BENAVIDES LOZANO, Jorge Alejandro (Lucila Godoy # 121, Col. Roma C.P. 64700, MX)
HERNÁNDEZ MIRELES, Tanhia Denys (8 de Diciembre # 445, Col Roble C.P., San Nicolás de los Garza Nuevo León, 66450, MX)
RITO PALOMARES, Marco Antonio (Lomas de la Ribera #5408, Col.Lomas de Cumbres2do. Secto, C.P. . Monterrey Nuevo León, 64116, MX)
BENAVIDES LOZANO, Jorge Alejandro (Lucila Godoy # 121, Col. Roma C.P. 64700, MX)
HERNÁNDEZ MIRELES, Tanhia Denys (8 de Diciembre # 445, Col Roble C.P., San Nicolás de los Garza Nuevo León, 66450, MX)
| REINVINDICACIONES
Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas: 1. Un método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica a partir de de cultivos de Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 caracterizado porque que comprende los siguientes pasos:
(a) Cultivar Porphyridium cruentum ATCC No. 50161
(b) Separar biomasa
(c) Romper células de Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 (d) Precipitación isoeléctrica
(e) Recuperar precipitado
(f) Incorporar al sistema de dos fases acuosas
(g) Recuperar fase superior del sistema (h) Ultrafiltrar 2. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (a), la incorporación de CO 2 , al flujo de aire que alimenta al biorreactor puede ser opcional.
3. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque cuando en la etapa (a) se adiciona CO 2 en una concentración entre 1-5 % v/v, se tiene un tiempo de cultivo de 15 días.
4. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque cuando en la etapa (a) no se adiciona CO 2 , se tiene un tiempo de cultivo de 30 días.
5. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (b) puede realizarse por técnicas convencionales como sedimentación o centrifugación.
6. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa (b) se realiza preferentemente por centrifugación a 500 - 10,000 X G durante 2 - 10 minutos. 7. El método para producir B B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa (b) se realiza por centrifugación preferentemente a 1000 durante 5 minutos.
8. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (c) se puede realiza por medios mecánicos como maceración y sonicación.
9. El método para producir B ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque en la etapa (c) se usa preferentemente sonicación (2-10 cm 3 de agua bidestilada por gramo de biomasa húmeda, 2 - 20 min de ruptura por gramo de biomasa húmeda).
10. El método para producir B ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque en la etapa (c) se realiza por sonicación preferentemente agregando 4 cm 3 de agua bidestilada por gramo de biomasa húmeda, 10 min de ruptura por gramo de biomasa húmeda). 11. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (d) de precipitación isoeléctrica se produce un precipitado de BFE.
12. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (d) se ajusta el pH entre 4 - 5 con acido o base a una temperatura comprendida entre 5 - 15° C, protegiendo de la luz.
13. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa (d) el ácido usado puede ser alguno de entre los siguientes: clorhídrico (HCl), sulfúrico (H 2 SO 4 ), fosfórico (H 3 PO 4 ) y acético (C 2 H 4 O 2 ) con concentración 0.1 a 10 N.
14. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la etapa (d) el ácido usado es preferentemente HCl a una concentración de 0.1 a 10 N, preferentemente 1.0 N.
15. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa (d) la base usada puede ser alguna de entre las siguientes: Hidroxido de Sodio (NaOH) con concentración 0.1 a IO N.
16. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa (d) el pH se ajusta preferentemente a 4.
17. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa (d) se realiza a una temperatura preferentemente de 10° C.
18. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa (d) se protege de una exposición no mayor a 20 microeinsteins por menos de 30 minutos a la luz.
19. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (e) se realiza por centrifugación a 100 - 2000G durante 10 - 20 minutos con buffer de fosfatos.
20. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la etapa (e) se realiza por centrifugación preferentemente a 1000 G por 10 minutos con buffer de fosfatos a una concentración de 2OmM y pH 7. 21. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (f) consiste en la aplicación de sistemas de dos fases acuosas PEG - fosfato de potasio bajo los siguientes parámetros: peso molecular de polímero (PM PEG) entre 600 y 1500 g/gmol, longitud de línea de corte (LLC, la cual es función de la diferencia de concentración de PEG y sal en cada una de las fases del sistema) entre 30 y 50% p/p, relación de volumen (VR, la cual esta definida como la razón entre el volumen de la fase superior e inferior del sistema) mayor a 2, y pH del sistema entre 7 y 8.
22. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (g) se realiza usando membranas con tamaño de poro de 10 a 100 kilodaltones (kDa).
23. El método para producir B-ficoeritrina con pureza analítica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la etapa (g) se usan preferentemente membranas de 50 kilodaltones (kDa). 24. El uso de B-ficoeritrina con pureza analítica para aplicaciones en biología molecular caracterizado porque la B-ficoeritrina tiene pureza analítica > a 4. |
RECUPERACIóN Y PURIFICACIóN DE B-FICOERITRINA PRODUCIDA
POR Porphyridium cruentum UTILIZANDO SISTEMAS DE DOS FASES ACUOSAS Y PRECIPITACIóN ISOELéCTRICA
DESCRIPCIóN OBJETO DE LA INVENCIóN
Esta invención se relaciona con el desarrollo de un proceso para la recuperación y purificación de B-ficoeritrina (BFE) producida por la microalga Porphyridium cruentum (ATCC No. 50161), utilizando como etapas principales precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas con polietilénglicol y fosfato de potasio.
