【발명의 명칭】

호흡기관 대체 삼차원 지지체 및 이의 제조방법

【기술분야】

본 발명은 호흡기관 대체제 및 삼차원 인쇄법을 이용한 이의 제조방법에 관한 것이다.

【배경기술】

세계보건기구 (Wor ld Heal th Organi zat ion, WHO)의 조사에 따르면, 선진국의 10대 사망원인 중 기관지 질병 및 폐암이 3위를 차지하고 있다. 또한， 최근 의학의 발달로 인한 미숙아의 생존율이 증가하고 인구의 고령화로 인해 장기간 집중치료를 받아야 할 환자의 수가 증가함에 따라， 장기간의 기관삽관술 ( intratracheal intubat ion)로 인한 호흡기관 관련 결손의 발생비율이 높아지고 있다. 일반적인 성인의 경우， 기관의 내경이 8 誦로 좁아지면 호흡곤란이 발생하며， 6 誦로 좁아지면 일상 생활이 힘들 정도의 호흡곤란이 발생한다. 4 匪까지 좁아지면 부호흡근까지 총 동원하여 호흡을 하는 호흡부전 직전의 상태에 빠지게 된다.

호흡기관 결손의 경우， 결손이 일어난 부위를 절제하고， 절단된 상단부와 하단부의 끝단을 봉합하는 기관절제 및 단단문합술 (tracheal resect ion and end-to-end anastomosi s)이 가장 보편화된 표준 수술로 알려져있다. 하지만 병변의 길이가 광범위한 경우나， 소아에서 선천성 기관결손이 발생한 경우에는 문합부의 과도한 긴장으로 인해 이의 적용이 어렵다. 일반적으로 성인의 경우， 전체 기관 길이의 절반 이내로 절제가 가능하며， 유소아의 경우 기관조직이 성인보다 약하여 전체 길이의 1/3 정도로 제한된다.

따라서 광범위한 호흡기관 결손을 치료하기 위해서는 절제된 결손 부위를 대체할 수 있는 삼차원 도관형 구조체가 필요하다. 이를 위해 줄기세포 및 경성 지지체를 이용한 다양한 조직공학적 방법들이 시도되고 있지만， 대부분은 국소 범위에서의 호흡점막상피 및 기관연골 조직재생에 대한 연구이다. 호흡기관의 광범위한 원형결손 재건에서는 이식된 지지체 내부 표면에서의 호흡점막상피 형성부전이 보고되고 있으며， 호흡기관의 유연성 ( f l ex i b i l i ty) 및 개방성 (patency)을 확보하지 못한 경상 지지체는 문합부에서의 과도한 긴장으로 인한 육아종의 과도성장 및 기관폐쇄의 문제점을 야기시킨다. ^'

이러한 측면에서 볼 때， 호흡기관의 광범위한 원형결손 재건을 위해서는 호흡기관의 기계적 생물학적 특성 및 호흡점막상피와 기관연골의 동시 재생을 함께 고려한 새로운 형태의 조직공학적 지지체가 필요하다.

【발명의 상세한 설명】

[기술적 과제]

이에， 본 발명의 일예는 길이방향으로 요철형상 주름과 홈을 외측 및 내측의 적어도 일면에 갖는 밸로우즈 프레임， 상기 밸로우즈 프레임의 내측면에 형성된 점막부 및 상기 홈의 원주를 따라 형성된 환형 연골부를 포함하는， 인공 호흡기관 대체제를 제공한다.

또한， 본 발명은 삼차원 인쇄법을 이용하여, 녹인 열가소성 수지를 노즐을 통해 분사 및 무분사를 반복 수행하고， 각 구간에서의 분사해드의 이동속도를 가변적으로 조절하며， 분사 구간의 거리 및 무분사 구간의 거리를 조절하여 공극을 갖는 다공성 밸로우^ 프레임을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 삼차원 인쇄법을 이용하여 열가소성 수지 용융물을 분사해 요철형상 주름과 홈을 외측 및 내측 중 적어도 일면에 갖는， 바람직하게는 내측 및 외측에 갖는 다공성 밸로우즈 프레임을 제조하고， 바이오잉크를 사용해 다공성 밸로우즈 외부면의 요철구조 홈에 환형 연골부를 제조하고 내측에는 점막부를 제조하는, 인공 호흡기관 대체제 제조 방법을 제공한다.

[기술적 해결방법】

본 발명에서는 밸로우즈 구조를 기본으로 하여 인체 내 호흡기관과 유사한 해부학적 특성을 가지는 새로운 호흡기관 대체제를 개발하였다. 밸로우즈 구조를 차용함으로써 유연성 및 개방성을 가지는 인체 호흡기관과 유사한 기계적 거동을 가질 수 있고， 호흡기관의 호흡점막상피와 기관€골의 동시 재생을 가능하게 하는 새로운 형태의 조직공학적 지지체이다. 이러한， 밸로우즈 프레임의 제작을 위해 분사방식 기반의 삼차원 인쇄 기술을 이용하여 다공성 중공벽 형태의 구조물을 제작할 수 있는 새로운 인쇄 방법을 개발하였다. 또한， 밸로우즈 프레임의 인쇄와 세포가 포함될 수 있는 연골부 및 점막부의 인쇄를 분리함으로써 호흡기관 대체제의 기계적， 재료적 물성을 향상시켰고， 세포의 생존 및 기능을 보장할 수 있는 최적화된 인쇄 공정을 개발하였다. 이와 더불어， 호흡기관 대체제의 기계적 물성 변화를 최소화하면서 세포가 포함될 수 있는 연골부의 체내 흡수를 방지하기 위해 호흡기관 대체제 외부에 결합되는 연골부 흡수 방지부를 개발하였다.

본 발명은 밸로우즈 프레임을 기반으로 하여 인체 내 호흡기관의 기계적 특성인 유연성 및 개방성을 그대로 모사할 수 있다. 따라서 이식된 이후 인체 내 기관과 이식된 대체제 사이의 기계적 물성차이로 인한 수술 후 부작용을 최소화할 수 있고 , 호흡기관 대체제를 이식 받은 환자의 안정을 효과적으로 유지할 수 있을 것으로 기대된다. 또한， 호흡기관 대체제는 호흡점막상피와 기관연골의 동시 재생을 고려함으로써 인체 내 호흡기관의 완벽한 재건을 이를 수 있다는 점에서， 기존 기관재건에 이용되었던 지지체의 한계를 극복하며， 난치성 기관 결손을 근본적으로 치료할 수 있는 새로운 맞춤형 의료기기라 할 수 있다.

또한, 본 발명에서의 삼차원 호흡기관 대체제 제조방법은 밸로우즈 프레임의 프린팅 공정과 세포가 포함될 수 있는 연골부 및 점막부의 프린팅 공정이 분리된 새로운 방식의 삼차원 프린팅 기반 제조 공정이다. 세포가 전체 프린팅 공정에 포함된 기존의 프린팅 방식과 달리 세포가 프린팅 공정에 이용되는 시간을 최소한으로 단축하여 프린팅에 이용된 세포의 생존 및 기능을 효과적으로 보장할 수 있고， 이는 삼차원 호흡기관 대체제의 성능을 극대화시킬 수 있다는 것을 의미한다. 또한， 밸로우즈 프레임의 프린팅 공정과 연골부 및 점막부의 프린팅 공정 사이에 열처리 공정을 추가함으로써， 층간 결합력이 좋지 않은 분사 기반 프린팅 기술의 한계를 극복하였다. 이와 더불어， 산소 플라즈마 처리 공정의 추가는 밸로우즈 프레임 제조에 이용되는 재료의 물성 (표면 친수성 )을 향상시켜 더욱 견고한 호흡기관 대체제 제조를 가능하게 하였다. 열처리 및 산소 플라즈마 처리 공정은 밸로우즈 프레임의 프린팅 공정과 세포가 포함될 수 있는 회전 프린팅 공정의 분리로 인해 추가될 수 있고， 이와 같은 분리된 프린팅 방식의 개발로 인체 내 호흡기관의 기계적 ·생물학적 특성을 그대로 모사한 호흡기관 대체제의 제조가 가능한 것이다.

또한， 본 발명에서의 다공성 밸로우즈 프레임은 호흡기관뿐만 아니라, 인체 내 모든 도관형 장기 재건을 위한 구조체 제작에 표준화된 모델로서 활용될 수 있을 것이다. 또한， 다공성 밸로우즈 프레임의 제조방법과 회전 프린팅 방식은 다양한 도관형 장기의 재건을 위한 새로운 구조체 제작에도 적용될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 예에 따른 다공성 밸로우즈 프레임은 생체재료를 사용해 삼차원 프린팅 방법으로 용이하게 제작할 수 있으며， 밸로우즈의 형상 및 치宁를 자유자재로 변경할 수 있고， 이는 서로 다른 크기의 기도를 가지고 있는 환자에게 맞춤형 호흡기관 대체제를 제공할 수 있으며， 호흡기관 손상 범위에 대해서도 한계가 없는 장점이 있다. 이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

인체의 호흡기관은 기능성 복합 관상골격 (tubular frame) 구조체로서， 내부로부터 호흡점막상피 (mucous epithelium)와 점막고유층 (lamina propria)으로 구성되는 호흡점막， 점막하조직 (submucosa), 기관연골 (tracheal cartilage), 외막 (adventitia)의 총 4개의 층으로 이루어져 있다 (도 1 참조).

