[0001] 本发明属于基因工程领域， 涉及一种 RNAi表达载体及其构建方法和应用， 尤 其涉及一种 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体、 构建方法及其应用。

背景技术

[0002] ILA属于 TNFR超家族， 主要表达于活化的 T细胞中， 是一种可诱导的 T细胞表 面受体； TNLG5A属于 TNF超家族， 主要表达在集中抗原呈递细胞 （APC) 。 IL A/TNLG5A是 CD28/B7之外的另一重要的共刺激分子， 可依赖或不依赖于 CD28/

B7途径而介导产生协同刺激信号， 诱导 T细胞的活化、 增殖与细胞因子的分泌。 技术问题

[0003] ILA及其配体系统存在双向信号传导， 既可通过 TNLG5A向 T细胞传递细胞， 又 可将信号传向表达配体的细胞， 其在肿瘤的免疫治疗中起重要的作用， 需做大 量研究方可实现临床转化， 但现有技术中缺乏特异抑制 TNLG5A基因表达的 RN Ai表达载体使得相关研究无法很好地幵展。

问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 本发明的目的是 TNLG5A基因的 RNAi表达载体、 构建方法及其应用。

[0005] 在本发明的第一方面， 提供一种分离的多核苷酸， 其核苷酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示。

[0006] 在本发明的另一方面， 提供一种重组载体， 含有如 SEQ ID NO:2所示的核苷酸 序列， 所述重组载体是以 pLVX-shRNAl载体为骨架载体， 在多克隆酶切位点处 插入顺序连接的由 Bam HI酶切位点 +靶核苷酸序列 +茎环结构序列 +靶核苷酸序列 互补序列 +终止位点序列 +EcoR I酶切位点组成的 shRNA寡核苷酸序列。

[0007] 在本发明的另一方面， 提供一种前述的 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体的制备 方法， 包括如下步骤：

[0008] A) shRNA寡核苷酸序列的设计： 根据 TNLG5A的 mRNA全序列， 经 BLAST同 源性比对证实特异性后应用 RNA structure 软件对靶 mRNA序列的二级结构进 行评估得到靶核苷酸序列， 设计并合成靶向 TNLG5A基因的 shRNA寡核苷酸序列

[0009] B) TNLG5A基因的 RNAi表达载体的构建和鉴定： 将合成的 shRNA寡核苷酸单 链按等摩尔比混合， 退火形成双链的 shRNA, 提取质粒 pLVX-shRNAl， 用限制 性内切酶 Bam HI、 EcoR I双酶切， 电泳、 切胶回收载体， 再用 T4 DNA Ligase分 别将双链 shRNA连接到 pLVX-shRNAl表达载体中， 得到连接产物； 将连接产物 转化到感受态大肠杆菌 Stbl3中， 均匀涂布到含氨苄青霉素 LB培养基平板上， 挑 取阳性单克隆菌落培养保存并进行 PCR鉴定， 将初步鉴定结果说明 shRNA寡核苷 酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定；

[0010] C) TNLG5 A基因的 RNAi表达载体的抽提： 将测序结果证实 shRNA寡核苷酸序 列插入成功的菌液扩增培养， 进行大量抽提重组质粒， 得到 TNLG5A基因的 RN Ai表达载体。

[0011] 本发明利用 RNAi技术构建靶向 TNLG5A基因表达的 RNAi表达载体， 经鉴定构 建成功后， 电转 Jurkat细胞， 使用实吋荧光定量 PCR技术从 mRNA水平验证 TNLG 5A基因表达的抑制效果， 实验结果证明本发明提供的 shRNA寡核苷酸成功插入 至 pLVX-shRNAl表达载体中， 且对 TNLG5A基因表达的抑制效果显著。

[0012] 在本发明的另一方面， 提供一种 SEQ ID ΝΟ:1所示的多核苷酸或含有 SEQ ID ΝΟ:1所示的多核苷酸的载体或前述 TNLG5A基因的 RNAi表达载体在 TNLG5A基 因表达异常相关疾病的药物中的用途。

发明的有益效果

有益效果

[0013] 本发明提供的 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体具有转染效率高， 用量少， 可高 效、 特异地抑制 Jurkat细胞 TNLG5A基因表达的优点， 可作为有力工具应用于制 备治疗 TNLG5A基因表达异常相关疾病的药物。

