A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.

A presente invenção refere-se também a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.

Especificamente, a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63 de serina para lisina.

A presente invenção fornece também composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção.

A presente invenção prevê ainda o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacina para prevenção contra tuberculose e infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis.

Por último, a presente invenção refere-se a métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Das micobactérias

As micobactérias compõem o género Mycobacterium da família das Mycobacteriacae da ordem dos Actinomycetales da classe dos Actinomycetes . As micobactérias que compõe esse género possuem um formato de bastonetes ligeiramente curvos, de 1 a 10 μιτι de comprimento e 0,2 a 0,6 μπι de diâmetro. Estas bactérias não podem ser classificadas como Gram-positivas, nem como Gram-negativas . A característica mais marcante desse bacilo é a natureza complexa de seu envelope celular, contendo uma percentagem relativamente

FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) alta de lipídios, os quais incluem as longas cadeias de ácido micólico. Esse envelope lhe confere uma forte hidrofobicidade, tornando-o resistente à lise e relativamente impermeável a antibióticos e outros agentes químicos. Os bacilos são ditos ácido-álcool resistentes, ou seja, são resistentes às descolorações por ácidos fracos após coloração com Fucsina ou corantes similares. O DNA genômico contém um alto conteúdo de guanosina/citosina, entre 58-79%, o que prejudica o uso da bactéria Escherichia coli como um hospedeiro genético. Estes aspectos são considerados características básicas para a identificação do bacilo como membro do género Mycobacterium [ORME, I. (1995) Medicai Intelligent Unit: Immunity to Mycobacteria . Austin: R.G. Lands Company, p. 5; JAWETZ, E . , MELNICK, J.L. Sc ADELBERG, E.A. (1998) Medicai Microbiology . 21 ^3t Ed. Appleton & Lange, Stamford, Connecticut ; SHINNICK, T .M. & GOOD, R. C. (1994) Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: 884-901] .

As micobactérias foram classificadas em dois principais grupos: bactérias de crescimento lento, que possuem um tempo de geração em torno de 13 horas e que podem levar de 3 semanas a 3 meses de cultura para fornecer colónias visíveis; e as bactérias de crescimento rápido, que possuem um tempo de geração em torno de 2-5 horas. As micobactérias de crescimento lento incluem muitos dos maiores patógenos de animais e humanos, como M. tuberculosis , M. bovis, M. paratuberculosis, M. avium, M. leprae, etc, enquanto as de crescimento rápido incluem espécies não patogênicas, tais como M. smegmatis , M. aurum, M. vaccae, etc. Quatro das cinco espécies patogênicas de micobactérias são agrupadas no complexo M. tuberculosis - um grupo de quatro espécies que pode causar a doença tuberculose ( . tuberculosis , M. bovis, M. microft e M. africanum) ; a quinta é a M. leprae, o agente causador da doença de Hansen (informalmente conhecida como lepra) [SHINNICK, T . M . & GOOD, R. C. (1994) Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: 884-901; ORME, I. (1995) Medicai Intelligent Unit : Immunity to Mycobacteria. Austin: R.G. Lands Company, p. 5; CONNELL, N.D. (2001) Expression systems for use in Actinomycetes and related organisms. Current Opinion in Biotechnology 12: 446-449] .

O M. tuberculosis (MTB) é transmitido, sobretudo pela via respiratória e, embora possa causar doenças em diversos órgãos, a tuberculose pulmonar é a mais comum. Estima- se que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo e que 200 milhões irão apresentar sintomas de tuberculose, dos quais 35 milhões poderão morrer até 2020 se medidas de controle e prevenção não forem tomadas (OMS Publicação Anual, 2000) .

Da profilaxia da tuberculose e do uso do bacilo de Calmette-Guérin (BCG)

No início do século passado, Albert Calmette e Camille Guérin, atenuaram uma cepa virulenta de Mycobacterium bovis. Esta cepa é conhecida atualmente como Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) , sendo a única vacina contra a tuberculose usada atualmente com sucesso, tendo já sido administrada a mais de três bilhões de indivíduos em todo o mundo .

Não obstante, a sua eficácia contra a forma adulta da tuberculose tem sido motivo de controvérsia, uma vez que pode variar de 0-80%, dependendo do estudo [Andersen, P. and Doherty, T.M. (2005) The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nat Rev Microbiol. 3: 656-662] . Assim, vários esforços têm sido empreendidos no desenvolvimento de novas vacinas, baseadas a) em proteínas recombinantes ou antígenos dominantes de MTB; b) na expressão desses mesmos antígenos em diversos vetores, tais como vetores virais, vetores bacterianos ou vetores baseados em BCG recombinante; c) em outras micobactérias que não causam tuberculose tais como Mycobacterium smegmatis ; ou d) no próprio M. tuberculosis atenuado [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T. , Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M. , Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M. , Kim, J., Lukose, R. , Chan, J. , Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis . Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577;

De um modo geral, a idéia por trás destas vacinas é buscar uma forma de mimetizar o que acontece numa situação real, ou seja, apresentar o patógeno por inteiro numa forma morta ou viva, porém, atenuada e que não provoque infecção [Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577], ou usando uma outra espécie do mesmo género, também morta ou atenuada, como a BCG, que possui antígenos importantes em comum com o patógeno de interesse. Outra variante dessas vacinas seria o seu uso como veículos vivos para apresentação ou expressão de antígenos heterólogos, neste caso moléculas de MTB sendo expressas em BCG ou M. smegmatis [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T. , Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M . , Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M. , Kim, J., Lukose, R. , Chan, J. , Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis . Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567- 577] .

Apesar dos esforços, os resultados em modelo animal quando comparados com a vacina BCG apontam para uma redução da carga bacilar nos pulmões de somente 1,0 log, ainda assim seguindo um regime de imunização baseado em "prime- boost" . Neste esquema de imunização, a primeira dose é administrada por uma das formulações mencionada acima seguida por uma segunda dose em uma outra formulação, ou seja, são necessárias duas imunizações com formulações ou apresentações diferentes para se chegar a um resultado melhor que a vacina BCG usada atualmente, que é administrada como dose única [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T., Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M. , Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M . , Kim, J. , Lukose, R. , Chan, J., Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis. Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567- 577] .

