ET LEURS UTILISATIONS

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se situe dans le domaine des extraits végétaux et concerne un extrait racinaire de Polygonum multiflorum concentré en THSG avec pas ou très peu d'émodine, un procédé de préparation d'un tel extrait ainsi qu'une composition cosmétique et une composition pharmaceutique ou nutraceutique, lesdites compositions comprenant en tant qu'agent actif au moins un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention.

ART ANTERIEUR

Polygonum multiflorum Thunb., plante herbacée de la famille des Polygonaceae, est une des plantes les plus populaires de la médecine traditionnelle chinoise. Sa racine séchée appelée Polygoni Multiflori Radix (RPM, Heshouwu en chinois) est utilisée dans de nombreuses préparations. Sous forme brute elle est utilisée à des fins multiples notamment pour aider à la digestion (purgatif).

Classiquement, les racines de Polygonum multiflorum sont traitées à la vapeur dans du jus de soja noir puis séchées. Sous cette forme ainsi préparée, Radix Polygoni Multiflori Praeparata (RPMP, Zhiheshouwu en chinois) est utilisé notamment pour détoxifier et activer la circulation dans le foie et les reins.

Récemment Polygoni multiflori Radix a été étudié pour son potentiel pharmacologique. L'extrait présente des effets immunologique, anti-cancer, anti-inflammatoire, neuro-protecteur et anti-hyperlipidémie

Dans le domaine cosmétique, des extraits de RPM ou de RPMP présentant un effet protecteur contre le stress oxydatif, sont utilisés pour prévenir la progression du blanchiment des cheveux ou dans des compositions cosmétiques anti-âge. Par exemple la demande KR20150143375 décrit une composition cosmétique contenant un extrait de racines adventices de Polygonum multiflorum, présentant une activité antioxydante, une inhibition de l'expression de la collagénase, une inhibition des activités élastase, et un effet anti-rides. La demande KR20160123433 décrit une composition cosmétique contenant un extrait de racines séchées de Polygonum multiflorum présente des propriétés antioxydantes et antirides mais aussi des fonctionnalités de blanchiment de la peau (activité inhibitrice de la tyrorinase), anti-inflammatoire et anti-atopique.

De nombreux composés ont été identifiés au sein de l'espèce Polygonum multiflorum. Ce sont pour la plupart des anthraquinones, des stilbènes, des flavonoïdes, parmi lesquels se trouvent le 2,3,5,4'-tétrahydroxystilbène-2-0- β-D-glucoside (THSG), l'émodine et le physcion (Traditional usages, botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb. : a review ; Lin L, Ni B, Lin H, Zhang M, Li X, Yin X, Qu C, Ni J. J. Ethnopharmacol . 2015 Jan 15; 159 : 158-83).

Le THSG est supposé être responsable de l'activité de Polygoni Multiflori Radix. Il a été identifié comme ayant des activités anti-inflammatoires et antioxydantes, des propriétés prophylactiques et thérapeutiques contre la maladie d'Alzheimer (Lin et al., 2015). Il agit également dans la prévention et le traitement du blanchiment des cheveux (WO2016/101259).

Bien que des extraits de Polygonum multiflorum soient habituellement utilisés pour traiter diverses maladies du foie, un nombre croissant de cas d'hépato- toxicité potentiellement induit par leurs usages a été signalé. Des études ont montré que des quinones et notamment l'émodine peuvent conduire à une hépato-toxicité. Récemment, une étude toxicologique basée sur une approche in silico d'analyse des mécanismes moléculaires d'hépatotoxicité induit par Polygonum multiflorum a montré que l'émodine est associée de façon évidente à cette hépato-toxicité (« Insights into the molecular mechanisms of Polygonum multiflorum Thunb-induced liver injury: a computational Systems toxicology approach »; Wang YY, Li J, Wu ZR, Zhang B, Yang HB, Wang Q, Cai YC, Liu GX, Li WH, Tang Y. ; Acta Pharmacol Sin. 2017 Feb 27, 719-732.)

Selon l'inventaire européen des produits cosmétiques (EU inventory cosmetic ingrédients) les anthraquinones, comme l'émodine, sont considérées comme faisant parties des composés indésirables des plantes.

Les constituants chimiques de Polygonum multiflorum changent lors du traitement de l'extrait. Ainsi, l'hépato-toxicité de Polygoni Multiflori Radix (RPM) est plus forte que celle de Radix Polygoni Multiflori Praeparata (RPMP). Cependant la teneur en émodine augmente avec le traitement de l'extrait de Polygonum multiflorum (Toxicity of raw and processed roots of Polygonum multiflorum ; Wu X, Chen X, Huang Q, Fang D, Li G, Zhang G. ; Fitoterapia. 2012 Apr;83(3) :469-75).

L'émodine étant présente dans la racine de Polygonum multiflorum, il est donc nécessaire de développer un procédé qui permette l'extraction sélective du THSG ou du moins qui permette l'obtention d'un extrait dépourvu d'émodine, ou comprenant de l'émodine en quantité très faible.

Des techniques d'extraction sélective de polyhydroxy stilbène, dont le resvératrol et le THSG font partie, ont été élaborées mais elles restent compliquées et coûteuses.

L'Aloe vera est une plante dont le gel est commercialisé notamment à des fins cosmétiques. Les anthraquinones contenues dans le gel doivent être éliminées. Pour ce faire la demande internationale WO2005/021018 décrit un procédé utilisant des oxydases dont l'activité enzymatique permet la dégradation de l'aloine et l'émodine présentes dans le gel d'Aloe vera.

La demande internationale WO2008/092221 décrit un système qui permet l'extraction sélective de trans-resvératrol et de l'émodine en utilisant le toluène comme solvant. Même si ce procédé présente de nombreux avantages il est encore long et nécessite plusieurs étapes dont notamment le séchage des racines et il ne permet pas l'obtention d'un extrait liquide directement exploitable par l'industrie cosmétique.

Pour le THSG, comme pour d'autres poly hydroxystilbènes, l'activité biologique est principalement liée à ses pouvoirs antioxydants qui sont reliés à ses groupements polyphénols. Ces groupements sont très instables et le THSG est donc susceptible d'être oxydé et hydrolysé. Il est donc nécessaire de réaliser des extraits dans lesquels la molécule aura une stabilité accrue grâce à l'utilisation d'un solvant et d'un pH adéquat.

Les inventeurs ont maintenant développé un procédé permettant de préparer un extrait racinaire de Polygonum multiflorum concentré en THSG avec pas ou très peu d'émodine, stable et directement exploitable par l'industrie cosmétique. Un tel procédé permet la réalisation d'extractions successives sans détruire ni altérer la survie des plantes. Les inventeurs ont également montré qu'un extrait végétal selon l'invention présente non seulement des bénéfices cosmétiques, comme la prévention ou le ralentissement du vieillissement cutané, la stimulation du renouvellement de l'épiderme ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau, mais aussi peut être utilisé en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne de la peau, atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1. Evolution de la teneur en THSG dans des extraits racinaires de Polygonum multiflorum à 3 pH différents (pH 2,8 représenté par les histogrammes noirs, pH 4 représenté par les histogrammes gris et pH 6,8 représenté par les histogrammes blancs) après 2, 4 et 6 mois de conservation de l'extrait à 40°C et à l'obscurité.

Figure 2. Chromatogramme (UV à 319 nm) de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'exemple 1.

Figure 3 : Chromatogrammes (UV à 288 nm) de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'exemple 1 (haut) et du standard d'émodine à 10 mg/L (bas).

Figure 4. Mesures de la viabilité de Kératinocytes humains NHEKs après 24h de traitement avec cinq différentes concentrations (3%, 1%, 0,33%, 0,11% et 0,037%) d'un extrait de Polygonum multiflorum préparé selon l'exemple 1.4 (en gris foncé hachuré), ou de son solvant seul à la même concentration (en gris clair). Les pourcentages de viabilité ont été calculés par rapport au contrôle négatif non traité (CTL NT) fixé à 100% et au contrôle positif de cytotoxicité (SDS à 0,008%). Les histogrammes représentent la moyenne de 3 réplicats indépendants et la barre d'erreur correspond à l'écart-type autour de la moyenne.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention a pour premier objet un extrait racinaire de Polygonum multiflorum caractérisé en ce

- qu'il comprend au moins 0,8% en poids de THSG, de préférence au moins 1,5%, plus préférentiellement au moins 2%, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec, et

- qu'il comprend moins de 0,01% en poids d'émodine, de préférence moins de 0,001%, plus préférentiellement moins de 0,0005%, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un extrait racinaire de Polygonum multiflorum caractérisé en ce :

• qu'il comprend au moins 0,8%, au moins 1%, au moins 1,2%, au moins 1,5%, au moins 1,7%, au moins 2%, au moins 2,5%, au moins 3%, en poids de THSG, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec,

et

• qu'il comprend moins de 0,01%, de préférence moins de 0,005%, de préférence moins de 0,001%, plus préférentiellement moins de 0,0005% et encore plus préférentiellement moins de 0,0001% en poids d'émodine exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.

Par « extrait racinaire de Polygonum multiflorum » on entend un produit obtenu par l'extraction de racines de plantes de l'espèce Polygonum multiflorum.

Par « concentré en THSG » on entend un extrait racinaire comprenant une quantité de THSG ne devant pas être inférieure à 0,8% exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.

Par «2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-0^-D-glucoside» ou « THSG » on entend un composé suivante :

Par « extrait sec » on entend l'extrait obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l'invention suivie d'une étape de dessication de l'extrait, la dessication étant mise en œuvre selon toute méthode bien connue de l'homme du métier, notamment de placer l'extrait en atmosphère chaude et sèche.

Par « pas d'émodine » on entend une quantité d'émodine dans l'extrait inférieure au seuil de détection et pas « très peu d'émodine » on entend une quantité d'émodine dans l'extrait inférieure à la limite de quantification par chromatographie en phase supercritique ou par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS). Selon un aspect particulier, dans un extrait racinaire selon l'invention, la quantité d'émodine dans l'extrait est inférieure à la limite de quantification par chromatographie en phase supercritique ou par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS).

Pour l'obtention d'un extrait racinaire, quand les racines sont jugées suffisamment développées, celles-ci sont mises en contact avec un solvant par immersion ou macération, et ensuite ledit solvant est récupéré et traité pour en extraire les molécules d'intérêts qui ont été libérées par les racines desdites plantes. Ce type de procédé est adapté du procédé développé par la société Plant Advanced Technologies (PAT) sous le nom de « PAT Plantes à Traire® » et décrit dans la demande internationale WO 01/33942.

Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un extrait racinaire de Polygonum multiflorum, plus particulièrement choisi parmi :

Un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un solvant,

Un extrait obtenu par macération racinaire dans un solvant, et

Un mélange d'au moins un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un premier solvant et d'au moins un extrait obtenu par macération racinaire dans un deuxième solvant.

Dans un deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention, comprenant : a) une étape de culture de de Polygonum multiflorum en conditions hors- sol, et particulièrement en aéroponie,

b) optionnellement une étape de stimulation des racines des plantes, c) une étape d'extraction solide / liquide des racines optionnellement stimulées lors de l'étape b), et

d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).

