[0001] 本发明涉及体外检测领域， 尤其涉及一种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检 测试 剂盒及其制备方法。

背景技术

[0002] 呼吸道合胞病毒 (RSV， 简称合胞病毒， 属副粘病毒科)于 1956年首次在伴有感 冒症状的猩猩体内分离到。 是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原， 因其在细胞 培养中能形成特殊的细胞融和病变， 故名。 该病毒的感染可引起间质性肺炎， 及毛细支气管炎。

技术问题

[0003] 目前呼吸道合胞病毒感染的检测主要有以下几 种方法：

[0004] 一、 酶联免疫吸附法

[0005] 酶联免疫吸附法 (ELISA)被广泛应用， 但该方法也存在着下述的不足之处： [0006] (1)使用 12x8型、 6x8型、 8x12型或整板型 96孔专用微孔板作为抗原包被用具 和反应容器， 在使用吋只能分成 12批次、 6批次、 8批次或整板一次使用， 无法 进行独立的、 单人份的检测；

[0007] (2)定量测定所用的试剂种类较多， 每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装， 并 且每使用一种试剂吋都需要更换吸液嘴来分别 加注到微孔板的微孔中， 不但试 剂瓶种类多， 加注试剂的操作也极为繁琐；

[0008] (3)缺少对检测信息的相应标注， 只能通过査看试剂盒外包装盒的标识才能了 解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息， 而且所知悉的信息在检测过程中 不受控， 具有很大的随意性；

[0009] (4)检测试剂在检测过程中处于幵放的空间， 容易引起各种试剂之间的交叉污 染而影响检测结果的准确性；

[0010] (5)检测过程多采用手工操作， 试剂或样本的加量不很精确， 操作过程极为繁 琐和复杂， 容易发生操作差错， 检测结果的准确度和精密度较差； [0011] (6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均 为项目数 X48/96人份， 如果需 要检测 10个项目， 则试剂的配置及使用数须为 10x48/96人份， 如果只有一份样 本需要检测 10个不同的项目， 也需要配置 10x48/96人份的试剂， 存在着不够经 济合理的缺点。

[0012] 二、 常规实验室检测一病毒分离法

[0013] 实验室诊断呼吸道合胞病毒感染的金标准是病 毒分离的方法。 采用标本的吋间 以发病前 5天为宜， 取病人鼻咽棉拭子或咯痰进行病毒分离培养。 该病毒不能在 鸡胚内增殖， 只能在人和猴细胞如 Hep-2， Hela等细胞株中培养增殖， 约培养 2— 3周才出现细胞界线不清、 融合成多核巨细胞等的细胞病变， 病毒通过出芽释放 。 但是病毒分离的方法具有严重的缺陷。 因为它们既费吋又费力， 通常需要较 长吋间才能得到最终结果， 这样在临床方面对病人的有效治疗有一定的局 限性

[0014] 三、 基因诊断

[0015] 对许多 RNA病毒来说 RT-PCR诊断方法比传统的病毒分离和抗原诊断方 法既 快又灵敏。 而且 RT-PCR可以很容易的同吋诊断多种病毒， 另一些诊断方法如病 毒分离和免疫荧光分析却不能。 但该方法也有不足之处， 如 PCR技术， DNA扩 增的高校性导致了极微量的污染既可出现假阳 性， 因而使结果失真。 此外病毒 作为外原基因的入侵者， 必须在阐明其全部或部分核苷酸序列吋， 才可以设计 引物或探针， 进行核酸分子杂交和 PCR检测。

[0016] 从现有的呼吸道合胞病毒的检测方法可见， EIA、 病毒分离、 RT-PCR诊断方法 尽管都有一定的特异性和敏感性的优点， 但在操作上需要专业技术人员、 专门 的仪器设备和特定的条件及费吋等缺点。

[0017] 吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比以上方 法具有明细优势， 主要表现在： 反应不需要催化剂， 只要碱性环境即可进行， 反应迅速， 背景发光低， 信噪比 高， 干扰因素少， 试剂稳定性好， 可以两点定标， 体系简单， 激发液成本低， 吖啶酯易与蛋白质联结， 且联结后光子产率不减少， 已经成为合胞病毒诊断新 的发展方向。