Do BCG Recombinante

O BCG é a vacina mais utilizada no mundo pois apresenta uma resposta imune duradoura e uma frequência muito baixa de efeitos adversos sérios. Essa e outras características tornam a BCG um excelente candidato a veiculo para apresentação de antígenos heterólogos através de vacinas recombinantes baseadas em BCG (Patente US 6,673,353) . Neste sentido, a expressão de domínios imunogênicos de bactérias, vírus e parasitas tem sido utilizado com sucesso no BCG, gerando cepas recombinantes (rBCG) , as quais produzem resposta imune não só contra o bacilo da tuberculose, mas também, contra os patógenos cujas proteínas seriam expressas nesse rBCG (Patente US 5, 504, 005) .No entanto, vale salientar que nas rBCGs descritas até a data, a adição de um domínio imunogênico heterólogo confere a proteção imunológica específica esperada contra os patógenos cujas proteínas seriam expressas no referido rBCG. Reações distintas das que são de conhecimento habitual, isto é, em que o rBCG confere a proteção imunológica diferente daquela esperada, ainda não foram descritas.

Da toxina termo-lábil LT de Escherichía coli e suas propriedades imunomoduladoras

Propriedades adjuvantes têm sido atribuídas a diversas toxinas bacterianas. Por exemplo, é amplamente conhecido que as toxinas tetânica (TT) , diftérica (DT) , colérica (CT) e a toxina termo-lábil (LT) de Escherichía coli (E. coli) , atuam como adjuvantes que direcionam a resposta imunológica para Th2 quando co-administradas com outros antígenos [Ryan, E.J. et al. (2000) Modulation of innate and acquired immune responses by Escherichía coli heat-labile toxin: distinct pro- and anti-inflammatory effects of the nontoxic AB complex and the enzyme activity. J Immunol. 165:5750- 5759; Miyaji, E.N. et al. (2001) Induction of neutralizing antibodies against diphtheria toxin by priming with recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing CRM197, a mutant diphtheria toxin. Infect Immun. 69:869-874] , Em particular, a toxina LT de E. coli está entre os mais potentes adjuvantes já descritos até o momento [Lycke, N. et al. (1992) The adjuvant effect of Vibrio cholerae and Escherichia coli heat-labile enterotoxins is linked to their ADP-ribosyltransferase activity. Eur J Immunol. 22: 2277-2281; Pizza, M. et al. (2001) Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19:2534-2541] .

A toxina LT de E. coli é formada por uma única molécula de subunidade A (LTA, 27kDa) , com atividade ADP ribosiltransferase , ligada a um pentâmero de subunidade B (LTB, 11,6 kDa cada) que se liga ao receptor gangliosídeo GM1 de células de mamíferos. A subunidade B de LT é uma potente molécula sinalizadora capaz de modular a resposta imunológica. O efeito imunoestimulatório de LTB parece estar relacionado com a capacidade desta de aumentar a apresentação de antígeno via o complexo de histocompatibilidade principal classe I (MHC-I) e classe II ( HC-II) , entre outros fatores . Já o efeito adjuvante de LTB tem sido relacionado diretamente à atividade de ligação a GM1 , através da ativação de células B e células T CD4 ⁺ por meio da interação dos pentâmeros de subunidade B e os receptores GM1 destas células. Além disso, LTB aumenta a apresentação de antígenos pela ativação de células dendríticas (DCs) e outras células apresentadoras de antígenos (APCs) . A ligação da LTB ao gangliosídeo GM1 permite que a subunidade A, que é tóxica, entre na célula [Spangler, B.D. (1992) Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol Rev. 56: 622-647] .

O uso da LT como adjuvante não é recomendado, em função da toxicidade da subunidade A. Já a subunidade B, por não apresentar esta toxicidade, tem sido mais frequentemente utilizada como adjuvante [de Haan, L., Verweij , W.R., Feil, I.K., Holtrop, M. , Hol, W.G., Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1998) Role of GM1 binding in the mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit. Immunology, 94: 424-430] .

As propriedades imunomodulatórias que levam ao aumento da imunogenicidade e eficácia protetora de LT têm sido amplamente estudadas. Embora os mecanismos que levam a esse efeito não sejam bem caracterizados, alguns aspectos como o aumento de citocinas inflamatórias e produção de quimiocinas, bem como recrutamento transiente de células imunoefetoras até o sítio de inflamação têm sido estabelecidos como fatores importantes . LT pode também influenciar a maturação de células dendríticas, apresentação de antígenos e ativação de células T e promover a indução de resposta por células T citotóxica antígeno-específico em modelo animal. O uso de LT como adjuvante leva comumente a um balanço de citocinas, envolvendo a produção de uma resposta por citocinas com características tanto Thl como Th2 e algumas classes de anticorpos em camundongos e humanos .

Esta toxina é capaz de ativar uma resposta imunológica contra outro antígeno quando apresentados simultaneamente na superfície de mucosa ou por administração oral, intra- nasal ou parenteral [Holmgren, J. , Lycke, N. and Czerkinsky, C. (1993) Cholera toxin and cholera B subunit as oral -mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine, 11: 1179-1184] .

Como uma consequência dessas propriedades, LT tem sido empregada extensivamente como adjuvante em modelos animais. No entanto, apesar da ação imunomodulatória de LT, este é altamente tóxico e inapropriado para uso clínico em humanos. Assim, para evitar a toxicidade associada com o uso da toxina nativa, porém mantendo suas propriedades adjuvantes, diferentes estratégias têm sido utilizadas, incluindo o isolamento da subunidade B (não tóxica) e a construção de mutantes de LT não-tóxicos, contendo mutações sítio-dirigidas específicas. Por meio de estudos de modelagem computacional da estrutura da proteína LT, foi possível identificar alguns aminoácidos potencialmente envolvidos na atividade enzimática desta proteína que poderiam ser estudados através da troca dos mesmos por mutação sítio-dirigida [Magagnoli, C. et ai., (1996) Infect Immun. 64: 5434-5438] . Alguns desses mutantes, tais como LTR192G (substituição de arginina para glicina na posição 192) , possuem uma mutação numa região de alça que é sensível a protease, tornando esta região insensível à ação de proteases, etapa fundamental para a ativação da atividade enzimática e consequentemente da sua toxicidade. Outros mutantes apresentam uma mutação na região enzimaticamente ativa da subunidade A, tal como LTR72 (substituição de alanina por arginina na posição 72) , a qual retém somente 1 % da atividade ADP-ribosiltransferase .

