L’ACIDE FERULIQUE

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un micro-organisme recombinant, de préférence une levure recombinante, capable de produire de l’acide caféique comprenant un gène hétérologue codant pour une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate. Ledit micro-organisme, de préférence ladite levure recombinante, peut également être capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu. La présente invention concerne également une méthode de production d’acide caféique et une méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique, à l’aide des micro organismes, de préférences des levures, selon l’invention. Enfin, l’invention concerne également l’utilisation des micro-organismes, de préférence des levures, selon l’invention pour produire de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique.

ETAT DE LA TECHNIQUE

L’acide férulique est un acide organique hydroxycinnamique présent dans de nombreuses plantes, et participant à la synthèse de la lignine. Cette molécule est utilisée dans de nombreuses applications. Dans le domaine cosmétique et thérapeutique, l’acide férulique est connu pour ses propriétés antioxydantes car réagissant avec les radicaux libres tels que les dérivés réactifs de l'oxygène. Des recherches sont également effectuées sur des applications dans la maladie d’Alzheimer, dans les maladies cardiovasculaires, dans le diabète, dans l’athérosclérose, dans les maladies coronariennes dans les pathologies inflammatoires ou encore dans les cancers. En dehors de ces applications en santé humaine, l’acide férulique est également utilisé en alimentaire pour ses propriétés antimicrobiennes de conservation, et en tant que précurseur dans la fabrication de la vanilline, un aromatisant souvent utilisé à la place de l'extrait naturel de vanille. La production d’acide férulique est ainsi un besoin ne cessant de croître, à mesure de la caractérisation de ses propriétés.

L’acide caféique est un précurseur de l’acide férulique, qui est synthétisé dans les plantes en tant également qu’intermédiaire de la synthèse de la lignine. Cette molécule est principalement utilisée pour ses propriétés anti-inflammatoires, antivirales, anti-cancéreuse et antioxydantes. Aujourd’hui, l’acide férulique est principalement récupéré par hydrolyse chimique de biomasses lignocellulosiques. Le rendement d’extraction de ce procédé est cependant relativement faible et entraîne par conséquent un coût de production de l’acide férulique au kilogramme particulièrement important.

La production d’acide férulique a de fait été envisagée chez Escherichia coli, mais bien que les taux de production des intermédiaires de la voie soient élevés, le rendement final de production d’acide férulique reste limité (Kang S. -Y. , Choi O., Lee K. J., Hwang B. Y., Uhm T. -B., Hong Y.S. 2012. Artificial biosynthesis of phenylpropanoic acids in a tyrosine overproducing Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories 11 :153.).

L'extraction de l'acide caféique est également réalisée à partir de matières végétales, ce qui de la même façon que pour l’acide férulique entraîne un faible rendement et des coûts de production élevée.

Une voie de production de l’acide caféique a été décrite chez la levure (Liu L., Liu H., Zhang W., Yao M., Li B., Liu D., Yuan Y. 2019. Engineering the biosynthesis of caffeic Acid in Saccharomyces cerevisiae with heterologous enzyme combinations. Enginneering 5 : 287- 295). Elle consiste en la conversion directe de l’acide p-coumarique en acide caféique via une unique étape d’hydroxylation. Cependant, les hydroxylases utilisées lors de ces études, SAM5 (Zhang H., Stephanopoulos G. 2012. Engineering E. coli for caffeic acid biosynthesis from renewable sugars. Applied Microbiology and Biotechnology 97:3333-3341 ), COUM3H, HpaBC (Furuya T. & Kino K. 2014. Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid dérivatives. Appl Microbiol Biotechnol 98:1145-1154.) et Cyp199A2 (Furuya T. & Kino K. 2014. Catalytic activity of the two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa toward cinnamic acid dérivatives. Appl Microbiol Biotechnol 98:1145-1154), sont relativement peu efficaces chez la levure, présageant un faible rendement de production.

Ainsi, il subsiste le besoin d’améliorer les rendements de production d’acide caféique et d’acide férulique, tout en baissant les coûts de sa production.

Le concept inventif général commun à cette invention est une nouvelle méthode de synthèse de ces molécules en passant par une voie métabolique alternative ayant pour intermédiaire principal le caféoyl-shikimate dans un même micro-organisme, de préférence une même levure, recombinant. De manière surprenante, la Demanderesse a découvert qu’un micro-organisme recombinant, de préférence une levure recombinante, comprenant des gènes provenant de plantes, et plus particulièrement issus de la voie de biosynthèse de la lignine, permettait de produire de l’acide caféique et de l’acide férulique à partir notamment de glucose, permettant d’augmenter les rendements de production de ces composés et d’en baisser le coût.

EXPOSE DE L'INVENTION

Selon un premier aspect, l’invention consiste en un micro-organisme recombinant, de préférence une levure recombinante, capable de produire de l’acide caféique, comprenant

- Un gène hétérologue codant pour une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate.

On entend par micro-organisme un organisme vivant de taille microscopique, notamment les bactéries ou champignons unicellulaires telles que les levures, ou toutes cellules procaryotes ou eucaryotes.

Par « micro-organisme recombinant » est entendu selon l’invention un microorganisme qui a été modifiée génétiquement par l’introduction et optionnellement la modulation de l’expression et/ou le blocage et/ou l’inactivation de gènes.

Les levures sont des micro-organismes eucaryotes unicellulaires du règne fongique.

Par « levure recombinante » est entendu selon l’invention une levure qui a été modifiée génétiquement par l’introduction et optionnellement la modulation de l’expression et/ou le blocage et/ou l’inactivation de gènes.