ANTECEDENTES En la actualidad el uso de pigmentos artificiales (particularmente en la industria alimentaria y cosmética) ha decaído considerablemente debido a los efectos adversos sobre la salud que algunos de estos han mostrado tener. Entre dichos efectos sobresalen el desarrollo de trastornos mentales (particularmente en niños), desarrollo de alergias e inclusive cáncer. Debido a esto y a la presión generada por el consumidor sobre las compañías que utilizan estos colorantes, el uso de pigmentos de origen natural (proteicos y no proteicos) ha tomado auge. Adicionalmente los colorantes de origen natural han mostrado tener una gran versatilidad, encontrando uso no solo en la industria alimentaria y de cosméticos, sino también en aplicaciones relacionadas con investigación (particularmente en el área de biología molecular).
Las fϊcobiliproteínas son colorantes proteicos encontrados en la naturaleza (cianobacterias, en algas eucarióticas monocelulares biflageladas, así como en rodófitas). Estos compuestos son considerados pigmentos accesorios, los cuales facilitan el proceso de fotosíntesis en dichos organismos. Se encuentran embebidos dentro de los cloroplastos (membrana tilacoide). Las ficobiliproteínas tienen grupos prostéticos tetrapirrólicos lineales (bilinas), unidos covalentemente a residuos de cisteína específicos de las proteínas (Bermejo et al, 2002; Berns and MacColl, 1989; Ritter et al, 1999). Estos complejos absorben la luz dentro de un rango amplio de longitud de onda dentro del espectro visible, por lo cual abarcan una amplia gama de colores. La B- ficoeritrina (BFE) es una ficobiliproteína de color rosa intenso, con un peso molecular de 245 kDa, formada por trece subunidades (α, β, y γ en una relación molar de 6:6:1) de
peso molecular igual a 18,000, 18,000 y 29,000 g/mol, respectivamente (Benavides y
Rito-Palomares, 2004). El punto isoeléctrico de BFE se ha reportado en 4.2 a 4.4 (Koller et al, 1977), quien presenta el método de electroforesis en gel para la separación de esta proteína. La microalga marina Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 ha demostrado tener gran potencial para la producción de BFE. Este pigmento proteico ha demostrado tener aplicación en la industria alimentaria, cosmética y de detergentes como colorante natural. De igual manera es utilizado ampliamente como pigmento fluorescente en biología molecular (Bermejo et al, 2002). El valor comercial de BFE altamente pura (definida como una relación de absorbancias a 545 y 280nm mayor a 4.0 (Abs 545nm/280nm > 4)) ha sido reportado en $50 dólares/mg (Martek Corporation, 2005; Haugland, 1996). Porphyridium cruentum produce adicionalmente otros dos pigmentos (ficobiliproteínas): aloficocianina (AFC) y R-ficocianina (RPC). Sin embargo, el valor comercial que alcanzan estos pigmentos no es tan elevado (comparado como el de BFE), y por lo tanto el desarrollo de un proceso para la recuperación y purificación de estos dos pigmentos no resulta tan atractivo. En contraste, el elevado valor comercial de la BFE justifica intentos trabajos previos (Bermejo et al, 2002 y 2003; UMV GRANADA Patente ES2197820-A1 y ES2197820- Bl) por desarrollar procesos eficientes para la recuperación y purificación de BFE.
A pesar de su gran versatilidad el uso de pigmentos naturales ha sido frenado, al menos en cierto grado, por la complejidad de los procesos de recuperación y purificación necesarios para su obtención. Adicionalmente, los costos relacionados con dichos procesos generalmente son elevados, debido a la gran cantidad de operaciones involucradas. El uso a nivel industrial de técnicas difícilmente escalables genera elevados costos de operación y mantenimiento, lo cual hace menos atractiva desde un punto de vista económico la intención de producir y recuperar compuestos de esta naturaleza.
Protocolos para la recuperación y purificación de B-ficoeritrina producida por algas han sido reportados, para una amplia gama de aplicaciones. En la Patente CN1587275-A, se reporta un método de recuperación y purificación de ficoeritrina producida por microalgas que involucra lixiviación con agua destilada, precipitación escalonada con sulfato de amonio y cromatografía por intercambio iónico, obteniendo de esta forma una recuperación aproximada del 52%. En las patentes ES2197820-A1 y
ES2197820-B1, reportan haber purificado BFE producida por Porphyridium cruentum mediante ruptura celular por choque osmótico, seguida por una etapa cromatográfica de cama expandida con un soporte iónico, de la cual se obtiene un rendimiento promedio de 80% y por último una etapa cromatográfica iónica convencional, dando esto por resultado un producto altamente purificado (Abs 545nm/280nm > 4). En las Patentes, TW222463-B1, TW222999-B1, TW223000-B1, TW224135-B1 y solicitudes de patente TW200408706-A, TW200408707-A, TW200408704-A, TW200408705-A, JP2004166704-A y US20040137583-A1) reportan un proceso de producción y recuperación de ficoeritrina producida por algas, el cual involucra el crecimiento del microorganismo utilizando dos tanques en serie, generación de una solución de cromoproteínas, para posteriormente sedimentar la ficoeritrina presente en la solución y purificarla mediante técnicas de alto costo como cromatografía de filtración en gel y ultrafiltración donde se obtiene una pureza de BFE > 4. La solicitud de Patente JP2003231821 -A) reporta un método para la recuperación de pigmentos producidos por algas el cual involucra el secado de la biomasa, su resuspensión en una solución de sulfato de amonio o algún otro buffer particular y posteriormente una etapa selectiva de separación. En la Patente TW270146, lograron recuperar ficoeritrina producida por Bangia atropurpúrea and Porphyra augusta mediante un proceso que involucra la colección de gametofitos del alga madura, el cultivo de dichos gametofitos en un medio especial para la producción de esporas, el cultivo de las esporas bajo condiciones controladas de temperatura y luz, el cultivo de los cuerpos filamentosos formados por las esporas, recolección, secado y resuspendido de los mismos en una solución de fosfato en la cual ocurre la extracción de los pigmentos de interés y otros contaminantes, agregar sales para precipitar impurezas y por último el uso de cromatografía en gel para purificar la ficoeritrina. A pesar de que este método da como producto ficoeritrina altamente purificada es relativamente complicado y su aplicación industrial es limitada como los procesos reportados en las Patentes JP2648088-B2, y Patente US5358858-A.
