본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RNA를 주형으로 하고, N-프라이머를 상기 주형에 어닐링시켜 제1가닥 (first strand) cDNA를 합성하는 단계; 및

상기 합성된 제1가닥 cDNA에 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 첨가하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, N-프라이머를 이용한 RT-PCR 방법을 제공한다.

바이러스를 검출하기 위한 공통적인 프라이머를 설계하기 위하여 지금까지 알려진 모든 바이러스의 전체 게놈 유전정보를 분석하였다. 분석 내용은 바이러스의 그룹별 mRNA 복제, poly A tail의 유무, 바이러스 구성에 중심이 되는 단백질의 역할 및 작용을 포함하는 바이러스 전체 유전 영역을 대상으로 하였다. mRNA 복제시에 sub-genome RNA의 생성은 바이러스의 양적 검출에 영향을 미칠 수 있었으며, 외피단백질(Capsid or coat protein)은 주로 특이 프라이머 조건을 충족하는 부분으로 바이러스 종 특이적으로 반응하는 핵산 단편에 일치하도록 설계할 수 있었다. 그러나 이 두 영역이 게놈의 3' 말단 부분이나 동일한 부분이라면 한 바이러스의 이상적 프라이머 설계에는 문제가 없었으나, 바이러스마다 부분적으로 틀리며, 연관 핵산 염기서열 또한 다양하였다. 이런 다양한 인프라의 제공으로 무작위적 염기서열의 배열을 고려하고 기존의 인프라를 타개하는데 주안을 두고 모든 바이러스에 부합되도록 N 염기서열의 반복으로 N-프라이머를 최종적으로 선발하였다.

본 발명에 제공된 바이러스, 진핵생물, 원핵생물은 대표적인 시료로 비교 실험하였다. 프라이머 설계는 N 염기서열의 반복을 25머(25mer)로 결정하였으며, 모든 비교 실험은 RT-PCR에 의한 기존의 프라이머와 N-프라이머의 RT-PCR 반응에 의한 목적 밴드(target band)의 명확성으로 검증하였으며, 이는 바이러스 검출 시 유용성 여부와 연관지어 하기 실시예에 설명하였다.

N-프라이머는 각각의 뉴클레오티드 위치에 G, A, T 및 C가 모두 위치할 수 있는 프라이머로서, 예를 들면, 25개 뉴클레오티드의 N-프라이머라면 예상할 수 있는 프라이머의 조합의 수는 4 ²⁵ 개이다. 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20~30개 뉴클레오티드이며, 가장 바람직하게는 25개 뉴클레오티드이다. N-프라이머의 길이가 상기 범위를 벗어나면 RT-PCR 효율이 저하될 수 있기 때문이다.

본 발명의 N-프라이머를 이용한 RT-PCR 방법은 특정 N-프라이머를 이용하는 것을 제외하고는 일반적인 RT-PCR 방법에 이용되는 시약 및 방법을 이용할 수 있다.

제1가닥 cDNA를 합성하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 역전사효소, RNase 블록 리보뉴클레아제 저해제 등을 이용하여 제1가닥 cDNA를 합성할 수 있다. 역전사 효소의 예는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함한다.

본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 핵산인 RNA는 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플로부터 분리하거나 제조할 수 있다. 핵산을 포함할 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층(buffy coat), 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액 (예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아 세포 배양액)과 같이 유기체로부터의 샘플, 비로이드(viroid), 바이러스, 박테리아, 진균, 효모, 식물 및 동물과 같이 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염된 것으로 예측되는 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같이 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 핵산은 이에 제한되지 않고, 예를 들면, 세제를 사용하는 세포 용해, 초음파 처리, 글래스 비드 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용하는 진탕/교반을 사용하여 상기 언급된 물질로부터 제조할 수 있다. 상기 RNA는 바람직하게는 바이러스 유래, 더욱 바람직하게는 식물 바이러스 유래이며, 가장 바람직하게는 하나의 게놈 RNA를 갖는 monopartite 게놈 식물 바이러스 유래이다.