De manière préférée, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une caféoyl-shikimate estérase (CSE).

La réaction opérée est décrite dans la Figure 1. L’acide caféique est un phénylpropanoïde et un acide-phénol présent chez les plantes, et agissant en tant qu’intermédiaire dans la biosynthèse de la lignine. La formule chimique brute de l’acide caféique est C9H8O4 et sa masse molaire est de 180,16g/mol. La structure chimique de l’acide caféique est :

[Chem 1]

Par « gène hétérologue » est entendu que le gène a été introduit par génie génétique dans la cellule. Il peut y être présent sous forme épisomale ou chromosomique. L’origine du gène peut être différente de la cellule dans laquelle il est introduit. Cependant, le gène peut également provenir de la même espèce que la cellule dans laquelle il est introduit mais il est considéré comme hétérologue en raison de son environnement qui n’est pas naturel. Par exemple, le gène est hétérologue car il est sous le contrôle d’un promoteur autre que son promoteur naturel, il est introduit dans un endroit différent de celui-ci où il est situé naturellement. La cellule hôte peut contenir une copie du gène endogène préalablement à l’introduction du gène hétérologue ou elle peut ne pas contenir de copie endogène. Par ailleurs, la séquence d’acide nucléique peut être hétérologue dans le sens où la séquence codante a été optimisée pour l’expression dans le microorganisme hôte.

Par « produire de l’acide caféique » est entendu l’obtention de ce composé, incluant sa synthèse, grâce au micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, selon l’invention. Par « hydrolase » est entendu une enzyme capable de casser une liaison covalente, de préférence par hydrolyse.

Par « rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate » est entendu la décomposition chimique et enzymatique cassant une liaison covalente de ce composé par voie enzymatique, de préférence par hydrolyse, afin de permettre la production de shikimate et d’acide caféique.

Une caféoyl-shikimate estérase (CSE) est une enzyme capable d’hydrolyser la liaison caféoyl- shikimate. Elle existe par exemple dans la voie de biosynthèse de la lignine (Ha C.M., Escamilla-Trevino L, Yarce J.C.S., Kim H., Ralph J., Chen F., Dixon R. A. 2016. An essential rôle of caffeoyl shikimate esterase in monolignol biosynthesis in Medicago truncatula. Plant J. 86950:363-75 ; et Vanholme R., Cesarino I., Rataj K., Xiao Y., Sundin L., Goeminne G., Kim H., Cross J., Morreel K., Araujo P., Welsh L., Haustraete J., McClellan C., Vanholme B., Ralph J., Simpson G. G., Halpin C., Boerjan W. 2013. Caffeoyl shikimate esterase (CSE) is an enzyme in the lignin biosynthetic pathway in Arabidopsis. Science 341 :1103-6.).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CSE est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase.

Medicago truncatula, ou luzerne tronquée, est une espèce de la famille des Fabaceae, de la sous-famille des Faboideae.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) et présentant une activité caféoyl- shikimate estérase.

Arabidopsis thaliana ou Arabette des dames est une espèce de la famille des Brassicacées.

Selon un mode de réalisation, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une chlorogénique acide estérase (ChlE). Une chlorogénique acide estérase (ChlE) est une enzyme ayant classiquement une activité d'hydrolyse de l'acide chlorogénique, et utilisé ici pour hydrolyser la liaison caféoyl-shikimate et ainsi produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1 :789353-790141 , GenBank, SEQ ID NO. 4) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

Bifidobacterium animalis subsp. Lactis est une espèce de bactérie lactique isolée de matières fécales de poulet, de lapin et de l’homme, ainsi que du lait fermenté.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1 , GenBank, SEQ ID NO. 15) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

Ustilago maydis est un champignon pathogène causant notamment le charbon du maïs.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1 : 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

Lactobacillus johnsonii est une bactérie lactique faisant partie du microbiote vaginal sain.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1 :2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. Salinibacter ruber est une bactérie rouge halophile qui se développe dans un environnement très concentré en sel.

Par « pourcentage d’identité » entre deux séquences de gène au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d’identité entre les deux séquences à comparer est le plus élevé.

De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre :

- Un gène hétérologue codant pour une enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A.

De manière préférée, l’enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A est une 4-coumarate-CoA ligase (4CL).

Par capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A, est entendu selon l’invention qu’à partir de ces deux composés, l’enzyme est capable de produire du coumaroyl-CoA. Cette réaction enzymatique fait intervenir de ATR et peut se réaliser en une ou plusieurs étapes.

Une 4-coumarate-CoA ligase (4CL) est une enzyme qui catalyse la formation de coumaroyl- CoA à partir de l’acide coumarique et du coenzyme A.

De manière préférée selon l’invention le gène hétérologue codant pour une 4CL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote.

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour ladite 4CL est muté afin de diminuer l’affinité de ladite 4CL mutée pour l’acide caféique et d’accroître sa spécificité pour l’acide p-coumarique par rapport au gène parent codant pour une 4CL non mutée.

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10). Populus tomentosa ou peuplier blanc de chine est une espèce de la famille des Salicaceae.

Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa, l’acide aminé :

- à la position 236 est une Alanine (Y236A) ou une Phénylalanine (Y236F) ; et/ou

- à la position 240 est une Alanine (S240A) ; et/ou

- à la position 305 est une Alanine (G305A) ; et/ou

- à la position 329 est une Alanine (G329A)

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1 ).

Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana, l’acide aminé :

- à la position 264 est une Alanine (S264A) ; et/ou

- à la position 329 est une Alanine (G329A) ; et/ou

- à la position 353 est une Alanine (G353A).

Une 4CL n’étant pas spécifique de l’acide p-coumarique et acceptant également comme substrat l’acide caféique, ce dernier libéré par la CSE est susceptible d’être de nouveau converti en caféoyl-CoA par la 4CL. Ces mutations sont réalisées pour pallier ce problème, et diminuer l’affinité de la 4CL pour l’acide caféique tout en améliorant sa spécificité pour l’acide p-coumarique.

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Streptomyces coelicolor (CAB95894.1 , Genbank, SEQ ID NO. 12).

Streptomyces coelicolor est une bactérie Gram positive du sol.

De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre :

- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H). De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre :

- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ).

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre :

- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ).

Une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) est une enzyme de la famille des transférases, qui catalyse la réaction : 4-coumaroyl-CoA + shikimate ^ CoA + 4-coumaroylshikimate.

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une HCT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7).

Une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) est une enzyme impliquée dans la synthèse de la lignine, et qui catalyse la production de caféoyl shikimate à partir de coumaroyl shikimate.

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une C3H est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5).

Une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ) est une oxydoréductase membranaire qui permet le transfert d'électrons du NADPH au cytochrome P450.

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CPR1 est un gène provenant d‘un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Catharanthus roseus (X69791.1 , GenBank, SEQ ID NO. 6).

Catharanthus roseus, ou pervenche de Madagascar, est une plante de la famille des Apocynaceae originaire de Madagascar. Une Tyrosine Amonia Lyase (TAL) est une enzyme qui transforme la tyrosine en acide p- coumarique avec libération d’ammoniac.

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une TAL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Rhodotorula glutinis (KF765779.1 , GenBank, SEQ ID NO. 14).

Rhodotorula glutinis est une levure rose du genre Rhodotorula.

Une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) est une enzyme qui catalyse la transformation de la phénylalanine en acide cinnamique, avec libération d'ammoniac.

Une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H), ou T rans-cinnamate 4-monooxygénase, est une enzyme qui transforme l'acide trans-cinnamique (CA) en acide p-coumarique.

De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre :

- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou

- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent.

De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre l’invalidation pour :

- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010).

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, comprend en outre :

- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou

- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou l’invalidation de :

- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). Par « invalidation » est entendu la suppression ou l’inhibition de l’expression du gène, et ainsi la suppression ou l’inhibition de l’activité de l’enzyme.

Une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04), ou DAHP synthase est une transférase qui intervient à la première étape de la voie du shikimate, et qui catalyse la réaction : phosphoénolpyruvate + D-érythrose-4-phosphate + H20 ^ 3-désoxy-D- arabinoheptulosonate-7-phosphate + phosphate.

Une chorismate mutase (AR07) est une isomérase qui intervient dans la voie du shikimate, et qui est connue pour catalyser une réaction péricyclique. Cette enzyme catalyse la réaction : chorismate ^ préphénate.

AR04 et AR07 sont deux gènes impliqués dans la synthèse de novo des acides aminés aromatiques tels que la phénylalanine et de la tyrosine chez la levure.

De manière préférée, le gène AR04 (NP_009808, GenBank) est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 229 soit une Leucine (K229L).

De manière préférée, le gène AR07 (NP_015385, GenBank) est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 141 soit une Sérine (G141S).

Ces mutations de AR04 et AR07 ont pour effet d’optimiser une production accrue des acides aminés aromatiques chez la levure.

Une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010) est une enzyme impliquée notamment dans la dégradation de la phénylalanine et de la tyrosine chez la levure.

Conjointes, les mutations d’AR04 et AR07 et l’invalidation de AR010 sont réalisées pour optimiser une production accrue des acides aminés aromatiques tels la phénylalanine et la tyrosine.

Selon un mode de réalisation, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est capable de produire de l’acide férulique.

De manière préférée, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, et comprend en outre :

- Un gène hétérologue codant pour une caféoyl-O-méthyl transférase (COMT).

De manière encore plus préférée, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu comprend en outre :

- Un gène codant pour la S-Adénosylméthyltransférase (SAM2).

L’acide férulique est un acide organique hydroxycinnamique présent dans de nombreuses plantes, et participant à la synthèse de la lignine.

La formule chimique brute de l’acide férulique est C ₁₀ H ₁₀ O ₄ et ce composé a une masse molaire de 194,18 g/mol.

La structure chimique de l’acide férulique est : [Chem 2]

Une S-Adénosylméthyltransférase, ou S-adénosylméthionine synthase 2 (SAM2) catalyse la formation de S-adénosylméthionine à partir de méthionine et dATP. La réaction comprend deux étapes catalysées par la même enzyme : la formation de S-adénosylméthionine et de triphosphate et l'hydrolyse ultérieure du triphosphate. Dans le cadre de l’invention, elle permet de transformer la méthionine en S-adenosylméthionine et en S- adenosilhomocysteine, ce qui permet la méthylation de l’acide caféique en acide férulique.

De préférence, le gène de SAM2 est le gène SAM2 de S accharomyces cerevisiae et est une copie de celui compris naturellement (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11 ).

Une caféoyl-O-méthyl Transférase (COMT) est une enzyme qui catalyse la réaction : S- adénosyl-L-méthionine + acide caféique ^ S-adénosyl-L-homocystéine + acide férulique. De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour la COMT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g54160, GenBank, SEQ ID NO. 2).