기관연골은 유리연골 (hyaline cartilage)로 구성된 연골구조이며， 호흡기관 둘레의 약 2/3 가량을 둘러싸고 있는 "C" 형태의 불완전한 고리형 구조로 몸의 앞쪽을 향하고 있다. 기관연골은 개인마다 그 개수에 차이가 있으며， 호흡기관의 전체 길이에서 보통 15~20 개가 분포되어 있고， 길이 방향의 두께는 대략 4 ram 정도이다. 또한, 기관연골의 반경방향 두께는 대략 1 내지 1.5 mm 정도로 알려져 있다. 기관연골 사이에는 환상인대 (annular ligament)가 존재한다. 호흡기관의 내부 직경은 대략 18 ram 정도이며， 기관연골의 앞뒤지름은 남자에서 대략 21 mm, 여자에서 대략 17 讓이며， 가로지름은 남자에서 대략 21.5 mm, 여자에서 대략 17 mm 정도이다. 본 발명의 일예는 길이방향으로 요철형상 주름과 홈을 외측 및 내측 중 적어도 일면에 갖는 표면 요철구조를 갖는 밸로우즈 프레임 (bel lows frame)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 길이방향으로 요철형상 주름과 홈을 외측 및 내측 중 적어도 일면에 갖는， 바람직하게는 내측 및 외측에 갖는 표면 요철구조를 갖는 밸로우즈 프레임 (bel lows frame)과 상기 밸로우즈 프레임의 내측 면에 형성된 점막부 (tracheal epi thel ium part ) , 및 상기 밸로우즈 프레임의 외측 면 홈의 원주를 따라 형성된 환형 연골부 (tracheal cart i lage part )를 포함하는， 인공 호흡기관 대체제를 제공한다.

본 발명에 따른 밸로우즈 프레임은 인체 호흡기관의 해부학적 구조 및 특성을 고려하여 설계한 것이며 (도 2 참조)， 보다 구체적으로， 상기 표면 요철구조를 갖는 밸로우즈 프레임은 유연성과 개방성을 가지며， 형상 유지에 용이하고 상기 점막부는 호흡점막상피조직의 재생을 위한 것으로서， 밸로우즈 프레임 내부표면 일부 또는 전부를 덮는 구조를 가지고, 연골부는 기관연골 재생을 위한 부분으로 밸로우즈 프레임의 외부 주름 (convolut ion) 사이의 홈 (g _{r oove} )의 원주를 따라 환형으로 형성되어 있는 구조이다.

본 발명의 추가 일 예에서, 본 발명에 따른 인공 호흡기관 대체제는 상기 밸로우즈 프레임， 점막부 및 연골부에 더하여, 상기 환형 연골부를 포함하는 밸로우즈 프레임의 외부면을 둘러싼 연골부 흡수 방지부를 추가로 포함할 수 있다. 상기 연골부 흡수 방지부는 호흡기관 대체제의 기계적 물성 변화를 최소화하면서 세포가 포함될 수 있는 연골부의 체내 흡수를 방지하기 위해 호흡기관 대체제 외부에 결합되는 것이다.

한편， 본 발명의 일예에 따른 호흡기관 대체제의 프레임은 인체 내 호흡기관과 유사한 기계적 거동을 구현할 수 있도록 벨로우즈 형태를 지닌다. 밸로우즈는 원형 실린더 (cyl inder ) 표면에 주름이 만들어진 구조로서, 실린더 형상과 비교하여 반경방향 압축에 대한 저항이 크고， 유연성 및 개방성이 높은 기능성 구조이다. 상기 밸로우즈 프레임은 단위 길이당 주름의 수， 주름각 ( incl inat ion angle)의 크기 및 벽 두께에 따라서 유연성이 달라지며， 이들은 이식하고자 하는 환자의 실제 호흡기관의 해부학적 치수에 따라 변형 가능하다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 밸로우즈 프레임은 도 16에 나타낸 바와 같이, 바깥 면에서 보았을 때 길이방향으로 외부로 도출된 주름과, 주름과 주름 사이에 내부로 들어가 있는 홈이 외측면에 존재하는 구성을 가진다. 주름과 홈 사이의 주름각은 0 ^° 내지 45 ^° 로 변형 가능하며， 홈의 길이방향 두께는 0 내지 5 mm, 예를 들면 인체 내 호흡기관 연골의 길이방향 두께와 동일한 4 mm일 수 있고, 주름의 길이는 1 내지 5 mm(주름의 길이가 없을 시를 삼각형 주름이라 하고， 삼각형 주름일 때의 최소 길이가 2 mm이다. )， 예를 들면 3匪일 수 있다.

상기 밸로우즈 프레임은 공극 없이 제작할 수도 있고， 공극을 갖는 다공성으로도 제작할 수 있으나， 인체 내에 이식되었을 때， 효과적인 혈관 형성 및 점막조직 재생을. 위해 다공성 (poros i ty)을 가지도록 제작함이 바람직하다. 본 발명의 일예에 따라 공극을 갖는 다공성 벽은， 공극율이

50 % 이하, 예를 들면 20 내지 50 % 일 수 있으며, 지름 또는 변의 길이가 260 내지 300 ； 인 공극 (pore)을 가질 수 있다. 상기 공극은 밸로우즈 프레임의 사용 용도에 따라， 밸로우즈 프레임의 재료 인쇄 시, 재료 분사 /무분사 구간 (재료 분사 0N/0FF) 제어， 각 구간에서의 분사 헤드의 이동 속도， 공압의 세기， 재료 분사 속도 (단위 시간 동안 분사되는 재료의 양) 등을 조절함으로써 적합하게 조정할 수 있다.

상기 밸로우즈 프꿰임은 열가소성 수지를 사용해 제조할 수 있으며， 사용 가능한 열가소성 수지는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나， 폴리카프로락톤 (Polycaprol actone ; PCL) , 폴리락테이트-코— 글라이콜레이트 (poly( lactate-co-glycol ate)ᅳ PLGA) , 폴리유산 (Poly Lact i c Acid , PLA) , 폴리우레탄 (polyurethane , PU)， 폴리락테이트-코- 카프로락톤 (poly( l act ide-co-caprol actone) , PLCL)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며， 바람직하게는 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone ; PCL)일 수 있다. 특히， 폴리카프로락톤의 경우 비교적 낮은 은도에서 분사되기 때문에 세포와 함께 프린팅 되었을 때 높은 세포 생존율을 가지는 바， 사용하기 적절하다.

본 발명의 밸로우즈 프레임은 친수성을 가지도록 제작하는 것이 바람직하며，예를 들면， 물 접촉각이 50 ^° 이하， 또는 20 내지 50° 일 수 있다. 밸로우즈 프레임이 소수성 (hydrophobi ci ty)을 가지고 있다면, 프레임 외측면과 내측면에 인쇄된 연골부와 점막부가 체외 배양 과정에서 밸로우즈 프레임으로부터 분리될 가능성이 크므로， 밸로우즈 프레임 제조용 재료로 제작된 밸로우즈 프레임의 친수성을 높이는 것이 필요하다. 본 발명의 일 예로서， 밸로우즈 프레임은 친수성을 가지도록 플라즈마 처리， 바람직하게는 산소 플라즈마 처리를 수행할 수 있으며， 보다 구체적으로， 열가소성 수지， 예컨대 PCL로 제작한 밸로우즈 프레임을 플라즈마 처리시킨 후, 프레임 표면에 물방울을 떨어뜨리고 표면과 물방을 사이의 접촉각을 측정한 결과， 측정된 접촉각이 50 ^° 이하의 수치를 나타냄을 확인하였다. 본 발명의 일 예에 따른 호흡기관 대체제의 밸로우즈 프레임 내부 표면은， 실제 호흡가관의 내부 표면이 호흡 점막 상피조직으로 덮여있는 점을 고려하여, 점막부로 이루어질 수 있으며， 밸로우즈 프레임의 의측면 홈을 따라 형성된 환형 연골부를 포함할 수 있다.

상기 밸로우즈 프레임의 외측면 홈에 형성되는 연골부는 인체 내 호흡기관의 연골재생을 고려하지 않고 단순히 연골을 대체하기 위한 목적일 경우, 호흡기관 연골조직 재생을 방지하기 위한 의료용 실리콘 등과 같은 비-생분해성 생체재료 고분자， 즉, 인체 내에 이식되어도 해가 없으며 인체 내에서 분해되지 않는 재료를 사용할 수 있다.

한편, 점막부 및 연골부의 재료로 겔화 고분자를 사용할 수 있으며， 필요에따라 세포와 성장인자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 점막부 및 연골부는 (a)겔화 고분자， (b)겔화 고분자와 세포， (c)겔화 고분자와 성장인자， 또는 (d)겔화 고분자， 세포 및 성장인자를 포함하는 조합알 수 있다.

상기 점막부 및 연골부에 사용되는 겔화 고분자의 종류는 콜라젠 (col lagen) , 알지네이트 (alginate) , 히알루론산 (hyaluroni c acid) 및 탈세포화 조직 유래 하이드로젤 (decel hil ar i zed t i ssue der ived hydrogel ) 등 광범위한 선택이 가능하다. ^'

점막부 겔화 고분자에 포함할 수 있는 세포로, 점막세포 (epi thel i al cel ls) , 줄기세포 (stem cel ls) 등 다양한 세포 및 이들의 조합이 가능하며 _: 점막부에 포함되는 성장인자는 형질전환성장인자 베타 1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β 1), 간세포성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF) , 각질세포성장인자 (kerat inocyte growth factor, KGF)， 상피성장인자 (epithelial growth factor, EGF)， 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 및 인슐린성장인자 (insulin-like growth factor, IGF) 등과 같은 점막조직 재생에 효과적인 성장인자를 1종 이상 포함 할 수 있다.