Um outro mutante importante é LTK63 (substituição de serina por lisina na posição 63) . Essa mutação elimina a atividade ADP-ribosiltransferase associada à toxicidade; eliminando a mesma, porém, mantém todas as outras propriedades biológicas, incluindo propriedades adjuvantes do LT nativo [Pizza, M. , et ai., (2001) Mucosal vaccines : non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19:2534-2541] .

LTK63 tem mostrado atuar como um potente adjuvante quando administrado mucosaraente ou parentalmente. De Haan e colaboradores [De Haan, L., Holtrop, M . , Verweij , .R., Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1999) Mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the recombinant A subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Immunology, 97: 706-7013] sugerem que adjuvantes usando LTA não tóxicos em associação com o pentâmero LTB podem ser mais potentes que adjuvantes usando a subunidade B sozinha, uma vez que o complexo poderia estimular o sistema imunológico mais fortemente do que cada molécula individualmente. Dados que apontam para uma função importante da subunidade A enzimaticamente inativa na indução de uma resposta imune, bem como em atividades imunomoduladoras , tais como efeitos sobre o processamento e apresentação de antígeno, dão suporte a essa visão.

Da expressão de LT e suas variantes

LTB e LTK63 recombinantes têm sido expressas tipicamente em E. coli. No entanto, outros sistemas de expressão têm sido usados. A molécula LTB foi expressa em Mycocabterium bovis BCG, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris , bem como plantas que incluem Oryza sativa (arroz) , Lactuca sativa (alface) e Peperomia pellucid. LTK63 tem sido expresso também em tabaco e cloroplastos , assim como Salmonella entérica serovar Typhimurium atenuada [da Hora, V.P. et ai. (2011) Non-toxic derivatives of LT as potent adjuvants. Vaccine, 29: 1538- 1544] .

No entanto, o objetivo de todos estes trabalhos, foi utilizar a molécula de LT ou uma de suas subunidades ou variantes para produzir vacinas contra E. coli. 0 uso de LT em vacinas contra tuberculose não foi descrito nem sugerido na literatura existente.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

Constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.

Em particular, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , recombinantes que codificam a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.

Mais especificamente, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium, em particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo- lábil LT ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.

Mais especificamente, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium, em particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo- lábil LT ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli, mutadas na posição 63 de serina para lisina, respectivamente rBCG- LTK63 e rBCG-LTAK63.

Constitui também um objetivo da presente invenção fornecer composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção.

Um outro objetivo da invenção é prover o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacinas para prevenção contra tuberculose e/ou infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis ou por outras micobactérias .

Em particular, tem a presente invenção o objetivo de prover vacinas de BCG melhoradas contra tuberculose (i.e. que induzem melhor proteção que a cepa BCG convencional) que compreendem as cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinantes da presente invenção. A presente invenção objetiva ainda métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais, mais particularmente humanos .

DEFINIÇÕES

No âmbito deste pedido de patente são utilizadas por diversas vezes abreviaturas cujas definições conforme empregues nèste pedido, encontram- se resumidas abaixo:

•BCG refere-se ao Mycobacterium bovis atenuado, Bacilo de Calmette-Guérin;

•LTK63 refere-se à toxina termo-lábil de Escherichia coli contendo a subunidade A modificada por mutagênese sítio-dirigida; ,

• LTAK63 refere-se à subunidade A da toxina termo,- lábil de Escherichia coli, modificada por mutagênese * ^sítio- dirigida; e

•rBCG-LTK63 ou rBCG-LTAK63 refere-se ao BCG recombinante expressando LTK63 ou LTAK63.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS i^j

As figuras a seguir fazem parte do presente relàtprio e estão aqui inclusas a fim de ilustrar determinados aspectos da invenção. O objeto da presente invenção pode ser' "melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada.

A Figura 1 mostra um gel de agarose contendo os produtos de PCR que confirmam a presença do gene LTK63 no BCG recombinante (rBCG-LTK63 ) . Os produtos de PCR foram amplificados à partir do DNA plasmidial extraído da construção rBCG-LTK63 usando oligonucleotídeos iniciadores específicos para amplificar a subunidade LTA ou a unidade LTB. 1Kb plus, peso molecular; poço 1, fragmento LTA completo (-700 pb) ; poço 2, fragmento LTB completo (-316 pb) .

A Figura 2 mostra a caracterização da expressão de LTAK63 (-31,0 kDa) em BCG recombinante . Extrato de proteínas solúveis (-10 g) de rBCG transfornado com pLNIP- LTAK63 (A) , ou BCG vazio como controle negativo (B) foram usados neste imunoensaio. Foi utilizado um soro (policlonal) feito em coelho anti-LT 1:1000).

As Figuras 3 e 4 mostram a análise comparativa da resposta de anticorpos IgGl e IgG2a induzida contra proteínas recuperadas do sobrenadante de cultivo de BCG - PDS. Camundongos BALB/c, fêmeas, com quatro semanas (18- 22g) , provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária - USP, foram imunizados com BCG ou rBCG-LT (Figura 3) ou com BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 4) e os isotipos determinados em soros isolados um dia antes do desafio contra MTB ou 90 dias após imunização. Os soros de 5 animais por grupo foram analisados individualmente por ELISA, usando anticorpos específicos anti IgGl e IgG2a de camundongo .

As Figuras 5 e 6 mostram a produção de IFN-γ por esplenócitos cultivados na presença de PDS. Camundongos BALB/c fêmeas foram imunizados com 1 x IO ⁶ UFC de BCG ou rBGC-LT (Figura 5) ou BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 6) e após quatro semanas ou oito semanas, respectivamente, os baços foram recuperados e preparações de células únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO ⁶ células/poço) na presença de 2,0 μg/mL de PDS. Os sobrenadantes das culturas foram recuperados após 48 h e os níveis de IFN-γ determinados por ELISA.

