Campo de aplicação

[001] A presente invenção está relacionada ao campo de produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em P/c/í/a pastoris. Mais especificamente, a invenção descreve a produção de proteína Sm14 do Schistosoma mansoni em forma recombinante, onde foi criado um gene sintético para alta expressão desta proteína, gene este que foi clonado sob controle de dois tipos de promotores de Pbhia pastoris: promotor induzível por metanol (AOX1) e promotor constitutivo (GAP). Com estas construções foram manipuladas geneticamente cepas de Pichia pastoris para produzir, eficazmente, o antígeno vacinai Sm14. Também foram aperfeiçoados os processos para produzir e purificar esta proteína a partir de células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial.

Fundamentos da invenção

[002] A proteína Sm14 que tem um peso molecular aproximado de 14,8 kDa e pertence a família de proteínas que se ligam a ácidos graxos (Fatty Acid Binding Proteins, FABP), já foi amplamente estudada e descrita pelo depositante em seus pedidos de patente anteriores relacionados a essa matéria técnica.

[003] A estrutura tridimensional da proteína Sm14 foi prevista através de modelagem molecular por homologia computadorizada assim como por cristalografia e Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura da proteína Sm14 permitiu a identificação dos epítopos protetores em potencial e, possibilitou o uso do rSm14 como antígeno de vacinação. Esta estrutura, assim como os modelos construídos para as proteínas homólogas de Fasciofa hepática (sendo a FABP tipo 3 a que compartilha maior identidade sequencial, 49%) mostram que estas moléculas adotam configurações tridimensionais típicas dos membros da família FABPs). A proteína Sm14 foi a primeira FABP de parasitas a ser caracterizada. Dados da literatura científica apontam as FABPs de parasitas como alvos importantes para o desenvolvimento de drogas e vacinas contra estes agentes infecciosos. [004] Assim, com base em todo o estado da arte de conhecimento dos inventores, será demonstrada aqui a capacidade que as formas recombinantes da proteína Sm14 têm de conferir uma alta proteção contra infecções causadas por helmintos supostamente patogênicos em relação a humanos e animais.

[005] Nos trabalhos que mostraram pela primeira vez a atividade protetora da proteína Sm14, a proteína recombinante correspondente era expressa com o vetor pGEMEX-Sm14, em forma de corpúsculos de inclusão. Após o isolamento e lavagem dos corpúsculos, a proteína era purificada através de eletròforese preparativa por eletroeluição da banda correspondente (Tendler et a/., 1996). Essa metodologia, entretanto, não era adequada para produção da proteína em escala maior. Posteriormente, a proteína Sm14 passou a ser produzida com uma fusão de seis histidinas consecutivas (6xHis) no extremo amino terminal no sistema de expressão de Escherichia cafí, na forma de corpúsculos de inclusão. Após a obtenção e solubilização dos corpúsculos era necessário fazer o re- enoveíamento (refoíding), para obter uma proteína imunologicamente ativa (Ramos et a/., 2001).

[006] O pedido de patente brasileiro PI 1005855-9 (correspondente às patente US9.193.772 e US9.475.838) está relacionado à obtenção de um gene sintético para a expressão da proteína Sm14. A transformação genética de Pichia pastoris com este gene sintético sob controle do promotor AOX1 permite produzir e purificar a proteína Sm 14. A obtenção da proteína Sm14 é alcançada a partir do um gene sintético, contendo códons otimizados para a alta expressão em Pichia pastoris.

[007] Entretanto, verifica-se que apesar de todo o conhecimento adquirido pelos inventores, ainda existem desvantagens a serem superadas para a obtenção de um material antigênico que possa ser obtido com alto rendimento, em escala industrial em condições de GMP, e que não perca a característica de estabilidade.

Sumário da Invenção

[008] A presente invenção propõe uma plataforma produtora de antígeno vacinai Sm14 recombinante para helmintos em Pichia pastoris. Através da referida plataforma é possível alcançar uma vacina recombinante para helmintos (em P. pastoris), incluindo os processos de produção e purificação da proteína Sml4 desenvolvida no sistema de Pichia pastoris.