또한， 상기 연골부 겔화 고분자는 필요에 따라， 세포 또는 연골재생에 효과적인 성장인자를 포함할 수 있다. 연골부 겔화 고분자에 포함할 수 있는 세포로는， 연골세포 (chondrocytes), 줄기세포 (stem cells) 둥 다양한 세포 및 이들의 조합이 가능하며， 연골조직 재생에 효과적인 성장인자로는 FGF, 뼈 성형 단백질 (bone morphogenetic protein, BMP-2) , 형질전환성장인자 베타 (transforming growth factor-β ), TGF-β 1, TGF- β2, TGF-P3, 인술린， TGF-l, TGF- α , Osteolectin, IGF-1 또는 NGF를 등과 같은 성장인자를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일예는 삼차원 인쇄법을 이용한 밸로우즈 프레임 및 이를포함하는 호흡기관 대체제의 제조방법을 제공한다.

일반적으로 삼차원 인쇄 기술을 기반으로 제작되는 호흡기관 대체제는, 희생층 (sacrificial layer)의 사용 유무에 따라서 두 가지 방식으로 나뉠 수 있다. 첫 번째 방식은 인쇄 공정에 희생층의 인쇄를 포함한 방식으로， 한 번의 인쇄 공정으로 호흡기관 대체제를 제작할 수 있다 (도 3 참조). 첫 번째 방식에서는 분사 (dispensing) 방식 삼차원 인쇄 시스템에서 4개의 분사 헤드 (dispensing head)를 이용한다. 총 4개 종류의 재료가 분사 헤드 내부의 시린지 (syringe) 에 탑재 (loading)되고, 필요에 따라 각각의 시린지는 내부 재료를 녹이기 위해 가열되기도 한다. 시린지 안의 재료는 물리적 힘, 예를 들면, 공압 (air pressure), 스크류, 또는 플런저 (plunger)를 이용하여 시린지 끝단의 노즐 (nozzle)을 통해 분사된다.

도 3에 나타낸 바와 같이， 본 발명에서 4개의 분사헤드를 갖는 인쇄장치를 사용하는 경우， 분사헤드 #1에는 밸로우즈 프레임 인쇄용 재료 (재료 #1)， 분사 헤드 #2에는ᅳ 희생층 인쇄용 재료 (재료 #2)， 분사헤드 #3에는 점막부 인쇄용 재료 (재료 #3)， 분사헤드 #4에는 연골부 인쇄용 재료 (재료 #4)가 탑재된다. 구체적 일 예로서 도 3에 나타낸 바와 같이， 재료 #1이 먼저 분사되고 (도 3(A) ) , 다음으로 재료 #2가 원형으로 인쇄된 재료 #1의 내부와 외부 주변에 동일한 간격을 두고 분사된다 (도 3(B) ) . 같은 위치에 재료 #1과 재료 #2가 분사되어 적층되고 (도 3(C) ) , 일정 높이가 적층되면， 재료 #1과 재료 #1의 내부에 인쇄된 재료 #2 사이의 빈 공간에 재료 #3이 1회 분사된다 (도 3(D) ) .

다음으로 재료 #1과 재료 #2가 다시 순차적으로 반복 분사된다. 이 때, 재료 #1은 밸로우즈 형상을 제작하기 위해 분사 및 적층되고， 재료 #2는 같은 위치에 계속 분사되어 실린더 형태로 적층된다 (도 3(E) , (F) ) . 분사된 재료 #1과 재료 #2가 일정한 높이에 도달하면, 재료 #1과 재료 #1의 내부에 인쇄된 재료 #2사이의 빈 공간에 재료 #3이 한 번 분사되고 재료 #1과 재료 #1의 외부에 인쇄된 재료 #2사이의 빈 공간에 재료 #4가 한 번 분사된다 (도 3(G) ) .

이와 같은 방식으로 재료 #1， #2， #3， #4의 순차적인 분사 및 적층을 통해 (도 3(H)~(L) ) , 도 3(M)과 같은 구조물을 제작할 수 있다. 이 후， 희생층 (재료 #2)을 녹여냄으로써 그림 3(N)과 같은 호흡기관 대체제를 최종적으로 얻을 수 있다.

첫 번째 방식에 따라 희생층을 이용한 삼차원 인쇄 기반 호흡기관 대체제의 제작은 한번의 재료 탑재로 호흡기관 대체제의 전체 제작이 가능하다. 하지만， 4개의 분사헤드를 사용함으로써 인쇄 공정이 복잡해지고， 지지체의 크기가 증가함에 따라 인쇄 시간이 길어지는 등의 단점이 있다. 인쇄 시간의 연장은 분사헤드 내부 시린지에 탑재된 재료 안의 세포의 괴사로 이어질 수 있고， 이는 지지체를 이용한 호흡기관 재건에 악영향을 미칠 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 일예는 희생층의 분사 및 적층을 이용하지 않고， 삼차원 인쇄법을 이용한 호흡기관 대체제의 쎄조방법으로서， "밸로우즈 프레임의 인쇄 공정"과 "세포를 포함한 점막부 및 연골부의 순차적인 인쇄" 공정으로 나뒤는 새로운 제조방법을 제공한다. 상기 희생층을 사용하지 않는 두 번째 제조 방식에서는 밸로우즈 프레임 제조용 재료 #1을 이용하여 먼저 밸로우즈 프레임을 제작한다. 밸로우즈 프레임은 관형으로 제조될 수 있으며 다공성 벽체 (wal l )로 제조할 수 있다. 밸로우즈 프레임은 호흡기관 대체제가 인체 내에 이식되었을 때， 효과적인 혈관 형성 및 점막조직 재생을 위해 다공성 벽체를 갖는 것으로 제작되는 것이 바람직하며, 예를 들면 260 - 300 의 공극 (pore)을 가지거나， 공극율인 20 ~ 50 %인 다공성 (porosi ty)을 갖는 것으로 제조할 수 있다.

보다 구체적으로， 재료를 분사할 때 (분사구간)와 분사하지 않을 때 (무분사구간)에서 분사헤드의 이동 속도를 가변적으로 제어하여， 공극을 갖는 다공성 밸로우즈 프레임을 제조할 수 있다. 가변적 속도 제어란， 재료를 분사할 때의 속도와 재료를 분사하지 않을 때의 속도에.차이를 두어 구조상 특징을 만들어 내는 것을 의미한다. 즉， 외벽을 만들기 위해서는 분사헤드가 재료를 분사하면서 A의 속도로 이동을 하고， 중간에 공극을 형성하기 위해서 재료 분사를 멈춘 채 B의 속도로 이동시킴으로써 다공성 프레임을 형성한다. 예를 들어， 도 4에 나타낸 바와 같이， 다공성 밸로우즈 프레임은 재료 #1의 인쇄 시 분사헤드의 이동 및 이동속도， 그리고 재료의 분사를 조절함으로써 다공성의 도관형 밸로우즈 프레임을 제작할 수 있다. 삼차원 인쇄기의 분사 헤드가 밸로우즈 프레임의 인쇄용 재료 #1을 분사하며 일정한 속도로 이동하다가 (도 4(A) ) , 분사를 멈춘 상태에서 빠른 속도로 일정 구간 이동한다 (도 4(B) ) . 이 때 헤드 노즐 끝에 남아있던 재료 #1이 필라멘트 ( f i lament )를 형성하며 늘어지며 이동 구간의 중간 부분에서 빈 공간 (empty interval )이 발생하게 된다. 그 후 다시 재료 #1을 일정 속도로 분사하면서 헤드를 이송시키면 (도 4(C) ) 점선 형태가 제작되고, 이를 적층하여 다공성의 중공벽 (porous hol low wal l ) 형태의 구조물을 제작할 수 있다. 이 때, 공극은 분사 헤드가 빠른 속도로 이송하는 구간의 중간 부분에 형성된다. 상기, 3D 프린터기로 분사헤드 재료를 분사구간과 무분사구간에서의 분사헤드의 이동 속도를 가변적으로 제어하여, 공극을 갖는 다공성 밸로우즈 구조를 만드는 방법은， 반드시 밸로우즈 프레임을 제작하는 경우에만 한정되는 것은 아니며， 밸로우즈 프레임 외 다양한 다공성 관상구조 (Tubul ar structure)를 만들기 위해， 사용할 수 있다.

본 발명의 일예에 따라 삼차원 인쇄법을 이용하여 밸로우즈 프레임을 제조하는 방법으로서， 바람직하게는 상기 밸로우즈 프레임은 공극을 갖는 다공성 및 /또는 요철구조를 갖는 것일 수 있다. 상기 밸로우즈 프레임을 제조하는 방법은 ( _a ) 열가소성 수지를 시린지에 투입하고 가열하여 열가소성 수지 용융물을 제조하는 단계; 및 (b) 물리적 힘을 가하여， 삼차원 인쇄기의 분사헤드 노즐 (nozzle)을 통해 열가소성 수지를 분사하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 일예에 따라 삼차원 인쇄법을 이용하여 인공 호흡기관 대체제를 제조하는 방법으로서， 상기 밸로우즈 프레임을 제조하는 단계에 더하여， 상기 밸로우즈 프레임의 외측 면에 홈의 원주를 따라 연골부 형성용 바이오잉크를 인쇄하여 환형 연골부를 제조하는 단계, 및 상기 밸로우즈 프레임의 내측 면에 점막부 형성용 바이오잉크를 인쇄하여 점막부를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 환형 연골부는 연골부 형성용 바이오잉크를 상기 밸로우즈 프레임의 외부면 요철구조 홈의 원주를 따라 인쇄하여 제조하고， 상기 점막부는 점막부 형성용 바이오잉크를 상기 밸로우즈 프레임의 내측면에 인쇄하여 제조한다. 상기 연골부의 제조 및 점막부의 제조는 동시 또는 순차로 진행될 수 있다. 본 발명의 일예에 따라 삼차원 인쇄법을 이용하여 밸로우즈 프레임의 제조방법 및 인공 호흡기관 대체제의 제조방법을 각 단계별로 상세히 설명하고자 한다.