Como se puede observar en la actualidad existen algunos protocolos reportados para la recuperación y purificación de colorantes proteicos intracelulares producidos por algas. Sin embargo en la mayoría de los casos, el proceso desarrollado es complicado debido a las numerosas etapas cromatográficas, necesarias para obtener la proteína de interés con los niveles de pureza necesarios (Bermejo et al, 2002 y 2003). La necesidad del elevado
número de etapas que demandan los protocolos convencionales comúnmente lleva a bajos rendimientos (pérdida del producto) y altos costos de procesos (Ranjitha y Kaushik, 2005). Consecuentemente, el escalamiento potencial de este tipo de procedimientos es percibido negativamente desde el punto de vista económico. El motivo de esta invención es un proceso para la recuperación y purificación de BFE mediante precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas PEG - sal, técnicas fácilmente escalables a nivel industrial, y por las cuales se obtienen buenos rendimientos y alta pureza de BFE. Como el trabajo publicado por Hernández-Mireles y Rito-Palomares (2006), autores de la presente solicitud, que describe un proceso para la recuperación y purificación de BFE mediante precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas PEG - sal. De dicha investigación se deriva el proceso aquí propuesto.
La precipitación isoeléctrica es una técnica que se utiliza ampliamente para la recuperación y purificación de proteínas, basada en que el punto isoeléctrico es el valor de pH en el cual la carga eléctrica superficial de cierta molécula (proteína) es igual a cero. La solubilidad de una proteína que se encuentra en su punto isoeléctrico es mínima, ya que al no existir carga eléctrica superficial, las fuerzas de repulsión entre las moléculas desaparecen, formándose agregados que precipitan fácilmente. A este fenómeno se le conoce como precipitación isoeléctrica. Esta técnica de recuperación y purificación de proteínas es ampliamente usada (Onsaard et al, 2006; Zhang et al, 2004) debido a que es económica y fácil de implementar a cualquier escala. Procesos desarrollados que incluyen entre otras etapas, precipitación isoeléctrica para la recuperación y purificación de BFE logran alcanzar una pureza analítica (Abs 545nm/280nm > 4) (Bermejo et al, 2003). Sin embargo dichos procesos de recuperación y purificación cuentan con un elevado número de etapas, entre las cuales se incluyen pasos cromatográficos. El exceso de operaciones unitarias genera perdidas innecesarias en el producto de interés. Si bien la cromatografía es una técnica que puede ser utilizada a nivel industrial, su escalamiento y aplicación a dicha escala incurre en elevados costos de inversión, operación y mantenimiento. Estudios económicos reportan que el uso de sistemas de dos fases acuosas (SDFA) representa una disminución en los costos de inversión y operación cuando es comparado con cromatografía (Aguilar et al, 2006). Debido a esto y a otras ventajas intrínsecas a los sistemas de dos fases acuosas se decidió desarrollar un proceso que comprendiera las técnicas de precipitación
isoelecrica y SDFA para la recuperación y purificación de BFE.
Debido a que SDFA son una técnica de recuperación y purificación primaria líquido- líquido, que ha demostrado ser eficiente para separar compuestos de naturaleza biológica (proteicos y no proteicos; Rito-Palomares, 2004, Rito Palomares, 2002; Shinomiya et al, 2003; Kepka et al, 2003; Cunha et al, 2003; Marcos et al, 2002; Reh et al, 2002). Los SDFA permiten la intensificación e integración de los procesos de recuperación, ya que son capaces de procesar grandes cantidades de sólidos suspendidos (incluyendo restos celulares) eliminando de esta forma etapas innecesarias, tales como centrifugaciones y precipitaciones, logrando de esta forma la integración de dos o más etapas en una sola. Adicionalmente los SDFA son relativamente económicos y fácilmente escalables, lo cual los hace candidatos ideales para formar parte de un proceso a nivel industrial.