본 발명의 N-프라이머를 이용한 RT-PCR 방법은 바이러스 진단, 바람직하게는 식물 바이러스 진단, 더욱 바람직하게는 하나의 게놈 RNA를 갖는 monopartite 게놈 식물 바이러스 또는 식물 바이러스 밀도가 낮은 시료의 식물 바이러스 진단에 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, RNA를 주형으로 하고, 하나의 튜브에 N-프라이머, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 내열성 중합효소 및 반응 완충액을 첨가하여 RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는, N-프라이머를 이용한 원스텝 (one-step) RT-PCR 방법을 제공한다.

본 발명의 원스텝 RT-PCR 방법은 기존에 제1가닥 cDNA를 먼저 합성하는 1단계; 및 합성된 제1가닥 cDNA에 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 첨가하여 PCR을 수행하는 2단계 과정을 거쳐 RT-PCR을 수행하는 과정을 하나의 단계로 RT-PCR을 수행하는 방법이다. 따라서, 원스텝 RT-PCR은 하나의 튜브에 역전사 및 중합효소연쇄반응에 필요한 N-프라이머, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등을 첨가하여 RT-PCR을 수행하는 것이다. 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 원하는 PCR 산물을 생성하기 위해 디자인된 프라이머 조합이다. 따라서, 표적 산물에 따라 그 서열은 상이할 것이다. 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 전술한 바와 같은 MuLV 역전사효소 등을 이용할 수 있다.

원스텝 RT-PCR 방법에 이용되는 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20~30개 뉴클레오티드이며, 가장 바람직하게는 25개 뉴클레오티드이다. N-프라이머의 길이가 상기 범위를 벗어나면 원스텝 RT-PCR 효율이 저하될 수 있기 때문이다.

원스텝 RT-PCR 방법에 이용되는 RNA는 전술한 바와 같으며, 상기 RNA는 바람직하게는 바이러스 유래, 더욱 바람직하게는 식물 바이러스 유래이며, 가장 바람직하게는 하나의 게놈 RNA를 갖는 monopartite 게놈 식물 바이러스 유래이다.

본 발명의 N-프라이머를 이용한 원스텝 RT-PCR 방법은 바이러스 진단, 바람직하게는 식물 바이러스 진단, 더욱 바람직하게는 하나의 게놈 RNA를 갖는 monopartite 게놈 식물 바이러스 또는 식물 바이러스 밀도가 낮은 시료의 식물 바이러스 진단에 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 N-프라이머 및 RT-PCR에 필요한 시약을 포함하는 RT-PCR용 키트를 제공한다. 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20~30개 뉴클레오티드이며, 가장 바람직하게는 25개 뉴클레오티드이다. N-프라이머의 길이가 상기 범위를 벗어나면 RT-PCR 효율이 저하될 수 있기 때문이다.

RT-PCR에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 전술한 바와 같은 MuLV 역전사효소 등을 이용할 수 있다.

또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

상기 RT-PCR용 키트는 바이러스 진단, 바람직하게는 식물 바이러스 진단, 더욱 바람직하게는 하나의 게놈 RNA를 갖는 monopartite 게놈 식물 바이러스 또는 식물 바이러스 밀도가 낮은 시료의 식물 바이러스 진단에 이용될 수 있다.

상기 RT-PCR용 키트는 또한 원스텝 RT-PCR에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 기존의 특이적 핵산 염기서열을 가진 프라이머와 본 발명의 프라이머와의 RT-PCR 반응 >

콩모자이크바이러스에서 특이 프라이머와 N-프라이머의 비교 RT-PCR 사진은 도 1에서 보여준다. 본 발명을 위해 사용된 콩모자이크바이러스는 농업과학기술원에서 바이러스 분리 후 재접종하여 선발된 바이러스 이병 식물 시료를 사용하였다. 본 바이러스에 특이적 핵산 염기 서열을 가진 프라이머는 목적하는 외피 단백질(Coat protein) 부분에서 제작되었으며, 바이러스 외피를 형성하는 역할을 수행하는 영역으로 일반적으로 바이러스 검출 스펙트럼에 이용되는 핵산 단편으로 통용되고 있다. 고안된 N-프라이머는 bioneer사에서 무작위적으로(GCAT mixed bases) 올리고를 합성한 핵산 단편이다.