As Figuras 7 e 8 mostram a produção de TNF-α por esplenócitos cultivados na presença de PDS. Camundongos BALB/c fêmeas foram imunizados com 1 x IO ⁶ UFC de BCG ou rBGC-LT (Figura 7) ou BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 8) . Após 4 semanas (Figura 7) ou oito semanas (Figura 8) os baços foram recuperados e preparações de células únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO ⁶ células/poço) na presença de 2,0 μg/mL de PDS. Os sobrenadantes das culturas foram recuperados após 24 h (Figura 7) ou 48 h (Figura 8) e os níveis de TNF-α determinados por ELISPOT (Figura 7) ou ELISA (Figura 8, respectivamente) . SFU = unidades formadoras de pontos.

As Figuras 9 e 10 mostram o perfil de células T CD4* produtoras das citocinas INF-γ e TNF-a, respectivamente. Camundongos BALB/c fêmeas (n = 5 por grupo) foram imunizados s.c. uma única vez com lxlO ⁶ UFC/animal com BCG ou rBCG-LTK63. Um grupo não imunizado foi utilizado como controle negativo. Oito semanas após a imunização os baços foram recuperados e preparações de células únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO ⁶ células/poço) na presença de 2,0 pg/mL de PDS. O perfil de células T CD4 ⁺ produtoras das diversas citocinas foram analisadas por Citometria de Fluxo (FACs) usando anticorpos anti-CD4, anti-INF-γ e anti-TNF-a específicos e marcados com o fluorocromo apropriado.

A Figura 11 mostra o resultado dos ensaios de proteção contra um desafio intra- traqueal com a cepa de M. tuberculosis H37Rv. Camundongos BALB/c fêmeas (n = 10 por grupo) A e B foram imunizados s.c. uma única vez com M. bovis BCG ou com rBCG-LT . Um grupo não imunizado foi usado como controle negativo. Oito semanas após a imunização os animais foram desafiados pela via intra-traqueal com lxlO ⁵ UFC de M. tuberculosis H37Rv. Barras de erro representam o desvio padrão da média. A e B representam dois ensaios realizados em tempos diferentes nas mesmas condições. C, representa um ensaio realizado com camundongos C57BL/6 fêmeas (n = 10 por grupo) imunizados s.c. uma única vez com M. bovis BCG ou rBCG-LTA. Oito semanas após a imunização os animais foram desafiados pela via intra-traqueal com lxlO ⁵ UFC de M. tuberculosis H37Rv. Barras de erro representam o desvio padrão da média.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Descrição das cepas

A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.

A presente invenção refere-se também a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.

Em particular a presente invenção refere-se a cepas de

Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.

Mais particularmente a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63 de serina para lisina, respectivamente rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63.

As referidas mutações permitem que a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli codificadas pelo Mycobacterium mantenham as propriedades adjuvantes do LT nativo, porém percam a atividade ADP-ribosiltransferase associada à toxicidade, evitando assim problemas de toxicidade no caso em humanos ou outros animais.

Cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo- lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli que apresentam outras mutações em sua sequência que objetivem um efeito equivalente, i.e. manutenção das propriedades adjuvantes do LT nativo e dimunuição ou supressão da toxicidade, estão também contempladas na presente invenção. Tais mutações podem incluir, mas não estão limitadas às posições 72 e 192.

As cepas da presente invenção são obtidas a partir de qualquer cepa do género Mycobacterium como carreador para apresentação de um ou mais antígenos de organismos distintos, obtidos e clonados em vetor de expressão em micobactéria e inseridos por meio de manipulação genética.

Preferencialmente as cepas de Mycobacterium recombinantes da presente invenção compreendem cepas do complexo de MTB, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis, Mycobacterium microft. e Mycobacterium africanum ou de micobactérias de crescimento rápido, Mycobacterium smegmatis, M. aurum, M. vaccae, etc.

Mais preferencialmente as cepas de Mycobacterium recombinantes da presente invenção compreendem cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) .

Descrição das composições imunogenicas

A presente invenção refere-se a composições imunogênicas que compreendem uma ou mais cepas da presente invenção e um ou mais dentre um veículo, excipiente, diluente ou solvente fisiologicamente aceitáveis.

Preferencialmente as composições da presente invenção compreendem cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo- lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTK63.

Alternativamente, as composições da presente invenção compreendem preferencialmente cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a subunidade A da toxina termo- lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTAK63. As composições da presente invenção podem ainda compreender uma mistura de cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTK63 e a subunidade A da toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG- LTAK63.

As composições imunogênicas da presente invenção, podem ainda compreender adicionalmente um ou mais antígenos, preferencialmente toxinas inativadas. Tais antígenos podem ser para uso na prevenção e/ou tratamento de tuberculose ou de outras doenças causadas por patógenos distintos. Os componentes inativados das composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica, tais como procedimentos químicos, como o tratamento com formaldeído ou água oxigenada, ou mesmo técnicas de recombinação de DNA .

De acordo com a presente invenção, adjuvantes são moléculas, componentes, macromoléculas ou microorganismos atenuados ou mortos que potencializam a resposta às imunizações, reduzem a quantidade de antígeno necessária e direcionam o tipo de resposta imune a ser desenvolvida, além de sustentá-la por um período de tempo maior, como um imunógeno; é qualquer material ou substância que altera o tipo, a velocidade, a intensidade ou a duração da resposta imune .

As composições da presente invenção podem compreender ainda excipientes, como bactericidas, bacteriostáticos, antioxidantes, conservantes, tampões, estabilizantes , ajustadores de pH, ajustadores de osmolaridade, agentes antiespuma e tensoativos ; e resíduos de agentes de inativação ou fracionamento de antígenos, componentes de meios de crescimento e solventes comumente utilizados na produção de vacinas; exemplos destes tipos de componentes podem ser encontrados no Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases The Pink Book, 11 ^a edição, seção "Vaccine Excipient & Media Summary" (Centers for Disease Control and Prevention. Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. Atkinson , Wolfe S, Hamborsky J, Mclntyre L, eds . 11th ed. Washington DC: Public Health Foundation, 2009) incorporado aqui como referência.

Conforme usado na presente invenção, o emprego do termo " farmaceuticamente aceitável" significa um sólido não- tóxico, inerte, excipiente líquido semi-sólido, diluente, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como solução salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, os amidos, tais como amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, a etilcelulose e o acetato de celulose, ciclodextrina; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girasol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol , polióleos, tais como glicerinaglicol , sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, ágar agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; ácido algínico,- água livre de pirogênio; salina isotônica, solução de Ringer; soluções tampões de álcool etílico e fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas .

Uma variedade de vias de administração das composições imunoterápicas e vacinas descritas na presente invenção está disponível. O modo particular selecionado dependerá do princípio ativo em particular selecionado, a dosagem necessária para eficácia terapêutica e do paciente ao qual será administrada a composição. Os métodos da presente invenção, geralmente, podem ser praticados usando qualquer modo de administração biologicamente aceitável, i.e., qualquer modalidade que produzir níveis eficazes de resposta imune sem causar efeitos adversos clinicamente indesejáveis. Tais modos de administração incluem as vias intradérmica, oral, retal, sublingual, tópica, nasal, transdermal ou parenteral . O termo "parenteral" inclui subcutânea, intravenosa, epidural, irrigação, intramuscular, bombas de liberação, ou de infusão. Particularmente, nesta invenção as vias intradérmica, oral, parenteral e nasal são preferidas para administração das composições aqui reivindicadas.

Para a administração parenteral, os princípios ativos podem igualmente ser dissolvidos em um veículo farmacêutico e administrados como uma solução, emulsão, incluindo micro e nanoemulsões , ou suspensão. Exemplos de veículos apropriados são água, salina, soluções de dextrose, soluções de frutose ou óleos de origem animal, vegetal ou sintéticos .

Para a administração nasal, os princípios ativos podem ser dissolvidos em um veículo farmacêutico e administrados como uma solução, emulsão, incluindo micro e nanoemulsões, ou suspensão. Exemplos de veículos apropriados são água e solução salina ou suspensões sólidas, como spray, lactose, frutose ou flocos de quitosana. Outros veículos podem também conter outros ingredientes, por exemplo, preservativos, agentes suspensores, agentes solubilizantes , tampões e similares. Preferencialmente as composições imunogênicas da presente invenção são para administração intradérmica, oral e parenteral .

Propriedades das cepas e das composições imunogênicas da presente invenção

As cepas e as composições imunogênicas da presente invenção apresentam um efeito sinérgico inesperado sobre a resposta imunológica contra Mycobacterium . Os antígenos recombinantes do LTK63 ou LTAK63 apresentam o efeito técnico inesperado de induzir um efeito adjuvante contra as proteínas do próprio Mycobacterium .

Conforme poderá ser visto nos Exemplos abaixo, as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção apresentam o efeito técnico inesperado de provocar uma resposta imunológica anti-TB mais intensa quando comparadas a vacinas compreendendo BCG tradicional. Ou seja, a adição de um domínio imunogênico, como por exemplo a subunidade não-tóxica LTAK63 da toxina termo- lábil de E. coli, que sabidamente não tem nenhuma ligação com nenhum tipo de micobactéria, em uma micobactéria recombinante, em partiular BCG, provoca um aumento da resposta protetora contra tuberculose.

Em particular as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção promovem uma diminuição da carga bacilar no pulmão em modelos animais de tuberculose.

Além disso, as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção levam a um aumento significativo da expressão de IFN-γ em relação ao grupo controle, uma citocina considerada essencial na resposta contra tuberculose; este fato sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl .

As cepas e as composições imunogênicas da presente invenção levam também a um aumento significativo de TNF-a. Uma vez que o TNF-α é relacionado como sinalizador da ação pro- inflamatória, caracterizando a fase aguda do processo inflamatório desencadeado pelos bacilos, então as vacinas da presente invenção promovem a ativação direta do sistema imune .

Finalmente podemos concluir que as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção, ao combinar micobactérias , em particular BCG, e toxinas de outros patôgenos, preferencialmente de Escherichia coli, gerando uma cepa de micobactéria recombinante, constituem uma nova vacina, mais potente e eficaz que o BCG convencional para a profilaxia ou imunização para tuberculose.

Uso das cepas e das composições imunogênicas da presente invenção.

Considerando as propriedades das cepas de Mycobacterium recombinantes e das composições imunogênicas da presente invenção, constitui outro aspecto da presente invenção o uso das composições imunogênicas para a prevenção de infecções causadas por micobactérias, em partcular Mycobacterium tuberculosis em animais, mais particularmente humanos .

Constitui um outro aspecto da presente invenção o uso de uma ou mais cepas de Mycobacterium recombinantes ou de uma ou mais composições imunogênicas da presente invenção na manufatura de uma vacina.

Mais particularmente, constitui um aspecto da presente invenção o uso de uma ou mais cepas de Mycobacterium recombinantes ou de uma ou mais composições imunogênicas da presente invenção na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de tuberculose e/ou infecções causadas por micobactérias.

Constitui ainda um outro aspecto da presente invenção métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais, mais particularmente humanos.

EXEMPLOS

Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos, são apresentados abaixo, como exemplos, os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a esta invenção.

No Exemplo 1 é descrita a obtenção das vacinas da presente invenção. Nos demais Exemplos (2 a 3) são ilustradas as propriedades e o uso da vacina da presente invenção. Estes Exemplos são apresentados a titulo meramente ilustrativo e não devem ser de forma alguma considerados como limitativos do âmbito e do alcance da presente invenção.

EXEMPLO 1 : Obtenção das vacinas rBCG-LTK63 e rBCG- LTAK63

Este exemplo descreve a obtenção das vacinas rBCG-LTK63 e rBGC-LTAK63.

a) Preparação de lote estoque de BCG competente: para preparação de estoques de BCG competente, uma ou mais colónias de BCG foi cultivada em meio líquido Middlebrook 7H9 mais Tween-80 e suplementado com albumina-dextrose- catalase 10% (MB7H9/Tw/ADC) até a fase exponencial. Composição do meio Middlebrook 7H9 de acordo com o fabricante (Difco-BD) : Sulfato de Amónio, Ácido L- Glutâmico, Citrato de Sódio, Piridoxina, Biotina, Di- Fosfato de Sódio, Mono- fosfato de Potássio, Citrato de Amónio Férrico, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco e Sulfato de Cobre. Em seguida, a cultura foi sedimentada por centrifugação a 4000 rpm e lavada duas vezes com glicerol 10% a 4°C, sendo finalmente re- suspendida em 5% do volume original com glicerol 10% e armazenada à -70°C até ser transformada por eletroporação com o plasmídeo pNL12-LTK63 ou com o plasmídeo pNL12- LTAK63.