[010] A invenção propõe ainda um gene sintético para a expressão da proteína Sm14. A transformação genética de Pichia pastoris com este gene sintético sob controle dos promotores AOXI e GAP permite produzir e purificar a proteína Sml4.

[011] Assim, a invenção permite a obtenção da proteína Sm14 a partir de um gene sintético contendo códons otimizados para a alta expressão em Pichia pastoris, SEQ ID NO:3 (sequencia final do gene), assim como os procedimentos de purificação da proteína Sm14.

Breve Descrição das Figuras

[012] A Figura 1 mostra a estratégia para a construção dos plasmídeos pPiC9K-Sm14-MVe pGAP9K-Sm14-MV.

[013] A Figura 2 mostra a indução da expressão da proteína Sm14 em P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.

[014] A Figura 3 mostra a expressão da proteína Sm14 em P. pastoris GSI15/pGAP9K-Sm14-MV.

[015] A Figura 4 mostra o resultado da indução da expressão da proteína Sm14 na cultura em fermentador P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.

[016] A Figura 5 mostra a análise por westem blotúa proteína purificada de P. pastoris.

[017] A Figura 6 mostra o espectro de dicroísmo circular da proteína Sm14 purificada de P. pastoris.

Descrição Detalhada da Invenção

[018] O objetivo principal da presente invenção, qual seja, produzir uma vacina recombinante para helmintos, é alcançável através da produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em Pichia pastoris. De acordo com a invenção foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína Sm14 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de Pichia pastoris para produzir a vacina de forma eficaz. A presente invenção contempla ainda os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial. [019] A Pichia pastoris é um hospedeiro eficaz para a expressão e secreção de proteínas heterólogas. O principal promotor usado para a expressão neste sistema é o promotor forte e firmemente regulado do gene do álcool oxidase de álcool I (AOX1), induzível por metanoL No entanto, a presente invenção descreve um sistema usando um promotor alternativo para evitar o uso de metanol. O promotor do gene da enzima gliceraldeido 3 fosfato desidrogenase (pGAP) foi usado na presente invenção para a expressão constitutiva da proteína heteróloga, já que este sistema é mais adequado para a produção em grande escala devido a que se elimina o risco e custo associados com o armazenamento e fornecimento de grande volume de metanol.

[020] A invenção será agora descrita através de sua melhor forma de realização. A matéria técnica do pedido de patente PI 1005855-9 que reflete o estado da arte mais próximo da presente invenção será aqui anexada para fins de referência.

1. OBTENÇÃO DA CEPA RECOMBiNANTE DE PICHIA PASTORIS

1.1 Gene sintético para a expressão da proteína sm14 em P. pastoris:

[021] Num primeiro passo foi desenhado e sintetizado um gene contendo códons otimizados para se obter máxima expressão da proteína Sm14 em P. pastoris. No presente caso foi utilizada a proteína Sm14-MV, entretanto pode ser utilizada qualquer forma da proteína Sm14.

[022] Na literatura existe evidência sobre o uso diferencial de códons entre proteínas expressas em pouca quantidade e em alta quantidade, num mesmo organismo (Roymondal and Sahoo, 2009). Porém, as tabelas de uso de códons disponíveis em bases de dados (por exemplo: (www.kazusa.or.jp/codon) contém dados de todas as proteínas do organismo, sem levar em consideração o nível de expressão gênica. Por este motivo, para o desenho do gene, inicialmente foi elaborada uma tabela de uso de códons tendo como base de dados de sequencias que codificam as proteínas recombinantes expressas acima de 1 grama por Litro de cultura em P. pastoris (ver tabela 1 ), assim como a sequencia da proteína AOX1 (que represente 30% da proteína total da P. pastoris, após a indução com metanol). Tabela 1: Lista de proteínas recombinantes com alta expressão em P. pastoris.