Dans le cadre de l'invention, on entend par « culture des plantes en conditions hors sol », tout mode de culture dans lequel les racines de la plante ne sont pas dans de la terre. Plus précisément, la culture hors sol est une culture dans laquelle les racines des plantes reposent dans un milieu reconstitué, détaché du sol. Ce milieu de culture est irrigué de façon régulière par des solutions nutritives appropriées à la plante cultivée. II existe différentes techniques de culture hors sol tels que les systèmes sans substrat qui nécessitent une solution nutritive enrichie en oxygène, et les systèmes avec substrat. Parmi les systèmes sans substrat, on peut citer l'aquiculture pour laquelle la solution nutritive est non circulante et est contenue dans un bac de culture, la Nutrient Film Technique (N. F.T.) pour laquelle la solution nutritive s'enrichit en oxygène dissous au cours de son déplacement par échange avec l'air, et l'aéroponie pour laquelle les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide : elles sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation (via un brumisateur) de la solution nutritive dans un milieu fermé. Parmi les systèmes avec substrat, on retrouve la subirrigation dans laquelle la solution nutritive pénètre dans le substrat au niveau de sa partie inférieure et la percolation dans laquelle la solution nutritive est distribuée par irrigation discontinue à la surface supérieure du système puis percole vers le bas du substrat. Le substrat, minéral ou organique, est neutre et inerte comme du sable, de l'argile ou de la laine de roche par exemple. Ce substrat peut être également d'origine industrielle.

On entend par « culture des plantes en aéroponie » un mode de culture hors sol pour lequel les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide. Selon un mode de réalisation particulier, les plantes sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation, via un brumisateur, de la solution nutritive dans un milieu fermé.

Typiquement, dans un procédé selon l'invention, on peut disposer des plantes sur des plateaux avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire en-dessous, on dispose les plateaux sur des tables formant zone de rétention pour collecter l'excédent d'un liquide diffusé vers les plantes, et on transfère les plateaux sur les tables à différents postes. Lors de l'étape a), les plantes cultivées en aéroponie sont alimentées par pulvérisation racinaire d'une solution nutritive de sels minéraux essentiels (Azote - N, Phosphore - P, Potassium - K), afin d'obtenir un développement racinaire maximum et une concentration maximum en molécules d'intérêt, sans altérer la survie de la plante. L'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales, sait comment adapter les proportions et concentrations des différents sels minéraux pour optimiser le développement racinaire et la concentration des molécules d'intérêt. Les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont dans ce cas comprises dans une gamme d'électroconductivité s'étendant avantageusement entre 0,8 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 1,0 à 1,2 mS/cm, afin de favoriser une plus grande teneur en THSG dans les extraits.

Dans l'étape c) d'un procédé selon l'invention, on entend par « extraction solide/liquide » toute technique d'extraction par solvant qui consiste à extraire une espèce chimique se trouvant dans un solide et étant soluble dans ledit solvant. Parmi ces techniques d'extraction, on peut citer la macération, l'exsudation, l'infusion, la décoction, l'extraction par extracteurs de Soxhlet et de Kumagawa, l'extraction assistée par micro-onde, l'extraction assistée par ultrason, l'extraction par voie enzymatique, l'extraction par fluide supercritique (C02 +DPG). L'extraction conduit à la récupération des métabolites contenus dans l'une ou l'autre partie des plantes, et notamment les racines, au moyen d'un liquide de lessivage, ou solvant, mis en contact avec les racines coupées et/ou encore accrochées à la plante, dans un solvant particulier et pendant une durée appropriée. Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation et une macération.

Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation racinaire et une macération racinaire. Cette étape consiste notamment en une étape de « trempage », pendant laquelle on met les racines des plantes dans un bac de trempage contenant un liquide pendant une durée prédéterminée. Typiquement, les plantes sont disposées sur un plateau avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire au- dessous, le plateau est remonté après le trempage, puis le liquide contenu dans le bac de trempage est collecté. Selon un aspect particulier, l'étape de trempage est suivie d'une étape de coupe dans laquelle la partie racinaire des plantes est partiellement coupée pour récolter les racines coupées. Il est possible d'extraire les substances des racines coupées, outre l'extraction des substances lors du trempage.

De préférence, dans un procédé selon l'invention, l'exsudation racinaire est réalisée sur des racines encore attachées à la plante. Selon un autre aspect préféré, la macération racinaire est réalisée sur des racines fraîchement coupées, c'est-à-dire coupées depuis moins de 24 heures, et de préférence le plus tôt possible après coupage, idéalement juste après coupage, lesdites racines étant éventuellement séchées après leur section et avant macération. Le séchage des racines peut être réalisé par la mise en œuvre de tout procédé de séchage adapté, connu de l'homme du métier, et notamment en plaçant les racines à une température comprise entre 40°C et 60°C pendant 4 heures, de préférence dans un environnement sec. Le séchage des racines peut notamment être réalisé dans une étuve ventilée.

Selon un autre aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), comprend donc une étape de séchage des racines coupées préalablement à l'étape de macération.

Plus particulièrement, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant choisi parmi : les alcools, la glycérine, les glycols et les solvants eutectiques. Ledit alcool est choisi de préférence parmi l'éthanol et le méthanol, utilisés purs ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% d'alcool, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit glycol est un diol dans lequel les deux groupes hydroxyl sont portés par des carbones différents, et est choisi parmi : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1,2 diol et le butylène glycol, et est utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse de glycol, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% de glycol, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. La glycérine est utilisée pure ou sous la forme d'une solution aqueuse de glycérine, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% de glycérine, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit solvant eutectique est constitué de deux composants ou plus, qui peuvent être solides ou liquides et qui, dans une composition particulière, présentent une forte diminution de leur température de fusion, rendant ainsi le mélange liquide. Les solvants eutectiques naturels sont principalement constitués d'acides aminés, d'acides organiques, de sucres et de dérivés de la choline. L'eau peut faire partie du solvant, mais est dans ce cas fortement retenu dans le liquide et ne peut être évaporée. Les combinaisons particulières des composants constituant ledit solvant eutectique sont choisies parmi notamment, et de manière non exhaustive, le chlorure de choline - glucose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 4: 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide tartrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - xylose (ratio 2 : 1), le chlorure de choline

- xylose (ratio 3 : 1), l'acide citrique - saccharose (ratio 1 : 1), l'acide citrique

- glucose (ratio 1 : 1), le glucose - acide tartrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - urée (ratio 1 : 2), le chlorure de choline - xylitol - eau (2 : 1 : 3) et l'acide lactique - glucose - eau (5 : 1 : 3). Par « butylène glycol » on entend le butane 1,2 diol, le butane 1,3 diol, le butane 2,3 diol et le butane 1,4 diol.

Ces solvants, et plus particulièrement la glycérine, le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol et le propane 1,2 diol permettent de favoriser une extraction sélective ; c'est-à-dire l'extraction d'une forte teneur en THSG, sans extraire ou extraire à une teneur très faible ou inférieure au seuil de quantification de l'émodine. Dans le cas d'un mélange d'extraits racinaires, lesdits premier et deuxième solvants peuvent être identiques ou différents.

Selon un aspect plus particulier, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant choisi parmi : la glycérine, le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol et le propane 1,2 diol. Selon un aspect particulier de l'invention, le solvant est caractérisé par un pH acide, notamment lorsqu'il est utilisé lors de l'étape d'extraction solide/liquide. Selon un aspect particulier, ledit alcool ou ledit glycol utilisé lors d'une étape d'extraction solide/liquide est caractérisé par un pH compris entre 1,5 et 5, de préférence entre 2 et 4,5, plus préférentiellement entre 3 et 4,5. Selon un autre aspect particulier, un extrait végétal selon l'invention est caractérisé par un pH compris entre 2,5 et 5 et de préférence entre 3,5 et 4,5. L'utilisation d'un solvant à pH acide, c'est-à-dire supérieur ou égal à 1,5 et inférieur ou égal à 5, favorise la solubilisation des composés d'intérêt dans ledit solvant, limite la dégradation chimique ou enzymatique du THSG lors de l'extraction et permet en combinaison avec le choix du solvant à favoriser une extraction sélective, c'est-à-dire l'extraction d'une forte teneur en THSG, sans extraire d'émodine ou l'extraire à une teneur très faible ou inférieure au seuil de quantification. Les acides utilisés pour l'ajustement du pH du solvant ou de l'extrait sont de préférence l'acide lactique, l'acide phosphorique, l'acide citrique ou l'acide chlorhydrique.

Plus particulièrement, ledit glycol est choisi dans le groupe suivant : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1, 2 diol et la glycérine. Le propane 1,3 diol, ou triméthylène glycol, peut être préparé par synthèse chimique selon des techniques connues de l'homme du métier et décrites dans la littérature, il est aussi disponible commercialement. Ledit propane 1,3 diol peut également être produit par la mise en œuvre d'un procédé de fermentation en conditions adaptées d'un organisme vivant, notamment une souche génétiquement modifiée d'Escherichia coli. Le propane 1,3 diol ainsi obtenu est désigné par le terme de « propane 1,3 diol biosourcé », un tel produit est produit puis purifié comme décrit notamment dans la demande internationale WO 2004/101479 et commercialisé sous la marque Zéméa®. Ledit propane 1,3 diol peut également avoir une certification Bio, par exemple de type COSMOS.

De façon encore plus particulière, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide comprend la mise en présence des racines avec du propane 1,2 diol ou avec du propane 1,3 diol, et notamment du propane 1,3 diol biosourcé et/ou de certification Bio.

Selon un aspect particulier, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant pendant une durée comprise entre 15 minutes et 30 minutes pour l'exsudation racinaire et pendant une durée comprise entre 1 heure et 108 heures, notamment entre 24 heures et 96 heures, plus particulièrement entre 48 heures et 96 heures pour la macération racinaire. Pour la macération racinaire, le ratio de la quantité de racines fraîches sur la quantité de solvant varie entre 0,2 kg de racines / L de solvant à 1 kg de racines / L de solvant. Selon un autre aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend une étape de section des racines puis de séchage des racines sectionnées, préalablement à l'étape de macération desdites racines, la macération étant réalisée par la mise en présence des racines avec un solvant. Pour la macération racinaire, le ratio de la quantité de racines sèches sur la quantité de solvant varie entre 0,1 kg de racines / L de solvant à 0,04 kg de racines / L de solvant.

Le procédé selon l'invention peut donc comprendre une première étape d'exsudation racinaire effectuée par immersion dans un solvant des racines encore accrochées à la plante pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes, suivie d'une étape de macération racinaire des racines coupées de la plante, puis éventuellement séchées.

