本发明属于生物技术和药物领域， 尤其涉及一种 rTRAIL突变体及其 海兔毒素偶联物。 背景技术

肿瘤坏死因子 （ TNF ) 相关的凋亡诱导配体 （ TNF related apoptosis-inducing ligand, TRAIL, 或 Apo2L， TNFSFIO)是继 TNF、 FasL 之后发现的第三个 TNF家族的凋亡因子， 为一种抗癌应用前景良好的生 物药物。 TRAIL由 Wiley等从心肌 cDNA文库中克隆出来的， 因其氨基酸 序列具有 TNF超家族的结构特征并能诱导 Jurkat细胞和 EB病毒转化的人 类淋巴细胞凋亡而得名。 TRAIL属 II型跨膜蛋白， 由 281个氨基酸组成， 其 N端 （1~17位氨基酸） 位于胞内， C端 （第 39~281位氨基酸） 延伸到 胞外， 其中第 114~281位是发挥主要功能的部位。

许多临床前期研究表明 TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡， 但对 正常细胞无毒副作用。 目前国外已进行关于 TRAIL及其受体激动型抗体 的 I、 II期临床试验， 并取得初步疗效。 另外， TRAIL对 NF-κΒ仅有很 微弱的激活作用， 即使是全身用药， 也不会像 TNF-α和 Fas-L那样产生严 重的炎症反应， 这些特性使得 TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。

TRAIL在免疫系统细胞中表达， 包括 NK细胞、 T细胞、 巨噬细胞和 树突细胞， 并且位于细胞膜中， 可经半胱氨酸蛋白酶加工成可溶形式。 TRAIL是通过与与其细胞膜受体结合发挥诱导凋� ��作用的。 目前已发现 5 种 TRAIL受体，包括： TRAIL-R1 (DR4， TNFSFlOa)和 TRAIL-R2 (DR5, TNFRSFlOb); TRAIL-R3 (DcRl , TNFRSFlOc) 和 TRAIL-R4 (DcR2， TNFRSFlOd); 循环骨保护素 （OPG， TNFRSFllb)。 DR4和 DR5具有一 段死亡结构域 （DD), 是 TRAIL结合受体后诱导凋亡所必需的。 其余三 个受体由于缺乏功能性死亡结构域， 虽然能与 TRAIL结合， 但无法诱导 凋亡。 TRAIL与 DR4或 DR5结合后可激活线粒体依赖和非线粒体依赖两 条 细胞凋亡信号途径， 介导死亡信号传导入细胞内， 启动效应物半胱天冬酶 -3 (caspase-3 ), 最终引起肿瘤细胞凋亡。

近年来， 人们发现重组可溶 TRAIL诱导了广谱的人肿瘤细胞系凋亡， 但同时也存在一些对 TRAIL敏感性较低或耐受的肿瘤细胞， 如所有的人 黑色素瘤细胞系、大部分乳腺癌细胞系、前列 腺癌细胞系 LNcaP等， 这些 细胞表面虽然或多或少也表达 DR4或 DR5, 却由于细胞内凋亡途径中关 键酶的缺失、 突变和其他抑制凋亡的蛋白高表达等原因， 导致 TRAIL结 合 DR4或 DR5之后并不能引起细胞的最终凋亡。

对于这类细胞所形成的实体瘤， 亟须其他治疗手段或改造 TRAIL使 之具备杀伤敏感性低以及耐受肿瘤细胞的能力 。 研究发现， 可溶型重组 TRAIL (rTRAIL)与放化疗联合应用能提高肿瘤细胞对 rTRAIL的敏感性， 二者具有协同作用。 目前国际通用的 rTRAIL是 95~281位氨基酸片段， rTRAIL 单体倾向于形成生物活性较好的三聚体而存在 ， 在三聚体的顶部 有一个锌离子结合位点， 对稳定三聚体构象起重要作用。

但联合治疗方案仅是将 rTRAIL和这些药物同时给药， 并未在二者之 间建立联系， 无法将这些药物单一地导向肿瘤细胞， 因此一般只选择低剂 量低毒性的药物， 以免对正常细胞产生毒害。 相应地， 也就无法得到更好 的治疗效果。 因此， 若能将一些能够强力杀伤肿瘤细胞的药物加以 有效利 用，将更有利于肿瘤的治疗。例如化疗药物海 兔毒素（ Monomethyl auristatin E， MMAE) 是一种人工合成抗肿瘤小分子， 它通过抑制细胞内微管蛋白 二聚化而诱导细胞凋亡。但由于它具有很强的 无选择毒性， 会对正常细胞 造成伤害， 所以其本身并不能成药。另外， 针对 TRAIL的突变体、 TRAIL 受体的抗体的研究都在进行中， 但治疗效果仍不理想。 发明内容