본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리 방법은 다음과 같다.

총 RNA는 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 감염 식물체 100mg을 유발에 담아 액체 질소를 넣어 유봉을 이용하여 잘게 마쇄하고, 마쇄된 식물체 조직을 온도를 떨어뜨린 용기에 담고 트리졸 용액 1ml를 넣고 볼텍싱(vortexing)으로 고루 섞었다. 여기에 200㎕ 클로로포름(Chloroform)을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리한 뒤, RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 여기에 200㎕ 클로로포름을 첨가하고 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리한 뒤 수층을 채취하였다. 수득한 수층의 80% 정도 부피의 이소프로판올을 혼합하여 실온에서 20분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리하고, 침전물의 이소프로판올 액을 건조시켜 1ml의 70% 에탄올을 넣어 침전물을 흔들어 세척한다. 70% 에탄올에 부양되어있는 침전물을 4℃에서 13000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 침전물의 70% 에탄올 액을 건조시켜 100㎕ 증류수로 녹여서 냉동보관한다.

추출한 총 RNA를 이용한 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법은 다음과 같다.

30㎍ 총 RNA에 기존의 특이 역방향 프라이머(서열번호 1)를 총 RNA량의 1/10㎍을 넣고, 비교하는 N-프라이머도 30㎍의 총 RNA에 1/10㎍으로 넣고, 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 각각 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 얼음(ice)에서 30분 정치하였다. 역전사는 위 반응액에 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응시켰다. MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2 유닛(unit)을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각하였다. PCR은 역전사 반응으로 합성해 놓은 각각의 cDNA를 1/2 희석한 후 주형으로 1㎕ 사용하여 표적 검출 스펙트럼 밴드를 도출하기 위한 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 정방향 프라이머(서열번호 2 또는 서열번호 3) 5pmole, 역방향 프라이머(서열번호 1) 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛을 넣고 증류수를 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로, PCR 조건은 94℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성은 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 30초를 35회 실시하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 역전사 특이 프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우보다 N-프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우에 PCR 산물이 더욱 특이적이어서 비특이적인 밴드가 거의 없어지고, 또한 특이적인 밴드가 다량 검출된다는 것을 알 수 있다.

<실시예 2: 담배녹반모자이크바이러스와 콩모자이크바이러스의 게놈 3' 말단 특이 핵산 단편 또는 표적(target) 영역의 3' 말단 특이 핵산 단편(reverse primer)과 N-프라이머로 표적 영역의 RT-PCR 반응>

본 발명을 위해 사용된 담배녹반모자이크바이러스와 콩모자이크바이러스는 농업과학기술원에서 바이러스 분리 후 재접종하여 선발된 바이러스 이병 식물 시료를 사용하였다. 본 바이러스에 특이적 핵산 염기 서열을 가진 프라이머는 바이러스의 전체 게놈 3' 말단 부분에서 선정한 것이며, 표적 영역은 바이러스 전체 게놈 일부분 또는 바이러스에서 기주 특이적으로 작용할 염기서열 부분으로 바이러스 진단 및 검출에 통용되는 감염매개단백질(P1 Protein, HC-Pro Protein)과 외피 단백질을 포함하는 영역을 대상으로 제작하였다. N-프라이머는 앞서 제작된 방식과 동일시하였다.

(1) 담배녹반모자이크바이러스의 전체 핵산 중 일부분을 검출하기 위한 RT-PCR (도 2A)

본 실험의 수행에 따른 총 RNA 추출 방법은 상기와 동일하며, 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법 및 조건은 다음과 같다.