Les durées d'exsudation racinaire et/ou de macération racinaire sont choisies de manière à favoriser l'extraction d'une forte quantité en composés d'intérêt tout en n'altérant pas la survie de la plante et sans mener à l'épuisement des ressources. Ainsi les plantes, après l'étape d'exsudation racinaire et éventuellement après l'étape de coupe des racines, sont remises en culture pendant 1 à 8 semaines en aéroponie selon les étapes a) et optionnellement soumises pendant 1 jour à 8 semaines à une étape de stimulation b) afin de recommencer leur développement racinaire et favoriser la production par les racines de métabolites secondaires.

Selon un mode de réalisation préféré, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention comprenant :

a) une étape de culture de Polygonum multiflorum en conditions hors- sol, et particulièrement en aéroponie,

b) une étape de stimulation des racines des plantes,

c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), et

d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).

Selon un autre aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape b) de stimulation des racines des plantes comprend :

• une étape d'élicitation dans laquelle les racines sont mises en présence d'une solution comprenant au moins un agent choisi parmi : un sel, un tensioactif, un solvant, un éliciteur d'origine fongique ou bactérienne, un dérivé de l'acide jasmonique, en particulier le méthyl jasmonate, l'acide salicylique, un générateur d'éthylène, une chitine, des chitosans et/ou leur mélange, et/ou

• une étape de mise en présence des racines avec une solution carencée en azote, c'est-à-dire une solution comprenant une proportion d'azote inférieure à la proportion d'azote habituellement considérée comme optimale pour le développement de la plante, avantageusement moins de 15% d'azote, et avantageusement ne comprenant pas d'azote, lesdites étapes étant séquentielles ou simultanées.

Les racines peuvent également être stimulées par la mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote. La mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote provoque un « stress azoté » responsable de la stimulation. Selon un aspect particulier, une solution carencée en azote selon la présente invention est une solution comprenant moins de 15% d'azote, de préférence moins de 10% d'azote, avantageusement moins de 8%, plus avantageusement moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% d'azote et encore plus avantageusement 0% d'azote.

L'étape b) de stimulation permet d'augmenter de manière significative les rendements de biomasse racinaire.

Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention l'étape de stimulation de Polygonum multiforum est réalisée dans des milieux nutritifs de composition N/P/K différente. Le milieu 0/15/40 offre une productivité racinaire convenable. Le milieu 15/10/30 permet une croissance des racines limitée avec des racines très courtes et peu ramifiées. Des milieux riches en azote, par exemple les milieux 20/20/20 et 28/14/14 n'ont pas permis la production de racines. Avantageusement, l'étape b) de stimulation des racines est réalisée par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution d'éliciteurs choisie parmi les dérivés d'acide jasmonique comme par exemple le méthyl jasmonate, l'acide salicylique, l'éthéphon et les chitosans ou par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'étape b) est mise en œuvre par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution choisie parmi :

• une solution de méthyl jasmonate à une concentration comprise entre 0,01 et 200 μΜ, avantageusement entre 0,1 et 100 μΜ, • une solution d'acide salicylique à une concentration comprise entre 1 et 500 μΜ, avantageusement entre 10 et 50 μΜ,

• une solution de chitosans à une concentration de 0,002 à 1 g/L, avantageusement de 0,05 à 0,1 g/L, et

· une solution nutritive N/P/K comprenant moins de 6% d'azote, ladite solution étant de préférence vaporisée sur les racines.

En outre, l'étape b) de stimulation des racines avec une solution d'éliciteurs est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 1 jour et 21 jours, de préférence entre 1 et 7 jours.

Selon un aspect particulier, l'étape b) de stimulation des racines par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 7 jours et 8 semaines, de préférence 3 semaines.

Lors de l'étape b), les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont comprises dans une gamme d'électroconductivité s'étendant avantageusement entre 0,8 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 1,0 à 1,2 mS, afin de favoriser une plus grande teneur en THSG des extraits.

Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) est réalisée après l'étape a). Selon un autre aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) et l'étape a) sont effectuées de manière simultanée, la solution de stimulation est alors incorporée à la solution nutritive ou administrée par tout autre mode d'administration connu de l'homme du métier.

Selon un perfectionnement, l'étape de « trempage » est précédée d'une étape de lavage dans laquelle le liquide diffusé vers les plantes est de l'eau claire. On limite ainsi l'apport des éléments contenus dans la solution nutritive ou dans l'éventuelle solution de stimulation lors de l'étape de trempage.

Avantageusement, l'invention a pour objet un procédé comprenant les étapes suivantes : a) une étape de culture de polygonum multiflorum en conditions hors- sol, et particulièrement en aéroponie,

b) une étape de stimulation des racines des plantes,

c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), comprenant :

- une première phase de mise en présence des racines encore liées à la plante avec un solvant, en particulier pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes,

- suivie d'une seconde phase comprenant la section desdites racines et la macération des racines sectionnées dans un solvant,

ledit solvant, identique ou différent dans la première et la deuxième phase, est choisi parmi les alcools, la glycérine, les glycols et les solvants eutectiques, et étant utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, de glycérine, de glycol ou de solvant eutectique, et

d) la récupération des extraits obtenus lors de l'étape c).

Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention le pH du solvant est compris entre 1,5 et 5, de préférence entre 2 et 5, de préférence entre 2 et 4,5, de préférence entre 3 et 4,5, plus préférentiellement entre 3,5 et 4,5.

Un procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape supplémentaire de réajustement de la teneur en solvant de l'extrait, pour obtenir une teneur avantageuse d'au moins 50%, et/ou un ajustement du pH de l'extrait, pour obtenir un pH avantageusement compris entre 3 et 5, de préférence d'approximativement 4, en vue de la conservation de l'extrait.

Un procédé selon l'invention comprend avantageusement au moins une étape supplémentaire de purification et/ou de traitement de l'extrait végétal, une telle étape est notamment choisie parmi :

au moins une filtration, en particulier une nanofiltration et/ou une filtration stérilisante et/ou une filtration clarifiante,

une extraction liquide/solide,

- une purification, une concentration et

une décoloration de l'extrait racinaire,

de telles méthodes de purification et/ou de traitement sont bien connues de l'homme du métier. Cette étape permet d'obtenir l'extrait racinaire final de Polygonum multiflorum concentré en THSG et contenant pas ou très peu d'émodine.

Un chromatogramme (Figures 2 et 3) de l'analyse d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'invention, montre que le THSG est majoritairement présent et que la teneur en émodine est inférieure à la limite de quantification.

La présente invention a également pour objet un extrait susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention. La présente invention a pour troisième objet une composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition cosmétique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement cosmétique adapté à un sujet comme par exemple le type de peau.

La composition cosmétique selon l'invention est avantageusement destinée à une application topique. Elle peut notamment se présenter sous la forme d'une crème, d'un lait, d'une lotion, d'un gel, d'un sérum, d'un spray, d'une mousse, d'une solution, d'une pommade, d'une émulsion, d'un patch ou d'un masque. Une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un excipient cosmétiquement acceptable choisi en fonction du type d'administration souhaitée. Une composition cosmétique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc.

Un excipient cosmétiquement acceptable peut être choisi parmi les polymères, les composés siliconés, les agents tensioactifs, les agents de rhéologie, les agents humectants, les agents de pénétration, les composants huileux, les cires, les émulsifiants, les agents filmogènes, les parfums, les électrolytes, les ajusteurs de pH, les agents antioxydants, les conservateurs, les colorants, les nacres, les pigments et leurs mélanges.

Une composition cosmétique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un autre agent cosmétiquement actif, tels qu'un autre agent anti-âge, un agent hydratant, un agent ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante, un agent stimulant la microcirculation cutanée, un agent sébo- régulateur pour le soin des peaux grasses, un agent nettoyant ou purifiant, un agent anti-radicalaire, un agent anti-inflammatoire, un filtre solaire chimique ou minéral, etc.

Avantageusement, une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention, en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, plus particulièrement entre 0,5 et 1%, en poids par rapport au poids total de la composition. La présente invention a pour quatrième objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition cosmétique selon l'invention, pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, et/ou pour stimuler le renouvellement de l'épiderme et/ou stimuler la défense antimicrobienne de la peau, plus particulièrement la défense antibactérienne de la peau et/ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation.

Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à prévenir ou ralentir le vieillissement cutané. Une composition cosmétique selon l'invention peut aussi être destinée à stimuler le renouvellement de 1'épiderme. Egalement, une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation qui peut se développer après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes

La présente invention a pour cinquième objet une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention a aussi pour sixième objet une composition nutraceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient nutraceutiquement acceptable.

Dans la présente invention, on désigne par « pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable » tout ingrédient qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique ou nutraceutique, qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire ou chez l'Homme.

On désigne par « sels pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables » d'un composé, des sels qui sont pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables, comme défini ci-dessus, et qui possèdent l'activité pharmacologique souhaitée du composé parent. De tels sels comprennent :

(1) les hydrates et les solvates,

(2) les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés avec des acides inorganiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2- hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2- naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p- toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires, ou

(3) les sels d'addition de base pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique ou inorganique pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable. Les bases organiques acceptables comprennent la diéthanolamine, l'éthanolamine, N-méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires. Les bases inorganiques acceptables comprennent l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium et l'hydroxyde de sodium.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmaceutique adapté à un sujet comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau. En fonction du type d'administration souhaitée, la composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant pharmaceutiquement connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc. Avantageusement, ladite composition pharmaceutique comprend au moins un extrait selon l'invention en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, plus particulièrement entre 0,5 et 1%, en poids par rapport au poids total de la composition.

Une composition pharmaceutique est particulièrement adaptée pour une administration par voie orale, nasale, transdermique, parentérale, topique, rectale et mucosale. Elle peut se présenter sous forme sèche, telle que par exemple : capsule molle, gélule, comprimé, lyophilisât, poudre, granule, ou patch, ou sous forme liquide, telle que : solution, suspension, spray, crème ou gel.

L'excipient pharmaceutiquement acceptable est connu de l'Homme du Métier et est choisi selon le mode d'administration de la composition pharmaceutique. A titre d'exemple, l'excipient pharmaceutiquement acceptable peut être choisi dans le groupe constitué par les agents diluants, liants, désintégrants, les colorants, les lubrifiants, les agents solubilisants, les agents promoteurs d'absorption, les filmogènes, les agents gélifiants, et leurs mélanges.

La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un composé choisi dans le groupe constitué par les émollients, les actifs hydratants, les activateurs de la synthèse de kératine, les kératorégulateurs, les kératolytiques, les agents restructurant de la barrière cutanée (activateurs de la synthèse des lipides cutanés, agonistes PPARs ou Peroxysome Proliferator Activated Receptor), les activateurs de la différenciation des kératinocytes (rétinoïdes, calcidone®, le calcium), les antibiotiques, les agents anti-bactériens, les composés antifongiques, les agents anti-viraux, les sébo-régulateurs, les immunomodulateurs, tels que le tacrolimus, le pimécrolimus, les oxazolines, les conservateurs, les agents anti-irritants, les agents apaisants, des filtres et écrans solaires, les agents anti-oxydants, les facteurs de croissance, les agents cicatrisants ou les molécules eutrophiques, les médicaments et les agents anti-inflammatoires, les médicaments et les agents anti-Alzheimer. La présente invention a pour sixième objet un extrait selon l'invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament.

Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention ou une composition nutraceutique selon l'invention ₇ pour son utilisation en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne de la peau, et/ou pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.

Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, et/ou pour stimuler le renouvellement de l'épiderme, et/ou pour avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation. Dans ce cas, ledit extrait sera avantageusement associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée, et ladite composition pharmaceutique contiendra avantageusement un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée. La présente invention a également pour objet une utilisation d'un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention pour la préparation d'une composition cosmétique visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou à stimuler le renouvellement de l'épiderme et/ou avoir un effet apaisant ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation. Selon cet objet, la présente invention concerne donc l'application, à titre de produit cosmétique, d'un extrait selon l'invention, ou d'un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, pour prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme et/ou avoir un effet apaisant ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation. La présente invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique de la peau visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou à stimuler le renouvellement de l'épiderme, et/ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend l'application, sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'une composition cosmétique selon l'invention. Avantageusement, dans la méthode selon l'invention, la composition cosmétique est appliquée chez un sujet en ayant besoin, notamment en prévision de ou consécutivement à une exposition unique ou répétée de la peau à un stress oxydant. En effet, ce dernier peut générer un excès de radicaux libres pouvant accélérer les signes de vieillissement cutané.

En outre, l'invention concerne une méthode pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, pour atténuer l'inflammation de la peau, pour avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, pour stimuler la défense antimicrobienne de la peau, plus particulièrement la défense antibactérienne de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie, chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition nutraceutique selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention.

Les exemples 1 à 3 qui suivent et les Figures 1 à 4 visent à illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLES

EXEMPLE 1 : PREPARATION ET CARACTERISATION D'EXTRAITS RACINAIRES DE POLYGONUM MULTIFLORUM SELON L'INVENTION. Les extraits racinaires de Polygonum multiflorum sont préparés à partir de plantes dont les graines ont été achetées auprès d'un fournisseur chinois (Zhong Wei Organic Seeds) en 2012 et en 2013. Depuis 2013, les plantes de Polygonum multiflorum sont conservées et multipliées en serre par la demanderesse.

1.1 Effet de plusieurs milieux de culture comme milieux de

stimulation sur la croissance racinaire

L'étude a été réalisée dans 12 unités expérimentales de 32 plantes chacune reproduisant le système de culture en aéroponie. Les plantes sont initialement cultivées pendant 8 semaines avec un milieu de culture 15/10/30 (N/P/K) sur des pilotes de 16m ² .

Pour cette expérience, 4 milieux de stimulation ont été testés, dont le milieu de culture initial. Il s'agit d'engrais ternaires habituellement utilisés en horticulture et dont la composition diffère selon leur rapport N/P/K (azote/phosphore/potassium). Les 4 modalités sont les suivantes : 0/15/40; 15/10/30; 20/20/20 et 28/14/14. Chaque modalité est répétée 3 fois selon une distribution aléatoire. Les plantes ont été cultivées avec les différents milieux pendant 4 semaines.

On observe que les parties aériennes croissent convenablement quel que soit le milieu utilisé. Parmi les 4 modalités testées, le milieu 0/15/40 offre une productivité racinaire convenable. Le milieu 15/10/30 permet une croissance des racines limitée avec des racines très courtes et peu ramifiées. Les autres milieux riches en azote, c'est-à-dire, les milieux 20/20/20 et 28/14/14 n'ont pas permis la production de racines.

1.2 Etude de plusieurs solvants pour la réalisation d'extrait racinaires de Polygonum multiflorum

Des plants de Polygonum multiflorum sont cultivés en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 8 semaines, puis avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 0/15/40 et à une électroconductivité comprise 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 3 semaines.

Les racines sont coupées puis 500 g de racines fraîches sont mises à macérer pendant 48 heures à température ambiante dans 1 L de différentes solution aqueuse de solvant à 70/30 (solvantl/eau - v/v) à un pH acide de 1,6 et à un pH non ajusté, c'est-à-dire compris entre 5 et 7,5. Après macération, les racines sont retirées du solvant.

Les quatre solvants testés sont la glycérine, le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol biosourcé (Zéméa ®) et le propane 1,2 diol.

La teneur en émodine, dans les extraits racinaires, est analysée par HPLC- MS (détecteur PDA, 254 nm). La quantification de l'émodine se fait grâce à un standard commercial d'émodine à 1 mg/L (Fournisseur=Shagai tauto Biotech ; ref= E0053) analysé en HPLC-MS (détecteur PDA, 254 nm). Comme, il a été impossible de quantifier ce composé dans les extraits, l'émodine étant sous le seuil de quantification de cette méthode, le rapport signal sur bruit (S/N) est mesuré afin d'évaluer grossièrement sa teneur dans les extraits. Lorsque le rapport est supérieur à 3, la quantité d'émodine est à la limite de détection. Lorsque le rapport est supérieur à 10, la quantité d'émodine est à la limite de la quantification. Le Tableau 1 résume les informations obtenues.

Solvant S/N (signal/bruit)

Dipropylène glycol 70% pH 1,6 1

Dipropylène glycol 70% pH 5-7,5 5

Zéméa ® 70% pH 1,6 1

Zéméa ® 70% pH 5-7,5 1

Propane 1,2 diol 70% pH 1,6 2

Propane 1,2 diol 70% pH 5-7,5 2

Glycérine 70% pH 1,6 0

Glycérine 70% pH 5-7,5 0 Tableau 1 : Rapport signal sur bruit dans les différents extraits obtenus avec 4 solvants différents à deux pH.

La teneur en émodine dans les extraits réalisés avec les 4 solvants, soit le Dipropylène glycol, le propane 1,2 diol, le Zéméa® et la glycérine aux deux pH testés est inférieure à la limite de détection d'émodine. Ces solvants permettent ainsi une extraction sélective du THSG sans ou avec très peu d'émodine.

1.3 Etude de stabilité d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum à différents pH acide

Le test de stabilité réalisé consiste à placer un échantillon d'extrait racinaire de Polygonum multiflorum à l'obscurité à 40 °C pendant 6 mois. Des prélèvements réguliers sont effectués afin de suivre l'évolution de la teneur en THSG des extraits par chromatographie liquide (HPLC-XR-Prominence, Shimadzu). Un standard de 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-0-beta-D- glucoside (THSG) à ΙΟΟμΜ est injecté au sein de chaque séquence d'analyse afin de normaliser les données.

Des plants de Polygonum multiflorum sont cultivés en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 8 semaines, puis avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 0/15/40 et à une électroconductivité comprise 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 3 semaines. Les racines sont coupées, puis un extrait racinaire est obtenu par macération pendant 48 heures de 500 g de racines fraîches dans 1 L de du Propylène glycol à 70% dont le pH (avant la macération) a été ajusté à la valeur de 2,8 en utilisant de l'acide citrique à 3 M .

Le pH de l'extrait racinaire après extraction a ensuite été réajusté avec de l'acide citrique à 3M ou de la soude à 5 M à trois pH différents : pH 2,8 ; pH 4,0 et pH 6 ,8.

Les profils phytochimiques des échantillons d'extraits ont été suivis par HPLC au cours du temps pendant six mois. Un prélèvement a été réalisé chaque mois. La Figure 1 montre l'évolution de la teneur en THSG selon les 3 pH à 2, 4 et 6 mois.

On observe une nette décroissance de la concentration en THSG de l'extrait conservé au pH initialement neutre (pH 6,8). A partir du quatrième mois il ne subsiste que des traces de ce dernier au sein de l'extrait. Ce pH ne pourra donc pas être utilisé pour la conservation de l'extrait.

Au sein de l'échantillon conservé au pH initialement de 2,8, on observe que la teneur en THSG diminue progressivement. A partir du quatrième mois on observe un changement significatif de la concentration de l'échantillon, avec une perte de 32% de la quantité de THSG. Ce pH ne semble pas idéal non plus pour la conservation de l'extrait.

L'échantillon réajusté au pH 4,0 avant sa conservation semble plus stable. La teneur THSG diminue de 8% au bout de 6 mois. Ce pH semble être le meilleur candidat pour la conservation de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum.

1.4 Extrait préparé à partir d'un solvant glycolé

Un extrait racinaire de Polygonum multiflorum concentré en THSG et comprenant une quantité d'émodine inférieure à la limite de quantification par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS), est obtenu selon le procédé suivant :

• Culture de Polygonum multiflorum en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 1,0 et 1,2 mS/cm,

• Stimulation de la plante pendant une durée de 2 à 4 semaines par un stress azoté par l'utilisation d'une solution nutritive N/P/K comprenant : moins de 6% d'azote, 15% de phosphore et 40% de potassium, et d'une électroconductivité de 1,0 à 1,2 mS/cm,

• Extraction des molécules d'intérêt par immersion des racines encore accrochées à la plante pendant une durée de 15 à 30 minutes dans un mélange propane 1,2 diol/eau, selon un ratio compris entre 85/15 et 70/30, à température ambiante et à un pH compris entre 3,5 et 4,5.

• Extraction des molécules d'intérêt par macération des racines coupées de la plante, pendant une durée de 48 à 96 heures dans un mélange propane 1,2 diol/eau selon un ratio compris entre 85/15 et 70/30, à température ambiante et à un pH compris entre 3,5 et 4,5, • Mélange des extraits obtenus aux deux étapes d'extraction précédentes,

• L'extrait est concentré par nanofiltration et clarifié par filtration clarifiante, et

· Réajustement de la teneur en propane 1,2 diol de l'extrait (au moins 50%) ainsi que du pH (approximativement 4) de l'extrait en vue de sa conservation.

L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes :

· Teneur en extrait sec : 10,8 g/L

• Teneur en THSG : 270 mg/L (soit 2,5% de l'extrait sec)

• Teneur en émodine : inférieure à la limite de quantification

• Solvant : 60%

pH : 4,3

La quantification du THSG (2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-0^-D-glucoside) se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir de standards commerciaux fourni par Sigma-AIdrich, référence : SML0834 (Saint-Quentin Fallavier, France) solubilisé dans le solvant DMSO/eau miliQ pH 3.0 (70/30 vol, pH ajusté par HCI 2N).

La quantification de l'émodine (6-methyl-l,3,8-trihydroxyanthraquinone) se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir de standards commerciaux fourni par Shangai Tuto Biotech Co LTD, référence : E-0053 (CHINA) solubilisé dans le solvant DMSO/eau miliQ pH 3.0 (70/30 vol, pH ajusté par HCI 2N).