£023] Para o desenho do gene foi escolhida a sequencia da proteína Sm14-MV, que tem um resíduo de valina na posição 62 - no lugar da cisteína, que a torna mais estável (Ramos et al., 2009), aqui representada como SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO:1

MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QI6NTVTPTV TFTMDGDKMT MLTESTFKNL SVTFKFGEEF DEKTSDGRNV KSWEKNSES KLTQTQVDPK NTTVIVREVD GDTMKTTVTV GDVTAIRNYK RLS [024] Após uma primeira seleção dos códons segundo a tabela criada com os dados das proteínas da Tabela 1 , foi realizada uma depuração de sequencias que resultaram em sítios de terminação de transcrição (ATTTA) doadores e receptores crípticos de splicing (MAGGTRAGT e YYYNTAGC, respectivamente) e sequencias repetitivas (sítios de corte para as enzimas de restrição BamHI e EcoRf). A SEQ ID NO:2 mostra a sequencia desenhada para expressar a proteína Sm14-MV em Pichia pastoris.

SEQ ID NO-.2

1 ATGTCTTCTT TCTTGGGTAA GTGGAAGTTG TCTGAATCTC ACAACTTCGA 51

CGCTGTTATG TCTAAGTTGG GTGTTTCTTG GGCTACCAGA CAAATTGGTA

101

ACACCGTTAC TCCAACCGTT ACCTTCACCA TGGACGGTGA CAAGATGACT 151

ATGTTGACCG AGTCTACCTT CAAGAACTTG TCTGTTACTT TCAAGTTCGG

201

TGAAGAGTTC GACGAAAAGA CTTCTGACGG TAGAAACGTT AAGTCTGTTG

251

TTGAAAAGAA CTCTGAATCT AAGTTGACTC AAACTCAAGT TGACCCAAAG

301

AACACTACCG TTATCGTTAG AGAAGTTGAC GGTGACACTA TGAAGACTAC

351

TGTTACCGTT GGTGACGTTA CCGCTATCAG AAACTACAAG AGATTGTCTT

401

AA

[025] Na extremidade 5' da sequencia desenhada foi adicionada a sequencia Kozak do gene da proteína AOX1 de P. pastoris (AAACG). Finalmente foram adicionados os sítios de restrição para BamnHI (GGATCC) e EcoRI (GAATTC) nas extremidades 5' e 3' do gene desenhado, respectivamente.

[026] A SEQ ID NO:3 mostra a sequencia final do gene sintético para a produção da proteína Sm14. SEQ ID NO:3

1 GGATCCAAAC GATGTCTTCT TTCTTGGGTA AGTGGAAGTT GTCTGAATCT 51

CACAACTTCG ACGCTGTTAT GTCTAAGTTG GGTGTTTCTT GGGCTACCAG

101

ACAAATTGGT AACACCGTTA CTCCAACCGT TACCTTCACC ATGGACGGTG

151

ACAAGATGAC TATGTTGACC GAGTCTACCT TCAAGAACTT GTCTGTTACT

201

TTCAAGTTCG GTGAAGAGTT CGACGAAAAG ACTTCTGACG GTAGAAACGT 251

TAAGTCTGTT GTTGAAAAGA ACTCTGAATC TAAGTTGACT CAAACTCAAG

301

TTGACCCAAA GAACACTACC GTTATCGTTA GAGAAGTTGA CGGTGACACT

351

ATGAAGACTA CTGTTACCGT TGGTGACGTT ACCGCTATCA GAAACTACAA

401

GAGATTGTCT TAAGAATTC

[027] Após a síntese da sequencia desenhada (SEQ ID N0:3) foi realizada a clonagem e posterior sequenciamento do gene sintético no vetor pCR2.1 para confirmação da fidelidade da sequencia sintetizada com a sequencia desenhada. 1.2 Construção dos plasmídeos para a expressão da proteína Sm14 em Pichia pastoris:

[028] O gene sintetizado foi clonado no vetor pPIC9K, onde a proteína Sm14 é expressa sem fusão nenhuma, possibilitando sua produção intracelular.