本发明提供了一种 rTRAIL突变体， 将特定氨基酸突变为半胱氨酸， 从而实现与海兔毒素的偶联， 且不会大幅降低蛋白对肿瘤细胞的杀伤力。

一种 rTRAIL突变体， 氨基酸序列如 SEQ ID NO.l所示。

该突变体取自全长 TRAIL蛋白的第 95~281个氨基酸， 且第 109位的 天冬酰胺 （Asn) 突变为半胱氨酸 ( Cys )。

本发明还提供了一种编码所述 rTRAIL 突变体的基因， 碱基序列如 SEQ ID N0.2所示。 该基因第 109位编码天冬酰胺 （Asn ) 的密码子 AAT 突变为编码半胱氨酸 （Cys ) 的密码子 TGT。

本发明还提供了一种含有所述基因的表达单元 、 重组载体或表达系 统。

所述表达单元的启动子为 77， 在这些启动子的作用下， rTRAIL突变 体可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可 溶表达。

所述重组载体的原始载体为： pET-28a ( + ) 。

所述表达系统可选细菌、 酵母、 昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统， 优选为细菌表达系统， 最优选为大肠杆菌表达系统。

本发明还提供了一种 rTRAIL突变体 -海兔毒素偶联物，由海兔毒素通 过连接臂偶联 rTRAIL突变体三聚体构成。 所述海兔毒素的合成方法参考 美国专禾 1J文献： Turner inhibiting tetrape tide bearing modified phenethyl amides (专利号: 5,635,483 )。

本发明所使用的连接臂为马来酰亚胺修饰的缬 氨酸-瓜氨酸二肽， 其 合成方法参考文献： Gene M.D., et al, Cathepsin B-Labile Dipe tide Linkers

Model Studies of Enzymatic Drug Release and Antigen- Specific In Vitro Anticancer Activity, Bioconjugate Chem. , \3(4) 855—869(2002)。 本发明带连接臂的海兔毒素（vcMMAE ) 由江阴康诺泰生物技术有限 公司代为合成，也可以参考文献（Svetlana O.D., et al, Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy [J], Nature Biotechnology., 21 (7) 778-784(2003). ) , 偶联时再通过缬氨酸上的马来酰亚 胺与 rTRAIL突变体的半胱氨酸巯基进行垸基化反应， 最终形成本发明偶 联物。 本发明还提供了所述 rTRAIL突变体-海兔毒素偶联物的制备方法，包 括：

( 1 )将 rTRAIL突变体多聚体解聚， 重新聚合得到 rTRAIL突变体三 聚体， 具体包括： 将 rTRAIL突变体溶于含锌离子的缓冲液中， 加入憐酸 三 （β-氯乙基)酯， 30~40°C水浴反应 l~3h;

由于 rTRAIL突变体之间会通过二硫键形成多聚体， 加入憐酸三 （β- 氯乙基） 酯 （TCEP) 使不稳定的多聚体解聚， 保持单体状态， 反应体系 中的锌离子进一步促使 rTRAIL突变体单体形成稳定的三聚体。

(2 )将 rTRAIL突变体三聚体与带连接臂的海兔毒素混合 ，进行偶联 反应， 偶联后， 每个三聚体可以结合 1-3个海兔毒素分子； 偶联反应的温 度优选为 0~4°C， 时间为 30~60min。

(3 ) 反应完成后， 分离纯化得到 rTRAIL突变体 -海兔毒素偶联物； 由于本发明 rTRAIL突变体 -海兔毒素偶联物单体的分子量为 23 kDa, 而反应体系中存在的其他分子的分子量均小于 10 kDa, 因此， 用截留分子 量 10 kDa的超滤管即可除去体系中的小分子， 再经离心去沉淀， 将所得 上清过滤除菌， 即得本发明的偶联物。

用于突变的 TRAIL分子可来源于人或动物， 但为了对人的肿瘤治疗 更有帮助，优选为人的天然 TRAIL分子。天然 rTRAIL单体分子表面也有 半胱氨酸巯基， 但均用于形成稳定的三聚体， 三聚体分子表面因没有游离 巯基存在而失去了偶联位点。 因此， 本发明利用 PCR定点突变手段获得 了含有一个半胱氨酸突变位点的 rTRAIL突变体， 步骤为：