En Figure 2 et en Figure 3 sont présentés des chromatogrammes de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'exemple 1. L'appareil utilisé pour analyser l'extrait est une HPLC Shimadzu Nexera X2 (les pompes LC-30AD, passeur d'échantillon SIL-30AC, four CTO-20A, détecteurs à barrette de diodes SPD-M20A ; Kyoto, Japon) fonctionnant en phase inverse avec une colonne Kinetex biphenyl (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) de dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm. La phase mobile est constituée d'un solvant A (Eau ultrapure Mili-Q, Merck Millipore +0.1% d'acide formique, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) et d'un solvant B (Acetonitrile, Sigma-AIdrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) dont le gradient a été programmé de la façon suivante : % B : 5-31,4% (0-6 min), 31,4-90% (6-6,1 min), 90% (6,1-7,9 min), 90-5% (7,9-8,0 min), 5% (8-10 min). Le débit d'analyse est de 0,5 mL/min avec une température de four de 40°C. En sortie de colonne, un détecteur à barrettes de diodes enregistre les spectres UV entre 220 et 370 nm. L'appareil est couplé à un spectromètre de masse (Shimadzu LCMS-2020) fonctionnant avec une ionisation par électrospray (4,5 kV) en mode positif et négatif dans une gamme de m/z entre 100 et 1000. Le logiciel LabSolutions (version 5.60 SP2) est utilisé pour exploiter le système. L'extrait à analyser est filtré sur un filtre 0,2pm avant injection.

En Figure 2, le chromatogramme présente un pic majoritaire pour un temps de rétention aux environs de 4,40 min correspond au THSH. En Figure 3, aucun pic n'est détecté pour un temps de rétention aux environs de 8,9 (±5%) min correspondant au standard d'émodine, confirmant que la quantité d'émodine dans l'extrait est inférieure à la limite de quantification.

EXEMPLE 2 : CARACTERISATION D'UN EXTRAIT RACINAIRE DE POLYGONUM MULTIFLORUM VIS-A-VIS D'UN BENEFICE POUR LA PEAU - IDENTIFICATION DE CIBLES PAR ANALYSE DES MODIFICATIONS D'EXPRESSION DE GENES PAR QRT-PCR SUR CARTES TAQMAN

L'étude consiste à mesurer les effets de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par qRT-PCR sur cartes TaqMan microfluidiques, d'une part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans la biologie du derme, le remodelage des tissus conjonctifs et le vieillissement (carte « Dermal Benefits » définie par la société StratiCELL) et, d'autre part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans les fonctions clés de l'épiderme, telles que la fonction barrière en lien direct avec l'hydratation, la réponse antioxydante, ou encore la pigmentation par les mélanocytes (carte « Epidermal Benefits » définie par la société StratiCELL).

Le protocole a consisté à ajouter de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum dans le milieu de culture de fibroblastes humains NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) en monocouche et d'épidermes humains mélanisés reconstitués (RHE/MEL/001), et, après 24 h, à analyser les différentes populations d'ARN pour identifier les gènes différentiellement exprimés par qRT-PCR.

Une étude préalable de cytotoxicité a permis de définir la concentration de travail de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pour l'étude d'expression génique.

Le TGF-βΙ (Transforming Growth Factor-beta-1) et la vitamine D3 (la, 25- dihydroxyvitamin D3), dont les effets sont documentés dans la littérature, ont été utilisés comme molécules de référence afin de valider les systèmes d'essai et la méthode d'analyse.

2.1. Matériels et méthodes Extrait

Les plantes Polygonum multiflorum sont cultivées en aéroponie selon l'exemple 1. Les racines fraîches sont coupées puis macérées à température ambiante pendant 48 heures dans une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v) à un ratio de 500 g de racines pour un litre de solvant et à un pH non ajusté. Ensuite l'extrait est filtré. Le solvant est éliminé en utilisant un évaporateur rotatif et la poudre séchée au dessiccateur. Une analyse par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrographie de masse (HPLC/MS), réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 1.4 a permis de vérifier que la teneur en émodine est inférieure à la limite de quantification et que le THSG est présent majoritairement dans l'extrait. Culture Cellulaire

La première partie de l'étude a été réalisée sur des fibroblastes de derme humains NHDFs (ATCC, CRL-2522, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu DMEM (Invitrogen, 31885-049) contenant des antibiotiques (Pénicilline/Streptomycine, Invitrogen, 15140-122) mais ne contenant pas de sérum. Ces cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.

La seconde partie de l'étude a été réalisée sur des épidermes reconstitués (StratiCELL®, RHE/MEL/001) contenant ou non des mélanocytes humains primaires NHEMs (Normal Human Epidermal Mélanocytes) provenant d'un donneur de phototype foncé (phototype IV à V) (Invitrogen, C2025C, lot n°439684). Les tissus ont été cultivés à l'interface air-liquide durant 14 jours dans un milieu de culture approprié, et une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02. Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité

Afin de déterminer la concentration d'analyse optimale pour l'extrait racianire de Polygonum multiflorum, une expérience préliminaire a été réalisée sur fibroblastes NHDFs, sur mélanocytes humains NHEMs et sur épidermes reconstitués.

Les fibroblastes NHDFs ont effectué 30,1 et 30,7 doublements de population et les mélanocytes NHEMs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 h avant l'application des actifs.

Les épidermes reconstitués (RHE/001 ; lot CB0314/2) ont été transférés dans une plaque 12 puits avant d'être traités avec l'extrait.

L'extrait a été dilué dans le milieu de culture, puis ajouté, sans filtration préalable, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs ne contenant pas de sérum, dans le milieu des mélanocytes humains primaires NHEMs, ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés.

Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules et des épidermes au MTS (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-( 4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout d'extrait racinaire de Polygonum multiflorum et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3) pour les fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs, et à 2 concentrations et 3 répétitions (n = 3) pour les épidermes reconstitués. Les 2 concentrations testées pour les épidermes reconstitués ont été choisies sur la base des résultats de cytotoxicité obtenus pour les mélanocytes NHEMs. Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.

Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à la mesure des modifications d'expression des gènes cibles.

Les concentrations suivantes, en pg d'extrait sec/ml, ont été testées : Fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs: 0,16 Mg/ml, 0,8 Mg/ml, 4 Mg/ml, 20 Mg/ml, 100Mg/ml ;

Epidermes reconstitués : 20 pg/ml et 100 Mg/ml . Analyse des modifications d'expression génique

L'extrait a été ajouté, à une concentration choisie, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs (ayant effectué 30,5 et 30,8 doublements de population) en absence de sérum ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés mélanisés (RHE/MEL/001, lots CB0314/3 et CB0314/4), sans filtration préalable à la mise en contact des cellules/épidermes.

Des molécules de référence ont été étudiées en parallèle, à savoir, le TGF-βΙ pour les fibroblastes NHDFs et la vitamine D3 (VD3) pour les épidermes reconstitués.

Extraction de l'ARN total

L'extraction des ARNs totaux a été réalisée à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen, 74106). 24 h après l'ajout de l'extrait, les cellules ont été rincées au PBS et lysées dans le tampon de lyse ad hoc, alors que les épidermes ont été directement plongés dans ce tampon (des triples de culture ont été réalisés pour chaque condition). L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à -80°C. Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire

La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).

Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNase-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham).

Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics d'électrophorèse correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S-ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN. L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S-ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARN de poids moléculaire plus élevé.

Synthèse des ADNs complémentaires ou ADNc

Les transcriptions inverses (RT) ont été réalisées à l'aide du kit « High Capacity RNA-to-cDNA Kit » (Applied Biosystems, 4387406). Pour la synthèse des ADNc, un mix a été préparé selon les instructions du fournisseur, avec 2 pg d'ARN total, le tampon ad hoc fourni dans le kit et l'enzyme transcriptase inverse. Cette réaction a été réalisée à 37°C pendant 1 heure, puis 5 minutes à 95°C et finalement les échantillons d'ADNc ont mis sur glace et stockés à - 20°C. Validation des systèmes d'essai - qPCR en temps réel à l'aide de sondes fluorescentes de type TaqMan

La méthode de qPCR en temps réel a été utilisée pour quantifier l'expression de différentes cibles spécifiques dans les populations d'ARNs issues des fibroblastes NHDF traités par le TGF-βΙ (20ng/ml) ainsi que des épidermes mélanisés traités par la vitamine D3 (ΙΟΟηΜ) et par le solvant éthanol (EtOH 0,1%), utilisé pour solubiliser la VD3.

Les séquences cibles des gènes d'intérêt ont été amplifiées par PCR en utilisant les « TaqMan Gene Expression Assays » (Applied Biosystems). Ces kits comprennent une sonde TaqMan et 2 amorces spécifiques, qui ont été pré-mélangées à une concentration de 18 μΜ pour chaque amorce et de 5 μΜ pour la sonde. Ce mélange est concentré 20 fois. Les sondes TaqMan ont été greffées avec un fluorophore (FAM) à l'extrémité 5' de la séquence et avec un «quencher» de fluorescence en 3'.

Les PCRs ont été réalisées à l'aide du système 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Les réactions ont été réalisées dans un volume de 20 μΙ_. Le mélange réactionnel contient 10 μΙ_ de TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 μΙ_ de TaqMan Gene Expression Assay et 5 pL d'eau RNase-free.

Dans chaque puits d'une microplaque 96 puits, 16 μΙ_ du mélange et 4 μΙ_ d'ADNc (4 ng) ont été ajoutés. A des fins de normalisation, des mélanges réactionnels avec des sondes et amorces correspondant à la glycéraldehyde- 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) pour les fibroblastes et à la β2- microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés ont également été préparés avec les mêmes échantillons d'ADNc. Un contrôle sans ADNc a servi de contrôle négatif d'amplification. Les cycles thermiques ont été programmés avec une étape d'incubation à 50°C pendant 2 min, suivie d'une première étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min. Le protocole d'amplification PCR s'est poursuivi avec 40 cycles de 15 sec à 95°C suivi d'une min à 60°C.

Les niveaux d'expression ont été quantifiés selon la méthode de calcul de l'expression relative par rapport à un gène de ménage (2 ^"Δα ), dérivée du calcul des ΔΔΟ: (Pfaffl, A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR, Nucleic Acids Res, 29 (9), 2001, 2002-2007; Livak and Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the ^&a method, Methods, 25 (4), 2001, 402-408) décrite ci-après :

La quantification relative des transcrits a été réalisée par l'utilisation d'une méthode de calcul qui consiste à comparer la moyenne des valeurs de contrôle (Ct) obtenues pour les conditions TGF-βΙ (20ng/ml) et VD3 (ΙΟΟηΜ) avec les conditions témoins respectives (CTL non traité et CTL Ethanol 0,1%). Ces Ct représentent le seuil de détection à partir duquel la quantité d'ADN est telle que le signal se distingue significativement du bruit de fond . Cette valeur moyenne de Ct a été normalisée par rapport à un gène de ménage, à savoir la Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase {GAPDH) pour les fibroblastes NHDF et la β2-microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés reconstitués. Ainsi, la différence de niveau d'expression (RQ) a été obtenue par utilisation de la formule :

2 ^_ (ACt condition traitée - ACt condition de référence)

où ACt = Ct (gène cible) - Ct (gène de ménage) au sein d'un même échantillon d'ADNc. Préparation des cartes microfluidiques Taqman, réalisation de la PCR quantitative et analyse des Ct

Les mélanges réactionnels pour PCR sur cartes microfluidiques TaqMan, produites à façon par Applied Biosystems, ont été préparés en suivant les instructions détaillées du guide Applied Biosystems Micro Fluidic Card Getting Started Guide. En résumé, 100 ng d'ADNc ont été ajoutés à un mélange spécifique pour PCR (Taqman Universal PCR Master Mix, 4364338, Applied Biosystems) avant d'être injectés dans la carte et dispersés par capillarité. Après avoir centrifugé la carte, celle-ci a été scellée avant la réalisation de la PCR quantitative et l'analyse avec le système 7900HT d'Applied Biosystems, à l'aide du software ABI PRISM® 7900 Séquence Détection System, SDS2.4. Les cycles seuil (Ct) ont été obtenus pour tous les gènes représentés sur les cartes et exprimés par les fibroblastes NHDF et par épidermes reconstruits mélanisés.