De manière préférée, ladite levure selon l’invention capable de produire de l’acide férulique comprend en outre l’invalidation du gène codant pour une ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1 ).

Une ferulic acid decarboxylase est une enzyme qui catalyse la décarboxylation d'acides carboxyliques aromatiques tels que l'acide férulique, l'acide p-coumarique ou l'acide cinnamique, produisant les dérivés vinyliques correspondants 4-vinylphénol, 4-vinylguaiacol et styrène, respectivement, qui jouent le rôle des métabolites aromatiques.

De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est une espèce de l’embranchement des Ascomycota, de préférence choisie parmi les genres Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora et/ou Zygosaccharomyces.

De manière préférée selon l’invention, ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, est de l’espèce Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae est une levure eucaryote unicellulaire, se présentant sous forme ovoïdes à arrondies, d’environ 6 à 12 pm de longueur et de 6 à 8 pm de largeur.

Selon un mode de réalisation où l’ensemble des gènes abordés ci-dessus sont respectivement introduits et/ou invalidés, les voies métaboliques de production de l’acide caféique et de l’acide férulique chez la levure selon l’invention sont illustrées en figure 2.

Selon un deuxième aspect, l’invention concerne un procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique, comprenant l’introduction de :

- Un gène hétérologue codant pour une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate. De manière préférée, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une caféoyl-shikimate estérase (CSE).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CSE est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) et présentant une activité caféoyl- shikimate estérase.

Selon un mode de réalisation, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une chlorogénique acide estérase (ChlE).

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1 :789353-790141 , GenBank, SEQ ID NO. 4) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1 , GenBank, SEQ ID NO. 15) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1 : 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1 :2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de :

- Un gène hétérologue codant pour une enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A.

De manière préférée, l’enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A est une 4-coumarate-CoA ligase (4CL).

De manière préférée selon l’invention le gène hétérologue codant pour une 4CL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote.

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une 4CL est muté afin de diminuer l’affinité de ladite 4CL mutée pour l’acide caféique et d’accroître sa spécificité pour l’acide p-coumarique par rapport au gène parent codant pour une 4CL non mutée.

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10).

Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa, l’acide aminé :

- à la position 236 est une Alanine (Y236A) ou une Phénylalanine (Y236F) ; et/ou - à la position 240 est une Alanine (S240A) ; et/ou

- à la position 305 est une Alanine (G305A) ; et/ou

- à la position 329 est une Alanine (G329A)

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1 ).

Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana, l’acide aminé :

- à la position 264 est une Alanine (S264A) ; et/ou

- à la position 329 est une Alanine (G329A) ; et/ou

- à la position 353 est une Alanine (G353A).

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Streptomyces coelicolor (CAB95894.1 , Genbank, SEQ ID NO. 12).

De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de :

- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H).

De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de :

- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ).

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de :

- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et - Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une HCT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une C3H est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CPR1 est un gène provenant d‘un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Catharanthus roseus (X69791.1 , GenBank, SEQ ID NO. 6).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une TAL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Rhodotorula glutinis (KF765779.1 , GenBank, SEQ ID NO. 14).

De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de :

- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou

- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent.

De manière préférée selon l’invention, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’invalidation pour :

- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (AR010). Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide caféique comprend en outre l’introduction de :

- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou

- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou l’invalidation de :

- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10).

De manière préférée, le gène AR04 est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 229 soit une Leucine (K229L).

De manière préférée, le gène AR07 est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 141 soit une Sérine (G141S).

De manière préférée selon l’invention, ladite levure est une espèce de l’embranchement des Ascomycota, de préférence choisie parmi les genres Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora et/ou Zygosaccharomyces.

De manière préférée selon l’invention, ladite levure est de l’espèce Saccharomyces cerevisiae.

Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique.

De manière préférée, l’invention concerne un procédé de modification d’un micro organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, comprenant en outre l’introduction de :

- Un gène hétérologue codant pour la caféoyl-O-méthyl Transférase (COMT).

De manière préférée, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, comprend en outre l’introduction de :

- Un gène codant pour la S-Adénosylméthyltransférase (SAM2). De préférence, le gène de SAM2 est le gène SAM2 de Saccharomyces cerevisiae et est une copie de celui compris naturellement (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11 ).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour la COMT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g54160, GenBank, SEQ ID NO. 2).

De manière préférée, ledit procédé de modification d’un micro-organisme, de préférence une levure, pour produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu selon l’invention comprend en outre l’invalidation du gène codant pour une ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1 ).

Selon un troisième aspect, l’invention concerne une méthode de production d’acide caféique, comprenant une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, tels que définis selon l’invention dans un milieu de culture.

De manière préférée, ladite méthode de production d’acide caféique comprend en outre une étape de : b. Récupération de l’acide caféique obtenu à l’étape a.

Par récupération est entendu selon l’invention le fait d’isoler le composé cible, ici l’acide caféique et/ou l’acide férulique, du reste des autres composés.

Des exemples de méthodes de récupération de l’acide caféique et de l’acide férulique sont décrites dans la littérature, notamment dans Yin Y. et al., « Polydopamine-coated magnetic molecularly imprinted polymer for the sélective solid-phase extraction of cinnamic acid, ferulic acid and caffeic acid from radix scrophulariae sample », J Sep Sci. 2016 Apr;39(8):1480-8, et dans Ning Li. et al., “Séparation and purification of the antioxidant compounds, caffeic acid phenethyl ester and caffeic acid from mushrooms by molecularly imprinted polymer”, Food Chem. 2013 Aug 15; 139(1 -4): 1161 -7.

