ЖАРИКОВ Геннадий Алексеевич (пр-т Биологов, д. 1 кв. 311, п. Оболенск, Серпуховский р-н, Московская oбл, 9 Obolensk, RU)
KRAINOVA, Olga Aleksandrovna (Festivalny pr-d, 11-145Protvin, Moskovskaya obl. 1, 14228, RU)
КРАЙНОВА Ольга Александровна (Фестивальный пр-д, д. 11 кв. 145, г. Протвино, Московская обл, 81 Protvino, RU)
KISELEVA, Nina Ivanovna (pr-t Biologov, 7-28Obolensk,Serpukhovsky raio, Moskovskaya obl. 9, 14227, RU)
КИСЕЛЁВА Нина Ивановна (пр-т Биологов, д. 7 кв. 28, п. Оболенск, Серпуховский р-н, Московская oбл, 9 Obolensk, RU)
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ "НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИИ И ГИГИЕНИЧЕСКОЙ РЕГЛАМЕНТАЦИИ БИОПРЕПАРАТОВ" ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА РФ (ул. Ленина, д. 102 А о/с Дашковка, Серпуховский район, Московская обл, 3 o/s Dashkovka, RU)
NAUCHNO-ISSLEDOVATELSKII TSENTR EKOLOGICHESKOI BEZOPASNOSTI (SPB NITSEB) RAN (ul. Korpusnaya, 18St.Petersburg, 19711, RU)
НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ (ул. Корпусная, д. 18 Санкт-Петербур, 1 St.Petersburg, RU)
ZHARIKOV, Gennadii Alekseevich (pr-t Biologov, 1-311Obolensk,Serpukhovsky raio, Moskovskaya obl. 9, 14227, RU)
ЖАРИКОВ Геннадий Алексеевич (пр-т Биологов, д. 1 кв. 311, п. Оболенск, Серпуховский р-н, Московская oбл, 9 Obolensk, RU)
KRAINOVA, Olga Aleksandrovna (Festivalny pr-d, 11-145Protvin, Moskovskaya obl. 1, 14228, RU)
КРАЙНОВА Ольга Александровна (Фестивальный пр-д, д. 11 кв. 145, г. Протвино, Московская обл, 81 Protvino, RU)
| формула изобретения
1. штамм Rhоdососсиs етуthrороlis 8D вкпм Ac- 1733 био деструктор продуктов гидролиза иприта.
2. штамм рsеиdоmопаs риtidа Y21 вкпм B-9450 - биодеструктор продуктов гидролиза иприта.
3. способ биоремедиации, включающий внесение микроорганизмов в почву, отличающийся тем, что обработку проводят штаммом Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D, или штаммом рsеиdоmопаs риtidа Y21, или смесью указанных штаммов, или ассоциацией указанных штаммов, полученной при их совместном культивировании.
4. способ по п.з отличающийся тем, что ассоциацию штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdоmопаs риtidа Y21 получают путем их совместного культивирования в жидкой питательной среде фгрм с добавлением 0,2 % тиодигликоля, при этом посевной материал штамма рsеиdоmопаs риtidа Y21 вносят в культуральную среду через 15-17 часов после начала культивирования штамма Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D.
заменяющий лист (правило 26) |
штамм Rhоdососсиs еrуthrороlis для биодеградации продуктов гидролиза иприта, штамм рsеиdотопаs риtidа для биодеградации продуктов гидролиза иприта и способ биоремедиации почвы, загрязненной ипритом и продуктами его гидролиза.
область техники, к которой относится изобретение.
изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в области охраны окружающей среды для очистки почв, загрязненных отравляющим веществом - ипритом и продуктами его гидролиза.
работы по ликвидации отравляющего вещества иприт проводятся в соответствии с международной конвенцией о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении. при этом особую актуальность приобретают проблемы ремедиации почв, загрязненной ипритом.
иприт (2,2-диxлopдиэтилcyльфид) относится к веществам, обладающим высокой реакционной способностью. для уничтожения этого отравляющего вещества в россии в основном используют щелочной гидролиз, в ходе которого от молекулы иприта отщепляются один или два атома хлора. при этом образуются тиодигликоль (тдг) и моно-хлортиодигликоль (хлорорганическое соединение - XOC). эти вещества (реакционные массы) обладают низкой токсичностью и в дальнейшем утилизируются IM.