30㎍ 총 RNA에 기존의 특이 3' 말단 핵산 단편(서열번호 4)을 총 RNA량의 1/10㎍로 넣고, 비교하는 N-프라이머도 30㎍의 총 RNA에 1/10㎍으로 넣고, 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 각각 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 얼음(ice)에서 30분 정치하였다. 역전사는 위 반응액에 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응시켰다. MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2 유닛을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각하였다. PCR은 역전사 반응으로 합성해 놓은 각각의 cDNA를 1/2 희석한 후 주형으로 1㎕를 사용하여 표적 검출 스펙트럼 밴드를 도출하기 위한 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 표적 영역의 정방향 프라이머(서열번호 5 또는 서열번호 6) 5pmole, 역방향 프라이머(서열번호 4 또는 서열번호 7) 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛을 넣고 증류수로 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 30초를 35회 실시하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

그 결과, 도 2A에서 볼 수 있는 바와 같이, 담배녹반모자이크바이러스 RT-PCT의 경우에 역전사 특이 프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우보다 N-프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우에 PCR 산물이 더욱 특이적이어서 비특이적인 밴드가 거의 없어지고, 또한 특이적인 밴드가 다량 검출된다는 것을 알 수 있다.

(2) 콩모자이크바이러스의 감염매개단백질(P1 Protein, HC-Pro Protein)과 외피 단백질을 검출하기 위한 RT-PCR (도 2B)

본 실험의 수행에 따른 총 RNA 추출 방법은 상기와 동일하며, 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법 및 조건은 다음과 같다. 30㎍ 총 RNA에 기존의 특이 3' 말단 핵산 단편(서열번호 1)을 총 RNA량의 1/10㎍로 넣고, 비교하는 N-프라이머도 30㎍의 총 RNA에 1/10㎍으로 넣었고, 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 각각 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 얼음(ice)에서 30분 정치하였다. 역전사는 위 반응액에 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응시켰다. MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2 유닛을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각시켰다. PCR은 역전사 반응으로 합성해 놓은 각각의 cDNA를 1/2 희석한 후 주형으로 1㎕를 사용하여 표적 검출 스펙트럼 밴드를 도출하기 위한 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 표적 영역의 정방향 프라이머(서열번호 8~서열번호 10 또는 서열번호 13, 14, 16, 17) 5pmole, 역방향 프라이머(서열번호 11 또는 서열번호 12, 15, 18, 19) 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛을 넣고 증류수로 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 30초를 35회 실시하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

그 결과, 도 2B에서 볼 수 있는 바와 같이, 콩모자이크바이러스 RT-PCT의 경우에 역전사 특이 프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우보다 N-프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우에 PCR 산물이 더욱 특이적이어서 비특이적인 밴드가 거의 없어지고, 또한 특이적인 밴드가 다량 검출된다는 것을 알 수 있다.

<실시예 3: 콩모자이크바이러스의 게놈 3' 말단 특이 핵산 단편 또는 표적 (target) 영역의 3' 말단 특이 핵산 단편(reverse primer)과 N-프라이머로 표적 영역의 One step RT-PCR 반응>

본 실험 수행에 따른 총 RNA 추출 방법은 동일하며, 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법 및 조건은 다음과 같다.

1㎍ 총 RNA에 표적 영역의 정방향 프라이머(서열번호 5 또는 서열번호 6) 10pmole, 역방향 프라이머(서열번호 4 또는 서열번호 7) 10pmole, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 1㎕, MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 200 유닛, 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 1.4㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛, 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 1.5㎕, DMSO 0.8㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들고, 비교하는 N-프라이머도 1㎍의 총 RNA에 20pmole 넣고, 위의 반응액과 증류수를 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다.

RT-PCR 조건은 42℃에서 1시간 동안 cDNA를 합성한 후, 94℃에서 10분간 변성시킨 후, 변성(Denature) 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 1분을 35회 실시하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다 (도 3).

그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 콩모자이크바이러스 RT-PCT의 경우에 역전사 특이 프라이머를 이용한 원스텝 RT-PCT의 경우와 N-프라이머를 이용한 원스텝 RT-PCT의 경우에 PCR 산물은 거의 유사하게 검출된다는 것을 알 수 있다.