De manière préférée selon l’invention, l’acide caféique est produit à partir de glucose, d’acide p-coumarique, de p-coumaroyl-shikimate et/ou de caféoyl-shikimate, ajouté dans le milieu de culture avant ou à l’étape a.

De manière encore plus préférée, l’acide caféique est produit à partir de glucose. Selon un quatrième aspect, l’invention concerne une méthode de production d’acide férulique, comprenant une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, tels que définis selon l’invention dans un milieu de culture.

De manière préférée, ladite méthode de production d’acide férulique comprend en outre une étape de : b. Récupération de l’acide férulique obtenu à l’étape a.

Selon un mode de réalisation, ladite méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique, comprend une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, capable de produire de l’acide caféique telles que définis selon l’invention dans un milieu de culture, ou de a’. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu selon l’invention dans un milieu de culture ; l’étape a ou a’ étant de préférence suivie d’une étape de : b. Récupération de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique obtenu à l’étape a. ou a’.

De manière préférée selon l’invention, l’acide férulique est produit à partir de glucose, d’acide p-coumarique, de p-coumaroyl-shikimate et/ou de caféoyl-shikimate, ajouté dans le milieu de culture avant ou à l’étape a ou a’.

De manière préférée, l’acide férulique est produit à partir de glucose.

Selon un cinquième aspect, l’invention concerne une méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique, comprenant une étape de : a. Mise en culture des micro-organismes recombinants, de préférence les levures recombinantes, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu telles que définies selon l’invention dans un milieu de culture.

De manière préférée, ladite méthode de production d’acide caféique et/ou d’acide férulique comprend en outre une étape de : b. Récupération de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique obtenu à l’étape a. De manière préférée selon l’invention, l’acide caféique et/ou l’acide férulique sont produits à partir de glucose, d’acide p-coumarique, de p-coumaroyl-shikimate et/ou de caféoyl-shikimate, ajouté dans le milieu de culture avant ou à l’étape a.

De manière préférée, l’acide caféique et/ou l’acide férulique sont produits à partir de glucose.

Selon un sixième aspect, l’invention concerne l’utilisation du micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, capable de produire de l’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu selon l’invention pour produire de l’acide caféique et/ou de l’acide férulique.

Selon un septième aspect, l’invention concerne l’utilisation du micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, productrice d’acide caféique selon l’invention pour produire de l’acide caféique.

Selon un huitième aspect, l’invention concerne l’utilisation du micro-organisme recombinant, de préférence la levure recombinante, productrice d’acide férulique selon l’invention pour produire de l’acide férulique.

De manière préférée, l’acide férulique est produit à partir de l’acide caféique produit par ledit micro-organisme recombinant, de préférence ladite levure recombinante, selon l’invention.

Selon un neuvième aspect, l’invention concerne au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprenant une séquence codante pour un gène hétérologue au micro-organisme hôte recombinant, de préférence à la levure hôte recombinante, codant une enzyme de la famille des hydrolases capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate.

De manière préférée, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une caféoyl-shikimate estérase (CSE). De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CSE est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) (XM_003609990.3, Genbank, SEQ ID NO. 9) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Medicago truncatula (MtCSE) et présentant une activité caféoyl-shikimate estérase.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue codant pour une CSE est le gène de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) (At1g52760, GenBank, SEQ ID NO. 3) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la CSE de Arabidopsis thaliana (AtCSE) et présentant une activité caféoyl- shikimate estérase.

Selon un mode de réalisation, l’enzyme capable de rompre, de préférence d’hydrolyser, la liaison caféoyl-shikimate pour produire de l’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate est une chlorogénique acide estérase (ChlE).

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) (CP001606.1 :789353-790141 , GenBank, SEQ ID NO. 4) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BiChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) (HG970190.1 , GenBank, SEQ ID NO. 15) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Ustilago maydis (UmChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) (SPPI01000004.1 : 37780-38526, GenBank, SEQ ID NO. 8) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Lactobacillus johnsonii (LaChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase. Selon un mode de réalisation, le gène hétérologue pour une ChlE est le gène de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) (CP030369.1 :2322200-2323400, GenBank, SEQ ID NO. 13) ou un gène codant pour une séquence ayant au moins 55, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% d’identité avec la séquence d’acides aminés de la ChlE de Salinibacter ruber (SrChlE) et présentant une activité chlorogénique acide estérase.

De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour un gène hétérologue codant pour une enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A.

De manière préférée, l’enzyme capable de catalyser la formation de la liaison entre l’acide coumarique et le coenzyme A est une 4-coumarate-CoA ligase (4CL).

De manière préférée selon l’invention le gène hétérologue codant pour une 4CL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote.

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une 4CL est muté afin de diminuer l’affinité de ladite 4CL mutée pour l’acide caféique et d’accroître sa spécificité pour l’acide p-coumarique par rapport au gène parent codant pour une 4CL non mutée..

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa (AY043495, Genbank, SEQ ID NO. 10).

Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Populus tomentosa, l’acide aminé :

- à la position 236 est une Alanine (Y236A) ou une Phénylalanine (Y236F) ; et/ou

- à la position 240 est une Alanine (S240A) ; et/ou

- à la position 305 est une Alanine (G305A) ; et/ou

- à la position 329 est une Alanine (G329A) Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana (At1g51680, GenBank, SEQ ID NO. 1 ).