в случае аварийных ситуаций или розливов иприт попадает в почву, где из-за своей высокой химической активности реагирует с различными компонентами почвы (щелочными соединениями, известью, мелом, гуминовыми кислотами) в присутствии грунтовой воды. при этом, также как и в случае щелочного гидролиза, в основном, образуются тдг и XOC 121.
таким образом, проведение экспериментов по биоремедиации почв, загрязненных продуктами гидролиза иприта (смеси тдг и XOC) пригодно и для случаев биоремедиации почвы от иприта.
заменяющий лист (правило 26)
уровень техники.
для детоксикации почв, загрязненных ипритом и продуктами его гидролиза, экологически и экономически наиболее целесообразен биологический метод, с использованием специальных микроорганизмов-деструкторов /3, 4/, при котором микроорганизмы-деструкторы вносят "iп sitи " в загрязненную почву.
известен ряд работ по изучению микробиологической деструкции иприта или пги в водных растворах /5, 6, II. однако, в литературе отсутствуют сведения о проверке их действия на образцах проб почвы, где имеются свои особенности, а именно: наличие антагонизма с почвенными сапрофитными микроорганизмами, сорбция интродуцированных микроорганизмов почвенными частицами и т. п.
прототипом изобретения является способ /8/, заключающийся в использовании для биодеградации ипритсодержащих смесей в водных растворах штаммов бактерий рsеиdотопаs sресiеs 8-2, рsеиdотопаs dоиdоrоfii 70-11 и соrупеbасtеriит sресiеs кзб. недостатком прототипа является то, что используемые штаммы необходимо раздельно выращивать и затем использовать последовательно.
раскрытие изобретения.
целью изобретения является разработка штаммов микроорганизмов, деградантов пги способных к совместному выращиванию, а также создание на их основе способа биоремедиации различных типов почвы, загрязненных ипритом и пги
поставленная цель достигается тем, что получены штаммы микроорганизмов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 биодеграданты пги и предложен способ биоремедиации почв, загрязненных ипритом и пги, заключающийся в обработке загрязненной почвы полученными штаммами или их смесью, или ассоциацией штаммов, полученной при совместном культивировании указанных штаммов.
штамм Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D выделен из почвы московской области методом накопительной культуры с пги, депонирован во всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (вкпм) фгуп госниигенетики (г. москва) 07.06.2006 под регистрационным номером Ac- 1733.
заменяющий лист (правило 26)
штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
культурально-морфологические признаки.
через 24 часа роста при 28 0 C в жидкой питательной среде - ферментативном гидролизате рыбной муки (фгрм) присутствуют полиморфные клетки палочковидной формы. длина клеток 1,5-2 мкм, ширина 0,6-0,8 мкм. клетки располагаются в основном парами или в цепочках, часто V-образно. грамположительны. спор и цист не образуют. на плотной питательной среде (фгрм) после 48 часов роста колонии розовые, округлые, блестящие.
физиолого-биохимические признаки.
штамм Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D является аэробом, растет при температурах от +10 0 C до +40 0 C, температурный оптимум 27 + 2 0 C, растет при рн 5,5 - 9,0, оптимум рн 6,5 - 7,5. растет на богатой питательной среде фгрм и на синтетической среде следующего состава (г/л): (NнtъSсь - 6,0, KH2PO4 - 5,0, K 2 HPO 4 - 5,0, MgSO 4 - 0,2, глюкоза - 5,0, тдг - 2,0, рн - 7,5.
в качестве источников углерода использует мальтозу, маннозу, фруктозу, галактозу, глюкозу. образует кислоту при росте на среде с глюкозой, фруктозой, маннозой, мальтозой.
растет на среде с аммонийным азотом (NH 4 ^SO 4 . индол и сероводород не образует, желатину, крахмал не гидролизует. каталазоположителен. устойчив к цефтазидину, полимиксину, цефалексину.
штамм Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D разлагает IJl и: тиодигликоль в концентрации до 4,5 г/кг почвы и хлорорганические соединения в концентрации до 500 мг/кг почвы.
штамм хранится на плотной питательной среде фгрм с добавлением 0,1 % тдг, при температуре 2-4° с или в лиофильно высушенном состоянии.
штамм рsеиdотопаs риtidа Y21 выделен из почвы северо-восточной якутии, методом накопительной культуры с 111 й, депонирован в вкпм фгуп госниигенетики (г. москва) 07.06.2006 под регистрационным номером B-9450.
штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
культурально-морфологические признаки.
заменяющий лист (правило 26)
после 24 часов роста при 28 0 C в жидкой питательной среде - мясопептонном бульоне (мпб) присутствуют клетки палочковидной формы с заостренными концами. длина клеток около 1 мкм, ширина клеток - 0,5 мкм. клетки располагаются поодиночке, редко парами, цепочек не образуют, имеют около четырех жгутиков (латеральные), спор и цист не образуют. на плотной питательной среде фгрм после 48 часов роста колонии бесцветные, округлые, блестящие.
физиолого-биохимические признаки.
штамм рsеиdотоrшs риtidа Y21 является аэробом, растет при температурах от +10 0 C до +37 0 C, температурный оптимум 26 ± 2 0 C, растет при рн 5,0 - 9,0, оптимум рн 7,0 - 9,0. растет на богатых питательных средах на основе мпб, фгрм и на среде Jfe 1 следующего состава (% масс.): (NнL^Sс^ - 0,40, KH2PO4 - 0,15, K 2 HPO4 - 0,15, MgSθ4 - 0,02, глюкоза - 0,50, дрожжевой экстракт - 0,20, агар - 2,0, вода - остальное, содержащей пги (XOC - 16,0 ± 2,0 мг/л, тдг - 0,14 ± 0,01 г/л) рн - 7,5 - 8,0.
в качестве источников углерода использует глюкозу, галактозу, маннозу, сахарозу, лактозу, арабинозу, рамнозу, маннит, фруктозу, сорбит, инозит. образует кислоту при росте на среде с глюкозой, галактозой, маннозой, лактозой, фруктозой, сорбитом, инозитом.
растет на среде с аммонийным азотом (NH 4 CI). индол и сероводород не образует, желатину, крахмал, казеин не гидролизует. обладает способностью к денитрификации. каталазоположителен. устойчив к антибиотикам: рокситромицину, канамицину, цефалотину, стрептомицину, эритромицину, линкомицину, оксациллину. чувствителен к антибиотикам: цефтазидиму, гентамицину, офлоксацину, пиперациллину.
штамм рsеиdотопаs риtidа Y21 разлагает пги. тиодигликоль в концентрации до 4,5 г/кг почвы и хлорорганические соединения в концентрации до 500 мг/кг почвы.
штамм хранится на среде Xs 1 с добавлением 0,1% тдг под слоем стерильного вазелинового масла при температуре 2-4 0 C или в лиофильно высушенном состоянии.
штаммы кhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 не обладают антагонизмом по отношению друг к другу, пригодны к совместному
заменяющий лист (правило 26)
культивированию и могут быть использованы для биоремедиации почвы как каждый по отдельности, так и в смеси или в виде ассоциации, выращенной при совместном культивировании.
краткое описание чертежей
на фиг. 1 отображено влияние концентрации микроорганизмов- деструкторов на деградацию тдг в различных типах почвы
на фиг. 2 отображена динамика изменения биомассы почвенных грибов в ходе биоремедиации почвы.
осуществление изобретения.
сущность изобретения и его практическая применимость иллюстрируется примерами. пример 1. наработка биомассы штаммов-деструкторов
штамм Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D выращивают в жидкой питательной среде следующего состава (г/л): ферм бульон - 20, раствор пги (80 мг XOC, 0,7 г тдг), рн - 7,5. культивирование проводят в колбах эрленмейера на качалке (200 об./мин) при 28 0 C в течение одних суток. титр выросшей культуры составляет (6,0 ± 1,5) 10 9 кое/мл.
штамм рsеиdотопаs риtidа Y21 выращивают в жидкой питательной среде следующего состава (г/л): фгрм бульон - 20, раствор пги (80 мг XOC, 0,7 г тдг), рн - 7,5. культивирование проводят в колбах эрленмейера на качалке (200 об./мин) при 28 0 C в течение одних суток. титр выросшей культуры составляет (5,2 ± 1,3) 10 9 кое/мл.
пример 2. исследование деструкции тдг и фитотоксичности почвы при использовании штаммов деструкторов
исследования проводят в лабораторных условиях с использованием торфяно- перегнойной почвы, характеризующейся высоким содержанием питательных веществ, и «бeднoй» неокультуренной дерново-подзолистой почвы.