<실시예 4: 진핵 생물과 원핵생물의 실험에 통용되는 기존의 핵산 단편들과 N-프라이머의 RT-PCR 반응>

(1) 원핵생물인 세균을 이용한 비교 실험

세균 벌크홀데리아 글루매( Burkholderia glumae )는 증식되는 벼 낟알에 세균성 벼알마름병을 일으켜 수확량에 영향을 미치는 세균이다. 서울대학교 및 한국생물공학연구원 식물유전체 실험실에서 실험 중인 본 시료는 단일 콜로니로 분리하여 계대 배양하여 사용하였다.

일반적인 원핵생물의 역전사 반응에 랜덤 옥타머(random octamer) 또는 헥사머 올리고(Hexamers oligo)와 표적 영역의 특이 역방향 프라이머가 통용되어 왔다. 이들 중 목적하는 역방향 프라이머와 N 염기서열을 가진 본 올리고(oligo)를 이용한 실험을 다음과 같이 수행하였을 때 목적하는 세균 Burkholderia glumae 의 전체 게놈 중에서 11번 ORF(open reading frame) 부분을 중합효소연쇄반응을 실시하여 결과를 보았다 (도 4A).

본 발명을 위해 사용한 세균 RNA 분리 방법은 다음과 같다.

단일 콜로니를 액체 항생 배지(Rifampicin 50 ㎍/ml)에서 16시간 배양한다. 위 배양액을 600㎕ 취해서 60ml의 액체 배지에서 배양한다. OD(Optimal density) 값이 600nm에서 0.6이 되면 배양을 중단한다. 7.5ml의 에탄올/페놀 스팟 용액 (에탄올 중의 5% 산 페놀)을 첨가한다. 원심 분리하여 상등액은 제거하고 침전물에 3ml의 아세테이트/SDS 버퍼를 첨가한다. 고루 섞어 침전물을 풀어주고 15ml 튜브에 10ml씩 옮긴 후 65℃로 가열한 페놀을 3ml 첨가한다. 고루 섞어주어 에펜돌프 튜브(e-tube)에 1ml 씩 옮겨 원심분리 (13,000rpm) 10분을 행한다. 상층의 맑은 부분만 취하여 동량의 페놀을 넣고 섞어 원심분리(13,000rpm) 10분을 행한다. 상층의 맑은 부분만 취하여 1/5의 클로로포름를 넣고 섞어 원심분리(13,000rpm) 10분을 행한다. 상층액의 3 부피에 해당하는 양의 100% 에탄올을 넣고, -70℃에서 30분 동안 정체시킨다. 원심분리(13,000rpm) 10분을 행하고, 생긴 침전물에 70% 에탄올을 넣어 세척해준다. 수득한 침전물에 다시 한번 아세테이트/SDS 버퍼로 풀어주어 에탄올 침전을 거치고 난 후 100㎕의 DEPC 물에 녹여낸다. DNase를 처리하고 37℃에서 20분간 반응시킨다. 6㎕의 3M Na-acetate(pH5.2)를 첨가하여 페놀로 추출한다. 상층액을 취하여 페놀:클로로포름:이소아밀알코올 (25:24:1)로 추출한다. 상층액을 취하여 클로로포름으로 추출한다. 에탄올을 행하고 침전물을 건조시켜 DEPC 물에 녹여낸다.

추출한 세균의 RNA를 이용한 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법은 다음과 같다.

30㎍ 총 RNA에 기존의 특이적 역방향 프라이머(서열번호 21)를 총 RNA량의 1/10㎍을 넣고, 비교하는 N-프라이머도 30㎍의 총 RNA에 1/10㎍으로 넣고, 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 각각 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 얼음(ice)에서 30분 정치한다. 역전사는 위 반응액에 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응시킨다. MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2 유닛을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각시킨다. PCR은 역전사 반응으로 합성해 놓은 각각의 cDNA를 1/2 희석한 후 주형으로 1㎕를 사용하여 목적하는 검출 스펙트럼 밴드를 도출하기 위한 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 정방향 프라이머(서열번호 20) 5pmole, 역방향 프라이머(서열번호 21) 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛을 넣고 증류수로 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 30초를 30회 실시하고 72℃에서 5분간 유지 후에 반응을 정지하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

(2) 진핵생물인 실험용 쥐의 간 조직을 이용한 비교 실험

한국생물공학연구원 동물자원센터에서 건강한 실험용 쥐의 간 조직을 분리하여 받았다. 중합효소연쇄반응으로 목적하는 영역은 액틴 부분이며, 진핵생물의 폴리 A 테일(poly A tail)에 적합한 올리고 dT(oligo dT) 핵산 단편이 보편적으로 실험에 이용되어 왔다. 고안된 N-프라이머와의 역전사 반응을 통한 액틴 부분의 검출 비교로 진핵 생물 내에서 N-프라이머의 사용가능성을 살펴보았다. 그 결과는 도 4B와 같다.