[029] O vetor pPJC9K (Invitrogen) foi escolhido para a construção do plasmídeo de expressão da Sm14 em P. pastoris pelos seguintes motivos: (1) Possibilidade de ser utilizado para expressar proteínas intracelulares substituindo o gene do fator-alfa pelo gene de interesse, a través do sítio de restrição BamHÍ do vetar, situado antes da sequencia Kozak e do início de tradução. Para isso, foi necessário recriar a sequencia Kozak antes do ATG da ORF a ser expressa, como realizado no desenho do gene sintético da Sm14. (2) Possui a vantagem de poder selecionar clones com múltiplas cópias integradas no genoma, pela seleçâo de resistência contra o antibiótico G4I8. Essa possibilidade não existia no pPIC9, usada anteriormente.

[030] A estratégia da construção do plasmídeo pPIC9K-Sm14 esta descrita na Figura 1. Conforme a esta estratégia, o plasmídeo pCR21-Sm14-MV e o vetor pPICSK foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI e EcoRL Após a digestão, os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos correspondentes ao vetor pPIC9K e ao inserto Sm14-MV sintético foram excisados do gel de agarose, purificados e ligados usando a T4 DNA ligase. A cepa DH5a de E. coli, foi transformada com a reação de ligação e os clones foram se!ecionados em meio LB ágar contendo ampicilina. O pDNA de alguns clones resistentes a ampicilina foi purificado e analisado por restrição com as enzimas BamHI e EcoRl, assim como por sequenciamento de DNA. A construção assim obtida foi denominada pPiC9K-Sm14-MV, que expressa a proteína Sm14 sob controle do forte promotor da álcool oxidase 1 (AOXI), que é induzido pelo metanol (Cregg et al, 1993).

{031] Conforme a presente invenção foi usado outro promotor com sucesso na expressão de proteínas recombinantes em Píchia pastoris é o promotor constitutivo do gene da gliceraIdeído-3-fosfato desidrogenase (GAP). Para produção em larga escala de proteínas recombinantes, o sistema de expressão com o promotor GAP baseado é mais adequado que o do promotor AOX1, pois são eliminados os riscos e custos associados ao transporte e o armazenamento de grande volume de metanol (Zhang et al, 2009).

[032] Conforme a estratégia descrita na Figura 1, ó promotor GAP foi amplificado a partir do DNA gnõmico da cepa GS115 de Pichia pastoris, usando os primers GAP-for (SEQ ID NO: 4) e GAP-rev (SEQ ID NO:5), que contêm os sítios de restrição Saci e BamHI, respectivamente.

SEQ ID N0.4

GAGCTCTTTT TTGTAGAAAT GTCTTGG 27 SEQ ID NO:5

GGATCCAAAT AGTTGTTCAA TTGATTGAAA TAGG 34

[033] Com estes ofigonudeotídeos foi amplificado um fragmento de 506 pares de bases correspondentes ao promotor GAP de Ptehia pastoris (SEQ ID NO: 6).