( 1) 밸로우즈 프레임의 제조 단계

본 발명의 제조방법에 따라 밸로우즈 프레임을 제조하는 단계로서，

(a)열가소성 수지를 시린지에 투입하고 가열하여 열가소성 수지의 용융물을 제조하는 단계; 및 (b) 물리적 힘， 예를 들면， 공압 (ai r pressure) , 스크류 (screw) , 또는 플런저 (plunger )를 이용하여 시린지 끝단의 노즐 (nozzl e)을 통해 열가소성 수지의 용융물을 분사하는 단계를 수행하여， 요철구조를 갖는 다공성 밸로우즈 프레임을 제조할 수 있다.

추가적으로， 상기 제조방법으로 얻어진 밸로우즈 프레임 프레임의 재료적, 구조적, 기계적 물성 등을 향상시킬 수 있는 다양한 처리 (treatment ) 공정을 추가로 수행할 수 있으며， 예를 들어 열처리 및 산소 플라즈마 처리공정으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정을 수행할 수 있다. 또한， 밸로우즈 프레임의 열처리와 산소 플라즈마의 처리 순서는 순서를 뒤바꾸 "1 수행할 수 있으며， 반드시 열처리 후 산소 플라즈마 처리를 수행해야하는 것은 아니다.

상기 단계의 열가소성 수지는 시린지에 봉입시킨 후 60 내지 200， 바람직하게는 65 내지 90로 가열하여 얻어진 용융물을 분사하여 인쇄하며， 분사시 용융물 분사 구간 및 무분사 구간을 설정하고 이를 반복 인쇄하여 다공성을 가지는 밸로우즈 프레임을 제작할 수 있다. 보다 구체적으로， 열가소성 수지의 용융물의 분사 구간에서 분사헤드의 이동속도를 조절하여， 다공성 밸로우즈의 두께를 조절하고, 무분사 구간에서 분사해드의 이동 속도를 조절하여， 공극의 크기와 공극를을 조절한다.

상기 용융물의 분사는 400 내지 600 kPa 공압을 가해 분사헤드의 이동속도 60 내지 150 nm/min , 바람직하게는 70 내지 100 nm/min , 예를 들어 80 내지 90 nm/rain 로 분사할 수 있으며, 공극형성 구간인 무분사 구간 (도 4의 B 구간)의 거리는 300 내지 800 urn 바람직하게는 400 내지 700 μΏΐ , 예를 들어 600 이고， 무분사 구간 사이의 거리는 100 내지 1000 이며， 분사헤드를 융용물 분사없이 이동속도 200 내지 600 隱 /min으로 이동시켜 공극을 형성할 수 있다. 위와 같은 조건에서 공극을 형성시 깔끔하고 조밀하게 공극이 가장 잘 형성된다.

보다 구체적으로， 다공성 밸로우즈 프레임을 제작하기 위해 열가소성 수지를 시린지에 투입하고 열처리를 가해 녹인 후， 물리적 힘, 예를 들면, 공압 (ai r pressure) , 스크류 (screw) , 또는 플런저 (plunger )를 이용하여 시린지 끝단의 노즐 (nozz le)을 통해 재료를 분사하며, 재료 분사 시 분사 및 무분사를 반복 수행하여 간극을 형성한다. 예를 들어， 실시예 1에 나타낸 바와 같이， PCL을 60 내지 100 ^° C로 녹여 용융상태로 만든 후， 400 내지 600 kPa 공압， 예를 들어 500 kPa 공압으로 분사속도 80 내지 90 mm/min 예를 들어 85 mm/min로 재료를 분사하고， 재료분사 없이 헤드가 이송되는 구간에서는 재료분사없이 100 내지 600 거리를 305 내지 505 mm/min로 이동시켜 공극을 형성할 수 있다. 상기 방법과 같이 제조할 경우, 공극이 조밀하게 가장 잘 형성된다 (도 5 참조) .

앞서 설명한 바와 같이， 분사 방식의 삼차원 인쇄 기술의 적층 방식을 이용하여 밸로우즈 프레임을 제작할 수 있으나， 이와 같은 방법으로 제조된 밸로우즈 프레임은 적층된 층간의 결합력 (bonding force)이 상대적으로 약하다. 따라서 몰딩 방식을 통해 제작된 구조물과 같은 완벽한 구조적 일체성 (structural integr i ty)을 달성하고자， 밸로우즈 프레임 제작 공정과, 점막부 및 /또는 연골부의 인쇄 공정 사이에， 열 처리 (heat ing treatment ) 공정을 추가하는 것이 바람직하다.

상기 열처리 공정은， 제작된 밸로우즈 프레임의 재료의 녹는점 (mel t ing point )과 같은 온도 하에서 일정 시간 처리 ( incubat i on)하여 수행할 수 있으며， 보다 구체적으로， 40 내지 200 ^° C 범위에서， 바람직하게는 50 내지 70 ^° C , 보다 바람직하게는 55 내지 65 V , 예를 들어 60 에서 처리하는 것이 적절하다. 반웅시간의 경우， 10분 내지 60분 동안 처리하는 것이 적절하며， 바람직하게는 20 내지 50분， 보다 바람직하게는 20분 내지 30분동안 수행할 수 있다. 특히， 도 8에 나타낸 바와 같이 60 ^° C에서 약 25분 동안 열처리할 경우 3점 굽힘 ( three-point bending) 시험에서 거리 -하중 선도의 차이가 가장 적게 나타났는 바， 상기 조건에서 밸로우즈 프레임을 제조할 경우， 우수한 구조적 일체성 물성을 확보할 수 있음을 확인할 수 있다.

또한， 밸로우즈 프레임의 친수성 처리로서， 산소 플라즈마 처리 공정의 경우， 밸로우즈 프레임의 크기， 모양, 용도 등에 따라 유동적으로 처리조건을 변동하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상온에서 50 내지 150 W, 예를 들어， 100 W의 플라즈마 클리너 (Pl asma Cleaner ) 내에 밸로우즈 프레임을 삽입하고 약 30분 내지 3시간 동안， 예를 들어 1시간 내지 2시간 동안 반웅을 수행할 수 있다. 또한， 상기 ^웅 시간 동안 밸로우즈 프레임의 위치를 위 아래로 뒤집는 과정을 한 번 이상 수행할 경우， 프레임의 위치를 변동시키지 않는 경우보다， 동일 시간내 표면 친수성을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 위와 같은 조건에서 산소 플라즈마 처리 공정을 수행할 경우， 하기 실시예 3과 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이， 접촉각 측정기로 측정한 표면과 물과의 접촉각이 50도 이하가 되는 바， 프레임의 표면 친수성이 가장 우수하게 향상 시킬 수 있다.

최종 인쇄된 호흡기관 대체제가 일정시간 체외 배양 후 인체 내 호흡기관에 안정적으로 이식되기 위해서는 점막부와 연골부가 밸로우즈 프레임으로부터 분리되지 않고， 인쇄된 자리에서 잘 유지되고 있어야 한다. 밸로우즈 프레임으로부터 점막부 및 연골부가 분리되는 것은， 밸로우즈 프레임 제조용 재료의 친수성 (hydrophi l ici ty) 및 소수성 (hydrophobi ci ty)에 의존적이다. 만일 밸로우즈 프레임 제조용 재료로 제작된 밸로우즈 프레임이 소수성을 가지고 있다면， 인쇄된 점막부와 연골부가 체외 배양 과정에서 밸로우즈 프레임으로부터 분리될 가능성이 크므로， 필요에 따라 밸로우즈 프레임 제조용 재료로 제작된 밸로우즈 프레임의 친수성을 높이는 것이 바람직하다.

(2) 연골부 및 /또는 점막부의 제조 단계

본 발명에 따른 인공 호흡기관 대체제의 제조방법에서 상기 연골부 또는 점막부를 제조하는 단계는， 상기 밸로우즈 프레임의 외측 면에 홈의 원주를 따라 연골부 형성용 바이오잉크를 인쇄하여 환형 연골부를 제조하는 단계， 및 상기 밸로우즈 프레임의 내측 면에 점막부 형성용 바이오잉크를 인쇄하여 점막부를 제조하는 단계로 수행할 수 있다. 상기 바이오잉크 인쇄를 위해서는 시린지에 바이오잉크를 주입하고 물리적 힘을 가하여 삼차원 인쇄기의 분사헤드 노즐 (nozz le)을 통해 분사하여 수행할 수 있다. 상기 물리적 힘은 예를 들면， 공압 (ai r pressure) , 스크류 (screw) , 또는 플런저 (plunger )를 이용할 수 있다.

본 발명의 일예에 따라 상기 연골부 또는 점막부를 제조하는 단계는 공압 20 kPa 내지 200 kPa , 바람직하게는 30 kPa 내지 150 kPa 및 회전속도 3 내지 180 DPS , 바람직하게는 4.5 내지 33 DPS (degree per second) 조건에서 바이오잉크를 인쇄하여 제조할 수 있으며， 추가적으로 바이오잉크를 인쇄한 후， 가교형성을 위한 공정을 수행할 수 있다. 상기 가교형성 공정은 그 종류를 특별히 한정하지 않으며， 사용하는 바이오잉크의 종류에 따라 가교형성에 적절한 공정을 사용할 수 있다. 예를 들어， 바이오잉크로 콜라젠 또는 탈세포화 조직 유래 하이드로젤을 사용할 경우， 열처리 공정을통해 가교를 형성시킬 수 있다.