b) Construção do vetor de expressão do gene LTK63 em BCG recombinante aqui denominado de pNL12-LTK63; o vetor de expressão de micobactéria usado para expressão de LTK63 em BCG recombinante é denominado pMIP12 e foi descrito por Le Dantec [Le Dantec et al. 2001 J Bacteriol . 183: 2157-2164] , O gene LTK63 foi gentilmente cedido pelo Dr. Rino Rappuoli (Novartis) . O vetor de expressão em BCG recombinante do gene LTK63 foi construído usando métodos convencionais de biologia molecular. O gene LTK63 foi amplificado por PCR usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: N- terminal ( 5 ' - TAGGGTACCCAAAAATATAACTTCATTTTTTTTATTTT- 3 " ) , contendo o sítio de restrição Kpn I (sublinhado) e C- terminal ( 5 ' - TAGCTGCAGCTAGTTTTTCATACTGATTGCCC-3 ' ) , contendo o sítio de restrição Pst I (sublinhado) . O produto de PCR correspondente ao gene LTK63 foi gerado usando as seguintes condições de PCR: 94°C por 4 minutos; 25 ciclos de 94°C por 1 min, 50°C por 1 min e 72°C por 30 s ; e 4°C final. Esse produto de PCR foi então digerido com as enzimas de restrição Kpn I e Pst I e então clonado no vetor de expressão pMIP12, que foi também previamente digerido com as mesmas enzimas Kpn I e Pst I, gerando assim o vetor de expressão denominado de pMIP12/LTK63.

Sequência gênica do plasmídeo pNP12-LTK63

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c) Construção do vetor de expressão do gene LTAK63 em BCG recombinante aqui denominado de pLN12-LTAK63 : o vetor de expressão em BCG recombinante do gene LTAK63 foi construído usando métodos convencionais de biologia molecular. O gene LTAK63 foi amplificado por PCR a partir do gene LTK63 usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: N- terminal (5'-

TAGGGATCCAATGGCGACAGATTATACCGTTG-3') , contendo o sítio de restrição BamH I (sublinhado) e C- terminal (5'- TAGGGTACCTAATTCATCCCGAATTCTGTTATA-3') , contendo o sítio de restrição Kpn I (sublinhado) . O produto de PCR correspondente ao gene LTAK63 foi gerado usando as seguintes condições de PCR: 94°C por 4 minutos; 25 ciclos de 94°C por 1 min, 50°C por 1 min e 72°C por 30 s; e 4°C final. Esse produto de PCR foi então digerido com as enzimas de restrição BamH I e Kpn I e então clonado no vetor de expressão pMIP12, que foi também previamente digerido com as mesmas enzimas BamH I e Kpn I, gerando assim o vetor de expressão denominado de pLNIP-LTAK63.

Sequência gênica do plasmideo pNLl2-LTAK63

GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGC TGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAG TTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAA TTCGAGCTCGACTTAATTAACTCCGGGTGGTCACTGAGTACATCCCGTCGGTGCGTTCG GCATCGGTCGGGGTGTGGGTGGGTGTCGGCTCCCGCGACGAAGGACGAAGCGTCGCGGG TGCCGCCCACTTCTTGGAGCATCTGCTGTTCAAGGCCACCCCGACGCGCACGCGGTCGA CATCGCGCAGGCTGTCGATGCCGTCGGCGGTGAGCTGAACGCGTTCACCACGCGCGAGC ACACCTGTTACTACGCGCATGTGCTCGACTCCGACCTGGAGCTCGCGGTCGACCTGGTG CGCCGATGTCGTGTTGCGTGGGCGTTGTGCCACCGAGGATGTCGAAGTGGAGCGCGACG

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e) Obtenção da cepa de BCG recombinante expressando LTK63, rBCG-LTK63: para preparação de rBCG-LTK63 , uma alíquota estoque de 50-200 μΐ de BCG competente foi misturada com 0,1-1 μ de pNL12-LTK63, em cubetas de eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 pF e 1000 Ω, num eletroporador de pulsação (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, UK) . Após eletroporação, o conteúdo das cubetas foi recuperado em 2 mL de meio (MB7H9/Tw/ADC) sem antibiótico e incubado a 37°C por 20 h antes de ser semeado em meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco) , suplementado com ácido oléico-albumina- dextrose-catalase 10% (MB7H9/OADC) mais canamicina (20 pg/mL) para seleção dos transformantes . Composição aproximada do meio sólido Middlebrook 7H10 de acordo com o fabricante (Difco-BD) : Sulfato de Amónio, Mono-fosfato de Potássio, Bi-Fosfato de Potássio, Citrato de Sódio, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco, Sulfato de Cobre Ácido L-Glutâmico, Citrato de Amónio Férrico, Hidrocloreto de Piridoxina, Biotina, Verde de Malaquita e Agar. As colónias de rBCG selecionadas foram então transferidas para 5 mL de meio líquido de cultura MB7H9/Tw/ADC com canamicina (20 pg/mL) .

e) Obtenção da cepa de BCG recombinante expressando a subunidade A LTAK63 , rBCG-LTAK63 : para preparação de rBCG- LTAK63, uma alíquota estoque de 50-200 μΐ de BCG competente foi misturada com 0,1-1 pg de pLN12-LTAK63 , em cubetas de eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 ]iF e 1000 Ω, num eletroporador de pulsação (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, U ) . Após eletroporação, o conteúdo das cubetas foi recuperado em 2 mL de meio (MB7H9/Tw/ADC) sem antibiótico e incubado a 37°C por 20 h antes de ser semeado em meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado com ácido oléico-albumina- dextrose-catalase 10% (MB7H9/OADC) mais canamicina (20 pg/mL) para seleção dos transformantes . Composição aproximada do meio sólido Middlebrook 7H10 de acordo com o fabricante (Difco-BD) : Sulfato de Amónio, Mono-fosfato de Potássio, Bi-Fosfato de Potássio, Citrato de Sódio, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco, Sulfato de Cobre Ácido L-Glutâmico, Citrato de Amónio Férrico, Hidrocloreto de Piridoxina, Biotina, Verde de Malaquita e Agar. As colónias de rBCG selecionadas foram então transferidas para 5 mL de meio líquido de cultura MB7H9/Tw/ADC com canamicina (20 g/mL) .