Selon un mode de réalisation, dans le cas où la 4CL est la 4CL de Arabidopsis thaliana, l’acide aminé :

- à la position 264 est une Alanine (S264A) ; et/ou

- à la position 329 est une Alanine (G329A) ; et/ou

- à la position 353 est une Alanine (G353A).

Selon un mode de réalisation, la 4CL est la 4CL de Streptomyces coelicolor (CAB95894.1 , Genbank, SEQ ID NO. 12).

De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour :

- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H).

De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour :

- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ).

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour :

- Un gène hétérologue codant pour une Hydroxycinnamoyl-Transférase (HCT) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Coumarate 3 Hydroxylase (C3H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Tyrosine Amonia Lyase (TAL), et/ou un gène hétérologue codant pour une Phénylalanine Amonia-Lyase (PAL) et un gène hétérologue codant pour une Cinnamate 4-Hydroxylase (C4H) ; et

- Un gène hétérologue codant pour une Cytochrome P450 reductase (CPR1 ). De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une HCT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At5g48930, GenBank, SEQ ID NO. 7).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une C3H est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis thaliana (At2g40890, GenBank, SEQ ID NO. 5).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une CPR1 est un gène provenant d‘un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Catharanthus roseus (X69791.1 , GenBank, SEQ ID NO. 6).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour une TAL est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Rhodotorula glutinis (KF765779.1 , GenBank, SEQ ID NO. 14).

De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour :

- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou

- Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent.

De manière préférée selon l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence permettant l’invalidation de :

- un gène codant pour la Phenylpyruvate decarboxylase (AR010).

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit au moins un vecteur d’expression pour la production d’acide caféique dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, comprend en outre une séquence codante pour :

- Un gène codant pour une 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase (AR04) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou - Un gène codant pour une chorismate mutase (AR07) mutée afin que le produit soit résistant à la rétro-inhibition par rapport au gène parent ; et/ou l’invalidation de :

- un gène codant pour une Phenylpyruvate decarboxylase (ARO10).

De manière préférée, le gène AR04 est muté de façon à ce que l’acide aminé à la position 229 soit une Leucine (K229L).

De manière préférée, le gène AR07 est muté de façon à ce que l’acide aminéà la position 141 soit une Sérine (G141S).

Selon un mode de réalisation, ledit au moins un vecteur d’expression dans un micro organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, permet la production d’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu, et comprend en outre une séquence codante pour :

- Un gène hétérologue codant pour la caféoyl-O-méthyl Transférase (COMT).

De manière préférée, ledit au moins un vecteur d’expression dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, permettant la production d’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu comprend en outre une séquence codante pour :

- Un gène codant pour la S-Adénosylméthyltransférase (SAM2).

De manière préférée, ladite levure est une espèce de l’embranchement des Ascomycota, de préférence choisie parmi les genres Schizosaccharomycetes, Saccharomyces, Kluyveromyces, Komagataella, Scheffersomyces, Torulaspora et/ou Zygosaccharomyces.

De manière préférée, ladite levure est de l’espèce Saccharomyces Cerevisiae.

De préférence, le gène de SAM2 est le gène SAM2 de Saccharomyces cerevisiae et est une copie de celui compris naturellement (YDR502C, SGD Database, SEQ ID NO. 11 ).

De manière préférée selon l’invention, le gène hétérologue codant pour la COMT est un gène provenant d’un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence Arabidopsis Thaliana (At5g54160, UniProtKB). De manière préférée, ledit au moins un vecteur d’expression dans un micro-organisme hôte recombinant, de préférence une levure hôte recombinante, permettant la production d’acide férulique à partir de l’acide caféique obtenu comprend en outre une séquence permettant l’invalidation du gène codant pour une ferulic acid decarboxylase 1 (FDC1 ).

L'invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, d’exemples de mise en oeuvre non limitatifs de l'invention, et à l'examen des figures annexées, sur lesquelles :

DESCRIPTION DES FIGURES

[Fig. 1] illustre la réaction d’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la caféoyl-shikimate estérase (CSE) selon l’invention.

[Fig. 2] illustre les voies métaboliques de production de l’acide caféique et de l’acide férulique chez la levure selon un mode de réalisation de l’invention.

[Fig. 3] illustre la production d’acide caféique chez une levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention à partir de p-coumarique ou de glucose en passant par une CSE (méthode UHPLC-TQ), à 24h, 48h et 72h.

[Fig. 4] illustre la production des différents intermédiaires produits par la levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention, analysé par une méthode qualitative (méthode UHPLC-HRMS (Spectrométrie de masse haute résolution).

[Fig. 5] illustre l’analyse des composés présents dans le surnageant de culture de levures recombinantes selon un mode de réalisation l’invention, la présence des composés étant déterminée par la méthode UHPLC-TQ. Le premier pic avec un temps de rétention de 2.1 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,25 min à l’acide férulique.

[Fig. 6] est un chromatographe caractérisant la production d’acide férulique chez la levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention à partir de glucose. Le pic à 2,01 correspond à l’acide caféique et le pic à 3,15 correspond à l’acide férulique.

[Fig. 7] est un chromatogramme caractérisant l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la CSE (provenant de Medicago truncatula, MtCSE) chez la levure levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention. Le pic avec un temps de rétention de 3,23 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,78 min au caféoyl-shikimate. [Fig. 8] est un chromatogramme caractérisant l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la ChlE (provenant de Lactobacillus johnsonii, LaChlE) chez la levure recombinante selon un mode de réalisation de l’invention. Le pic avec un temps de rétention de 3,19 min correspond à l’acide caféique. [Fig. 9] est un chromatogramme caractérisant la présence de caféoyl-shikimate dans les échantillons témoins. Le pic avec un temps de rétention de 3,88 min correspond au caféoyl- shikimate.