상기 연골부의 인쇄의 경우, 바이오잉크로 세포를 포함한 겔화 고분자를 사용할 수 있으며， 일반적으로 바이오 잉크에 포함된 세포의 양과 겔화 고분자의 농도가 높을수록 바이오 잉크의 점도 (vi scos i ty)는 높아진다. 바이오 잉크의 점도가 높을수록 이를 분사하기 위한 공압은 증가할 수 있다. 또한， 연골부를 인쇄하는 데에 이용되는 곡선형 노즐의 겅우， 제작하고자 하는 호흡기관 대체제의 크기， 예를 들면 토끼 동물 실험용 및 개 동물 실험용 등에 따라서 다르게 선택할 수 있으며， 곡선형 노즐의 내경은 0. 15 내지 1.52 mm일 수 있다. 곡선형 노즐의 내경이 작을수록 바이오 잉크를 분사시키는 공압은 증가하며， 바이오 잉크를 분사하기 위해 이용되는 공압은 30 내지 150 kPa , 바람직하게는 50 내지 120 kPa일 수 있다. 또한， 단위 시간당 분사되는 바이오 잉크의 양이 많아질 록 밸로우즈 프레임의 회전속도는 증가하고， 이는 4 내지 35 DPS (Degree per Second) , 예를 들어 4.5 내지 33 DPS 일 수 있다. 구체적으로 실시예 4에 나타낸 바와 같이 , 60 kPa 공압에서 9 내지 10.5 DPS 회전속도， 70 kPa 공압에서 25.5 내지 27 DPS 회전속도로 바이오잉크를 분사할 경우 인쇄된 연골부 재료가 밸로우즈 프레임의 외부 홈의 체적에 맞게 수축되었는 바， 상기 범위가 적절한 연골부 인쇄 조건임을 알 수 있다.

상기 점막부의 인쇄의 경우， 곡선형 노즐을 사용하는 것이 바람직하며 상기 곡선형 노즐의 내경은 0. 15 내지 1.52 mm일 수 있다. 바이오잉크를 분사하기 위해 이용되는 공압은 .20 kPa 내지 200 kPa , 바람직하게는 30 내지 150 kPa, 보다 바람직하게는 50 내지 120 kPa일 수 있으며， 곡선형 노즐의 내경이 작을수록 바이오잉크를 분사시키기 위한 공압은 증가한다. 또한， 벨로우즈 프레임의 회전속도는 3 내지 180 DPS (degree per second)일 수 있으며， 분사되는 바이오잉크의 양이 많아질수록 밸로우즈 프레임의 회전속도는 증가한다. 본 발명의 경우, 밸로우즈 프레임의 내부 홈에 점막부 재료를 인쇄하기 위해서는 연골부의 인쇄와 같은 조건 (120 kPa 의 공압)을 이용하였고 (도 14 참조), 내부 홈을 제외한 다른 내부 표면에 점막부 재료를 인쇄하기 위해서는 연골부의 인쇄 조건보다 두 배 빠른 회전속도 (8 DPS)를 이용하였다.

상기 점막부 및 연골부 인쇄에 사용되는 바이오잉크는 겔화 고분자를 포함할 수 있고， 예를 들어 0.5 내지 5 중량 %의 겔화 고분자일 수 있으며 상기 겔화 고분자는 알지네이트 (alginate), 히알루론산 (hyaluronic acid), 및 탈세포화 조칙 유래 하이드로젤 (decel hilar ized tissue derived hydrogel)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 생분해성인 것이 바람직하다.

또한， 상기 바이오잉크는 세포 및 성장인자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 필요에 따라 점막부의 경우 점막세포 (epithelial cells), 줄기세포 (stem cells) 또는 이들의 흔합물 및 점막조직 재생 성장인자를 포함할 수 있고， 연골부의 경우 연골세포 (chondrocytes), 줄기세포 (stem cells) 또는 이들의 흔합물 및 뼈조직 성장인자를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로， 상기 바이오잉크로 세포를 포함한 하이드로젤을 사용할 경우， 하이드로젤 재료의 농도는 0.5 내지 5 % 일 수 있으며, 상기 세포의 농도는 IX 10 ⁵ 내지 5Xl0 ⁷ /ml일 수 있다. 점막부 형성을 위한 삼차원 인쇄용 바이오잉크에 성장인자를 포함할 경우， 성장인자의 농도는 10 내지 500 ng/ml일 수 있다. ·

한편， 상기 연골부의 용도에 따라, 세포를 포함하지 않은， 비- 생분해성 고분자， 예를 들면 의료용 실리콘을 사용할 수도 있다.

(3) 연골부 흡수 방지부의 제조

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면， 상기 제조방법은, 연골부 외부면에 삼차원 인쇄법으로 연골부 흡수 방지부를 제조하는 단계를 추가로 포함하며， 상기 연골부 흡수 방지부는 생체에서 분해되는 열가소성 수지를 60 ^° C 내지 200 ^° C 로 가열 용융한 용융물을 400 내지 600 kPa 공압으로 분사하여 인쇄하고， 두께가 80 내지 200 보다 바람직하게는， 80 내지 120 urn인 인쇄층을 적어도 하나 이상 적층하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 호흡기관 대체제의 연골부는 호흡기관 외측면 주름 사이에 위치하여 노출되어 있는 형태이다. 따라서 연골부가 비-생분해성 생체재료가 아닌， 하이드로젤 및 세포 또는 성장인자로 이루어져 있을 경우, 호흡기관 대체제가 인체 내에 이식된 이후쎄 연골부가 기관연골로 재생되기 전에 체내 ^' 흡수가 될 가능성이 매우 높다. 따라서 연골부의 체내 흡수를 방지하기 위하여 호흡기관 대체제의 외부 표면을 둘러 쌀 수 있는 연골부 흡수 방지부를 구비하는 것이 바람직하다 .

이 때 , 연골부- 흡수 방지부는 연골부의 체내 흡수를 효과적으로 방지함과 동시에 연골부가 기관연골로 재생되는 데에 방해가 되지 않기 위해 다공성을 가지는 것이 바람직하며， 연골부가 기관연골로 재생된 이후에는 연골부 흡수 방지부가 인체 내에 흡수될 수 있도록 생분해성 재료로 제작하는 것이 적절하다. 또한， 호흡기관 지지체의 기계적 거동특성을 방해하지 않는 것이 바람직하므로 본 발명에서의 연골부 홉수 방지부는 혈관 확장에 이용되는 스텐트와 같은 특정한 패턴을 가질 수 있다. 연골부 흡수 방지부는 프린팅되는 방식에 따라 멤브레인 형태, 또는 중공 실린더 형태로 제작하여 호흡기관 대체제와 함께 이용할 수 있다. 멤브레인 형태로 제작된 연골부 흡수 방지부의 경우， 호흡기관 대체제의 이식 후, 호흡기관 대체제의 연골부를 감싸주는 형식으로 처리할 수 있고, 중공 실린더 형태로 제작된 연골부 흡수 방지부의 경우, 호흡기관 대체제와 미리 결합된 이후에 호흡기관 대체제의 봉합이 이루어질 수 있다. 즉, 호흡기관 대체제를 절단된 형태로 부분적으로 이용할 때에는 멤브레인 형태의 연골부 흡수 방지부를， 온전한 하나 전체를 이용할 때에는 증공 실린더 형태의 연골부 흡수 방지부를 이용하는 것이 좋다.

보다 구체적으로， 상기 연골부 흡수 방지부는 멤브레인형태 또는 관형태로 제작할 시, 용융물을 노즐을 통해 분사할 때 평면에서 스텐트 패턴을 그리며 분사할 수 있으며， 관 형태의 연골부 흡수 방지부는 용융상태의 PCL을 연골부 흡수 방지제 제작을 위한 코드에 따라 희전축의 길이 방향으로 분사하고 이와 동시에 회전축을 스텐트 형태의 패턴을 성형하기 위해 코드에 따라 정지 및 회전시키며， 첫번째 패턴 위에 두번재 패턴을 PCL을 분사하여 층마다 100 씩 두 층， 세 층으로 적층하여 인쇄 제조할 수 있다. 【발명의 효과】

본 발명에서의 삼차원 호흡기관 대체제는 인체 내 호흡기관의 기계.적 ᅳ 생물학적 특성을 고려한 새로운 형태의 지지체이다. 밸로우즈 프레임을 기반으로 하여 인체 내 호흡기관의 기계적 특성인 유연성 및 개방성을 그대로 모사할 수 있어 이식된 이후 인체 내 기관과 이식된 지지체 사이의 기계적 물성차이로 인한 수술 후 부작용을 최소화할 수 있고， 호흡기관 지지체를 이식받은 환자의 안정을 효과적으로 유지할 수 있으며， 호흡점막상피와 기관연골의 동시 재생을 고려함으로써 인체 내 호흡기관의 완벽한 재건을 이를 수 있다는 점에서， 기존 기관재건에 이용되었던 지지체의 한계를 극복하며 난치성 기관 결손을 근본적으로 치료할 수 있는 새로운 맞춤형 의료기를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에서의 삼차원 호흡기관 대체제 제조방법은 기존의 프린팅 방식과 달리 세포가 프린팅 공정에 이용되는 시간을 최소한으로 단축하여 프린팅에 이용된 세포의 생존 및 기능을 효과적으로 보장할 수 있고 이는 삼차원 호흡기관 대체제의 성능을 극대화시킬 수 있는바， 인체 내 호흡기관의 기계적 ᅳ생물학적 특성을 그대로 모사한 호흡기관 대체제를 제공할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 인체의 호흡기관의 관상골격 ( tubul ar frame) 구조체를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 일예에 따른 호흡기관의 광범위한 원형결손 재건을 위한 호흡기관 대체제를 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명의 일예에 따라 희생층을 사용하여 호흡기관 대체제를 제조하는 공정을 설명하는 모식도이다.