( 1 )提取人组织总 RNA, 以总 RNA为模板进行反转录， 获得 cDNA 文库；

(2 ) 以所述 cDNA为模板， 利用引物 P1和 P2进行 PCR扩增， 得到 TRAIL编码序列；

(3 ) 以所述 TRAIL编码序列为模板， 利用引物 P3和 P4进行 PCR 定点突变扩增， 获得突变序列；

(4) 将突变序列可操作性地连入载体， 转化宿主细胞；

(5 )诱导经转化的宿主细胞表达融合蛋白，获得� �述 rTRAIL突变体。 所述引物 P1和 P2的序列为：

P1： 5 '-ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3 '；

P2: 5'-TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3'；

所述引物 P3和 P4的序列为：

P3： 5 '-TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATT TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3 '；

P4： 5 '-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC

GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3 '。

本发明还提供了所述 rTRAIL 突变体-海兔毒素偶联物在制备抗肿瘤 药物中的应用。

所述抗肿瘤药物包括有效量的 rTRAIL突变体 -海兔毒素偶联物，以及 至少一种药学上可接受的载体、 稀释剂或赋形剂。 制备时， 通常将活性成 分与赋形剂混合， 或用赋形剂稀释， 或包在可以胶囊或药囊形式存在的载 体中。 当赋形剂起稀释剂作用时， 它可采用固体、 半固体或液体材料作为 赋形剂、载体或活性成分的介质。 因此， 组合物可以是片剂、 丸剂、粉剂、 溶液剂、 糖浆剂、 灭菌注射溶液等。

合适的赋形剂包括： 乳糖、 葡萄糖、 蔗糖、 山梨醇、 甘露醇、 淀粉、 微晶纤维素、 聚乙烯吡咯垸酮、 纤维素、 水等； 制剂还可包括： 湿润剂、 乳化剂、 防腐剂 （如羟基苯甲酸甲酯和丙酯）、 甜味剂等。 所述抗肿瘤药 物可制成单元或多元剂型，各剂型包含为了产 生所期望的疗效而计算出预 定量的 rTRAIL突变体 -海兔毒素偶联物， 以及合适的药剂学赋形剂。

所述的抗肿瘤药物可以通过常规途径进行给药 ， 包括（但并不限于）： 肌内、 腹膜内、 静脉内、 皮下、 皮内、 局部给药等。

使用该药物时，是将安全有效量的 rTRAIL突变体 -海兔毒素偶联物施 用于人， 其中该安全有效量的范围优选为 0.5~50毫克 /千克体重， 更优选 为 1~10毫克 /千克体重。 当然， 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状 况等因素， 这些都是在熟练医师技能范围之内的。

此外， 本发明的偶联物还可与其他治疗药物联用， 其中包括 （但并不 限于）： 各种细胞因子， 如 IFN、 TNF、 IL-2 等； 各种肿瘤化疗药物， 如 5-FU、 氨甲喋呤等影响核酸生物合成的药物； 氮芥、 环憐酰胺等垸化剂类 药物； 阿霉素、 放线菌素 D等干扰转录过程阻止 RNA合成的药物； 长春 新碱、 喜树碱类等影响蛋白质合成的药物及某些激素 类药物， 等等。

与现有技术相比， 本发明的有益效果为：

( 1 )本发明偶联物具有 rTRAIL突变体和 MMAE两者的生物学功能， 既具有 rTRAIL突变体在肿瘤细胞外诱导凋亡的能力， 又具有 MMAE在 细胞内抑制微管蛋白从而诱导凋亡的能力， 在二者的协同下， 抗肿瘤效果 得到显著增强。

(2 ) 本发明偶联物通过 rTRAIL突变体与肿瘤细胞表面的死亡受体特 异结合， 将 MMAE定向转运到肿瘤细胞， 并在肿瘤细胞内释放发挥作用， 既可杀伤对 TRAIL敏感性低甚至抵抗的肿瘤细胞，也减少 MMAE单独给 药产生的毒副作用。

(3 ) 本发明偶联物中的 rTRAIL突变体与 MMAE偶联后， 其水溶液 具有比单纯的 rTRAIL分子更佳的稳定性， 表现为经反复冻融后不出现沉 淀。 附图说明