g) Preparação dos lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63 : Em seguida, os clones destas duas cepas foram expandidos para 50 mL de meio líquido MB7H9/Tw/ADC ou em qualquer meio descrito para cultivo de micobactérias mais canamicina (20 g/mL) . Após 2-3 semanas, quando o cultivo atinge D0 ₆ oo 0,6- 0,8, as amostras foram centrifugadas , lavadas duas vezes com H ₂ 0 destilada, resuspendidas em 1 mL de glicerol 10% e aliquotadas em volume de 50 μΐ e então armazenadas a -80°C, para posterior utilização nos ensaios de imunização.

h) Avaliação dos Lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63 : a viabilidade dos lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63 foi avaliada por meio de contagem do número de unidades formadoras de colónia (UFC) . O número de UFC foi determinado como segue: uma ou mais alíquotas do lote congelado a -80°C foram descongeladas e realizadas várias diluições sucessivas (lxlO ² , lxlO ⁴ , lxlO ⁵ e lxlO ⁶ ) . Em seguida as diluições lxlO ⁵ e lxlO ⁶ foram plaqueadas em meio MB7H10/OADC mais kanamicina (20 pg/mL) e incubadas a 37°C. Após 3-4 semanas fez -se a contagem do número de colónias na placa.

i) Caracterização da expressão de LTK63 em BCG recombinante

Uma vez que não foi possível determinar a expressão do gene LTK63 pelo método clássico de imunoensaio, a caracterização da expressão LTK63 foi realizada de maneira indireta pela confirmação da presença do gene LTK63 no plasmídeo dentro do BGC recombinante . Essa caracterização foi realizada através de ensaio de PCR utilizando iniciadores específicos, os mesmos já descritos acima e utilizados para amplificar e clonar o gene LTK63 no vetor pMIP12 (Figura 1) .

j) Caracterização da expressão LTAK63 em BCG recombinante

Para verificação da expressão do gene LTAK63, foi utilizado um imunoensaio (Western blot) , usando um soro policlonal anti-LT, procedendo-se da seguinte maneira: uma ou mais alíquotas estoques de rBCG-LTAK63 foram sonicadas por 1,5 min sob gelo numa amplitude constante correspondente a metade do valor máximo (Soniprep 150 MSE, UK) e centrifugadas para precipitação de sólidos. Os sobrenadantes foram recuperados e a concentração de proteínas dosada usando o kit BIO-RAD Protein Assay (Bio- Rad) , utilizando albumina bovina como padrão. Amostras contendo 10 pg de proteínas totais foram aplicadas em gel de poliacrilamida 10% em presença de duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE 10%) . A eletroforese foi realizada à temperatura ambiente a 120 V até o corante atingir o final do gel. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de PDVF com poros de 0,45 μπι (GE Healthcare), utilizando-se um sistema de transferência semi-seco. O gel contendo LT, como controle positivo, foi colado sob a membrana de PDVF, mergulhado em tampão de transferência (Tris 0,25 M, pH 8,3, glicina 0,129 M e metanol 20 %) e colocados entre cinco folhas de filtro também embebidos no mesmo tampão. O conjunto foi colocado entre duas placas e submetido a uma corrente de 120 mA por 1,5 h a temperatura ambiente. Ao final da eletrotransferência, a membrana foi retirada do sistema e incubada em solução bloqueadora (PBS contendo leite 5% - PBS-L) a 4°C, durante toda noite. Ao término do bloqueio, a membrana foi incubada a temperatura ambiente por 2 h com soro anti-LT diluído em PBS-L (diluição 1:1000). Após este período de incubação a membrana de PVDF foi lavada três vezes, sob leve agitação, com PBS/Tween20 0,1% (PBS-T) , em intervalos de 10 min. A membrana foi então incubada por 2 h nas mesmas condições em PBS-L contendo anticorpo anti-IgG conjugado a HRP (Sigma, Chem Co, St. Luis) e novamente lavada 3 vezes com PBS-T. A revelação foi feita por quimiluminescência usando o kit ECL (Amersham) por exposição em aparelho de fotodocumentação (ImageQuant LAS4000 - GE) (Figura 2) .

EXEMPLO 2 : Ensaio de resposta imunológica humoral e celular dos animais imunizados com rBCG-LTK63.

Foram utilizados camundongos das linhagens BALB/c (Mus musculus, Rodentia, Mammalia) , fêmeas, adultas, com 6 a 8 semanas de vida, provenientes e mantidos nas condições padrões do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Os animais foram divididos em quatro grupos (n=30) : •Grupo BCG: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de BCG (lxlO ⁶ UFC/camundongo suspensas em PBS IX) ;

•Grupo rBCG-LTK63: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de rBCG-LTK63 (lxlO ⁶ UFC/camundongo suspensas em PBS IX) ;

•Grupo rBCG-LTKA63: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de rBCG-LTAK63 (lxlO ⁶ UFC/camundongo suspensas em PBS IX) ; Grupo Controle: animais inoculados com 0,1 mL de salina (PBS IX).