도 4는 본 발명의 일예에 따라 희생층을 사용하지 않고， 중공형의 다공성 밸로우즈 구조물 제작을 위한 3D 프린팅 공정을 설명하는 모식도이다.

도 5는 본 발명의 일예에 따라 PCL의 온도， 분사 헤드의 이송속도， 및 B 구간의 길이 변화에 따른 공극 형성에 미치는 효과를 나타낸다.

도 6은 본 발명와 일예에 따라 B 구간 사이의 거리 변화에 따른 공극 형성에 미치는 효과를 나타낸다.

도 7은 본 발명의 일예에 따라 전임상 평가를 고려한 두 가지 치수의 PCL 밸로우즈 프레임를 나타낸다.

도 8은 본 발명의 일예에 따라 60 ^° C에서의 열처리 시간 변화에 따른 밸로우즈 프레임의 굽힘 거동을 보여주는 도면이다. .

도 9는 본 발명의 일예에 따라 토끼 모델용으로 제작된 8 X 8 X 13 隱 크기의 중공형 사각 PCL 구조물의 표면 친수성에 대한 산소 플라즈마 처리 효과를 나타내는 도면이다.

도 10은 본 발명의 일예에 따라 개 모델용으로 제작된 18 X 18 X 33 mm 크기의 중공형 사각 구조물의 표면 친수성에 대한 산소 플라즈마 처리 효과를 나타내는도면이다.

도 11은 본 발명의 삼차원 인쇄법을 이용한 인공 호흡기관 대체제의 제조방법의 대략적인 개략도를 나타낸 것이다. 밸로우즈 지지체 제조단계와 연골 및 점막부의 제조단계가 별개의 단계를 분리하여， 그 사이에 밸로우즈 구조체의 물성을 향상시키기 위한 열처리 또는 산소 플라즈마 처리를 수행할 수 있다.

도 12는 본 발명의 일예에 따라 제조된 PCL 밸로우즈 프레임의 외부 홈에 회전 인쇄된 연골부 샘플의 사진을 나타낸다.

도 13은 본 발명의 일예에 따라 프린팅 후 1일째의 연골부의 수축을 보여주는 도면이다.

도 14는 본 발명의 일예에 따라 회전 프린팅 된 점막부 (A) 및 프린팅 후 3일째의 점막부 (B)를 보여주는 도면이다.

도 15는 본 발명의 일예에 따라 제조된 멤브레인 형태의 연골부 흡수 방지부 및 이의 효과를 검증하기 위한 동물 실험 결과이다.

도 16은 밸로우즈 프레임 주름의 주름각， 홈의 길이 및 주름의 길이 부분을 나타낸 도이다. 도 17은 4가지의 세포 밀도 (ixlOVml (그룹 I), 2xl0 ⁶ /ml (그룹 II), 5Xl0 ⁶ /ral (그룹 111)， lxl0 ⁷ /ml (그룹 IV)) 를 가지는 바이오 잉크를 PCL 밸로우즈 프레임의 외부 홈 부분에 분사하여 각각의 연골부가 인쇄된 밸로우즈 프레임을 제조한 후， PCR을 통해 각 그룹별 연골분화 관련 인자 (C0L2, ACAN, S0X9)의 상대적 발현 정도를 비교하여 그 수치를 그래프로 나타낸 것이다.

도 18은 4가지의 세포 밀도 (lxi0 ⁶ /ml (그룹 1)， 2xi0 ⁶ /ml (그룹 II), 5xi0 ⁶ /ml (그룹 III), lxi0 ⁷ /ml (그룹 IV)) 를 가지는 바이오 잉크를 PCL 밸로우즈 프레임의 내부 표면에 분사하여 각각의 점막부가 인쇄된 밸로우즈 프레임을 제조한 후， PCR을 통해 각 그룹별 점막조직 분화 관련 인자 (MUSIN 5AC, KARATIN 14， BETA-TUBULIN)의 상대적 발현 정도를 비교하여 그 수치를 그래프로 나타낸 것이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나， 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다. 실시예 1: 다공성 벨로우즈프레임의 제작조건 시험

본 발명에서는 다공성 밸로우즈 프레임의 제작을 위해 PCL을 이용하였다. 일정양 (15 ~ 1,000 mg)의 PCL을 분사 헤드 내부의 10cc 스테인리스 시린지 내에 적재하고， 시린지를 65 ~ 80 ° C로 가열하여 PCL을 녹였다. 녹은 PCL은 500kPa의 공압으로 시린지 끝단의 메탈 노즐 (N20, inner diameter: 200 ^m, Musashi Engineer ing)을 통.해 분 1·되도록 하였다. PCL이 적층되는 높이는 100 卿 (총 세 층)， 구간 A 및 C에서 PCL이 분사되는 속도를 85 mra/min로 고정한 뒤， PCL의 온도， B구간의 거리 및 이 구간에서의 이송속도의 변화 (305， 405 and 505 匪 /min)에 따라서 공극의 형성을 관찰하였다 (도 5). _,

실험 결과， PCL의 녹는 온도를 80 ° C, B 구간의 거리를 600 m, B 구간에서의 분사 헤드의 이송속도를 305 mm/min으로 설정하였을 때 공극이 가장 잘 형성된다는 것을 확인하였다. 분사해드의 이송속도의 경우， 세 가지 조건 (305 , 405 and 505 mm/min)에서 큰 차이를 보이지 않았으며, 분사헤드가 빠르게 이송할 시에 발생되는 헤드의 진동을 최소화하기 위해 가장 작은 이송속도 (305 mm/mi n)를 선택하는 것이 좋다.

다음으로， 확립된 조건으로 PCL을 100 의 높이로 세 층을 적층할 때 공극을 얼마나 조밀하게 형성시킬 수 있는지에 대해 실험을 진행하였다. PCL의 분사 없이 305 mm/mi n의 속도로 이송하는 B 구간의 거리를 600 로 고정시키고， B 구간 사이의 거리를 100~600 로 변화시키며 공극이 생성되는 것을 관찰하였다 (도 6) .

실험 결과， B 구간 사이의 거리가 최소 100 일 때까지 공극이 잘 형성된 것을 확인하였다. 따라서， 증공벽 형태의 구조물에서 최소 400 의 간격을 두고 공극을 형성시킬 수 있다. 이는 밸로우즈 프레임의 공극률 (poros i ty)을 필요에 따라 조절 가능하다는 것을 의미한다.

본 실험에서는 호흡기관 대체제의 전임상 평가 (토끼 및 비글 견 (beagl e dog)을 이용한 동물 실험)를 고려하여 두 가지 치수의 밸로우즈 프레임을 제작하였다 (도 7) . 결과적으로, 본 발명에서는 필요에 따라 다양한 치수 및 공극률을 가진 밸로우즈 프레임을 분사 방식의 삼차원 인쇄 기술로 제작가능하다. 실시예 2 : 밸로우즈프레임의 구조적 일체성 평가 (열처리)

본 실험에서는 PCL을 이용하여 밸로우즈 프레임을 제작하였고, PCL의 녹는점은 60 ° C이다. 따라서 제작된 밸로우즈 프레임의 열처리를 위해 진공 오본 (OV- U JEI0TECH , Korea)의 내부 온도를 60 ° C로 맞추고， 열처리를 위해 밸로우즈 프레임을 오븐 내에서 10 ~ 30 분간 보관하였다. 그 후， 각 조건 별로 열처리된 밸로우즈 프레임의 구조적 일체성을 평가하기 위하여 3점 굽힘 ( three-po int bending) 시험을 수행하였다. 3점 굽힘 시험에서는 밸로우즈 프레임에 굽힘을 가하기 위해 밸로우즈 프레임의 양쪽 끝 단의 주름 부분을 지지하고， 양끝단의 주름 사이의 중앙부 (밸로우즈 프레임의 길이 방향의 정 가운데 부분)을 누름으로써 실시하였다. 그리고 밸로우즈 프레임의 중앙부를 누르고 굽힘을 가함으로써 발생하는 하중의 크기를 관찰하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이， 열 처리 시간이 증가함으로써 벨로우즈 프레임이 굽힘 하에서 파단이 발생하는 이동 (displacement) 지점이 증가한다. 그리고 60 ^° C 에서 25 분간의 열처리 조건이 가장 효과가 좋은 것을 알 수 있다. 또한， 25분간의 열처리 조건에서 각 샘플들의 거리 -하중 선도의 차이가 가장 적은 것을 확인할 수 있다. 실시예 3: 밸로우즈프레임의 친수성 평가 (친수성 처리)

밸로우즈 프레임이 소수성을 가진다면， 인쇄된 점막부와 연골부가 체외 배양 과정에서 밸로우즈 프레임으로부터 분리될 가능성이 크므로， 필요에 따라 재료 1로 제작된 밸로우즈 프레임의 친수성을 높일 필요가 있다. 상기 실시예 2에서 밸로우즈 프레임 제작에 PCL을 사용하였고， 이 재료는 매우 높은 소수성을 가진다. 따라서 산소 플라즈마 처리 (oxygen plasma treatment) 공정을 통해 밸로우즈 프레임 표면의 친수성을 높였다. 먼저， 호흡기관 대체제의 전임상 평가 (토끼 및 개를 이용한 동물 실험)를 고려하여 두 가지 치수의 사각형 실린더 구조물 (rectangular cylinder structure)을 제작하였다. 그리고 플라즈마 클리너 (Plasma Cleaner, PDC-001, Harrick Plasma)를 이용하여 제작된 사각 실린더 구조물을 각 조건 (그룹 I ： 100 W + 30 분간 처리， 그룹 Π ： 100 W + 60 분간 처리， 그룹 m ： 100 W + 30 분간 처리 + 구조물의 위, 아래를 바꾼 (overturning) 후 30 분 처리， 그룹 IV ： 100 W + 60 분간 처리 + 구조물의 위, 아래를 바꾼 (overturning) 후 60 분 처리)에 따라 산소 플라즈마 처리하였다. 그 후， 안쪽 및 바깥쪽 표면에서의 각 위치 (A, B) 별 접촉각 (contact angle)을 측정하여 산소 플라즈마 처리의 효과를 검증하였다 (도 9).