图 1为大肠杆菌表达的 rTRAIL突变体 N109C电泳图。 其中， M代 表低分子量 Marker; 1为未诱导的菌液； 2、 3为诱导的菌液； 4为未诱导 的菌液破碎后离心取的上清 （可溶部分）； 5、 6为诱导的菌液破碎后离心 取的上清（可溶部分）； 7、 8、 9为诱导和不诱导的沉淀用 8M尿素重溶后 的样品。

图 2为 rTRAIL突变体 N109C的亲和纯化结果电泳图。 其中， M为 蛋白分子量 marke 1为 IPTG诱导后的菌液， 2为破菌后的上清； 3为 Ni柱的流穿液； 4为 10 mM咪唑洗脱液； 5为 60 mM咪唑洗脱液； 6为 500 mM咪唑洗脱液。

图 3为 rTRAIL突变体 N109C的 SP强阳离子交换柱纯化结果电泳图。 其中， 1为 10 mM咪唑洗脱液脱盐后的蛋白溶液； 2和 3都是 SP柱的洗 脱蛋白， 即纯化后的 N109C , 4为 N109C非变性电泳的结果。

图 4为 N109C及其 MMAE偶联物的电泳图。 其中， 1为 N109C, 2 为 N109C-vcMMAE偶联物， 3为 N109C-vcMMAE脱盐后的产物， 4、 5、 6分别为 1、 2、 3样品非变性条件下的电泳结果。

图 5为 rTRAIL突变体 -vcMMAE偶联物各部分连接关系示意图。 图 6为各 TRAIL元件对不同细胞系的杀伤效果。

图 7为 N109C-vcMMAE偶联物在荷瘤小鼠体内的分布。

图 8为 N109C-VCMMAE偶联物的肿瘤细胞内吞实验图。 图 9为 rTRAIL突变体 -vcMMAE偶联物诱导凋亡机制示意图。 具体实鮮式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一 步详细说明。

1、 建立人前列腺 cDNA文库

( 1 ) 提取人前列腺总 mRNA

液氮研磨冻存的人前列腺组织小块 （lOOmg 左右） 成粉末状， 加 TRIZOL试剂 1 mL继续反复研磨， 转移至 1.5 mL无 RNA酶 EP管中， 室 温放置 5 min， 加 0.2 mL氯仿剧烈振荡 15 s， 室温放置 3 min。 4°C 12000 g 离心 15 min， 转移上层水相至另一无 RNA酶的 EP管中。 加入异丙醇 0.5 mL,室温放置 10 min，沉淀 RNA。 4°C 12000 g离心 10 min，去上清， 75% 乙醇洗涤沉淀。 4°C 12000 g离心 5 min， 去上清， 干燥后用 50 μΐ DEPC水 溶解， -70°C保存。

(2 ) 反转录 PCR

以 oligodT为引物， 人前列腺总 RNA为模板， 加 AMV逆转录酶进 行 Reverse-PCR， 得到 cDNA文库。 具体步骤为：

1 ) RNA预变性： 5 人前列腺 RNA+25 OligodT, 用 0.1% DEPC 补足至 10 L _; 70°C水浴 5 min， 冷却至室温， 破坏 mRNA二级结构。

2 ) 反转录： 合成体系为:

组分 体积

上述 RNA混合液 10 μΐ

dNTP (各 10 mM) 3 μL

RNA酶抑制剂 （40 U/ L) 20 U

逆转录酶 15 U

5x缓冲液 4 μΙ

0.1% DEPC 补足至 20 μ

PCR程序为： 逆转录过程 42 °C 60 min

逆转录酶灭活 70 °C 10 min

获得的 cDNA存于 -20°C， 备用。

2、 获取 TRAIL编码序列

以上述 cDNA为模板， P1和 P2为上下游引物， Taq DNA聚合酶催 化合成和扩增 TRAIL编码序列。经序列分析， 所得 DNA序列与 GenBank 登记的序列 （NM— 003842.4 ) 所显示的 TRAIL 编码序列一致， 即得到了 TRAIL编码序列。 引物的序列为：

P1： 5 '-ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3 '；

P2 : 5'-TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3O

PCR反应体系为：

组分 体积

5xPCR缓冲液 （含镁离子） 10

dNTP Mixture (各 2.5 mM)

PI 1

P2 1 μL

cDNA 2

Prime Star高保真酶 （2.5 U L) 0.5 μL

dd¾0 31.5

PCR反应程序:

预变性 95 °C 3 min

变性 95 °C 30 seconds

退火 55 °C 30 seconds 30个循环

延伸 72 °C 1 min

延伸 72 °C 10 min

保存 4°C hold

3、 获取 TRAIL 95~281 (rTRAIL) 突变序列

( 1 ) 获取 rTRAIL N109C突变序列

以 TRAIL编码序列为模板， P3和 P4为上下游引物， Taq DNA聚合 酶催化合成和扩增 rTRAIL N109C 突变体编码序列。 经测序分析， 所得 DNA序列如 SEQ ID No.2所示， 与预想一致。 引物的序列为：

P3： 5 '-TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATT

TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3 '；

P4： 5 '-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC

GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3 '。

除引物和模板外， PCR反应体系和反应程序同步骤 2。

(2 ) 获取 rTRAIL S96C突变序列

以 TRAIL编码序列为模板， P5和 P6为上下游引物， Taq DNA聚合 酶催化合成和扩增 rTRAIL N109C 突变体编码序列。 经测序分析， 所得 DNA序列如 SEQ ID No.4所示， 与预想一致。 引物的序列为：

P5： 5 '-TATACCATGGGCACCTGTGAGGAAACCATT

TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCT-3 '；

P6: 5 '-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC

GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3 '。

除引物和模板外， PCR反应体系和反应程序同步骤 2。

下面以 rTRAIL N109C突变序列为例， 对 rTRAIL突变体的制备及偶 联物的构建作进一步说明。 rTRAIL S96C突变体的制备及偶联物的构建与 之相同。

4、 构建含 rTRAIL突变序列的表达载体

rTRAIL N109C突变序列和 pET28a (+)分别进行 Ncol/Xhol双酶切， 然后按照 3 : 1的摩尔比连接， 连接酶为 T4 (Takara) o 连接产物转化大肠 杆菌 DH5a感受态细胞， 挑取阳性克隆培养。 抽提质粒后 Ncol/Xhol双酶 切验证连接情况， 再经测序验证， 得到 rTRAIL突变体表达载体： pET28a (+ ) -rTRAIL N109C。

5、 表达载体转化大肠杆菌， 建立工程菌

将 pET28a (+) -rTRAIL N109C表达载体转化大肠杆菌表达宿主 BL21 (DE3 ) (购自 Novagen) , 从卡那霉素抗性平板上挑取单克隆于 37°C 160 rpm培养过夜。用菌液 PCR的方法确认 rTRAIL突变体表达载体已转化表 达宿主： 以菌液作为模板， P3、 P4作为引物进行 PCR。 经验证为阳性的 单克隆即为所需要的工程菌， 菌液加 10%~15%甘油后 -80°C保存。

6、 rTRAIL突变体的制备和纯化

将构建好的工程菌接种至 200 mL LB培养基（含 15 g/mL kanamycin ) 中， 37°C 160 111摇床培养至菌液00600=0.8左右。 加入终浓度为 1 mM 的 IPTG诱导 BL21 (DE3 )表达融合蛋白， 诱导时间为 12 h。 7200 g离心 lO min得到 BL21菌体。

用上样缓冲液 A重悬菌体， 法式压力破碎。 7200 g离心 30 min后， 取上清过 0.22 μηι水膜。 然后用 GE公司 Ni-NTA亲和柱进行金属亲和层 析。 10 mM咪唑洗脱杂蛋白， 60 mM咪唑洗脱目的蛋白。 60 mM咪唑洗 脱的组分用 GE公司脱盐柱将其缓冲液替换为缓冲液 B, 然后进行进一步 的离子交换层析，选用的柱子为 GE公司的 SP强阳离子交换柱。缓冲液 C 用于洗脱离子交换柱上的蛋白。

其中， 各缓冲液的组分为：

缓冲液 A: 50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl， H 7.4

缓冲液 B: 20 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 6.0

缓冲液 C: 20 mM NaH ₂ PO ₄ , 1 M NaCl, pH 6.0

图 1、 图 2和图 3所示的为 rTRAIL N109C突变体的原核表达及纯化 结果电泳图。 由图 1可见， rTRAIL N109C突变体可在大肠杆菌内成功地 可溶性表达。 由图 2可见， 在 10 mM咪唑浓度下 rTRAIL N109C突变体 已经开始洗脱， 初步纯化后其纯度在 85%以上。 由图 3可见， 经 SP柱纯 化后， 能去掉部分杂蛋白， 但还有三条细小的杂带。 同时， 对基本纯化的 rTRAIL N109C突变体进行非变性凝胶电泳发现， 获得的 rTRAIL N109C 突变体中存在二聚体、 四聚体等， 这是突变蛋白分子间二硫键所导致的。