EXEMPLES Exemple 1 : Matériels et méthodes :

Les standards pour l’acide p-coumarique, l’acide caféique et l’acide férulique ont été obtenus chez le fournisseur Sigma-Aldrich.

Clonage des gènes : Les gènes AR04 (NP_009808, Genbank) et AR07 (NP_015385, Genbank) ont été amplifiés par PCR à partir de l’ADN génomique de S. cerevisiae, puis ont été mutés afin que leur produit soit résistant à la rétro-inhibition (FBR: Feed Back Résistance) (Gold et al. Microbial Cell Factories (2015)). 14:73, voir pages 11 à 16 et fichiers additionnels). Pour AR04, ceci correspond à la mutation K229L, et pour AR07 à la mutation G141S.

Les gènes obtenus par synthèse ou PCR comprennent à l’extrémité 5’ et 3’, un site de restriction Bbs\ (GAAGAC) ou Bsa\ (GGTCTC), compatible avec le système de clonage utilisé. Tous les gènes, promoteurs et terminateurs ont été clonés par restriction dans le vecteur pSBK. Les promoteurs et terminateurs (Wargner et al., 2015) ont été amplifiés par PCR à partir de l’ADN génomique de la levure S. cerevisiae.

Le vecteur pSBK comprend un marqueur de sélection de la levure : URA3, LEU2 ou TRP1. Tableau 1 : Les différents gènes utilisés pour réaliser une levure recombinante selon l’invention. Mutation de la 4CL :

Les mutants Y236A et Y236F de la 4CL de P. tomentosa ont été construits par PCR. Délétion des gènes :

Les gènes AR010 (YDR380W) et FDC1 (YDR539W) ont été invalidés par délétion, c’est à dire par intégration en lieu et place du cadre de lecture ouvert, d’un ADN linéaire comprenant un marqueur de sélection borné par les régions amont et aval du gène.

Souches :

Le modèle levure utilisé dans cette étude est la souche FY1679-28A de Saccharomyces cerevisiae (Tettelin et al., 1995 - tableau 1 page 85), auxotrophe pour l’uracile, le tryptophane, et la leucine. Les constructions ont été réalisées dans la souche d ’Escherichia coli MH1 avant leur transfert chez la levure.

Tableau 2 : Liste des souches utilisées

Conditions de culture :

Les souches de levure ont été cultivées 72h à 30° C, en plaque 24 puits, sous agitation continue (200 RPM), dans 1 ml de milieu SD (Dutscher, Brumath, Fr) supplémenté ou non par du CSM (Complété Supplément Mixture; Formedium, UK). Le glucose est ajouté à 20 g/L. ou de l’acide p-coumarique a été ajouté dans le milieu à une concentration de 100 mg.l-1.

Méthode analytique : Méthode UHPLC-TQ Préparation des échantillons : Des échantillons de 100 pL sont récupérés pour chaque expérience. 50 pL sont transférés dans une nouvelle plaque, auxquels sont ajoutés 50 pL de la solution d’étalon interne. Chaque échantillon est ensuite homogénéisé par aspiration- refoulement, puis centrifugé pendant 5 min à 3000 rpm à température ambiante. La concentration finale de l’étalon interne (Acide Protocatéchique) est de 0,5 mg/L.

Analyse par UHPLC-TQ : Les échantillons ont été analysés par une UHPLC Vanquish-H (Thermo) couplée à un triple-quadripôle UHPLC-TQ (Thermo). La colonne est une colonne Waters Acquity UPLC@ USST3 (8 pm 2,1 X 100 mm) associée à une pré-colonne HSST3 1 ,8 pm 2,1 X 5 mm.

La phase mobile A est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’eau de qualité LC/MS et la phase mobile B est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’acétonitrile pur de qualité LC/MS. La température de la colonne est de 50° C et la température du passeur d'échantillons à 10°C.

Tableau 3 : conditions chromatographiques pour la détection des molécules d’intérêt :

Les paramètres de la source électrospray sont : - voltage du spray mode positif à 4000V

- gaz rideau : à 50 Arb

- gaz auxiliaire à 15 Arb

- température du tube de transfert à 300° C

- température du vaporisateur à 300° C Tableau 4 : Les ions suivis et les conditions de fragmentation pour les molécules d’intérêt :

Méthode UHPLC-HRMS (Spectrométrie de masse haute résolution) : Préparation des échantillons : Des échantillons de 100 pL sont récupérés pour chaque expérience. 50 pL sont transférés dans une nouvelle plaque, auxquels sont ajoutés 50 pL d’acétonitrile. Chaque échantillon est ensuite homogénéisé par aspiration-refoulement, puis centrifugé pendant 5 min à 3000 rpm à température ambiante. Analyse par UHPLC-HRMS : Les échantillons ont été analysés par une UHPLC Vanquish-H (Thermo) couplée à une UHPLC-HRMS. La colonne est une colonne Waters Acquity UPLC@ USST3 (8 pm 2,1 X 100 mm) associée à une pré-colonne HSST3 1 ,8 pm 2,1 X 5 mm.

La phase mobile A est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’eau de qualité LC/MS et la phase mobile B est une solution de 0,1 % d’acide formique dans de l’acétonitrile pur de qualité LC/MS. La température de la colonne est de 50° C et la température du passeur d’échantillons à 10°C.