Existen sistemas de dos fases acuosas polímero — polímero, los cuales están formados por dos polímeros diferentes (Polietilenglicol (PEG) - Dextrano, PEG - Polivinil alcohol). Sin embargo, el uso de estos sistemas esta de cierta forma limitado por los altos costos que algunos polímeros tienen. Muchos polímeros forman sistemas de dos fases acuosas cuando son combinados con ciertas sales, dando como resultado un sistema de dos fases acuosas polímero - sal (PEG - Fosfato de potasio, PEG - Sulfato de sodio.) (Huddleston et al, 1991; Albertsson et al, 1990). La preferencia de un compuesto por migrar a una fase particular del sistema depende de varios factores, entre los cuales se encuentran: su peso molecular, carga electroquímica neta, punto isoeléctrico y contenido de residuos hidrofóbicos de aminoácidos. Sin embargo, no solo las características de la proteína a separar influyen en su comportamiento de partición. Los parámetros del sistema de dos fases acuosas juegan un papel de gran importancia durante la partición de la proteína de interés hacia una fase en particular. Entre estos parámetros se encuentran: tipo, peso molecular y concentración de polímero usado para construir el sistema, naturaleza y concentración de las sales utilizadas, diferencias de concentración de los componentes en cada una de las fases, pH del sistema, temperatura (Sarubbo et al, 2000). Debido a su bajo costo y al corto tiempo de separación, uno de los sistemas de dos fases acuosas más caracterizado y utilizado es el sistema polietilenglicol - fosfato de potasio.
El proceso aquí propuesto permite la recuperación y purificación de B-ficoeritrina
producida por Porphyridium cruentum. Dicho proceso comprende una etapa de precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas, logrando una pureza de B- ficoeritrina superior a 4 (Abs 545nm/280nm > 4), lo cual permite usar el producto obtenido en aplicaciones relacionadas con el área de biología molecular.
BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Diagrama de flujo simplificado del proceso propuesto para la recuperación y purificación de BFE producida por Porphyridium cruentum.
Figura 2. Efecto del método mecánico de ruptura celular utilizado sobre la cantidad de B-ficoeritrina ( ξ ), aloficocianina ( E2) y R-ficocianina ( M ).
Figura 3. Pureza del extracto resuspendido de B-ficoeritrina (BFE) proveniente del precipitado isoeléctrico a diferentes pH.
DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN La presente invención esta enfocada a un proceso novedoso para recuperar y purificar B-ficoeritrina producida por la microalga Porphyridium cruentum (ATCC No. 50161) utilizando sistemas de dos fases acuosas polímero - solución salina y precipitación isoeléctrica como etapas principales de proceso. La invención cuenta con tres etapas principales (posteriores al cultivo de la microalga). Los protocolos para el cultivo de microalgas están bien documentados y estandarizados (Cohén et al, 1991; Cohén y Arad, 1989), lo cual facilita su aplicación tanto a nivel laboratorio como industrial. El cultivo de Porphyridium cruentum se realiza utilizando el medio de cultivo cuya composición se muestra en la Tabla 1.
El cultivo del alga se lleva a cabo en una modalidad de lote o lote alimentado, a 18- 25°C, bajo condiciones de luz natural o regulada (5 - 300 microeinsteins por metro cuadrado por segundo). Las paredes del bioreactor tienen que ser de un material transparente (vidrio o plástico) de tal forma que se permita el libre paso de la luz a través del mismo. Durante el cultivo se proporciona agitación y aireación al reactor, mediante un flujo de aire de 2-4 cmVseg por cada dm 3 de caldo de cultivo. La adición de dióxido de carbono es opcional, pero es recomendable adicionarlo al flujo de aire que alimenta al birreactor en una concentración entre 1-5 % v/v, con la finalidad de acelerar el crecimiento del alga, así como aumentar la densidad celular. El crecimiento de las células se mantiene generalmente por un total de 15 días si su cultivo es suplementado
con CO 2 ; mientras que, un cultivo sin CO 2 suplementado puede tomar hasta 30 días.
Tabla 1. Composición del medio de cultivo de Porphyridium cruentum
Nombre del compuesto Fórmula química Cantidad (por un litro)
Cloruro de sodio NaCl 24.53 g
Cloruro de magnesio MgCl 2 5.2O g
Sulfato de sodio Na 2 SO 4 4.09 g
Cloruro de calcio CaCl 2 1.16 g
Cloruro de potasio KCl 0.7O g
Bicarbonato de sodio NaHCO 3 0.2O g
Nitrato de sodio NaNO 3 0.17 g
Bromuro de potasio KBr 0.10 g
ácido bórico H 3 BO 3 30 mg
Fosfato monobásico de NaH 2 PO 4 14 mg sodio
EDTA sal disódica Na 2 Ci 0 Hi 4 N 2 O 8 10 mg
Citrato de fierro Fe 3 (C 6 H 5 O 7 ) 2 5 mg
Molibdato de sodio Na 2 MoO 4 0.24 mg
Cloruro manganoso MnCl 2 0.20 mg
Cloruro de zinc ZnCl 2 0.14 mg
Sulfato de cobre CuSO 4 0.03 mg
Cloruro de cobalto CoCl 2 0.01 mg
Tiamina Ci 2 H 17 N 4 OS 35 μg
Biotina Ci 0 H 16 N 2 O 3 S 5 μg
Separar biomasa: En la primera etapa las células del alga, también conocida como biomasa, son recuperadas mediante etapas tradicionales de separación sólido-líquido, tales como centrifugación o sedimentación. Se utiliza preferentemente la centrifugación debido a que permite recuperar una mayor fracción de la biomasa en suspensión y reduce significativamente los tiempos de espera inherentes a la sedimentación. Las condiciones de centrifugación seleccionadas pueden ir de 500 - 10,000 X G durante 2 - 10 min. Bajo dichas condiciones es posible recuperar la totalidad de la biomasa suspendida en el caldo de cultivo. La cantidad de biomasa obtenida depende fuertemente de las condiciones de cultivo elegidas (medio utilizado, ciclo de luz natural o regulada, CO 2 suplementado y tiempo de cultivo). Dicha cantidad suele ir de 5 a 40 g de biomasa húmeda por litro de cultivo.
