró 50 veces y se añadieron 50 μΙ a 1 mi de leche (12% (w/v) desnatada en polvo (Nestle Sveltesse) suplementada con 10mM CaCI ₂ , pH 6 a 37 °C en tubos de cristal y se determinó el tiempo que transcurría hasta la aparición de los primeros flóculos. Como controles negativos se utilizaron: agua destilada, progaline B incubada con pepstatina A a una concentración 2 μΜ a 37°C durante 30 minutos y el sobrenadante de una cepa de P. pastoris sin tranformar obtenida en las mismas condiciones que la cepa transformada. El tiempo transcurrido hasta la aparición de los primeros flóculos fue de 35 minutos. También se comprobó que la progaline B coagulaba la leche de vaca y oveja, siendo el coagulo más firme y requiriendo un menor tiempo de coagulación cuando se utilizaba la de origen ovino.

Ejemplo 10. Influencia del medio de cultivo para la producción de la progaline B en su forma activa o inactiva.

La cepa recombinante de P. pastoris se cultivó a 28°C y 230 rpm durante 3 días en medio YPD, medio YPD ajustado a pH7 mediante tampón fosfato sódico (nombrado YPD7) y en medio YPD ajustado a pH4 mediante tampón citrato (nombrado YPD4) a una concentración final 100 mM de cada uno de los tampones. La cepa sin tranformar fue cultivada en las mismas condiciones para comprobar que la actividad proteolítica no era debida a posibles proteasas secretadas por P. pastoris.

El patrón de bandas en el Western blot de la progaline B cuando la cepa recombinante era cultivada en YPD4 (fig.9 A/, líneas 1 y 2) o YPD (fig. 9 A/ líneas 5 y 6) era el mismo, tanto en condiciones reductoras (+) como no reductoras (-) (descrito en el ejemplo 4). Cuando la cepa se cultivaba en YPD7 la progaline B presentaba un peso molecular de 56 kDa en condiciones reductoras (fig.9 A/ línea 3), la cual corresponde al peso molecular predicho para la forma de la enzima no procesada (con el propéptido y el PSI presentes). La diferencia en el peso molecular de la proteína en condiciones no reductoras (58 kDa, fig.9 A/, línea 4) podría ser debida a la forma adoptada por la misma cuando no se rompen los puentes disulfuro. La progaline B secretada en YPD e YPD4 muestra actividad proteolítica usando FTC-K-casein como sustrato, mientras que la producida en YPD7 es inactiva (fig.9 C1). La conversión de la progaline B secretada en YPD7 a su forma activa ocurre cuando se baja el pH del sobrenadante a pH 3.5 durante 4,30 horas a 37°C. Así, después de la incubación se detecta la banda de 30,7 kDa (fig.9 B/ línea 3) debido a la rotura del PSI y pérdida del propéptido (fig.9 B/ línea 4: en condiciones no reductoras HC y LC permanecen unidas por puentes disulfuro) (la pérdida del propéptido se deduce por el menor peso molecular de la banda correspondiente a la enzima recombinante y fue verificado mediante MALDI TOF en un ensayo no incluido en este documento). La bajada de pH activa la progaline B lo cual da lugar a que el sobrenadante muestre actividad proteolítica (122 ± 23 U) (fig9. C2).

Las actividades enzimáticas en YPD, YPD4 y YPD7 no son comparables debido al efecto del pH en el crecimiento celular. La activación de la progaline B cuando se cultiva en medio YPD sin tamponar se debe a la bajada de pH que se produce en el transcurso de la fermentación (fig. 6). Este ensayo demuestra que la activación de la progaline B recombinante es dependiente de pH y que tamponando el medio de cultivo podemos producirla en su forma inactiva y activarla posteriormente mediante una bajada de pH. Ejemplo 11. pH de activación de la progaline B.

El pH de activación de la progaline B cultivada en medio tamponado a pH7 (YPD7) se determinó incubando los sobrenadantes de un cultivo de la cepa recombinante con un volumen de tampón 0,2 M a diferentes pHs. Las muestras se incubaron a 28°C durante 30, 150 y 270 minutos, transcurridos los cuales se analizaron mediante Western Blot y se midió su actividad mediante el método de Ageitos et al. 2006 (fig. 10 A y fig. B respectivamente). Transcurridos 30 minutos de incubación en el rango de pH 3.5-5.0 se detectaba una banda correspondiente a la cadena pesada de la progaline B con el propéptido (37 kDa), mientras que en los sobrenadantes incubados a pH 6.6 y 7 se observaba únicamente la banda de 56 kDa correspondiente a la enzima sin procesar (fig. 10 A.1). Cuando el tiempo de incubación se incrementaba (150 minutos) se producía la rotura del propéptido detectándose la banda de 30.7 kDa correspondiente a la cadena pesada sin el propéptido. El procesamiento era total cuando el sobrenadante se incubaba a pH 3.5 (fig.10 A.2, línea 2); la conversión era más lenta cuando el sobrenadante se incubaba a pHs más alcalinos, así la banda de 30,7 kDa era más tenue a pH 4.6 -5 y no se detectaba a pH 5.8, 6.6 y 7 (fig.10 A.2). Transcurridos 270 minutos la activación de los sobrenadantes en el rango 4.3 - 5.8 da lugar a una activación parcial (la banda de 37 kDa sigue siendo visible), mientras que a pH 6,6 y 7 la progaline B no es activada (fig.10, A.3). Como puede verse en la figura 10 B las muestras en las cuales la progaline B ha perdido el propéptido muestran actividad enzimática sobre la k-caseína (fig. 10 B) y esta es mayor en función de la pérdida del propéptido.