토끼 동물 모델용 치수를 고려한 8 X 8 X 13 mm의 사각 실린더 구조물에서는 산소 플라즈마 처리를 오래할수록 안쪽 및 바깥 쪽 표면의 친수성이 좋아진다 (도 9， group I and II). 또한， 동일한 처리시간에서는 처리 중간에 구조물의 위 (A)와 아래 (B)의 위치를 뒤엎는 과정을 포함함으로써 구조물 전체의 표면 친수성의 균일성 (uniformity)을 높인다 (도 9， group II and III). 하지만， 1 시간 및 2시간 동안의 산소 플라즈마 처리는 큰 차이가 없으므로 (도 9， group I I I and IV) , 구조물의 위 (A)와 아래 (B)의 위치를 교체하는 과정을 포함한 1시간 동안의 산소 플라즈마 처리 ( 100 W + 30 분간 처리 + 구조물의 위 아래를 바꾼 (overturning) 후 30 분 처리)가 가장 효율적인 것으로 결론지을 수 있다 (도 9， group I I I ) .

개 동물 모델용 치수를 고려한 18 X 18 X 33 瞧 크기의 사각 실린더 구조물의 경우에는 구조물의 위， 증간， 그리고 아래 부분에서의 내， 외부의 표면 친수성을 관찰한 결과, 그룹 Π에서의 2시간 동안의 플라즈마 처리 ( 100 W + 60 분간 처리 + 구조물 위， 아래를 바꾼 (overturning) 후 60 분 처리)조건이 그룹 I에서의 1시간 동안의 플라즈마 처리 ( 100 W + 30 분간 처리 + 구조물의 위, 아래를 바꾼 (overturning) 후 30 분 처리) 조건보다 실린더 표면 친수성 향상 효과가 우수함을 확인할 수 있었다 (도 10， 그룹 I 및 Π ) .

이와 같이， 밸로우즈 프레임의 인쇄 공정과 점막부 및 연골부의 인쇄 공정 사이에 밸로우즈 프레임의 열처리 및 산소 플라즈마 처리 공정을 추가함으로써 먼저 제작된 밸로우즈 프레임의 구조적 일체성 및 표면 친수성을 높였다. 이와 같은 부가적인 처리 공정은 밸로우즈 프레임의 인쇄 공정과 점막부 및 연골부의 인쇄 공정을 분리함으로써 가능한 것으로， 밸로우즈 프레임、재료의 물성에 따라서 추가 및 생략할 수 있다. 실시예 4: 인공 호흡기관의 연골부 인쇄

다음으로， 연골부와 점막부의 인쇄 공정이 이어진다. 이 인쇄 공정은 회전 스테이 '지 (motor i zed rotat ion stage)와 곡선형 노즐 (curved nozz le)을 이용한다 (도 11) . 먼저， 제작된 밸로우즈 프레임은 연골부의 인쇄를 위해 회전 스테이지 위에 올리고， 연골부 재료가 탑재된 분사헤드가 이동하여 곡선형 노즐의 끝 단을 밸로우즈 프레임의 외부 홈 부분에 위치시킨다. 그리고 연골부 재료가 분사되기 시작함과 동시에 회전 스테이지가 일정한 속도로 회전하면서 스테이지 위에 올려진 밸로우즈를 함께 회전시킨다. 밸로우즈 프레임이 360 。 회전하고 나면 회전 스테이지는 회전을 멈추고， 이와 동시에 연골부 재료의 분사도 함께 종료하게 된다. 다음으로 분사헤드가 이동하여 곡선형 노즐의 끝 단은 밸로우즈 프레임의 다른 홈 부분에 위치하게 되고， 재료의 분사와 밸로우즈 프레임이 360 ^° 회전한다. 이와 같은 과정은 밸로우즈 프레임의 모든 외부 홈 부분에 연골부 재료가 채워질 때까지 반복한다.

연골부 재료로서 코중격 연골세포 (human septal chondrocytes, hNSCs)가 포함된 액상 콜라젠 (3% atelocollagen, Therafill, Sewon Cellontech. , Seoul, Korea)을 이용하였다. 충분한 세포수 (lx 10 ⁷ ~ lxiOVml)를 확보하기 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)가 함유된 DMEM 배양액에서 hNSCs를 일정 기간 동안 체외 배양하고， lxioVml 의 세포 밀도 (cell density)가 되도록 hNSCs가 포함된 배양액 (세포 부유액， cell suspension)과 액상 콜라젠을 1:10의 부피비로 흔합하여 바이오 잉크를 준비하였다. 준비된 바이오 잉크를 분사헤드 내 시린지에 탑재한 후， 곡선형 노즐 (CPN-25G-A45, inner diameter: 250 μια, Musashi Engineering)을 통해 분사하였다. 이때， 50 ~ 120 kPa의 공압과 4.5 ~ 33 DPS (degree Per Second)의 회전 속도 범위 내에서 적절한 연골부 인쇄 조건을 확립하였다.

도 12에 나타낸 바와 같이， 다양한 공압 및 회전 속도 범위 내에서 밸로우즈 프레임의 외부 홈에 연골부 재료가 성공적으로 인쇄되었다. 70 kPa의 공압과 9 DPS의 회전 속도에서 연골부 재료가 유하 (flow down)하는 것을 확인하였으나， 다른 조건에서는 본래의 외부 홈의 체적 (volume)보다 더 많은 양의 연골부 재료를 분사하여도 인쇄된 연골부 재료가 흘러내리지 않고， 밸로우즈 프레임의 외부 홈 내에 잘 머물러 있는 것을 확인하였다. 연골부가 인쇄된 밸로우즈 프레임은 콜라젠의 가교 (cross-linking)를 위해 37 ^° C 에서 약 30분갚 유지 (incubation)시킨 후， 37 ^° C, 5 % C0 ₂ 배양기 (incubator) 내에서 하루 동안 배양하였다. 이 과정에서 인쇄된 연골부 재료의 수축 (contract ion)이 발생하였고 (도 13)， 60 kPa의 공압과 10.5 DPS 및 9 DPS, 그리고 70 kPa의 공압과 27 DPS 및 25.5 DPS의 조건으로 인쇄된 연골부 재료가 밸로우즈 프레임의 외부 홈꾀 체적에 맞게 수축된 것을 확인할 수 있었다. 따라서， 인쇄된 연골부의 수축 정도와 인쇄 시간을 고려하여 70 kPa의 공압과 25.5 DPS의 회전 속도를 이용한 인쇄 조건이 가장 적절한 것으로 결론지을 수 있다.

또한， 임상에 이용되고 있는 또 다른 콜라젠 (3 % atelocol l agen, UBIOSIS , Korea)를 이용하여 상기와 같은 방식으로 바이오 잉크를 준비하였고， 연골부 프린팅 실험을 진행하였다. 다른 콜라젠을 이용하였을 경우의 연골부 프린팅은 120kPa의 공압 및 12 DPS의 조건으로 수행하였다. (같은 콜라젠이라 하더라도 다른 제조회사 제품을 이용할 경우， 프린팅 조건이 달라진다. ) 실시예 5: 인공호흡기관의 점막부 인쇄

다음으로 밸로우즈 내부 표면의 점막부의 인쇄 공정이 이어진다. 점막부 재료가 탑재된 분사해드의 곡선형 노즐 끝 단이 밸로우즈 프레임 안쪽의 홈 부분에 위치하게 되고， 연골부 재료가 인쇄 될 때와 마찬가지로 점막부 재료가 분사됨과 동시에 스테이지가 360 ^° 회전하게 된다. 이와 같은 방식으로 밸로우즈 프레임의 모든 안쪽 홈 부분에 점막부 재료가 채워지고 나면， 내부 홈과 홈 사이의 표면에도 같은 방식으로 점막부 재료가 채워진다.