Les résultats ont été exportés à partir du dispositif de qPCR en temps réel en utilisant le logiciel SDS RQ Manager (vl.2.1, Applied Biosystems) et l'analyse des modifications d'expression a été réalisée à l'aide du logiciel Data Assist (V3.0., Applied Biosystems) conçu pour réaliser la quantification relative de l'expression génique en utilisant la méthode de comparaison des Ct (ΔΔΟ:) (Pfaffl, 2001 et Livak and Shmittgen, 2001) décrite dans le paragraphe ci- dessus et une combinaison d'analyses statistiques. Comme précisé plus haut, la méthode de calcul des ΔΔΟ: consiste en la comparaison des valeurs de Ct obtenues pour les conditions traitées par l'extrait avec la condition de référence (contrôle DMSO). Ces valeurs de Ct ont elles-mêmes été normalisées par rapport au gène de ménage GAPDH (glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase) pour les fibroblastes NHDF et B2M (β-2 microglobulin) pour les épidermes reconstruits mélanisés. La valeur de Ct maximale admissible utilisée comme seuil de détection a été fixée à 36 cycles.

2.2. Résultats

2.2.1. Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait par une étude de cytotoxicité L'étude préalable de cytotoxicité sur les fibroblastes NHDF, sur les mélanocytes humains NHEM et sur les épidermes reconstitués a permis de définir une concentration de travail (préparé dans du DMSO) pour l'étude d'expression génique. Le solvant présent dans l'extrait a été testé en parallèle. Le SDS à 0,08% (pour NHDF) et à 0,05% (pour NHEM) a été utilisé comme contrôle positif de cytotoxicité afin de valider l'expérience. Sur la base de ces résultats (données non montrées), les concentrations suivantes ont été choisies pour la suite de l'étude : 100 pg d'extrait sec /ml (pour les fibroblastes NHDF) et 100 pg d'extrait sec/ml (pour les épidermes mélanisés reconstitués).

2.2.2. Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire

Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARNs ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées). La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrée, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions de synthèse des ADNs complémentaires.

2.2.3. Effets de l'extrait sur 94 gènes cibles au sein des fibroblastes NHDF

L'extrait a été ajouté dans le milieu de culture des fibroblastes NHDF (n = 3). Des contrôles traités seulement par le solvant DMSO à 1% (véhicule de l'extrait) ont également été analysés. En parallèle, le TGF-βΙ (20 ng/ml) a été étudié en tant que contrôle de validation. Après 24 heures de culture des fibroblastes NHDF, les populations d'ARNs totaux ont été extraites, leur intégrité a été analysée par électrophorèse capillaire, et les différences d'expression géniques ont été analysées par qRT-PCR à l'aide de cartes TaqMan 96-puits, ciblant les fonctions clés du derme.

Les résultats sont présentés de manière récapitulative sous la forme d'un tableau (Tableau 2) indiquant des gènes représentatifs d'un effet cosmétique bénéfique, variant significativement, 24 heures après l'application de l'extrait sur des fibroblastes de derme humains NHDF. Symbole Nom du gène RQ p-value

SOD2 Superoxyde dismutase 2, mitochondriale 13,80 0,0011

CCL5 Chémokine (C-C motif) ligand 5 3,75 0,0059

NGF Beta-nerve growth factor 1,89 0,0008

HMOXl Hème oxygénase (decycling) 1 1,79 0,0114

NQOl NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 1,61 0,0034

COL3A1 Sous-unité alpha-1 du collagène de type III 1,52 0,0433

TXNRD1 - Thiorédoxine réductase 1 1,51 0,0225

CYR61 Protéine CYR61 1,50 0,0277

G6PD Glucose-6-phosphate déshydrogénase 1,24 0,0181

BDNF/NT-3 récepteur de facteurs de

NTRK2 croissance 0,57 0,0038

Tumor necrosis factor receptor superfamily

NGFR member 16 (p75NTR) 0,08 0,0115

Tableau 2 : Liste des gènes qui varient de manière significative 24 heures après l'application de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum (à 100 pg ES/ml) sur des fibroblastes de derme humains NHDFs. Le symbole des gènes, le nom des gènes, l'expression relative (RQ) par rapport au véhicule DMSO à 1% (RQ > 1 : augmentation) et la valeur p (p-value) sont présentés.

• Défense anti-oxydante (5 gènes surexprimés)

L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit remarquablement l'expression du gène de la superoxyde dismutase 2 (SOD2) (X 13,8). Cette régulation est couplée à la surexpression d'autres gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant, tels que HMOXl (hème oxygénase 1 (XI, 8)), TXRND1 (thiorédoxine réductase 1 (XI, 5)), NQOl (NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (XI, 6)) et G6PD (Glucose-6-phosphate déshydrogénase (X 1,2)). La superoxyde dismutase 2 codée par le gène SOD2 est une protéine mitochondriale impliquée en première ligne dans la défense contre les espèces réactives de l'oxygène (ROS). En effet, elle convertit l'anion superoxyde en hydroperoxyde qui, lui-même, est convertit en oxygène et en eau par la catalase et les peroxyrédoxines.

Le gène HMOX1 codant pour la protéine HO-1 ou hème oxygénase est souvent surexprimé en réponse à un stress, et joue un rôle crucial dans la protection et le maintien de l'homéostasie cellulaire. La protéine HO-1 est impliquée dans la dégradation de Thème (ayant des propriétés prooxydantes) en monoxyde de carbone, fer ferreux et biliverdine. Ces 2 derniers composants sont les précurseurs des antioxydants bilirubine et ferritine. HMOX1 est donc connu pour son rôle protecteur contre le stress oxydant. Le système thiorédoxine est un des systèmes majeurs de défense antioxydante. Dans ce système, la thiorédoxine réductase catalyse le transfert d'électrons provenant du NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) vers la thiorédoxine, qui elle-même exerce une action réductrice sur diverses protéines cibles. Parmi les 3 isoformes de la thiorédoxine réductase, l'isoforme 1 codée par le gène TXRND1 est la plus étudiée. Elle est connue pour être notamment sous le contrôle transcriptionnel du facteur de transcription Nrf-2 jouant un rôle majeur dans la défense anti-oxydante. La NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (NQOl) est une autre enzyme détoxifiante qui favorise, par réduction, la formation des hydroquinones à partir des quinones, empêchant la production d'espèces radicalaires. Le gène NQOl est surexprimé en réponse à des agents pro-oxydants, à des métaux lourds, aux UV ou encore à des radiations ionisantes afin de protéger la cellule de leurs effets néfastes.

La glucose-6-phosphate déshydrogénase codée par le gène G6PD est la première enzyme de la voie des pentoses phosphates. Elle catalyse l'oxydation du glucose-6-phosphate en 6-phosphoglucono-5-lactone. Cette réaction est couplée à la réduction d'une molécule de NADP+ en NADPH, nécessaire à la réduction du glutathion GSSG (forme oxydée) en glutathion GSH (forme réduite), un puissant antioxydant.

La surexpression de 5 gènes impliqués dans la défense anti-oxydante témoigne de la capacité de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum à réduire les effets de stress pro-oxydants générant un excès de radicaux libres, comme les UV accélérant les signes de l'âge au niveau de la peau, ou encore de lutter contre diverses pathologies ou conditions pro-inflammatoires cutanées, également génératrices d'espèces réactives de l'oxygène. Structure et homéostasie de la matrice extracellulaire (MEC)

L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit l'expression du gène COL3A1 (X 1,5) qui code pour la sous-unité alpha-1 du collagène de type III, et du gène CYR61 (X 1,5) qui code pour une protéine de la MEC CYR 61 pour « cysteine-rich angiogenic protein 61 ». La protéine CYR61 est exprimée au niveau des sites inflammatoires et des plaies cutanées où elle induit la production de nouvelle matrice extracellulaire. Les collagènes fibrillaires sont, de loin, les protéines les plus abondantes dans la peau, constituant plus de 90% de son poids sec. Le collagène de type I représente 60 à 80% des collagènes du derme et de l'hypoderme alors que le collagène de type III (COL3A1) compte pour 15 à 25% et le collagène de type V pour 2 à 5%. Les collagènes de type I, III, et V s'auto-assemblent en fibres plus épaisses pour former un réseau tridimensionnel dans toute l'épaisseur du derme. Ainsi, le collagène III (COL3A1) joue un rôle de structure au niveau de la MEC et donc dans la résistance et l'élasticité du derme. L'induction du gène COL3A1 par l'extrait pourrait se révéler intéressant en vue d'une stratégie anti-âge pour permettre une diminution la dégradation du derme avec l'âge · Neurotrophines et perception de la douleur

Plusieurs gènes sont également réprimés par l'extrait : c'est le cas de NTRK2 (X0,6) et de NGFR (X0,08). Ces derniers codent pour des récepteurs aux neurotrophines, responsables de la sensation de la douleur. La sous- expression de ces gènes pourrait favoriser un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.

Les neurotrophines font partie d'une famille de facteurs de croissance contrôlant le développement, la maintenance et l'apoptose des cellules neuronales. Les neurotrophines exercent également de multiples fonctions non-neuronales : elles régulent la prolifération et la différenciation cellulaire, l'apoptose et le remodelage des tissus notamment au niveau de la peau. Les fibroblastes de derme ainsi que les myofibroblastes synthétisent et sécrètent des neurotrophines telles que le Nerve Growth Factor (NGF), le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ou encore la neurotrophine-3 (NT- 3). Les effets des neurotrophines sont médiés par leurs récepteurs exprimés également par les fibroblastes. On distingue deux classes de récepteurs : les récepteurs de la famille des tyrosine kinase receptors (Trk) et le récepteur aux neurotrophines p75 (p75 NTR ou NGFR). Chaque récepteur a une affinité et spécificité propre vis-à-vis de son ou de ses ligands. TrkB (codé par le gène NTRK2) lie spécifiquement BDNF ainsi que NT-3 et NT-4. P75 NTR est quant à lui capable de lier toutes les neurotrophines.

Les neurotrophines, via leurs récepteurs, stimulent la prolifération et la migration des fibroblastes ainsi que la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes. Elles pourraient donc être impliquées dans la régulation du remodelage des tissus lors du processus de cicatrisation des plaies cutanées. Le NGF est un facteur neurotrophique, initialement décrit comme un facteur de survie des neurones dans le système nerveux central, mais également au niveau des neurones sensoriels ou des nocicepteurs de la peau. NGF joue également un rôle dans l'inflammation. En effet, la neutralisation du NGF inhibe la sensibilisation des neurones sensoriels (nocicepteurs), avec pour effet de réduire la perception de la douleur associée à un état inflammatoire. L'extrait favorise un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.