почвы обрабатывают раствором пги, создавая концентрации 500 мг хос/кг a.c. почвы и 4,5 г тдг/кг a.c. почвы.
в опытные варианты почвы вносят суспензии культур Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21, выращенных по примеру 1, создавая титр
заменяющий лист (правило 26)
клеток 10 9 кл./г a.c.пoчвы.
в качестве контроля используют почву, загрязненную раствором пги, не обработанную микроорганизмами. эксперимент длится в течение 10 недель.
для идентификации и количественного определения тдг используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматограф HP- 1090). содержание XOC определяют спектрофотометрическим методом.
фитотоксичность почвы характеризуют по морфометрическим показателям растений овса, длины колеоптиля и корня растений.
результаты исследований для торфяно-перегнойной почвы приведены в табл. 1 и 2, для дерново-подзолистой почвы - в табл. 3 и 4.
приведенные результаты показывают, что содержание тдг в опытных образцах почвы, обработанных заявляемыми штаммами значимо меньше, чем в контрольных образцах.
содержание тдг в опытных образцах торфяно-перегнойной почвы через 4 недели составляет 0.07-0.1 % от исходного (в контроле 18 %), в опытных образцах дерново-подзолистой почвы через 10 недель составляет 0,3 % от исходного (в контроле 30 %).
таблица 1 динамика микробной деструкции пги в торфяно-перегнойной почве
таблица 2
фитотестирование торфяно-перегнойной почвы
заменяющий лист (правило 26)
таблица 3 динамика микробной деструкции пги в дерново-подзолистой почве
таблица 4
фитотестирование дерново-подзолистой почвы
наряду с уменьшением содержания тдг в опытных образцах при внесении суспензии клеток Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21, наблюдается снижение фитотоксичности опытных образцов по сравнению с контролем. при этом обращает на себя внимание то, что для торфяно-перегнойной почвы существенное снижение фитотоксичности наблюдается при внесении штамма Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D, а на дерново-подзолистой почве лучший результат по фитотоксичности показывает штамм рsеиdотопаs риtidа Y21.
пример 3. влияние концентрации микроорганизмов-деструкторов на деградацию тдг в различных типах почвы
образцы торфяно-перегнойной и дерново-подзолистой почвы обрабатывают раствором пги (3200 мг хос/л; 61,4 г тдг/л), создавая концентрации: 250 мг XOC /кг а. с. почвы и 4,0 г тдг/кг а. с. почвы.
в опытные варианты почвы вносят суспензии культур Rhоdососсиs еrуthrороlis SO и рsеиdотопаs риtidа Y21, выращенных по примеру 1, создавая
заменяющий лист (правило 26)
концентрации 2xlO б - зхlо 9 кл./г а.с.почвы. в качестве контроля используют почву, загрязненную раствором пги, не обработанную микроорганизмами. результаты приведены в табл. S и 6 и на фиг.1.
приведенные результаты показывают, что и для торфяно-перегнойной и для дерново-подзолистой почв процесс деструкции тдг значимо ускоряется уже при внесении микроорганизмов-деструкторов в загрязненную почву в концентрации 2xlO 6 кл/г а.с.почвы. увеличение количества клеток до 10 7 кл./г a.c. почвы способствует увеличению скорости деструкции тдг, в то же время изменение титра клеток микробов с 10 7 до 10 9 кл./г ас. почвы практически не влияло на скорость деструкции.
таким образом, полученные результаты показывают, что увеличение концентрации штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis SD и рsеиdотопаs риtidа Y21 выше 10 7 кл./г а с. почвы нецелесообразно.
таблица 5
деградация тдг в образцах торфяно-перегнойной почвы при различных концентрациях микроорганизмов- деструкторов
заменяющий лист (правило 26)
таблица 6 деградация тдг в почвенных образцах дерново-подзолистой почвы
пример 4. оценка безопасности штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 для теплокровных животных
оценку безопасности штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 для теплокровных животных проводили на лабораторных линиях беспородных белых мышей массой 16-18 г и белых крыс живой массой 160-180 г по общепринятым методикам.
изучение патогенных свойств выделенных штаммов проводили в соответствии с международными требованиями GLP, по следующим показателям:
1. среднесмертельная доза (LD50) исследуемых штаммов,
2. токсичность исследуемых штаммов,
3. токсиrенность исследуемых штаммов,
4. диссеминация штаммов во внутренних органах экспериментальных животных.