본 발명에서는 점막부 재료로서 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포

(human nasal infer ior turbinate der ived mesenchymal stem eel I s , hTMSCs)를 포함한 콜라젠을 이용하였다. 층분한 세포수 ( I X 10 ⁶ ~ l x l0 ⁷ /ml )를 확보하기 위해 10% 우태아 혈청 ( fetal bovine serum, FBS)가 함유된 DMEM 배양액에서 일정 기간동안 체외 배양된 hTMSCs를 3% 액상 콜라젠과 흔합하여 분사헤드 내 시린지에 로딩한 후， 곡선형 노즐을 통해 분사하였다. 밸로우즈 프레임의 내부 홈에 점막부 재료를 인쇄하기 위해서는 연골부의 인쇄와 같은 조건을 이용하였고 (도 14)， 내부 홈을 제외한 다른 내부 표면에 점막부 재료를 인쇄하기 위해서는 연골부의 인쇄 조건보다 두 배 빠른 회전속도를 이용하였다. 실시예 6: 인공호흡기관의 연골부흡수 방지부 인쇄

6-1. 멤브레인 형태 연골부홉수 방지부 인쇄

실시예 5 다음으로 프린팅된 연골부의 체내 흡수를 방지하기 위해 연골부 흡수 방지부의 인쇄가 이어질 수 있다. 본 발명에서는 멤브레인 형태의 연골부 흡수 방지부를 제작하기 위해 PCL을 이용하였다. 일정양 (15 ~ 1,000 mg)의 PCL을 분사 헤드 내부의 lOcc 스테인리스 시린지 내에 적재하고， 시린지를 65 ~ 80 ° C로 가열함으로써 PCL을 녹였다. 녹은 PCL은 500kPa의 공압으로 시린지 끝단의 메탈 노즐 (N20, inner diameter: 200 , Musashi Engineering)을 통해 분사되도록 하였다. 멤브레인은 호흡기관 대체제를 들러쌌을 때 스텐트와 같은 패턴을 가질 수 있도록 특정 패턴을 그리면서 분사되고， 이는 두 층， 흑은 세 층으로 인쇄된다. 다음으로 두 번째 패턴을 첫 번째 패턴 위에 PCL을 분사하며 그리게 되고， 이 또한 두 층, 흑은 세 층으로 인쇄된다. PCL이 적층되는 높이는 100 이다 (도 15(A)).

멤브레인 형태의 연골부 흡수 방지부를 제작하고， 이의 적용에 따른 호흡기관 대체제의 연골부 흡수 정도를 누드 마우스를 이용한 실험을 통해서 검증하였다. 누드 마우스를 이용한 동물 실험은 총 두 달간 수행하였으며, 호흡기관 대체제를 누드 마우스의 피하에 이식한 이후 한 달 및 두 달째에 호흡기관 대체제를 추출하여 연골부 흡수 정도를 관찰하였다. 연골부 흡수 방지부를 적용한 호흡기관 대체계 (그룹 Π)의 경우， 초기에 인쇄된 연골부의 부피가 잘 유지된 것을 확인하였다. 하지만 연골부 흡수 방지부 없이 호흡기관 대체제만을 누드 마우스의 피하에 이식하였을 경우 (그룹 1 )， 연골부가 상당히 흡수되어 연골부의 부피가 상당하 줄어듦을 알 수 있었다 (도 15(A)).

6-2. 관형태의 연골부흡수방지부 인쇄

관 형태의 연골부 흡수 방지부를 제작하기 위해 PCL을 사용하였다. 일정양 (15 - 1,000 mg)의 PCL을 분사 헤드 내부의 10 cc 스테인리스 시린지 내에 적재하고， 시린지를 65 ~ 80 ° C로 가열하여 PCL을 녹였다. 녹은 PCL은 500 kPa의 공압으로 시린지 끝단의 메탈 노즐 (N20, inner diameter: 200 ^m, Musashi Engineer ing)을 통해 분사하였다. 미리 설정된 초기 위치에 따라 시린지를 회전축 위에 위치시키고, 관 형태의 제작을 위해 코드에 따라 회전축의 길이 방향으로 PCL을 분사하였다， 이와 동시에 스텐트 형태의 패턴을 성형하기 위해 회전축을 코드에 따라 정지 및 회전시킨다. 그 다음으로 두 번째 패턴을 첫 번째 패턴 위에 PCL을 분사하고， 두 층， 또는 세 층으로 인쇄한다. PCL이 적층되는 각 높이는 100 이다. 실시예 7: 연골부 및 점막부의 세포 함량

연골부 및 점막부의 인쇄에 있어서， 연골부 재료로서 연골형성을 촉진시키는， 연골세포， 즐기세포 등을 포함할 수 있으며， 점막부 재료로서， 점막세포， 줄기세포 등을 포함시킬 수 있다. 이 경우， 우선 호흡기관 대체제의 연골부 및 점막부를 회전 프린팅하기 위해서 층분한 양의 세포 수의 확보가 필요하며， 린팅된 연골부 또는 점막부에 포함된 세포의 농도에 따라 연골부 및 점막부의 조직재생 효과가 영향을 받을 수 있는 바, 회전 프린팅 효율을 고려하면서도 가장 우수한 조직재생 효과를 나타내는 세포의 최적 함량을 결정할 필요가 있다.

따라서 연골부 및 점막부에 포함되는 줄기세포의 최적 함량을 결장하기 위하여， 하기 실험을 진행하였다.

7-1. 호홉기관 대체제의 연골부 최적 세포 함량결정

충분한 세포수 (IX 10 ⁶ ~ lXlO ml)를 확보하기 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배양액에서 일정 기간 동안 체외 배양된 hNSCs(Human neural stem eel Is)를 3% 액상 콜라젠과 흔합하여 총 4가지의 세포 밀도 (lxl0 ⁶ /ml (그룹 I), 2 i0 ⁶ /ml (그룹 II), 5xl0 ⁶ /ml (그룹 III), lxloVral (그룹 IV)) 를 가지는 바이오 잉크를 준비하였다. 준비된 바이오 잉크를 분사헤드 내 시린지에 로딩한 후， 곡선형 노즐을 통해 PCL 밸로우즈 프레임의 외부 홈 부분에 분사하였다. 이 실험에서는 외부 홈을 하나만 포함한 PCL 밸로우즈 프레임을 이용하였다. 연골부가 인쇄된 밸로우즈 프레임은 콜라젠의 가교를 위해 37 ^° C 에서 약 30분간 유지시킨 후， 37 ^° C, 5 % C0 ₂ 배양기 내에서 일주일 동안 배양하였다. 이 때， 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)가 함유된 DMEM 배양액을 2 ~ 3일 마다 새로 교체하였다. 그 후， 각 세포 함량 별 연골 재생 효과를 확인하기 위해 역전사 증합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 통해 각 연골분화 관련 인자 (C0L2, ACAN, S0X9)의 발현 정도를 비교하였으며， 이때， 각 연골분화 관련 인자의 발현 정도는 컨트롤 유전자로 사용된 GAPDH의 발현에 대한 상대적 값으로 표기하였다 (도 17참조).

도 17에 나타낸 바와 같이, 각 그룹별 (그룹 I 내지 그룹 IV) 연골분화 관련 인자 (C0L2, ACAN, S0X9)의 상대적 값 비교 결과, 2xi0 ⁶ /ml (그룹 Π )의 세포 함량을 가진 바이오 잉크로 인쇄된 그룹에서 가장 발현값이 높은 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 다공성 밸로우즈 표면에 연골부를 인쇄하여 호흡기관 대체 지지체 제조할 때， hNSCs를 포함하는 바이오 잉크를 사용할 경우, 2xi0 ⁶ /ml 의 세포 함량을 포함하는 것이 가장 적절함을 알 수 있었다.

7-2. 호흡기관 대체제의 점막부 최적 세포 함량 결정

층분한 세포수 (1X10 ⁶ ~ lxlOVml)를 확보하기 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배양액에서 일정 기간 동안 체외 ^' 배양된 hTMSCs (Human turbinate mesenchymal stromal eel Is)를 3% 액상 콜라젠과 흔합하여 총 4가지의 세포 밀도 (lxlOVml (그룹 1)， 2xl0 ⁶ /ml (그룹 Π), 5Xl0 ⁶ /ml (그룹 III), lxl0 ⁷ /ml (그룹 IV)) 를 가지는 바이오 잉크를 준비하였다. 준비된 바이오 잉크를 분사헤드 내 시린지에 로딩한 후， 곡선형 노즐을 통해 PCL 밸로우즈 프레임의 내부 표면에 분사하였다. 이 실험에서는 외부 홈을 하나만 포함한 PCL 밸로우즈 프레임을 이용하였다.

점막부가 인쇄된 밸로우즈 프레임은 콜라젠의 가교를 위해 37 ^° C 에서 약 30분간 유지시킨 후， 37 ^° C, 5 % C0 ₂ 배양기 내에서 일주일 동안 배양하였다. 이때， 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)가 함유된 DMEM 배양액은 2~3일 마다 새로 교체해 주었다. 그 후， 각 세포 함량별 점막조직 재생 효과를 확인하기 위해 역전사 중합효소 연쇄 반웅 (polymerase chain reaction, PCR)을 통해 각 점막조직 분화 관련 인자 (MUSIN 5AC, KARATIN 14， BETA-TUBULIN)의 발현 정도를 비교하였다. 이 때， 각 마커별 발현 정도는 컨트롤 유전자로 사용된 GAPDH의 발현에 대한 상대적 값으로 표기하였다 (도 18 참조).

도 18에 나타낸 바와 같이 , 각 그룹별 점막조직 분화 관련 인자 중 MUSIN 5AC의 상대적 발현값은 lxl0 ⁶ /ml (그룹 I)의 세포 함량을 가진 바이오 잉크로 인쇄된 그룹에서 가장 높게 나타났지만 KARATIN 14， BETA- TUBULIN 의 경우 2xi0 ⁶ /ml (그룹 II)의 세포 함량을 가진 '바이오 잉크로 인쇄된 그룹에서 발현값이 가장 높았다. 따라서 본 발명의 다공성 밸로우즈 표면에 점막부를 인쇄하여 호흡기관 대체 지지체 제조할 경우， hTMSCs를 포함한 바이오 잉크를 이용할 시， 2xi0 ⁶ /ml 의 세포 함량을 가지도록 하는 것이 가장 적절함을 알 수 있었다.