• Cicatrisation cutanée

L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit l'expression du gène CCL5, codant pour la chémokine (C-C motif) ligand 5, encore appelée RANTES. Il a été montré que cette chémokine joue un rôle important dans le processus de cicatrisation cutanée. Elle est impliquée dans la migration des cellules souches dérivées du derme (dermal stem cells, DSC) vers le site de lésion cutanée. Ce processus est essentiel pour la ré-épithélialisation, la repopulation des fibroblastes au niveau du derme et l'angiogenèse.

2.2.4 Effets de l'extrait sur 94 gènes cibles au sein des épidermes reconstruits mélanisés (RHE/MEL/OOl)

• Cicatrisation cutanée L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit d'une amplitude remarquable (d'un facteur 4,1, p-value = 0,0175) l'expression du gène de la métalloprotéinase-1 MMP-1. Les MMPs sont des métalloprotéinases capables de cliver la plupart des composants de la MEC et de modifier, par protéolyse, bon nombre de molécules importantes pour la cicatrisation cutanée. En particulier, MMPl joue un rôle majeur dans la ré-épithélialisation des kératinocytes. MMPl facilite l'assemblage de la MEC, l'élongation et la migration des cellules, la réorganisation du cytosquelette d'actines, et induit l'activation de la kinase ERK (extracellular signal-regulated kinase) nécessaire à la motilité et la capacité d'invasion des cellules épithéliales. En outre, il a été montré que la protéine MMPl est surexprimée au niveau de l'épiderme en réponse aux plaies cutanées.

La surexpression du gène MMP-1 au niveau de l'épiderme par l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum permet de le positionner comme actif favorisant potentiellement la cicatrisation cutanée, en particulier au niveau de la fermeture de la plaie.

2.3 Conclusion En synthèse, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum se positionne clairement par rapport à une revendication cosmétique dans une optique anti- âge liée à une activité antioxydante et une réduction de la dégradation du derme.

L'extrait, de par son rôle dans le contrôle de la production de radicaux libres, pourrait être utilisé comme actif pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau.

De plus, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pourrait avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation qui peut se développer après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.

Enfin, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum se positionne éventuellement comme un actif favorisant la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie. Exemple 3 : Effet d'extraits racinaires de Polygonum multiflorum dans du propane 1,2 diol, sur des kératinocytes humains - Etude en puces à ADN "GeneChip Human Gene"

Afin d'analyser la possibilité qu'un extrait selon l'invention possède une action anti-âge, une étude transcriptomique sur puce à ADN a été réalisée à partir de kératinocytes humains (NHEKs) traités durant 24 heures par un extrait racinaire de Polygonum multiflorum. Les variations d'expression des gènes ont été contextualisées et interprétées biologiquement au travers de la base de données propriétaire « StratiCELL Skin Knowledge database ».

Une étude de cytotoxicité préalable réalisée a permis de déterminer la concentration optimale de l'extrait utilisé pour l'étude.

3.1. Matériels et méthodes Extrait

Un extrait racinaire de polygonum multiflorum a été préparé selon l'exemple 1.4.

Culture Cellulaire

L'étude a été réalisée sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs (Normal Human Epidermal Kératinocytes ; Lonza, 0019206, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu Epilife contenant de l'HKGS (Human Keratinocyte Growth Supplément) et de la gentamycine.

Les cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.

Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité

Les kératinocytes NHEKs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 heures avant l'application de l'extrait en milieu Epilife (INVITROGEN, M-EPI-500 A) contenant le supplément HKGS (INVITROGEN, S-001-K) et de la gentamycine (INVITROGEN, 15710-049).

L'extrait a été solubilisé dans le milieu de culture approprié, puis placé en contact des kératinocytes NHEKs durant 24 heures. Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules au MTS (3-(4,5- dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfop henyl)-2H- tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout de l'extrait et de son solvant ou véhicule (propane 1,2 diol 60% pH = 3,5) et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3).

Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.

Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à l'analyse transcriptomique.

Les concentrations suivantes, en pourcentage v/v, ont été testées pour l'extrait et le solvant: 3%, 1%, 0,33% 0,11%, 0,037%

Traitement des cellules

L'extrait ou le solvant ont été appliqués à une concentration choisie, pendant 24h, dans le milieu de culture des kératinocytes NHEKs. Des quadruples de culture ont été réalisés pour chaque condition (n=4).

Extraction de l'ARN total

Au terme des traitements, les populations d'ARNs totaux ont été extraites. L'extraction a été réalisée à l'aide du kit RNeasy (Qiagen). Après 24h de traitement, les cellules ont été rincées avec du PBS et lysées dans du tampon ad hoc. L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à - 80°C en vue de l'analyse transcriptomique.

Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire

La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).

Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNAse-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham). Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S- ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN . L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S- ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARNs de poids moléculaire plus élevé.

Phase d'hybridation sur puces GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix)

Les ARNs ont ensuite été dilués à 50 ng/μΙ et 50 μΙ de chaque échantillon (n = 3). La quatrième réplique sert de back-up.

Les échantillons d'ARN (50ng) ont été amplifiés par l'utilisation de la technologie Ribo-SPIA, selon 3 étapes (Ovation Pico WTA System V2, NuGEN, 3302-12) et purifiés avec le kit Agencourt RNA Clean up XP Beads (Agencourt - Beckam Coulter Genomics, A29168). Pour chaque échantillon, 4,5 pg ont été fragmentés et marqués à la biotine, grâce au NuGEN Encore Biotin Module (NuGEN, 4200-12). L'hybridation a été effectuée sur des puces à ADN du modèle GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix, 902112). Les étapes d'hybridation sur puce, lavage et fixation, ont été réalisées suivant le protocole défini par Affymetrix. La solution d'hybridation a été préparée par utilisation des kits Affymetrix Genechip Expression 3' Amplification Reagent Hybridization Controls (Affymetrix, 900454) et Hybridization Module for GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix, 900720), et mélangée avec l'ADN complémentaire (ADNc) amplifié dans les étapes précédentes. L'hybridation a été réalisée durant 18h dans le four GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix, 800139). Le lavage et la révélation ont été réalisés à l'aide de la station fluidique GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix, 00-0079) et les mesures d'intensité ont été scannées avec le GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Prétraitement des données d'hybridation Le traitement des données brutes a été réalisé avec les logiciels R (v3.2.3 ; Ihaka R and Gentleman T. Journal Of Computational And Graphical Statistics 1996, 5 (3), 299-314) et le package Oligo' (vl .34.2 ; Benilton S Carvalho And Rafaël A Irizarry. Bioinformatics 2010 (Oxford University Press), 26 : 19, Pp 2363-7, Doi : 10.1093/Bioinformatics/Btq431.) du projet BioConductor (v3.2 ; Gentleman R, Carey Vj, Bâtes Dm, Bolstad B, Dettling M, Dudoit S, Ellis B, Gautier L, Ge Y. Génome Biology 2004, 5, R80). La dernière version des librairies fournies par Affymetrix, construites sur la version 19 du génome humain (UCSC Human génome 19), et la méthode RMA, décrite par Irizarri et al . (Irizarry Ra, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay Yd, Antonellis Kj, Scherf U, Speed Tp. Biostatistics. 2003b, 4 (2), 249-64 ; Irizarry Ra, Ooi SI, Wu Z, Boeke Jd . Stat Appl Genêt Mol Biol. 2003a, 2, Epub. 2003 Mar 18) ont été utilisées afin de guider et effectuer le prétraitement et l'annotation des séquences.

Analyse des données, annotation et analyse thématique

L'analyse statistique individuelle des gènes/transcrits a été réalisée avec les méthodes "Moderated t" et "Moderated F" implémentées dans le package R Limma 3.26.8 (Smyth Gk. Statistical Applications In Genetics And Molecular Biology 2004, 3 (3)).

L'annotation des gènes et la définition de groupes de gènes pour l'analyse de sur-représentation ont été réalisés au départ de la base de données interne « StratiCELL Skin Knowledge Database » (Salmon M & Berger F. Expression Cosmétique 2014, 30, 91-94).

L'analyse de sur-représentation a été réalisée avec la méthode du test hypergéométrique dans but de caractériser les facteurs thèmes/groupes d'intérêt dermo-cosmétique au départ de la proportion de leurs cibles détectées et différentiellement exprimées. L'analyse a été menée au départ de la liste des gènes détectés avec une p-value de 0.05 et une différence du niveau d'expression (Taux de variation ou fold-change ou FC) supérieur à 1,5 (bi-latéral).

3.2. Résultats Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité

Une étude de la cytotoxicité a été réalisée sur des kératinocytes NHEKs. L'extrait et son solvant utilisé pour sa préparation ont été appliqués dans les milieux de culture, durant 24h (n = 3). Le contrôle non traité a été arbitrairement fixé à 100% de viabilité et le seuil de cytotoxicité a été fixé par convention à 80% de viabilité. La condition SDS constitue le contrôle positif qui valide l'expérience.

Sur la base des résultats de l'étude préliminaire de cytotoxicité (Figure 4), les concentrations optimales (en pourcentage v/v) sélectionnées pour l'extrait et son solvant (propane 1,2 diol) sont les suivantes : 0,33%.

Quantification des ARNs par spectrophotométrie

Le rapport de l'absorbance à 260nm et 280nm est utilisé pour évaluer la pureté de l'ARN . Un rapport proche de 2 permet de considérer l'échantillon comme étant pur et dépourvu de contamination par des protéines. Le rapport 260/230 est utilisé en tant que mesure secondaire de la pureté de l'échantillon. La valeur 260/230 est généralement plus élevée que le ratio 260/280 et est attendue aux environs de 2,2. Les ratios obtenus pour l'ensemble des échantillons de la présente étude sont donc satisfaisants (données non montrées) et ont été qualifiés ensuite par électrophorèse capillaire.

Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire

Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARN ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées).

La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrées, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions d'amplification, de purification, marquage à la biotine puis hybridation sur puces à ADN. Analyse des modifications d'expression de gènes induites par l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum

Au terme de l'étude transcriptomique sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pourraient joue un rôle potentiel dans la stimulation de la différenciation épidermique et de la défense anti-bactérienne. Ci-après, les régulations observées en lien avec ces hypothèses sont renseignées entre parenthèses, comme suit : nom du gène - Taux de variation p-value.

• Stimulation de la différenciation épidermique

L'épiderme humain est un épithélium stratifié constituant une barrière dont les couches sont définies par le stade de différenciation des cellules qui les composent. Au fur et à mesure de leur différenciation, les kératinocytes se chargent en filaments de kératine et contiennent une matrice retenant l'eau, le tout étant entouré par l'enveloppe cornée. Les kératinocytes en phase terminale de différenciation sont isolés par les lipides intercornéocytaires et sont attachés les uns aux autres par les cornéodesmosomes.