본 발명을 위해 사용한 쥐 간 RNA 분리 방법은 다음과 같다.

간 RNA는 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 쥐 간을 0.5g 정도 떼어내어 e-tube에 담고 tri-reagent를 300㎕ 넣어 전동 분쇄기로 잘게 마쇄하였고, 마쇄된 쥐 간 조직이 용액에 풀어지고 덩어리가 없을 때 200㎕의 tri-reagent를 첨가하여 볼텍싱(vortexing)으로 고루 섞고 실온에 놓아두었다. 100㎕ 클로로포름을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 100㎕ 클로로포름을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 맑은 수층을 수득하였다. 수득한 수층의 80% 정도 부피의 이소프로판올을 혼합하여 실온에서 20분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 침전물의 이소프로판올 액을 건조시켜 1ml의 70% 에탄올을 넣어 침전물을 흔들어 세척하였다. 70% 에탄올에 부양되어있는 침전물을 4℃에서 13000rpm으로 15분 동안 원심분리하였고, 침전물의 70% 에탄올 액을 건조시켜 100㎕ 증류수로 녹여서 냉동보관하였다.

추출한 총 RNA를 이용한 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법은 다음과 같다.

30㎍ 총 RNA에 기존의 특이 역방향 프라이머(서열번호 23) 또는 oligo dT ₁₈ 핵산 단편을 총 RNA량의 1/10㎍을 넣고, 비교하는 N-프라이머도 30㎍의 총 RNA에 1/10㎍으로 넣고, 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 각각 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 얼음(ice)에서 30분 정치하였다. 역전사는 위 반응액에 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응하였다. MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2 유닛을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각시켰다. PCR은 역전사 반응으로 합성해 놓은 각각의 cDNA를 1/2 희석한 후 주형으로 1㎕를 사용하여 표적 검출 스펙트럼 밴드를 도출하기 위한 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 정방향 프라이머(서열번호 22) 5pmole, 역방향 프라이머(서열번호 23) 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛을 넣고 증류수로 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 30초를 25회 실시한 후 72℃에서 5분간 유지 후에 반응을 정지시켰다. PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 원핵생물 및 진핵생물 RT-PCT의 경우에 역전사 특이 프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우와 N-프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우에 PCR 산물은 거의 유사하게 검출된다는 것을 알 수 있다.

<실시예 5: 바이러스와 식물에서 악조건에서의 N-프라이머 활성 변화도>

(1) 고추식물에서 악조건 하에 N-프라이머 활성 변화도 (도 5A)

본 발명을 위해 사용된 부강 고추는 온실 내 재배한 것으로 건전한 조직을 선정하여 사용하였다. 식물체 역전사 반응에 통상적으로 이용하는 올리고 dT(oligo dT) 프라이머와 고안한 N-프라이머로 역전사 반응시켜서 액틴 부분의 중합효소연쇄반응을 관찰하였다. 건전 조직의 RNA 시료상태가 좋을 경우에서부터 시료의 상태가 좋지 않은 상황으로의 변화에 N-프라이머 핵산 단편의 민감한 반응도를 살펴 유용성을 증명하였다.

본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리 방법은 다음과 같다.