Ruptura celular: Posteriormente, debido a que la BFE es un producto intracelular, es necesario liberar el pigmento mediante una técnica de ruptura celular. Las técnicas de ruptura celular que pueden utilizarse son mecánicas (maceración o sonicación) o no- mecánicas (lisis química o enzimática), prefiriéndose las técnicas mecánicas debido a su eficiencia y a que no involucran la adición de agentes externos (químicos o enzimas) en el proceso. Después de la recuperación de las células se realiza la ruptura celular del alga utilizando métodos mecánicos (por ejemplo maceración manual o sonicación). La sonicación de la biomasa se realiza agregando un peso determinado de biomasa húmeda de Porphyridium cruentum (ATCC No. 50161) en un recipiente de vidrio. Posteriormente por cada gramo de biomasa húmeda se agregan 2-10 cm 3 de agua bidestilada. La mezcla se agita manualmente por inversión hasta suspender las células. Se sumerge el recipiente con las células suspendidas en la cámara de sonicación para dar inicio al proceso de ruptura. La mezcla es sometida a sonicación durante 2-20 min por cada gramo de biomasa húmeda agregada. Una técnica alternativa para llevar a cabo la ruptura celular de Porphyridium cruentum (ATCC No. 50161) es realizar maceración manual. En este caso se agrega un peso determinado de biomasa húmeda en un mortero. Posteriormente se agregan 2-10 cm 3 de agua bidestilada por cada gramo de biomasa húmeda utilizada. La mezcla es macerada manualmente durante 2-20 min por gramo de biomasa húmeda agregada. A pesar de que con ambos métodos es posible llevar a cabo la ruptura celular de Porphyridium cruentum (ATCC No. 50161) sin embargo, no se obtiene la misma eficiencia de liberación de BFE por ejemplo, el uso de sonicación permite liberar una mayor cantidad de BFE por gramo de biomasa húmeda procesada en comparación cuando se utiliza maceración. La sonicación no tan solo permite liberar mayor cantidad de BFE, sino que adicionalmente libera proporcionalmente una menor cantidad de alofϊcocianina (AFC) y R-ficocianina (RFC) en relación a BFE. La pureza de BFE con respecto a otras proteínas (definida como una relación de absorbancias a 545 y 280nm) en el extracto crudo obtenido por sonicación y maceración se encuentra generalmente entre 0.6 - 0.8 (Abs 545nm/280nm ~ 0.6 - 0.8). El rompimiento de la membrana celular (ruptura celular) del alga en ambos métodos puede ser verificado utilizando un microscopio óptico estándar (Microscopio Estándar 25 Cari Zeiss). Al extracto obtenido como resultado de la ruptura de las células de Porphyridium cruentum (ATCC No 50161) se le da el nombre de extracto crudo de BFE e incluye los fragmentos celulares generados. Si bien la ruptura celular por sonicación es
g principalmente aplicada en procesos a nivel laboratorio y piloto, otros métodos mecánicos de ruptura tales como el molino de perlas o la prensa francesa pueden tomar su lugar a escala industrial sin comprometer (de una forma negativa) la cantidad de BFE liberada ni la pureza de la misma.
Precipitación Isoeléctrica: En la segunda etapa del proceso, contempla la purificación inicial del extracto crudo de BFE proveniente de la etapa de ruptura celular, utilizando precipitación isoeléctrica. La precipitación isoeléctrica es aplicada al extracto crudo de BFE obtenido de la ruptura celular de Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 se logra ajustando el pH del extracto a 4 - 5. Dicho ajuste de pH puede llevarse a cabo utilizando una gran variedad de ácidos o bases (inorgánicas u orgánicas) en caso de querer disminuir o aumentar, respectivamente, el pH del extracto. Los ácidos: clorhídrico (HCl), sulfúrico (H 2 SO 4 ), fosfórico (H 3 PO 4 ) y acético (C 2 H 4 O 2 ) son ampliamente utilizados para llevar a cabo el ajuste de pH durante la precipitación isoeléctrica de la BFE. Preferentemente se utiliza acido clorhídrico generalmente entre 0.1 y 10 N. Entre las bases mas utilizadas para llevar el ajuste del pH durante la precipitación isoeléctrica se encuentran el hidróxido de sodio (NaOH) y hidróxido de potasio (KOH). En lo que respecta a la concentración de dichas bases se prefiere trabajar en un rango entre 0.1 y 10 N. De preferencia este proceso se lleva a cabo a baja temperatura (5 - 15° C) y protegiendo la suspensión de una exposición excesiva a la luz por un largo periodo de tiempo (> 20 microeinsteins por metro cuadrado por segundo por mas de 30 min) para evitar la degradación del producto de interés. Es posible proteger la suspensión de la luz llevando a cabo la precipitación en un recipiente ámbar o simplemente recubriendo el recipiente que contiene la suspensión con papel aluminio y otro material que no permita el paso de la luz.