Les kératinocytes basaux progressent à travers les quatre couches de l'épiderme : basale, épineuse, granuleuse et cornée.

La couche basale est formée par une seule assise de kératinocytes cubiques ou prismatiques liés les uns aux autres par les desmosomes. Dans cette couche les cellules se divisent, l'une des deux cellules reste dans la couche basale tandis que l'autre migre vers les couches supérieures. Les kératinocytes basaux sont attachés par les hémi-desmosomes à une membrane basale qui sépare l'épiderme du derme et forme la jonction dermo-épidermique.

La couche épineuse est formée par 5 à 15 assises de kératinocytes polygonaux liés les uns aux autres par les desmosomes. Ces cellules contiennent des tonofilaments, les filaments précurseurs de la kératine.

La couche granuleuse est formée par 3 couches de kératinocytes qui contiennent des grains de kératohyaline et des granules lamellaires.

La couche cornée est formée de 5 à 15 couches de cornéocytes, c'est-à-dire des kératinocytes différenciés qui ne présentent plus de noyaux et d'organites, mais ils sont entourés par une enveloppe cornée. Ils sont chargés en filaments de kératine.

Formation des filaments de kératine :

Au cours de la différenciation épidermique, les filaments de kératine (appelés tonofilaments) se font de plus en plus nombreux et commencent à s'agréger dans les cellules de la couche épineuse pour former les tonofibrilles. Au niveau de la couche granuleuse, ils s'associent aux granules de kératohyaline. Les granules de kératohyaline sont composés de loricrine, d'involucrine (IVL - 2,24 p=0.0002), de trichohyaline et de profilaggrine qui sera transformée en filaggrine par différentes protéases, dont la caspase 14 (CASP14 - 4,76 p=0.00002). La réticulation de la filaggrine avec la kératine accélère le processus d'agrégation et d'alignement des tonofilaments permettant de former les câbles de kératine qui composent 85% du volume des cornéocytes. Ceux-ci sont ensuite associés aux desmosomes lors de la formation de l'enveloppe cornée par les transglutaminases (TGM1 - 1,98 p=0.00025). La kératine joue le rôle de structure mécanique rigide en association avec l'enveloppe cornée pour assurer le maintien de l'intégrité épidermique.

Au niveau de la couche basale, les kératinocytes expriment principalement les kératines 5 (KRT5 - 1,54 p=0.0039) et 14 alors que les couches supérieures comportent plutôt les kératines 1 (KRT1 - 2,65 p=0.000056), 2 et 10 (KRT10 - 7,81 p=0.0000013).

Formation de l'enveloppe cornée :

Au cours de la différenciation des kératinocytes stimulée par divers facteurs de transcription tel que la protéine zinc finger 750 (ZNF750 - 2,59 p=0.00004), la membrane plasmique est progressivement remplacée par une coque rigide appelée enveloppe cornée. L'initiation de ce changement se traduit par un assemblage protéique intracellulaire coordonné par les transglutaminases (TGM1 - 1,98 p=0.00025). La périplakine, l'envoplakine et l'involucrine (IVL - 2,24 p=0.0002) forment une armature qui recouvre progressivement la face interne de la membrane plasmique. Simultanément, la structure protéique est renforcée par d'autres protéines comme la loricrine, l'hornerine, les protéines « small proline rich » (SPRR1A - 2,48 p=0.000011 ; SPRR1B - 2,61 p=0.00037 ; SPRR4 - 1,73 p=0.0084), les protéines S100 (S100A8 - 2,51 p=0.000056 ; S100A9 - 1.57 p=0.014), et les protéines « late-cornified envelope » (LCE1C - 1,53 p=0.031 ; LELP1 - 1,77 p=0.049).

Les jonctions intercellulaires :

Les desmosomes représentent un type de jonctions situées entre les kératinocytes. Parmi les composants de ce type de structures, les desmocollines (DSC1 - 7,9 p=0.000002 ; DSC2 - 2,43 p=0.0000095 ; DSC3 - 1,57 p=0.00046) et desmogléines (DSG1 - 7,62 p=0.0000042 ; DSG3 - 1,84 p=0.00011) sont des glycoprotéines transmembranaires appartenant à la famille des cadhérines. Leurs parties extracellulaires assurent l'adhésion intercellulaire tandis que leurs parties cytoplasmiques s'associent avec des protéines intracellulaires telles que la plakoglobine (JUP - 1,73 p=0.00031), la plakophiline (PKP1 - 2,01 p=0.00014) ou encore la desmoplakine (DSP - 1,64 p=0.00028). La desmoplakine interagit elle-même avec les filaments de kératine permettant ainsi l'attachement du cytosquelette au complexe d'adhésion. Au cours de la cornification, les desmosomes sont modifiés, la plaque desmosomale est incorporée à l'enveloppe cornée et la cornéodesmosine y est intégrée. Ils portent alors le nom de cornéodesmosomes.

• Stimulation de la défense anti-bactérienne

Pour lutter contre les agressions pathogènes, les kératinocytes peuvent produire des peptides anti-microbiens, responsables de l'attraction et de l'activation des cellules immunitaires.

Les peptides anti-microbiens ont une activité à large spectre et détruisent les organismes en perturbant leur intégrité membranaire. Certains d'entre eux sont exprimés de manière constitutive mais la plupart sont inductibles. Les kératinocytes expriment des peptides de ce type notamment la calgranuline A (S100A8 - 2,51 p=0.000056) et la calgranuline B (S100A9 - 1,57 p=0.014) qui forment un complexe hétérodimérique antimicrobien appelé calprotectine. Il a été démontré que la calprotectine exerce son activité antibactérienne contre Escherichia coli, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus Epidermidis, Capnocytophaga sputigena et Borrelia burgdorferi (Maladie de Lyme). D'autre part, l'étude transcriptomique a permis de mettre en évidence une augmentation très importante de l'expression du gène codant pour la chémokine (C-X-C motif) ligand 14 (CXCL14 - 16,7 p=0.00000013). Cette chémokine est constamment produite dans l'épiderme et le derme en conditions saines. Cependant, en plus de ses effets chémo-attractants, elle possède une activité bactéricide reconnue contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Streptococcus pyogenes.

Différents mécanismes sont mis en place pour moduler la prolifération des bactéries, parmi ceux-ci, on distingue le processus de desquamation qui permet d'éliminer les micro-organismes indésirables installés sur les cornéocytes. La desquamation repose sur l'équilibre entre la synthèse de protéines structurales des cornéodesmosomes et leur dégradation par des protéases spécifiques comme les kallikréines (KLK5 - 2,57 p=0.000011 ; KLK7 - 2.17 p=0.000029) et la cathépsine L2 (CTSV - 3,41 p=0.00000083).

3.3 Conclusion

En modulant positivement les gènes codant pour les protéines impliquées dans la différenciation épidermique, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pourrait potentiellement stimuler le renouvellement de l'épiderme. De plus, il pourrait jouer un rôle dans la défense antimicrobienne de l'épiderme en augmentant l'expression des gènes codant pour certains peptides antimicrobiens ou pour des chémokines impliquées dans la défense anti-bactérienne.

Exemple 4 : Effet de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum dans du propane 1,2 diol, sur des kératinocytes humains - Etude en RT-qPCR

Cette étude consiste à confirmer les modifications d'expression des gènes détaillées dans l'exemple 3. La confirmation est réalisée par RT-qPCR à partir de nouvelles cultures de kératinocytes NHEKs mises en présence de l'extrait pendant 24 heures. 4.1. Matériels et méthodes

L'extrait, la culture cellulaire, la détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité, le traitement des cellules, l'extraction de l'ARN total ainsi que la qualification des ARN par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire sont décrits au point 3.1.

La synthèse des ADNs complémentaire ou ADNc est décrite au point 2.1.

La méthode de qPCR en temps réel à l'aide de sondes fluorescentes de type TaqMam est décrite au point 2.1. Dans cet exemple, il s'agit de quantifier l'expression de différentes cibles spécifiques dans les populations d'ARNs issues des kératinocytes NHEKs traités par l'extrait et son solvant. Les PCR ont été réalisées à l'aide du système QuantStudio Flex (Applied Biosystems).

À des fins de normalisation, des mélanges réactionnels avec des sondes et amorces correspondant à la β2-microglobuline (B2M) ont également été préparés avec les mêmes échantillons d'ADNc. Un contrôle sans ADNc a servi de contrôle négatif d'amplification.

4.2. Résultats

Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité

Sur la base des résultats de l'étude préliminaire de cytotoxicité, la concentration optimale (en pourcentage v/v) sélectionnée pour l'extrait et son solvant (propane 1,2 diol) est de 0,33%.

Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire

Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARNs ribosomiaux 18S et 28S. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs, témoigne de l'intégrité des différentes populations. La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrées, ceux-ci ont dès lors été utilisés dans les réactions de synthèse des ADN complémentaires. Analyse des modifications d'expression de gènes induites par l'extrait sur des kératinocytes NHEKs.

Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait durant 24h a permis de confirmer les modifications d'expression des gènes détaillées dans l'exemple 3. Ci-après, les régulations observées sont renseignées entre parenthèses, comme suit : nom du gène - Taux de variation p-value.

• Allégation « Barrière, cohésion et hydratation »

Les profils d'expression de 5 gènes spécifiques à l'hydratation, la fonction barrière et la cohésion de l'épiderme ont été analysés. Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait augmente l'expression de la desmogléine 1 (DSG1 - 11,6 P=0.00088), de la desmocolline 1 (DSC1 - 9,6 P=0.00027), de la Claudine 1 (CLDN1 - 1,5 p=0.022), de l'aquaporine 3 (AQP3 - 4,7 p = 0.000014) et de ΑΤΡ-binding cassette sous-famille A membre 12 (ABCA12 - 1,8 p = 0.002).

· Allégation « Différenciation de l'épiderme et son renouvellement »

Les profils d'expression de 4 gènes spécifiques à la différenciation de l'épiderme et son renouvellement ont été analysés. Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait augmente l'expression de l'involucrine (IVL - 3,7 p=0.00058), de la transglutaminase-1 (TGM1 - 2,8 p=0.0017), et les deux protéines « small proline rich » (SPRR1A - 4,6 P=0.012 ; SPRR1B

- 5,4 P=0.001).

• Allégation « Défense antibactérienne »

Les profils d'expression de 5 gènes spécifiques à la défense antibactérienne ont été analysés. Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait augmente l'expression de la défensine bêta 1 (DEFB1 - 5,1 p=0.00057), de la calgranuline A (S100A8 - 6,2 p=0.0000018 ), de la calgranuline B (S100A9

- 3 p = 0.00001), de la calgranuline C (S100A12 - 4 p=0.0019) et de la chémokine (C-X-C motif) ligand 14 (CXCL14 - 19,9 P=0.00007).

4.3 Conclusion

Ces résultats appuient donc les pistes proposées à l'exemple 3 et confirment que l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention renforce les jonctions intercellulaires et plus particulièrement, les desmosomes, stimule la différenciation de l'épiderme et son renouvellement et stimule la défense antibactérienne.