a) Resposta humoral: para tal procedimento, os animais imunizados ou inoculados com o controle, com BCG ou rBCG-LT (Figura 3) ou com BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 4), foram sangrados pela via retro-orbital um dia antes do desafio e o soro separado e aliquotado para posterior caracterização pelo método de ELISA. Os isótipos foram determinados em soros isolados um dia antes do desafio contra MTB ou 90 dias após imunização. Os soros de 5 animais por grupo foram analisados individualmente por ELISA, usando anticorpos específicos anti IgGl e IgG2a de camundongo. A análise da resposta humoral foi realizada comparando a concentração dos anticorpos e/ou subtipos IgGl e IgG2a específicos contra PDS nos diferentes grupos de imunização. Para tal foi utilizada a curva padrão desses anticorpos detectados por anticorpos monoclonais específicos contra as respectivas imunoglobulinas . A análise comparativa da resposta de anticorpos IgGl e IgG2a induzida contra proteínas de micobactérias (PDS) é importante, uma vez que pode fornecer dados sobre o perfil ou comportamento da resposta imune contra essas proteínas. Destacando que um perfil de resposta mais Thl e, portanto mais adequado para combater uma infecção por MTB, pode ser identificado através da relação IgGl/IgG2a (Figuras 3 e 4. b) Resposta celular de rBCG-LTK63: a avaliação da resposta celular dos grupos Salina, BC6 e rBCG-LTK63 foi feita pelos métodos de ELISA e ELISPOT. Inicialmente os baços dos camundongos imunizados como descrito acima, foram removidos 30 dias após a primeira e única imunização, macerados e passados por peneiras com porosidade de 70 μπι (Celi strainer-ΒΌ Falcon, Bedford, MA) . Os esplenócitos , assim obtidos, de cada grupo (Salina, BCG e rBCG-LTK63 ) foram contados em câmara de Neubauer e tiveram sua viabilidade avaliada através da coloração de azul de Trypan. Procedeu- se, então, à diluição celular era meio RPMI completo [RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies) , penicilina (100 U/ml) , estreptomicina (100 μg/ml) mais 10% de soro fetal bovino] , na concentração de 2x10 ^s células/mL no ensaio de ELISA e lxlO ⁵ células/mL no ensaio de ELISPOT, seguida de semeadura em placa de cultura celular de 24 poços sob o estimulo de PDS (2 pg/mL) e incubadas por 24 horas e 48 horas, respectivamente, a 37°C com atmosfera de C0 ₂ a 5%. No grupo tratado com rBCG-LTK63 observou-se um aumento significativo nos níveis de INF-γ e TNF-α em relação ao grupo BCG. Fato este, que sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl (Figuras 5 e 6) .

c) Resposta celular de rBCG-LTAK63: a avaliação da resposta celular dos grupos Salina, BCG e rBCG-LTAK63 foi feita pelos métodos de ELISA e Citometria de Fluxo (FACS) . Inicialmente os baços dos camundongos imunizados como descrito acima, foram removidos 60 dias após a primeira e única imunização, macerados em homogenizadores de tecidos do tipo Pyrex (Fischer Scientific - USA) e recuperados os esplenócitos. Os esplenócitos, assim obtidos de cada grupo (Salina, BCG e rBCG-LTA 63) , foram contados em câmara de Neubauer e tiveram sua viabilidade avaliada através da coloração de azul de Trypan. Procedeu-se, então, à diluição celular em meio RPMI completo [RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies) , penicilina (100 U/ml) , estreptomicina (100 g/ml) mais 10% de soro fetal bovino] , na concentração de 2xl0 ⁶ células/mL para os ensaios de ELISA e FACS . No ensaio de ELISA as células foram semeadas em placa de cultura celular de 24 poços sob o estímulo de PDS (2 pg/mL) e incubadas por 48 horas, a 37°C com atmosfera de C0 ₂ a 5%. No ensaio de FACS, um volume de 500 pL de células foi semeado em placa de 96 poços sob o estímulo de PDS (5 pg/mL) e incubadas por 5 horas a 37°C com atmosfera de C0 ₂ a 5%. Cada amostra foi aliquotada e marcada em três diferentes tubos (200 μΐ/tubo) seguindo protocolo de permeabilização intracelular e marcação para analisar separadamente a expressão intracelular de INF-γ e TNF-a dentro da subpopulação de células T CD4 ⁺ . Foi utilizado protocolo padrão fornecido pelo fabricante para a marcação de superfície (anti-CD4-PerCP, BD Pharmingen, San Diego, CA. USA) e para marcação intracelular os anticorpos monoclonais (mAb) anti-IFN-γ (clone 4S.B3; BD Pharmingen, San Diego, C.A., USA) e anti- TNF-α (clone MAbll; BD Pharmingen, San Diego, C.A., USA) . No grupo tratado com rBCG-LTAK63 observou-se um aumento significativo nos níveis de INF-γ e TNF-α em relação ao grupo BCG, tanto nos ensaios de ELISA como no de citometria de fluxo. Fato este, que sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl (Figuras 7 e 8, ELISA; Figuras .9 e 10, FACS).

EXEMPLO 3 : Desenvolvimento do modelo animal de desafio contra tuberculose -Ensaios de proteção contra um desafio intra- raqueal com a cepa de M. tubérculosis H37Rv.

Foram utilizados camundongos das linhagens C57BL/6 ou

BALB/c {Mus musculus , Rodentia, Mammalia) , fêmeas, adultas, com 6 a 8 semanas de vida, provenientes e mantidos nas condições padrões do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Utilizou-se para os ensaios de desafio a cepa de Mycobacterium tuberculosis (MTB) 37HRv, a qual foi cultivada em meio líquido MB7H9/Tw/ADC em estufa a 37°C e 5% de C0 ₂ . A suspensão bacilar de MTB foi cultivada em meio 7H9/Tw/ADC por duas semanas e somente suspensões com no mínimo de 80% de bacilos viáveis foram usados para o desafio pela via intratraqueal . 0 cultivo bacilar foi centrifugado a 4000 rpm e lavados duas vezes com igual volume do cultivo com PBS IX. Em seguida o sedimento foi ressuspendido em 1 mL de PBS IX e o número de bacilo estimado usando a escala de Macfarland.

O desafio intratraqueal seguiu o método previamente descrito [Pelizon et al. (2010) Neonatal BCG immunization followed by DNAhsp65 boosters: highly immunogenic but not protective against tuberculosis - a paradoxical effect of the vector? Scand J Immunol . 71: 63-69. Os camundongos foram infectados com lxlO ⁵ UFC de MTB viáveis ou inoculados com 100 L de PBS (Tampão Fosfato Salina) intratraquealmente sob anestesia (200 pL de uma mistura de Quetamina/Xilazina)

Os animais foram acompanhados por quatro semanas. Após este período todos foram sacrificados em câmera de C0 ₂ e os pulmões retirados para serem processados . Um dos lóbulos de cada pulmão foi separado e macerado num volume total de 1 mL de solução de PBS IX. Em seguida esse material foi diluído serialmente e semeado em placas de petri contendo meio sólido 7H10/OADC. Trinta dias depois, o número de UFC foi determinado nas placas correspondentes a cada grupo de animais imunizados (Figura 11) .