问题的解决方案 技术解决方案

[0018] 基于此， 有必要提供一种检测灵敏度较高的呼吸道合胞 病毒化学发光免疫检测 试剂盒及其制备方法。

[0019] 一种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 ， 包括： 呼吸道合胞病毒重组蛋 白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标 记的化学发光标记物。

[0020] 所述呼吸道合胞病毒重组蛋白包被的羧基化的 磁微粒中， 所述呼吸道合胞病毒 重组蛋白与所述羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=

[0021] 所述抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中 ， 所述抗人免疫球蛋白与所述化 学发光标记物的比例为 50: 1~10。

[0022] 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~ 1 μηι。

[0023] 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。

[0024] 所述的呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂 盒， 还包括化学发光底物液， 所 述化学发光底物液包括 Α液和 Β液。

[0025] 所述 A液为 H ₂ 0 ₂ 溶液， 所述 B液为 NaOH溶液。

[0026] 所述的呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂 盒， 还包括呼吸道合胞病毒定标

p

[0027] 所述呼吸道合胞病毒定标品为浓度分别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 10 00U/L和 2000U/L的呼吸道合胞病毒的溶液。

[0028] 一种上述的呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测 试剂盒的制备方法， 包括如下步 骤：

[0029] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入呼吸道合胞病毒重组蛋 白， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到呼吸道合胞 病毒重组蛋白包被的羧基化的磁微粒； 以及

[0030] 取抗人免疫球蛋白， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入化学发光标记物后混 匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物 发明的有益效果 有益效果

[0031] 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具， 完成呼吸道合胞病毒的检测这种呼吸道合胞病 毒化学发光免疫 检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏度达到 1U/L， 相对于传统的呼吸道合胞病 毒的检测方法灵敏度至少提高了 10倍， 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测 试剂盒的检测精度较高。

对附图的简要说明

附图说明

[0032] 图 1为一实施方式的呼吸道合胞病毒化学发光免� �检测试剂盒的制备方法的流 程图；

[0033] 图 2为实施例 3得到的呼吸道合胞病毒标准曲线图。

本发明的实施方式

[0034] 为使本发明的上述目的、 特征和优点能够更加明显易懂， 下面结合附图和具体 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明 。 在下面的描述中阐述了很多具 体细节以便于充分理解本发明。 但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它 方式来实施， 本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情 况下做类似改进， 因此本发明不受下面公幵的具体实施的限制。

[0035] 一实施方式的呼吸道合胞病毒化学发光免疫检 测试剂盒， 包括： 呼吸道合胞病 毒重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫 球蛋白标记的化学发光标记物。

[0036] 优选的， 呼吸道合胞病毒重组蛋白包被的羧基化的磁微 粒中， 呼吸道合胞病毒 重组蛋白与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=

[0037] 优选的， 抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中， 抗人免疫球蛋白与化学发 光标记物的比例为 50: 1~10。

[0038] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。

[0039] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。

[0040] 在其他的实施例中， 上述呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 还包括化学 发光底物液。

[0041] 化学发光底物液包括 A液和 B液。 A液可以为 H ₂ 0 ₂ 溶液， B液可以为 NaOH溶液

[0042] 本实施例中， A液为浓度为 0.1mol/L的 H ₂ 0 ₂

溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。

[0043] 在其他的实施例中， 上述呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 还包括呼吸 道合胞病毒定标品。

[0044] 呼吸道合胞病毒定标品为浓度分别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/

L和 2000U/L的呼吸道合胞病毒的溶液。

[0045] 具体的， 呼吸道合胞病毒定标品可以采用标准品缓冲液 将呼吸道合胞病毒配制 成浓度分别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L的呼吸道合 胞病毒的溶液。

[0046] 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 用于呼吸道合胞病毒检测吋， 利 用全自动化学发光免疫分析仪对呼吸道合胞病 毒定标品进行检测， 绘制标准曲 线， 内置于电脑软件； 接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度； 最 后对呼吸道合胞病毒全自动化学发光免疫分析 系统进行性能 （灵敏度、 线性、 精密度、 干扰性） 的评价。