Eliminar sobrenadante o recuperar precipitado: El precipitado es recuperado mediante centrifugación (100 - 2,000 X G durante 10 - 20 min) y resuspendido utilizando buffer de fosfato (20 mM, pH 7.0). A la solución obtenida como resultado del proceso anterior se le da el nombre de extracto resuspendido de BFE. La máxima pureza de la proteína de interés se obtiene a pH 3.5 - 4.5 (valor cercano al punto isoeléctrico para BFE reportado por Koller et al, 1977). A este valor de pH el extracto resuspendido tiene una pureza entre 1.6 y 2.0 (Abs 545nm/280nm ~ 1.6 - 2.0). Esto representa un aumento de 2.6 en la pureza del extracto crudo proveniente de la etapa de ruptura celular. Durante la
etapa de precipitación isoeléctrica, aproximadamente de 70-80% de la BFE que se encuentra en el extracto crudo es recuperado en el precipitado, mientras que el resto permanece en el sobrenadante. La precipitación isoeléctrica da como resultado un precipitado (rico en BFE, restos celulares y otras proteínas que tienen con un punto isoeléctrico similar a BFE), el cual es recuperado, resuspendido y alimentado al sistema de dos fases acuosas.
Incorporar al sistema de dos fases acuosas: Los sistemas de dos fases acuosas se preparan por conveniencia utilizando una base másica fija. A fin de lograr la formación de los sistemas de dos fases polietilénglicol (PEG) - fosfato de potasio, se mezclan las cantidades adecuadas de PEG y fosfato de potasio con el extracto resuspendido de BFE (obtenido mediante la precipitación isoeléctrica del extracto crudo). En estudios previos realizados (Benavides y Rito-Palomares, 2004; Hernandez-Mireles y Rito-Palomares, 2006) se determinaron los parámetros de sistema bajo los cuales la partición de la BFE se ve favorecida hacia la fase superior del sistema (en otras palabras las condiciones bajo las cuales la recuperación de BFE en la fase polimérica del sistema es optimizada). Dichas condiciones son: peso molecular de polímero (PM PEG) entre 600 y 1500 g/gmol, longitud de línea de corte (LLC, la cual es función de la diferencia de concentración de PEG y sal en cada una de las fases del sistema) entre 30 y 50% p/p, relación de volumen (V R , la cual esta definida como la razón entre el volumen de la fase superior e inferior del sistema) mayor a 2, y por último el pH del sistema, el cual debe estar entre 7 y 8.
Los sistemas se forman mediante la mezcla de PEG en forma de una solución concentrada (50 - 80% p/p) y de fosfato de potasio en solución (30 - 40% p/p). El pH de la solución de fosfato de potasio es ajustado a 7 - 8 mediante la adición de ácido orto- fosfórico o hidróxido de potasio, en una concentración que puede variar entre 0.1 a ION, según se requiera. Una vez mezcladas las soluciones de PEG y fosfato de potasio se procede a agregar el extracto resuspendido de BFE cuya concentración puede variar del 10 al 40% p/p del sistema de extracción, prefiriéndose el 40% p/p. El peso total del sistema se alcanza mediante la adición de agua.
Agitar el sistema de dos fases acuosas: El sistema es agitado para mezclar de los compuestos adicionados. La agitación es llevada a cabo mediante un mezclador
rotatorio por inversión durante 5 - 10 min a 20 - 120 rpm.
La separación de las fases del sistema puede llevarse a cabo mediante dos métodos: sedimentación o centrifugación. En caso de hacerla por sedimentación el sistema se deja en reposo para que de esa forma ocurra la separación de las fases. La velocidad con la cual se separan las fases depende de varios parámetros, entre los cuales destacan la LLC, el peso molecular del polímero utilizado y la geometría del sistema. La separación de las fases mediante sedimentación tarda entre 10 - 30 min bajo los rangos paramétricos de sistema antes mencionados (peso molecular de polímero (PM PEG) entre 600 y 1500 g/gmol, longitud de línea de corte (LLC, la cual es función de la diferencia de concentración de PEG y sal en cada una de las fases del sistema) entre 30 y 50% p/p, relación de volumen (V R , la cual esta definida como la razón entre el volumen de la fase superior e inferior del sistema) mayor a 2). De manera alternativa es posible acelerar la formación de las fases del sistema mediante centrifugación. La centrifugación se lleva a cabo a 100 - 5,000 X G durante 2 - 20 min. El uso de centrifugación agiliza enormemente el proceso de recuperación y purificación, al acelerar la formación y separación de las fases del sistema. En los sistemas de dos fases acuosas, los compuestos y restos celulares provenientes de los extractos se concentran en la fase hacia la cual tienen mayor afinidad. En el caso de la BFE, esta proteína colorante muestra una afinidad por la fase superior de sistemas formados con PEG y fosfato de potasio. Los restos celulares tienden a concentrarse en la interfase del sistema de dos fases acuosas, lo cual facilita la eliminación de estos contaminantes. Una vez que las dos fases del sistema se separan por completo, la fase superior (rica en polímero), donde se encuentra la BFE, es recuperada. Si el contenedor donde se encuentra el sistema tiene una válvula en el fondo del mismo, es posible remover primero la fase inferior del sistema (la cual no contiene BFE), y una vez retirada la fase inferior es posible recuperar la fase polimérica (la cual contiene BFE). Una alternativa es recuperar la fase superior mediante bombeo.