총 RNA는 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 건전 식물체 100mg을 유발에 담아 액체 질소를 넣어 유봉을 이용하여 잘게 마쇄하였고, 마쇄된 식물체 조직을 온도를 떨어뜨린 용기에 담고 트리졸 용액 1ml를 넣고 볼텍싱(vortexing)으로 고루 섞었다. 200㎕ 클로로포름을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 200㎕ 클로로포름을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 맑은 수층을 수득하였다. 수득한 수층의 80% 정도 부피의 이소프로판올을 혼합하여 실온에서 20분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 침전물의 이소프로판올 액을 건조시켜 1ml의 70% 에탄올을 넣어 침전물을 흔들어 세척하였다. 70% 에탄올에 부양되어 있는 침전물을 4℃에서 13000rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 침전물의 70% 에탄올 액을 건조시켜 100㎕ 증류수로 녹여서 냉동보관하였다.

추출한 총 RNA를 1시간 실온 방치 후 30분간 -70℃에서 얼리고(stress 1), 실온에서 1시간 방치 후 30분간 -70℃에서 얼리고(stress 2), 실온에서 1시간 방치 후 30분간 -70℃에서 얼리고(stress 3)의 방법으로 stress 5까지의 RNA 시료를 분리하여 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 다음과 같이 수행하였다.

각각의 RNA 시료 5㎕에 대하여 oligo dT 프라이머를 1㎍을 넣거나, N-프라이머 1㎍을 넣어 프라이머 양을 동일시하였다. 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 각각 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 얼음(ice)에서 30분 정치하였다. 역전사는 위 반응액에 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응시켰다. MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2 유닛을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각시켰다. PCR은 역전사 반응으로 합성해 놓은 각각의 cDNA를 1/2 희석한 후 주형으로 1㎕를 사용하여 표적 검출 스펙트럼 밴드를 도출하기 위한 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 정방향 프라이머(서열번호 24) 5pmole, 역방향 프라이머(서열번호 25) 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛을 넣고 증류수로 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 30초를 35회 실시하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

(2) 바이러스에서 악조건 하에 N-프라이머 활성 변화도(도 5B)

본 발명을 위해 농업과학기술원에서 고추 mild mottle 바이러스 분리 후 재접종하여 선발된 바이러스 이병 식물 시료를 사용하였다. 바이러스 역전사 반응에 통상적으로 이용하는 특이 역방향 프라이머와 고안한 N-프라이머로 역전사 반응시켜서 바이러스를 진단하되, RNA 시료 상태가 나쁜 악조건에서의 N-프라이머 핵산 단편의 반응도를 역전사 중합효소연쇄반응으로 관찰하였다. 건전 조직의 RNA 시료 상태가 좋을 경우에서부터 시료의 상태가 좋지 않은 상황으로의 변화에 N-프라이머 핵산 단편의 민감한 반응도를 살펴 바이러스 검출 스펙트럼에 이용되는 핵산 단편으로의 유용성을 증명하고 있다.

총 RNA는 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 이병 식물체 100mg을 유발에 담아 액체 질소를 넣어 유봉을 이용하여 잘게 마쇄하였고, 마쇄된 식물체 조직을 온도를 떨어뜨린 용기에 담고 트리졸 용액 1ml를 넣고 볼텍싱(vortexing)으로 고루 섞었다. 200㎕ 클로로포름을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 200㎕ 클로로포름을 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 맑은 수층을 수득하였다. 수득한 수층의 80% 정도 부피의 이소프로판올을 혼합하여 실온에서 20분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 침전물의 이소프로판올 액을 건조시켜 1ml의 70% 에탄올을 넣어 침전물을 흔들어 세척하였다. 70% 에탄올에 부양되어있는 침전물을 4℃에서 13000rpm으로 15분 동안 원심분리하였고, 침전물의 70% 에탄올 액을 건조시켜 100㎕ 증류수로 녹여서 냉동보관하였다.

추출한 총 RNA를 9시간 실온 방치 후 15시간 -20℃에서 얼리고(stress 1), 실온에서 9시간 방치 후 15시간 -20℃에서 얼리고(stress 2), 실온에서 9시간 방치 후 15시간 -20℃에서 얼리며(stress 3) RNA 시료를 각각 분리하여 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 다음과 같이 수행하였다.

각각의 RNA 시료 5㎕에 대하여 역방향 특이 프라이머(서열번호 27)를 1㎍을 넣거나, N-프라이머 1㎍을 넣어 프라이머 양을 동일시하여 비교하였다.