SEQ ID NO:6

GAGCTCTTTT TTGTAGAAAT GTCTTGGTGT CCTCGTCCAA TCAGGTAGCC

50

ATCTCTGAAA TATCTGGCTC CGTTGCAACT CCGAACGACC TGCTGGCAAC 100

GTAAAATTCT CCGGGGTAAA ACTTAAATGT GGAGTAATGG AACCAGAAAC

150

GTCTCTTCCC TTCTCTCTCC TTCCACCGCC CGTTACCGTC CCTAGGAAAT

200

TTTACTCTGC TGGAGAGCTT CTTCTACGGC CCCCTTGCAG CAATGCTCTT

250

CCCAGCATTA CGTTGCGGGT AAAACGGAGG TCGTGTACCC GACCTAGCAG 300

CCCAGGGATG GAAAAGTCCC GGCCGTCGCT GGCAATAATA GCGGGCGGAC 350

GCATGTCATG AGATTATTGG AAACCACCAG AATCGAATAT AAAAGGCGAA

400

CACCTTTCCC AATTTTGGTT TCTCCTGACC CAAAGACTTT AAATTTAATT

450

TATTTGTCCC TATTTCAATC AATTGAACAA CTATTTTTGA ACAACTATTT

500

GGATCC 506

[034] O DNA do promotor GAP amplificado assim como o plasmídeo pPIC9K-Sm14-MV foram digeridos com as enzimas de restrição Saci e BamHI. Os fragmentos correspondentes ao vetor pPIC9K-SM14-MV e ao inserto GAP foram purificados a partir do gel de agarose, purificados e ligados. A cepa DH50 de E co//, foi transformada com a reaçâo de ligação e os clones foram selecionados em meio LB ágar contendo ampicilina. O pDNA de alguns clones resistentes a ampicilina foi purificado e analisado por restrição com as enzimas BamHI e EcoRI, assim como por sequenciamento de DNA. A construção assim obtida foi denominada pGAP9K-Sm14-MV, que expressa a proteína sob controle do promotor constitutivo pGAP.

1.3 Transformação da P. pastoris com os plasmídeos pPiCSK-Sm14-MV e pGAP9K-Sm14-MV. E seleção de clones recombinante com múltiplas cópias

[035] Para a produção da proteína a cepa GSI15 (his4) de P. pastoris foi transformada com os plasmídeos pPIC9K-Sm14-MV e pGAP9K-$m14-MV, digeridos com a enzimas Saci. Com o DNA digerido e purificado, as células competentes para eletroporação da cepa GSI15 foram transformadas.

[036] Após a transformação, as células foram semeadas no meio RD (meio sem histidina, que contém: 1 M sorbitol; 2% dextrose; 1,34% YNB 4x1 Cr ⁵ % biotina; e 0,005% de cada aminoácido: L-glutamato, L-methionina, L-lisina, L- !eucina, e L-isoleucina para a seleção das cepas transformadas pelo marcador de auxotrofia his4. Os clones que conseguiram crescer no meio sem histidina, foram submetidos à seleção com o antibiótico G418, nas concentrações 0,5; 1; 2 e 4 mg/ml no meio de cultura YPD (1% Extraio de Levedura, 2% Peptona; 2% dextrose) a 30°C.

[037] Para confirmar se os clones selecionados apresentavam o cassete de expressão do gene sintético, o DNA genômico dos clones foi purificado e usado em reações de PCR com os primers AOX5' e AOX3' (para pPIC9K-Sm14- MV) e GAP5' e AOX3' (para pGAP9K-Sm14-MV).

1.4 Expressão em cultivo em shaker

[038] Para testar a expressão da proteína Sm14 nos clones de P. pastoris/pPlC9K-Sm14-MV, os clones foram crescidos em shaker em 5ml do meio BMG (Buffered Minimal Glycerol mediumn, contendo: 1,34% YNB; 0,04% biotina, 0,1 M fosfato de potássio pH 6,0; e 1% glicerol) a 30°C por 48 horas e depois transferidos ao meio BMM, 5ml, (Buffered Minimal Methanol médium, contendo os mesmos componentes que o meio BMG, porém o glicerol foi substituído por 0,5% de metanol), para a indução da expressão da proteína recombinante. Após 72 horas, adicionando 0,5% de metanol cada 24 horas, as proteínas totais de cada clone foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 2). A

Figura 2 mostra o resultado da indução da expressão da proteína Sm14 nos clones P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.

M.- Low Molecular Weight Marker (Marcador de baixo peso molecular)

Sm14.- Controle da proteína Sm14 sem fusão purificada de £ coli

1 a 8.- Proteína total dos clones 1 - 17 GSl15/pPIC9KSm14-MV apos a indução com metanol.