результаты токсикологических исследований, приведенные в тaбл.7, показывают отсутствие патогенных свойств у штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21, что позволяет их безопасно использовать для биотехнологических целей, при проведении работ по биоремедиации почвы.
заменяющий лист (правило 26)
таблица 7 сводная таблица по изучению патогенности штаммов микроорганизмов
пример 5. исследование фитотоксичностн штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21
оценку фитотокснчности штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 осуществляют по методу OA берестецкого 191.
культуры штаммов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 выращивают на жидкой среде фгрм на качалке (200 об./мин) при температуре 28 0 C в течение одних суток.
для оценки степени токсичности используют суспензии с титром для Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D O,5xlO 8 - O,5xlO 10 кое /мл, для рsеиdотопаs риtidа Y21 - O,9xlO 8 - 0,9xl0 10 кое /мл.
семена редиса замачивают в исследуемых бактериальных суспензиях в течение 24 часов и проращивают в течение 4 суток на фильтровальной бумаге, пропитанной равным количеством воды, при постоянной температуре.
в качестве контрольных образцов используют семена редиса, замоченные в жидкой среде фгрм.
наличие в испытуемом образце фитотоксинов определяют по ростовым эффектам: учитывают процент прорастания семян, измеряют длину и массу проростков растений. токсичными считают культуры микроорганизмов, вызывающие снижение всхожести семян или угнетение роста проростков не менее чем на 30 % по сравнению с контролем.
из результатов, представленных в табл. 8 видно, что только штамм рsеиdотопаs риtidа Y21 с титром клеток O,9xlO 10 кое/мл тормозит рост редиса. однако такие высокие концентрации микроорганизмов на практике для заменяющий лист (правило 26)
и
биоремедиации почвы не используют. более низкие концентрации микроорганизмов не оказывают отрицательного действия на проростки редиса. всхожесть семян редиса, замоченных в суспензиях микроорганизмов, не отличается от всхожести контрольных семян.
таблица 8 оценка фитотоксичности штаммов-деструкторов иприта для семян редиса
пример 6. исследование деструкции тдг и фитотокснчности почвы при использовании смеси штаммов деструкторов Rhоdососсиs еrуthrорыis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21
исследования проводят с использованием торфяно-перегнойной и дерново- подзолистой почвы. образцы почвы обрабатывают раствором пги, создавая
заменяющий лист (правило 26)
концентрацию 250 мг XOC /кг a.c.пoчвы и 4,0 г тдг/кг а с. почвы. суспензии культур-деструкторов получают аналогично примеру 1.
в опытные варианты почвы вносят суспензии культур Rhоdососсиs еrуthrороtis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21, а также их смесь, содержащую культуры- деструкторы в соотношении 1:1. титр клеток бактерий-деструкторов в опытных вариантах составляет 10 7 кл./г а.с.почвы.
в качестве контроля используют почву, загрязненную раствором пги, не обработанную микроорганизмами.
результаты, представленные в табл. 9 - 12 показывают, что и для обоих типов почвы образцы, обработанные смесью штаммов микроорганизмов Rhоdососсиs еrуthrороtis 8D и рsеиdотопаs рυtidа Y21, дают лучшие результаты как по снижению содержания тдг в почве, так и по уменьшению ее фитотоксичности.
таблица 9
деградация тдг в образцах торфяно-перегаойной почвы
содержание тдг
образец почвы 2 недели 4 недели г/кг % к иcx. г/кг % к исх.
пги (контроль) 1,19 29,8 0,34 8,5
пги + Rhоdососсиs еrуthrороtis 0,1 2,5 0 0 SD
пги + рsеиdотопаs риtidа Y21 0,64 16,0 0,004 0,1
пги + смесь Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D : рsеиdотопаs 0,084 2,1 0 0 риtidа 21 (1 : 1)
полученные данные позволяют предложить использовать смесь штаммов микроорганизмов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 в качестве универсального средства для обработки iп sitи разных агрохимических типов почвы, загрязненной ипритом и пги.
заменяющий лист (правило 26)
таблица 10
фитотести ование то яно-пе егнойной почвы
таблица 11
деградация тдг в образцах дерново-подзолистой почвы
при этом наиболее широкое применение может найти смесь, содержащая микроорганизмы в соотношении 1:1, хотя, при значительном преобладании на местности какого-либо одного типа почвы, могут быть использованы и другие соотношения.