对附图的简要说明

附图说明

[0014] 图 1为转染 TNLG5A基因的 RNAi表达载体细胞的荧光定量 PCR检测结果示意图 实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0015] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步 的说明。

[0016] Jurkat细胞购自上海生命科学院细胞资源中心， RNAi载体 pLVX-shRNAl购自 C1 ontech公司， RNeasyMiniKit购自 Qiagen公司， 无内毒素质粒提取试剂盒购自 Ome ga bio-tek公司。 下文所述完全培养基为加入了 10%胎牛血清的细胞培养基。

[0017] 实施例一靶向 TNLG5A基因的 shRNA寡核苷酸序列的设计

[0018] 在 GenBank査找 SJTNLG5A的 mRNA全序列， 经 BLAST同源性比对证实特异性 后应用 RNAstmcture 4.4软件对靶 mRNA序列的二级结构进行评估， 最后获得靶 核苷酸序列。

[0019] 根据靶核苷酸序列设计合成 shRNA。 设计如下： B _a m HI酶切位点+19 _n t靶核苷 酸序列 +茎环结构 （TTCAAGAGA) +靶序列互补序列 +RNAPolym聚合酶转录中 止位点 （TTTTTT) +EcoR I酶切位点六个区域， 其序列如 SEQ ID NO: 1所示。 设 计的 shRNA寡核苷酸链由上海生工生物工程技术服务� ��限公司合成。

[0020] 实施例二 TNLG5A基因的 RNAi表达载体的构建。

[0021] 将合成的 shRNA寡核苷酸单链等量混合， 退火形成双链的 shRNA, 提取质粒 pL VX-shRNAl , 用限制性内切酶 Bam HI、 EcoR I双酶切， 电泳、 切胶回收载体， 再用 T4 DNA Ligase将双链 shRNA连接到载体 pLVX-shRNAl中， 形成 TNLG5A基 因的 RNAi表达载体。 将连接产物转化到感受态大肠杆菌 Stbl3中， 涂布到含氨苄 青霉素 LB培养基的平板上， 于 37°C培养 14 h。 挑取长出的菌落， 送至上海生工 测序。 测序结果与所设计的序列完全相符， 可用于后续实验。

[0022] 实施例三 Jurkat细胞的电转

[0023] 培养 Jurkat细胞， 取生长状态良好的细胞 5000000个， 离心收集细胞， 然后重悬 于 500 μL PBS中， 与 20 μ _β TNLG5 Α基因的 RNAi表达载体混匀后加入电击杯， 应 用 BTX ECM830电转仪进行电转， 电转程序： 2.5 KV， 25 FD， 脉冲电击一次； 将细胞转移至含 5 mL DMEM完全培养基的 6

cm皿中， 轻轻晃动皿使细胞混匀， 48 h后检测 TNLG5A基因表达情况。 [0024] 实施例四荧光定量 PCR检测 TNLG5A基因表达量

[0025] 分别培养正常 Jurkat细胞和电转 TNLG5A基因的 RNAi表达载体的 Jurkat细胞 48 h ， 用 RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScript RT reagent Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， 逆转录条件： 37°C， 15min; 85°C， 5s; 4°C， ∞。 反转录结束后， 加入 90μ1的 RNase-Free dH20稀释 cDNA， -20°C保存， 以便后面 检测使用。 取各组细胞的 cDNA 1

为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR (QPCR) 检测 TNLG5A相对表 达量， 设置反应条件： 95°C 10s， 1个循环； 95°C 5s， 54°C 30s， 共 40个循环， 利用 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit检测各组细胞 TNLG5 A基因相对表达量， 结果 如图 1所示。 结果显示转染 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体的 Jurkat细胞， TNLG5 A基因表达明显受到抑制， shRNA片段对目的基因的抑制效率达 77.1%±6.8<¾， 从 而证明本实验中采用的 TNLG5A基因的 RNAi表达载体能特异抑制 TNLG5A基因 的表达， 且抑制效果非常显著。

[0026] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明 所作的进一步详细说明， 不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。

工业实用性

[0027] 本发明提供的 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体具有转染效率高， 用量少， 可高 效、 特异地抑制 Jurkat细胞 TNLG5A基因表达的优点， 可作为有力工具应用于制 备治疗 TNLG5A基因表达异常相关疾病的药物。