[0047] 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具， 完成呼吸道合胞病毒的检测这种呼吸道合胞病 毒化学发光免疫 检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏度达到 1U/L， 相对于传统的呼吸道合胞病 毒的检测方法灵敏度至少提高了 10倍， 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测 试剂盒的检测精度较高。

[0048] 此外， 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 还具有以下优点：

[0049] 1、 选择吖啶酯作为标记材料， 并应用于化学发光免疫分析系统， 该发光体系 为直接化学发光， 与传统的酶促化学发光相比， 该反应不需要酶的参与， 更加 节约成本；

[0050] 2、 选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围 宽， 能达到 1U/L~ 1000U/L, 而传统的呼吸道合胞病毒的检测方法的检线性 范围为 20U/L~ 1000U/L; [0051] 3、 吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高， 批内及批间差均在 5%以内， 这是 其它化学发光免疫分析系统难以达到的；

[0052] 4、 化学发光免疫分析系统已实现样本的定量， 通过内置标准曲线到测试软件

， 只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；

[0053] 5、 化学发光免疫分析系统可以实现全自动化， 试剂及样本的添加全有仪器完 成， 操作更加简便， 减少了人为的误差。

[0054] 如图 1所示的上述呼吸道合胞病毒化学发光免疫检� �试剂盒的制备方法， 包括 如下步骤：

[0055] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入呼吸道合胞病毒重组蛋 白， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到呼吸道合胞 病毒重组蛋白包被的羧基化的磁微粒。

[0056] MES (2-(N-吗啡啉)乙磺酸） 缓冲液的浓度为 0.02M， pH为 5.5。

[0057] Tris缓冲液的浓度为 0.1M并且含有 2%BSA， pH为 8.0。

[0058] EDC (1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺） 水溶液的浓度为 10mg/mL~20m g/mL, EDC与羧基化的磁微粒的比例为 0.05: 0.1-1 =

[0059] 优选的， 呼吸道合胞病毒重组蛋白包被的羧基化的磁微 粒中， 呼吸道合胞病毒 重组蛋白与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=

[0060] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。

[0061] 取抗人免疫球蛋白， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入化学发光标记物后混 匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物

[0062] 碳酸盐缓冲液浓度为 0.1M， pH为 9.0 9.5，

[0063] 除杂的操作为离心脱盐柱脱盐， 具体操作为： 先分别用纯净水及 TBS缓冲液 ( 40 mM Tris-HCl， 0.5% BSA, l% NaCl, pH 8.0) 处理离心脱盐柱， 最后加入得 到的呼吸道合胞病毒重组蛋白包被的羧基化的 磁微粒的溶液， 最后收集离心管 中的液体。

[0064] 优选的， 抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中， 呼吸道合胞病毒重组蛋白 与化学发光标记物的比例为 50: 1~10

[0065] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。

[0066] 得到的呼吸道合胞病毒重组蛋白包被的羧基化 的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记 的化学发光标记物组合即可得到上述呼吸道合 胞病毒化学发光免疫检测试剂盒

[0067] 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 在使用吋， 还需要化学发光底物 液和呼吸道合胞病毒定标品。

[0068] 化学发光底物液和呼吸道合胞病毒定标品可以 自行配制得到。

[0069] 化学发光底物液包括 A液和 B液。 A液可以为 H ₂ 0 ₂ 溶液， B液可以为 NaOH溶液

[0070] 本实施例中， A液为浓度为0.1mol/L的H ₂ O ₂

溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。

[0071] 具体的， 呼吸道合胞病毒定标品可以采用标准品缓冲液 将呼吸道合胞病毒配制 成浓度分别为 1U/L 10U/L 100U/L 500U/L 1000U/L和 2000U/L的呼吸道合 胞病毒的溶液。

[0072] 这种呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒 的制备方法简单方便， 制得的呼 吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒的检测 灵敏度较高， 具有良好的应用前

[0073]