заменяющий лист (правило 26)
таблица 12
фитотестирование дерново-подзолистой почвы
пример 7. совместное культивирование штаммов микроорганизмов Rhоdососсиs еrуthrороlis SD и рsеиdотопаs риtidа Y21
в связи с тем, что использование смеси микроорганизмов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 показывает лучшие результаты по биодеградации разных типов почвы, загрязненных ипритом и пги, встал вопрос о возможности совместного культивирования штаммов.
совместное культивирование культур Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21 осуществляют в жидкой питательной среде фгрм с добавлением 0,2 % тиодигликоля, которая обеспечивает хороший рост обоих штаммов.
посевной материал готовят смывом односуточных культур микроорганизмов с чашек петри с агаризованной средой фгрм и засевом по 2 мл бактериальной суспензии (одs-кf^) на 100 мл питательной среды в качалочные колбы.
культивирование смеси микроорганизмов проводили на термостатированной качалке при 190 об/мин и температуре (28±1)°C в течение 24 - 40 часов.
проведенные исследования показали, что штаммы не являются антагонистами и пригодны для совместного культивирования. при этом штамм рsеиdотопаs риtidа Y21 показывает более высокую скорость роста, чем штамм заменяющий лист (правило 26)
Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D, вследствие чего при одновременном посеве обеих культур концентрация штамма 8D в среде была более низкой (-1,5 • 10 8 кл/мл), (табл.13).
таблица 13 влияние способа культивирования штаммов 8D и Y21 на их продуктивность
для получения при совместном культивировании смеси (ассоциации), содержащей культуры в равном соотношении, наиболее благоприятным оказался вариант с их последовательным внесением, а именно: посевную дозу штамма Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D вносят в питательную среду через 15-17 часов культивирования штамма рsеиdотопаs риtidа Y21 (табл.13).
совместное культивирование полученных штаммов можно проводить на любых богатых средах: мясо-пептонном агаре, фгрм, кровяном агаре и т.д., обеспечивающих хороший рост обоих штаммов.
пример 8. исследование степени деструкции XOC, динамики выживаемости штаммов и восстановления сапрофитной почвенной микрофлоры при использовании ассоциации микроорганизмов
образец серой лесной почвы обрабатывают раствором пги, создавая концентрацию XOC 50 мг /кг а с. почвы и тдг 270 мг /кг a.c.пoчвы.
в опытные образцы почвы вносят ассоциацию штаммов, выращенную по примеру 7, создавая титр клеток 10 7 кл./г а. с. почвы, и суспензии культур Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdотопаs риtidа Y21, выращенных по примеру 1, заменяющий лист (правило 26)
создавая тигр клеток 10 кл./г а.с.почвы.
таблица 14
деградация XOC в образцах серой лесной почвы
в качестве контроля используют почву, загрязненную раствором пги, не обработанную микроорганизмами.
восстановление сапрофитной почвенной микрофлоры исследуют, контролируя динамику изменения общей биомассы сапрофитных грибов.
таблица 15
численность интродуцированных микроорганизмов-деструкторов в процессе биоремедиации почвы, загрязненной пги
результаты экспериментов, приведенные в табл.14 и 15 и на фиг.2, показали, что ассоциация микроорганизмов обладает высокой деструктивной активностью в
заменяющий лист (правило 26)
отношении пги, выживаемостью штаммов-деструкторов, а так же восстанавливает численность сапрофитной почвенной микрофлоры.
пример 9. исследование деструктивной активности и интегральной токсичности почвы при использовании штаммов-деструкторов и их смеси
образец серой лесной почвы обрабатывают раствором пги, создавая концентрацию XOC 50 мг /кг a.c.πoчвы и тдг 270 мг /кг а с. почвы.
в опытные образцы почвы вносят суспензии культур Rhоdососсиs етуthrσроtis 8D и рsеиdоmопаs риtidа Y21, выращенных по примеру 1, создавая концентрацию клеток 10 8 кл./г а. с. почвы и их смеси в соотношении 1:1, 1:2 и 2:1.
в качестве контролен используют почву, загрязненную раствором пги, не обработанную микроорганизмами и почву, не обработанную раствором пги (чистую почву).