Remover polímero: Una vez recuperada la fase superior es posible remover el polímero mediante ultrafiltración (la cual es una técnica fácilmente implementable a nivel industrial). El peso molecular de BFE es de 245 kDa. Por otro lado el peso molecular de los polímeros utilizados para generar el sistema de fases acuosas se encuentra entre 600 y 1500 g/gmol. La amplia diferencia entre los pesos moleculares de la proteína y del polímero hace de la ultrafiltración una técnica ideal para su separación. El peso
molecular de corte (MWCO) de la membrana de ultrafiltración utilizada puede estar entre 10 y 100 kDa, preferentemente la de 50 kDa.
De esta manera el proceso de recuperación y purificación consiste en tres etapas principales: (i) ruptura celular de Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 mediante sonicación (o algún otro método de ruptura mecánica), (ii) precipitación isoeléctrica (pH 4 - 5) del extracto crudo de BFE, y por último (iii) sistemas de dos fases acuosas PEG - fosfato de potasio. El proceso descrito permite obtener BFE de alta pureza (Abs 545nm/280nm > 4), la cual puede ser utilizada en aplicaciones de biología molecular.
Determinar pureza y concentración de BFE: En cuanto a las técnicas analíticas utilizadas, la concentración de proteína total de las muestras se estima utilizando el método de Bradford (1976). La pureza de BFE se determina como la relación entre las absorbancias a 545 y 280nm (pureza de BFE = Abs545 nm / AbS 2 SO nn ,). Bermejo et al, (2002) reportaron el uso de la relación de las absorbancias a 545 y 280nm como una estimación de la pureza de BFE, debido a que el espectro de absorción de esta proteína exhibe un pico a 545nm. Bajo estas circunstancias una relación de estas absorbancias superior a 4.0 corresponde a BFE de alta pureza (definida como BFE comercialmente pura; Sigma Chemicals). La concentración de BFE y las proteínas intracelulares adicionales, R-ficocianina (RFC) y aloficocianina (AFC), producida por Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 se estima mediante el uso de las absorbancias a 565, 620 y 650nm obtenidas y un sistema de ecuación previamente reportado (Bermejo et al, 2002; Bennet y Bogorad, 1973). El fundamento de estas ecuaciones se basa en el coeficiente de extinción constante que estas ficobiliproteinas (RFC, AFC y BFE) presentan en longitudes de onda de 565, 620 y 650, al encontrarse dentro de un rango de densidad óptica (OD) de 0.05-1.0 (Bennet y Bogorad, 1973). Para las lecturas de absorbancia, se puede utilizar un espectrofotómetro con rango de operación en el espectro ultravioleta- visible.
Ejemplo 1: Proceso propuesto para la recuperación y purificación de BFE producida por Porphyridium cruentum
En referencia a la Figura 1, Porphyridium cruentum es cultivado en un bioreactor (1) bajo condiciones previamente reportadas. Mediante centrifugación (1,000 X G durante 5 min) la biomasa (101) es separada del medio de cultivo gastado (102). A la biomasa se
le agrega agua destilada (4 cm 3 por gramo de biomasa húmeda utilizada) (201) y se lleva a cabo la ruptura celular mecánica (2) de la microalga mediante sonicación (10 min por gramo de biomasa húmeda utilizada). El pH del homogenizado resultante de la ruptura, el cual consiste en la proteína de interés (BFE) y contaminantes (incluyendo restos celulares), es ajustado a 4 mediante la adición de HCl (1.0 N) para llevar a cabo la precipitación isoeléctrica (3), la cual se lleva a una temperatura de 10° C. Para proteger la muestra de una exposición prologada a la luz excesiva (> 20 microeinsteins por metro cuadrado por segundo) se recubre el recipiente con papel aluminio donde es llevada la precipitación isoeléctrica. El precipitado resultante (301, el cual consiste en BFE, restos celulares y otras proteínas con pl similar a BFE) es recuperado, mientras que el sobrenadante (302), pobre en BFE, es eliminado. El precipitado isoeléctrico es resuspendido en buffer de fosfatos (20 mM pH 7) y alimentado a los sistemas de dos fases acuosas PEG - fosfato de potasio (4). Una vez agregado el precipitado se mezcla el sistema utilizando un agitador por inversión (60 rpm durante 10 min) y se lleva a cabo la separación de las fases mediante o centrifugación (1000 X G durante 10 min). La fase superior (401, conteniendo BFE) es recuperada mediante succión utilizando una pipeta, mientras que la fase inferior (402) es desechada una vez que la fase superior ha sido recuperada La fase superior recuperada (401) es ultrafϊltrada utilizando una celda de ultrafiltración escala laboratorio (5). La fase superior recuperada es colocada dentro de la cámara de ultrafiltración en la cual la membrana de ultrafiltración fue colocada con anterioridad. Se utilizó una membrana de 50 kDa de tamaño de poro y nitrógeno como gas propelente a una presión de 30 psi, para de dicha manera separar el polímero (501, el cual pasa a través de la membrana de ultrafiltración) de la BFE (502, la cual es retenida en la membrana). La BFE obtenida mediante este proceso tiene pureza analítica (Abs 545nm/280nm > 4).