[0074] 以下为具体实施例。

[0075] 实施例 1 : 呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒的制 备

[0076] (1) 呼吸道合胞病毒重组蛋白包被的羧基化的磁微 粒的制备：

[0077] 取含有 50mg粒径为 0.05μηι~1μιη的羧基化的磁微粒 （MagnaBind™, 货号 21353 ) 悬浮液， 磁分离去上清， 用 0.02 M pH为 5.5 MES缓冲液重悬， 加入 lmL新配 置的 10mg/mL的 EDC水溶液， 活化磁珠表面羧基， 加入 4mg呼吸道合胞病毒重组 蛋白 （biorbyt, 货号 orb48780) ， 室温下混悬 6h， 磁分离， 去除上清， 用含 2<¾B SA的 0.1M pH为 8.0的 Tris缓冲液重悬到 lmg/mL， 得到呼吸道合胞病毒重组蛋白 包被的羧基化的磁微粒， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。

[0078] (2) 抗人免疫球蛋白标记的吖啶酯的制备：

[0079] 取 50μί浓度为 25mg/mL的抗人免疫球蛋白， 加入 150μί浓度为 0.1M、 pH为 9.0~

9.5的碳酸盐缓冲液， 混匀， 然后加入 1.5μί浓度为 5mg/mL的吖啶酯溶液混匀， 室温下避光反应， 1.5h后取出， 用 2mL的 zeba离心脱盐柱脱盐处理， 脱盐过程中 首先分别用纯净水及 TBS缓冲液进行处理， 最后加入得到的抗人免疫球蛋白标记 的吖啶酯溶液， 收集离心管中的液体至保存管得到抗人免疫球 蛋白标记的吖啶 酯， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。

[0080] (3) 呼吸道合胞病毒定标品的制备：

[0081] 用标准品缓冲液 （40 mM Tris-HCl， 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0) 将呼吸道 合胞病毒配置成浓度为 0U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L, 每瓶 0.5 mL分装冻干， 4 °C保存备用。

[0082]

[0083] 实施例 2: 呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测方法

[0084] 以全自动化学发光免疫分析仪 （YHLO， 货号 iFlash3000) 为检测工具， 方法学 模式为间接免疫法， 即仪器依次加入 50 的样品、 50 的呼吸道合胞病毒重组 蛋白包被的羧基化的磁微粒以及 50 的呼吸道合胞病毒处理液， 反应 20 min后 ， 再加 50 的抗人免疫球蛋白吖啶酯， 反应 20 min后， 进行磁分离， 仪器将反 应混合物送入暗室， 依次加入发光底物 A液 （H ₂ 0 ₂ ) 及 B液 （NaOH) 进行发光 反应， 最后记录发光值。

[0085]

[0086] 实施例 3: 呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒性能 评价

[0087] 采用实施例 2中的方法对呼吸道合胞病毒定标品进行检测� � 得到绘制标准曲线 如图 2所示。

[0088] 接着对接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度。

[0089] 灵敏度的检测：

[0090] 参照 CLSI EP17-A文件推荐实验方案， 计算呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测 试剂盒的灵敏度， 求得的灵敏度为 1U/L。 [0091] 线性的检测：

[0092] 对浓度为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L标准品做线性 分析， 计算线性相关系数， r=0.9996， 另外， 该试剂盒对呼吸道合胞病毒样品检 测的线性范围为 1U/L ~1000U/L。

[0093] 精密度测定：

[0094] 取浓度为 50U/L及 500U/L两个呼吸道合胞病毒样品， 每个样本每个浓度各做 3个 平行， 用三批试剂盒进行检测， 计算试剂盒批内及批间差， 结果表明该试剂盒 批内及批间差均小于 5%。

[0095] 干扰性实验：

[0096] 取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、 游离胆红素、 血红蛋白、 抗坏 血酸、 甘油酯， 添加比例按照 1 : 20进行， 分别测定混合血清及添加了各种干扰 物后混合血清的测值， 计算二者之间的偏差， 以 ±10%为可接受范围。 结果表明 ， 干扰性均达到 NCCLS的文件标准， 可用于临床实验室呼吸道合胞病毒状况 的准确评估。

[0097]

[0098] 实施例 4、 呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒的对 比实验

[0099] 分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸 附法对浓度为 0、 50U/L的呼吸道 合胞病毒样品做检测， 两种方法检测灵敏度相比， 数据如下表所示：

[0101]

[0102]

[0103] 由上表可以看出， 化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法 提高了 10倍以 上。

[0104] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方 式， 其描述较为具体和详细， 但 并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制 。 应当指出的是， 对于本领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改 进， 这些都属于本发明的保护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。