증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 각각 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 얼음(ice)에서 30분 정치하였다. 역전사는 위 반응액에 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응시켰다. MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2 유닛을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각시켰다. PCR은 역전사 반응으로 합성해 놓은 각각의 cDNA를 1/2 희석한 후 주형으로 1㎕를 사용하여 표적 검출 스펙트럼 밴드를 도출하기 위한 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 정방향 프라이머(서열번호 26) 5pmole, 역방향 프라이머(서열번호 27) 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛을 넣고 증류수로 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94℃에서 30초, 결합(Annealing)은 58℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 30초를 35회 실시하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 바이러스와 식물에서 악조건에서의 RT-PCT의 경우에 역전사 특이 프라이머 또는 올리고 dT 프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우와 N-프라이머를 이용한 RT-PCT의 경우에 PCR 산물은 거의 유사하게 검출된다는 것을 알 수 있다.

<실시예 6: Tobacco Ringspot Virus (TRSV)에 감염된 대두로부터 TRSV의 진단을 위한 One step RT-PCR 반응>

본 실험 수행에 따른 총 RNA 추출 방법은 동일하며, 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법 및 조건은 다음과 같다.

1㎍ 총 RNA에 표적 영역의 정방향 프라이머(서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 또는 서열번호 33) 10pmole, 역방향 프라이머(서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 34) 10pmole, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 1㎕, MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 200 유닛, 5배 역전사 완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl ₂ , 150 mM KCl, 5 mM 디티오트레이톨, pH 8.5) 1.4㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, EF Taq 중합효소 1 유닛, 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl ₂ , 500 mM KCl, pH 8.3) 1.5㎕, DMSO 0.8㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들고, 비교하는 N-프라이머도 1㎍의 총 RNA에 20pmole 넣고, 위의 반응액과 증류수를 첨가하여 최종 20㎕ 반응액으로 수행하였다.

RT-PCR 조건은 42℃에서 1시간 동안 cDNA를 합성한 후, 94℃에서 10분간 변성시킨 후, 변성(Denature) 94℃에서 30초, 결합(Annealing) 55℃에서 30초, 합성(Extension)은 72℃에서 2분을 30회 실시하였고, PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다 (도 6).

도 6에서 패널 A는 one step RT-PCR 반응액에 역전사효소가 포함되어 있고, 패널 B는 포함되어 있지 않은 경우의 결과이다. 패널 B를 만든 이유는 본 발명자의 연구실에서 이 바이러스를 많이 다루기 때문에 혹 오염이 있을까 싶어서 오염 여부를 체크하기 위한 것이다.

패널 B에서, 역전사효소나 N-프라이머를 첨가하지 않고 실험된 반응(레인 5, 6, 7, 8)을 보면 이미 total RNA 시료에 대두 유래의 RNA가 다량 존재하지만 역전사효소에 의해 합성되는 cDNA는 생성될 수 없기 때문에 RT-PCR 반응 결과 나타난 DNA들은 그 유래가 total RNA 시료로 소량 carry over된 genomic DNA로부터 유래되었음을 알 수 있다. 그러나, 역전사효소는 없으나 N-프라이머가 반응액에 포함된 경우 (레인 1, 2, 3, 4)는 전혀 증폭된 DNA를 볼 수 없다. 그 이유는 RT-PCR 반응에서도 N-프라이머가 우리가 모르는 작용에 의해 특이성을 높여주는 것 같다. 많은 경우에 이러한 현상을 관찰할 수 있다. 특이 프라이머를 사용하는 반응은 대체로 반응물이 깨끗하게 나타나지만 비 특이적인 반응이 많이 동반되는 경우에 N-프라이머가 이를 보정해 주는 역할을 하는 것 같다.

패널 A에서 볼 수 있는 바와 같이, TRSV RT-PCT의 경우에 역전사 특이 프라이머를 이용한 원스텝 RT-PCT의 경우와 N-프라이머를 이용한 원스텝 RT-PCT의 경우에 PCR 산물은 거의 유사하게 검출된다는 것을 알 수 있다.