Ejemplo 2: Ruptura celular para la liberación del colorante proteico
En referencia particular a la Figura 2, las proteínas colorantes intracelulares (BFE, AFC y RFC) producidas por Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 fueron liberadas por los métodos de ruptura celular por maceración manual y por sonicación. La biomasa producida por el cultivo de Porphyridium cruentum ATCC No. 50161 fue recuperada por centrifugación a 5 g por 5 min. La ruptura celular por maceración manual se realizó en un mortero cerámico pre-enfriado en un baño de hielo. El mortero fue adicionado con biomasa húmeda, y por cada gramo de biomasa utilizada, se agregaron 4 cm 3 de
agua bidestilada y 0.98 g de polvo de vidrio. El tiempo de maceración se estimó considerando la cantidad de biomasa húmeda utilizada, siendo este de 15 min por gramo. La ruptura celular por sonicación se realizó utilizando un sonicador Branson 1510. Se agregaron 5 gramos de biomasa húmeda en un tubo de vidrio con capacidad de 50 cm 3 . A la biomasa húmeda se le agregaron 20 cm 3 de agua destilada. La mezcla se agitó manualmente utilizando una varilla de vidrio generando movimientos circulares para suspender las células. Se introdujo el tubo de vidrio en el sonicador. Se sometió la suspensión de células a sonicación por 50 minutos. El análisis del homogenizado celular resultante mostró una concentración de BFE liberada mediante sonicación fue 5.5 veces mayor a la obtenida mediante maceración manual. Considerando un volumen total de extracto crudo de 25 cm 3 (con una densidad aproximada de 1.2 g/cm 3 ), se logran obtener 5.5 mg de BFE. La pureza de BFE obtenida en el extracto crudo fue de 0.7 (Abs 545nm/280nm = 0.7). Las concentraciones de B-ficoeritrina (BFE), R-fϊcocianina (RFC) y aloficocianina (AFC) fueron estimadas utilizando el sistema de ecuaciones reportado por Bermejo et al, 2002.
Ejemplo 3: Precipitación isoeléctrica del extracto de BFE
Se prepararon 50 cm 3 de extracto crudo de BFE (con una concentración de 0.2 mg BFE/cm 3 ) y se separaron en alícuotas de 1.5 cm 3 en tubos para microcentrífuga. El contenido de diferentes tubos fue ajustado a diferente pH (1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 y 6.5) para determinar a que valor ocurría la precipitación isoeléctrica. El pH se ajustó utilizando HCl (0.1 N)- Cada tubo fue agitado por inversión (60 rpm durante 2 min) y posteriormente se dejó reposar 10 min a 10 0 C para que la aglomeración de BFE tomara lugar. Posteriormente se llevó a cabo una centrifugación a 200 X G durante 10 min. Una vez llevada a cabo la centrifugación el sobrenadante fue eliminado mediante decantación. El precipitado fue resuspendido en 1.5 cm 3 de buffer de fosfatos (20 mM, pH 7.0). Se estimó la concentración de BFE en el extracto crudo resuspendido, así como la pureza de BFE (Abs 545nm/280nm) para cada valor de pH. Se determinó que el extracto resuspendido logra una mayor pureza cuando se ajusta el pH entre 3.5 y 4.5 (ver Figura 3). El porcentaje de recuperación de BFE relacionado con la etapa de precipitación isoeléctrica es 78% aproximadamente.
Ejemplo 4: Purificación del precipitado de BPE utilizando sistemas de dos fases acuosas
Para construir un sistema de dos fases acuosas de 5Og de peso total (29% p/p PEG 1000 g/gmol, 9% p/p fosfato de potasio, 40% p/p precipitado resuspendido BFE) en un tubo de plástico cónico con capacidad de 50 cm 3 se mezclaron 18.1 g de solución PEG 1000 g/gmol (80% p/p), 11.3 g de solución de fosfato de potasio (40% p/p), 20.0 g de extracto resuspendido (obtenido mediante precipitación isoeléctrica) y 0.6 g de agua destilada. El contenido del tubo se agitó por inversión (60 rpm durante 10 min) y posteriormente se llevó a cabo una centrifugación a 200 X G durante 10 min. Posteriormente la fase superior del sistema se recuperó (volumen total de fase superior recuperada de 39 cm ). La concentración de BFE en la fase superior del sistema fue de 0.055 mg/cm 3 , dando una masa total de BFE en fase superior de 2.14 mg. Debido a que se alimentaron 2.33 mg de BFE en el sistema se tuvo una recuperación del 92% de BFE en la fase superior del sistema de dos fases acuosas. La pureza de BFE en la fase superior del sistema fue de 4.1 (pureza grado analítico, aceptable para aplicaciones en biología molecular). La recuperación global de BFE del proceso (considerando las pérdidas durante la precipitación isoeléctrica y en el sistema de dos fases acuosas) es aproximadamente 72%. En la Tabla 2 se pueden observar los rendimientos de las etapas de ruptura celular, precipitación isoeléctrica y sistemas de dos fases acuosas, así como el rango de pureza de BFE obtenido en cada una de ellas.
Tabla 2. Rendimientos de las etapas de la ruptura celular
Rango pureza BFE
Rendimiento Etapa de proceso (Abs 545nm/Abs Rendimiento etapa acumulado 280nm)
Ruptura celular
0.6 - 0.8 100% 100%
(sonicación)
Precipitación
1.6 - 2.0 78% 78%
Isoeléctrica (pH 4)
Sistemas de Dos Fases
4.0 - 4.2 92% 72%
Acuosas