таблица 16
интегральная токсичность почвы с пги для Dарhпiа mаgпа во время микробной ремедиации
заменяющий лист (правило 26)
интегральную токсичность почвы при использовании штаммов- деструкторов и их смеси исследуют путем биотестирования на дафниях. токсичными считаются пробы, в которых гибель дафний превышает 50% по сравнению с контролем.
результаты, приведенные в табл.16 показывают, что через месяц все образцы почвы, подвергнутые обработке штаммами-деструкторами и их смесями не являются токсичными при этом наибольшее снижение интегральной токсичности (на 95%) отмечено для образцов почвы, содержащих смеси микроорганизмов.
таким образом, получены штаммы микроорганизмов Rhоdососсиs еrуtbrороlis 8D и рsеиdотпопаs риtidа Y21 - деструкторы пги, пригодные для биоремедиации почвы, загрязненной ипритом и пги. штаммы безвредны для человека и окружающей среды, снижают интегральную токсичность и фитотоксичность почвы.
показано, что штамм Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D лучше «paбoтaeт» на богатых питательными веществами почвах (черноземах, торфяно-перегнойных), а штамм и рsеиdотпопаs риtidа Y21 - в случае «бeдныx» почв (дерново-подзолистых, серых лесных).
в качестве универсального средства для обработки iп sitи разных типов почвы, загрязненных ипритом и пги, целесообразно использовать смесь штаммов микроорганизмов Rhоdососсиs еrуthrороlis 8D и рsеиdоmопаs риtidа Y21 в соотношении 1:1.
исследования также показывают, что указанные штаммы не обладают антагонизмом по отношению друг к другу и могут культивироваться совместно, что позволяет получить значительный экономический эффект.
список литературы:
1. умяров и. а., кузнецов б. а., кротович и.H., холстов B.и., соловьев в.к. методы уничтожения и утилизации запасов люизита и иприта.- российский химический журнал, 1993, т. 37, Jfа 3, с. 25-29.
2. методические указания минздрава ссср Jfe 4263 - 87, Jte 2620 - 82.
3. A M. воронин, в.г. сахаровский, и.T. ермакова и др. утилизация продуктов детоксикации ипритно-люизитной смеси. - прикладная биохимия и микробиология., 1999, т.35, Jfe 6, с. 671-678.
заменяющий лист (правило 26)
4. с.в.пегров, ю.н. корякин, в.и. холстов и др. биотехнология в решении проблемы уничтожения химического оружия. - российский химический журнал, 1995, т. XXXDC, J64, с. 18-20.
5. LT. еrmаkоvа, N.S. Sаfriпа, LI. Stагоvоhоv апd оthеrs мiсгоbiаl dеgrаdаtiоп оf thе dеtохifiсаtiоп рrоduсts оf mustаrd frоm thе Rшsiап сhеmiсаl wеаропs stосkрilе - Jоuгпаl оf сhеmiсаl тесhпоlоgу апd вiоtесhпоlоgу, 2005, v. 80, р. 495-501.
6. T -S. Lее, W. A.Weigaпd, W. E. вепtlеу. оbsеrvаtiопs оf mеtаbоlitе fоппаtiоп апd vаriаblе уiеld iп thiоdiglусоl biоdеgrаdаtiоп рrосеss. Imрасt оп rеасtоr dеsigп - аррl. вiосhеm. вiоtесhпоL 1997, v. 63-65, р. 743-757.
7. H.г. медведева, T.б.зaйцeвa, C B. зиновьева, в.и. сухаревич, о.г. орлова. деструкция продуктов гидролиза иприта культурой рsеudоmопаs sр. Y-13 - биотехнология, 2006, JVs 2, с. 50 - 56.
8. патент рф JSs 2103357. Cl. способ биодеградации ипритсодержащих смесей, штамм бактерий рsеudоmопаs sресiеs 8-2 - биодеградатор иприта, штамм бактерий рsеudоmопаs dоиdоrqfli 70-11 - биодеградатор иприта, штамм бактерий соrупеbасtеriит sресiеs кзб - биодеградатор иприта / медведева H.г., сухаревич B.и., лаврентьев A.H. и др. - бюл. Jfe 3,1998. (прототип)
9. о.а. берестецкий. методы определения токсичности почвы. микробиологические и биохимические исследования почв, киев. урожай, 1971, с. 28-31.
заменяющий лист (правило 26)