[039] Para testar a expressão da proteína Sm14 nos clones de P. pastoris/pGAP9K-Sm14-MV, os clones foram crescidos em 5 ml do meio BMG por apenas 72 horas. A Figura 3 mostra o resultado da expressão da proteína Sm14 nos clones P. pastoris GS115/pGAP9K-Sm14MV.

M.- Low Molecular Weight Marker (Marcador de baixo peso molecular)

1 a 6.- Proteína total dos clones 1 - 17 GSI15/pGAP9KSm14-MV após 3 dias de cultura no meio BMG.

Sm14.- Controle da proteína Sm14 sem fusão purificada de £ coli.

[040] Em todos os clones selecionados foi possível observar uma banda majoritária que coincide com o tamanho da proteína Sm14 sem fusão, purificada de E. coli

1,5 Expressão da Sml4 recombinante em P. pastoris GS115/ pPIC9K-Sm14- MV em fermentador.

[041] A fermentação foi realizada com una cultura de 5 Litros num fermentador com control automatioo de ajustes de alimentação, pH, antiespumante. O meio de fermentação usado fué Basal Salt Médium (BSM) suplementador com a solução de sais de mateis (trace elements) e biotina.

[042] Para preparação do inoculo, uma ampola do banco de trabalho da cepa Pichia pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV foi usada para inocular o meio YDP e cultivado em shaker por 18 horas a 220 rpm a 30°C. Em seguida, as células sâo inoculadas em médio BSM suplumentado com glicerol, cultivado em shaker por 18 horas antes de inocular o fermentador. [043] A primeira fase da fermentação (Glicerol fed batch: O glicerol fed batch) se inicia alimentando a cultura com 50% glicerol contendo trace elements (12%). A temperatura e pH foram mantidos a 30°C e 5,00, respectivamente e a aeração em 1,0 WM.

[044] A indução foi indiciada alimentando o fermentador com 100% de metanol, contendo trace elements (12%): Apos o período de adaptação, o metanol foi adionado segundo o comportamento do oxigénio dissolvido.

[045] A Figura 5 mostra a indução da expressão da proteína Sm14 em P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV, em fermentador, onde:

M.- Low Molecular Weight Marker (Marcador de baixo peso molecular)

1-7.- Indução da expressão por 24, 48, 72 e 96, 120, 144 e 168 horas, respectivamente.

Sm14.- Controle da proteína Sm14 sem fusão purificada de E. co//

[046] Desta forma, foi comprovada a indução especifica da proteína recombinante correspondente a Sm14 em P. pastoris no cultivo em fermentação.

[047] O rendimento atingido de massa celular úmida de 170 g por litro e rendimento estivado da Sm14 é de aproximadamente 1g de proteína por litro de cultura. Mudando as condições de fermentação é possível superar o rendimento de massa celular e, correspondentemente o rendimento obtido da proteína Sm14.

[048] Mesmo assim, o valor obtido já corresponde a um alto nível de expressão da proteína Sm14, que compõe a proteína majoritária das células após a indução com metanol.

2. PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA SM14 RECOMBINANTE EXPRESSA NA CEPA P. pastoris GSM 5/pPIC9K-Sm14-MV

[049] O protocolo de purificação da proteína Sm14 recombinante a partir do citoplasma de P. pastoris foi baseado na metodologia desenvolvida no Laboratório de Esquistossomose Experimental do Instituto Oswaldo Cruz (fOC) para a purificação da Sm14 sem fusão no sistema de E. co/í.

[050] Lise: A purificação da proteína recombinante se inicia com a lise das células de P. pastoris. Para isso, as células são ressuspendidas 30mM Tris-HCl 30mM pH 9,5 e lisadas por pressão a 1500 Bar. O lisado é clarificado por centrifugação. f051] Condicionamento: 0 lisado clarificado é submetido a filtração tangencial na membrana de 100 kDa para remoções de proteínas alto pesso molecular, seguido concentração e diafiltração na membrana de 3 kDa com o tampão 30mM Tris-HCI 30mM pH 9,5, ate que a condutividade corresponda ao valor do tampão.