Tableau 5 : Conditions chromatographiques pour la détection des molécules d’intérêts :

Les paramètres de la source électrospray sont :

- voltage du spray mode positif à 3,10 kV

- gaz rideau à 50 Arb - gaz auxiliaire à 20 Arb

- température du capillaire à 350° C

- température de chauffage du gaz auxiliaire à 500° C

- S-lens RF à 55 V

- énergie de collision (NCE en rampe) : 20, 40, 60

Tableau 6 : Ions suivis et les conditions de fragmentation pour les molécules d’intérêt : Exemple 2 : Production d’acide caféique à partir de glucose ou d’acide p-coumarique.

La production d'acide caféique à partir de glucose ou d’acide p-coumarique a été testée dans 4 souches, dont les différences portent sur le choix des 4CL mutées (soit Y236A soit Y236F) et des CSE utilisées (A. thaliana ou . truncatula).

La Figure 3 décrit les résultats de la production d’acide caféique à partir de p-coumarique ou de glucose en passant par une CSE (méthode UHPLC-TQ) à l’aide de la levure selon l’invention. Dans toutes les souches testées les gènes AR04K229L-AR07G141S-TAL-HCT-C3H- CPR1 ont été ajoutés et le gène AR010 a été invalidé par délétion. Ces souches divergent donc uniquement par les 4CL et CSE utilisées (L16A3 : 4CLY236A-AtCSE; L16B5 : 4CLY236A- MtCSE; L16C2 : 4CLY236F-AtCSE; L16D5 : 4CLY236F-MtCSE).

Les résultats présentés en Figure 3 montrent que l’association de ces différentes enzymes permet la production d’acide caféique.

La meilleure condition est obtenue avec la mutation 4CL Y236A et la CSE de . truncatula (L16B5).

Exemple 3 : Production des différents intermédiaires.

Les résultats présentés en Figure 4 montrent la caractérisation de la production des différents intermédiaires produits par la levure productrice d’acide caféique selon l’invention à partir de glucose ou d’acide p-coumarique, par une méthode qualitative (méthode UHPLC-HRMS).

Ces résultats permettent de montrer l’accumulation de chacun des intermédiaires, c’est à dire l’acide p-coumarique, le p-coumaroyl-shikimate, le caféoyl-shikimate et l’acide caféique (voir Figure 4).

L’accumulation des différents intermédiaires démontre la possibilité de produire de l’acide caféique grâce à la levure selon l’invention, comme l’indique la présence de p-coumaroyl- shikimate et caféoyl-shikimate.

Exemple 4 : Production d’acide férulique à partir d’acide p-coumarique

La levure selon l’invention capable de produire de l’acide férulique possède la méthytransférase d’A rabidobsis thaliana (COMT) et est invalidée pour le gène FDC1. Cette souche a été incubée 72h en présence d’acide p-coumarique et la production d’acide caféique et d’acide férulique a été déterminée par la méthode UHPLC-TQ.

Le chromatogramme montre une production d’acide caféique et d’acide férulique (Figure

5). Le premier pic avec un temps de rétention de 2.1 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,25 min à l’acide férulique.

Ces tests permettent de montrer que l’acide caféique, produit à partir d’acide p- coumarique, peut être efficacement converti en acide férulique, lorsqu’une méthyl- transférase est ajoutée à la souche productrice (Figure 5).

Exemple 5 : Production d’acide férulique à partir de glucose :

La levure selon l’invention capable de produire de l’acide férulique possède la méthytransférase d ’Arabidobsis thaliana (COMT) et est invalidée pour le gène FDC1. Cette souche a été incubée 72h en présence de glucose et la production d’acide férulique a été déterminée par la méthode UHPLC-TQ.

Le chromatogramme montre une production d’acide caféique et d’acide férulique (Figure

6). Le premier pic avec un temps de rétention de 2,01 min correspond à l’acide caféique et le second à 3,15 min à l’acide férulique.

Ces tests permettent de montrer que l’acide caféique produit à partir d’acide p-coumarique peut être efficacement converti en acide férulique, lorsqu’une méthyl-transférase est ajoutée à la souche productrice (Figure 6).

Exemple 6 : Test de l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la CSE :

L’échantillon de caféoyl-shikimate a été préparé à partir du surnageant de culture d’une souche productrice. La libération d’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate a été testée à l’aide d’une souche contenant la CSE provenant de Medicago truncatula (MtCSE).

Les résultats sont présentés en Figure 7, le premier pic avec un temps de rétention de 3,23 min correspondant à l’acide caféique et le second à 3,78 min au caféoyl-shikimate.

Une production d’acide caféique à partir du caféoyl-shikimate en présence de la MtCSE est observée. Exemple 7 : Test de l’hydrolyse du caféoyl-shikimate en acide caféique et shikimate grâce à la la ChLE :

L’échantillon de caféoyl-shikimate a été préparé à partir du surnageant de culture d’une souche productrice. La libération d’acide caféique à partir de caféoyl-shikimate a été testée à l’aide d’une souche contenant la ChlE de Lactobacillus johnsonii.

Les résultats sont présentés en Figure 8. On observe un pic à un temps de rétention de 3,19 min correspondant à l’acide caféique, tout le caféoyl-shikimate ayant été consommé. Dans la Figure 9 représentant un échantillon témoin, on peut vérifier la présence de caféoyl- shikimate pour lequel on observe un pic à 3,88 min et l’absence d’acide caféique. Une production d’acide caféique à partir du caféoyl-shikimate est observée en présence de la LaChlE.