[052] Captura: O lisado clarificado é carregado na resina Q-Sepharose XL (GE Healthcare) equilibrada com o tampão A (30 mM Tris-HCi pH 9,5). Depois, a coluna é lavada com tampão A. e a proteína é eluída com tampão B (30 mM Tris-HCI pH 8,0) onde a proteína Sm14 elui com alto grau de pureza.

[053] Polimento: A proteína eluída da resina Q-sepharose XL apresenta poucas proteínas contaminantes. Para separar estas proteínas da proteína Smn14, foi usada a gel-filtração na resina Sephacryl S100 HR (GE Healthcare) usando PBS pH 7,4 como fase móvel.

4. ANÁLISE DA PROTEÍNA Sm14 BECOMBINANTE PRODUZIDA EM Pichía pastoris

[054] A proteína recombinante foi purificada de Pichia pastoris, usando as mesmas características físico-químicas que a proteína Sm14-MV sem fusão expressa em E. coll A proteína purificada desta forma de P. pastoris corresponde em tamanho com a proteína induzida especificamente pelo metanol. Sendo que no cassete de expressão temos o gene sintético da proteína Sm14-MV sob controle do promotor AOX1 , deduzimos que a proteína expressa e purificada de P. pastoris é a proteína Sm14-MV.

[055] Para comprovar esta afirmação, a proteína purificada de P. pastoris foi analisada por wesfem blot, usando soro anti-Sm14 de coelho (Figura 6). A Figura 6 representa a análise por wesfem blot da proteína purificada de P. pastoris.

1 e 2·- Proteína Sm14-MV purificada de P. pastoris

3.- Controle positivo proteína Sm14 sem fusão purificada de E. coli

[056] Neste experimento foi possível observar que os anticorpos anti- Sm14 reconheceram especificamente a proteína purificada de P. pastoris (o soro dos coelhos não reconhece proteínas endógenas de P pastoris, dados não mostrados), confirmando de esta forma sua identidade. [057] Por fim foi necessário identificar se a proteína purificada de P. pastoris possui estrutura correspondente ao enovelamento beta, característico das proteínas da família das FattyAcsd Binding Protein, à qual a Sml4 pertence. Para isso, as amostras de proteínas foram analisadas por dicroísmo circular, usando o espectrofotopolarímetro J-815 (JASCO) (Figura 7). A Figura 9 mostra o espectro de dicroísmo circular da proteína Sm14 purificada de P. pastoris.

[058] Como se observa na Figura 7, o espectro corresponde a uma proteína com estrutura beta. Este espectro foi semelhante a os espectros de dicroísmo circular de lotes da proteína Sm14 purificados anteriormente de E. coli em laboratório.

[059] Assim, a partir do relato acima podemos concluir que a presente invenção permite:

- desenhar e sintetizar um gene sintético para a alta expressão da proteína Sml4-MV em Pichia pastoris;

- construir plasmídeos de expressão pPIC9K-Sm14-MV e pGAP9K-$m14- MV que contém a sequencia do gene sintético sob controle do promotor AOX1 e GAP, respectivamente;

- obter cepas de P. pastoris produtoras da proteína Sm 14; e,

- purificar a proteína Sm14 em duas etapas cromatográficas, factíveis de escalonamento para sua produção industrial.

[060] Através do processo da presente invenção foi possível construir oq plasmídeos pPiC9K-Sm14-MV e pGAP9K-Sm!4MV para a expressão constitutiva da proteína Sm14 em Pichia pastoris e selecionar os clones produtores a partir da transformação da cepa GS115 com o plasmídeo pGAP9K- Sm14MV. Uma das vantagens da invenção é que as cepas produzem a proteína em menor tempo do que o sistema com indução com metanol em forma constitutiva. Além disso, a nova cepa simplifica o processo fermentativo para a produção da proteína Sm14.

[061] Portanto, a presente invenção aqui descrita mostra que a proteína Sm14 confere proteção contra a infecção por Schistosoma mansoni em camundongos, nas plataformas E. coli e P. pastoris.

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