获得的 N109C突变体的氨基酸序列如 SEQ ID No. l所示， S96C突变 体的氨基酸序列如 SEQ ID No.3所示。

7、 rTRAIL突变体与 MMAE偶联

取 0.5 mg rTRAIL N109C突变体溶解于 0.8 mL PBSCpH 6.0，含 10 μΜ ZnCl ₂ ) 中， 加入 6 L憐酸三 ( β-氯乙基)酯（TCEP) , 37°C水浴 2 h。 边 搅拌边加入用 50 μ 30%乙腈 /水溶解的 10倍过量 vcMMAE (由江阴康诺 泰生物技术有限公司代为合成， 10倍过量即反应体系中 vcMMAE的摩尔 量大于等于 N109C的 10倍）， 4°C反应 40 min， 加入过量的半胱氨酸终止 反应。 用 Millipore截留分子量为 10 kDa的超滤管除去反应体系中的小分 子。 所得到的偶联物过 0.22 μηι孔径的水膜除菌， -20°C保存备用。

图 4为 rTRAIL N109C与 MMAE偶联的电泳结果图。 由图可见， 偶 联后的蛋白条带发生明显偏移， 表明小分子 MMAE已经偶联到蛋白上， 使其电泳行为发生变化。 其中， 泳道 1和 4对比可见 N109C由于突变了 一个半胱氨酸残基， 所以有多聚体存在； 而泳道 3与 6的对比表明， 偶联 时， rTRAIL N109C的多聚体在 TCEP的作用下解聚， 锌离子促使 N109C 单体形成稳定的三聚体， 其半胱氨酸巯基与 vcMMAE的马来亚酰胺基团 发生垸基化反应， 变成了偶联不同个数 MMAE的偶联物。 rTRAIL突变体 -海兔毒素偶联物各部分的连接关系如图 5所示。

8、 偶联物的体外抗肿瘤活性测定

选择四个类型的细胞： TRAIL敏感型（NCI-H460)、 不敏感型 (Hela)、 耐受型 （MCF-7)、 和普通细胞 （HEK293 ) 对 rTRAIL突变体与 MMAE 偶联物的体外抗肿瘤活性进行测定。 这四种细胞表面皆有 TRAIL死亡受 体。

下面以 TRAIL敏感型细胞 NCI-H460为例对试验步骤作详细说明，包 括：

( 1 ) 细胞 NCI-H460消化成为单个细胞后， 稀释为 Ι χΙΟ ⁴ 个 /mL， 铺 96孔板 （每孔 100 μυ, 正常条件下继续培养 24小时。

(2 ) 将 N109C、 N109C-vcMMAE、 S96C-vcMMAE分别用培养基稀 释， 加入细胞板作为实验组， 使终浓度为： 32、 63、 125、 250、 500、 1000 ng/mL _; 以标准品 TRAIL ( 114-281 ) 为阳性对照， 以溶解实验品的缓冲 液为阴性对照， 并用培养基以同样方式稀释。 空白对照照为不加任何溶液 的培养基。 实验中对照组和实验组皆做三个复孔。

(3 ) 将对照组和实验组加入细胞板中， 37°C继续培养 96 h， 观察实 验组和对照组对目的细胞的杀伤能力。

(4) 培养结束后， 每孔加入 10 L CCK-8显色液， 置于培养箱中孵 育显色 l h。 取出以 450 nm、 630 nm双波长检测。

(5 ) 结果计算： 以实验组中 OD值高于同等稀释度的阴性对照的样 品为阳性 （t检验 P<0.01 )。 计算结果如图 6所示。

由图 6可见，对四种不同的细胞， rTRAIL突变体 -vcMMAE偶联物都 比 rTRAIL突变体的肿瘤杀伤力强。

对于 NCI-H460细胞， rTRAIL突变体及其 MMAE偶联物都不能比 TRAIL ( 114-281 ) 的活性更好。

对 Hela和 MCF-7细胞， rTRAIL突变体 -vcMMAE在较高浓度时表现 出更强的杀伤效果， 而在低浓度 （<250 ng/mL ) 时稍微低于 TRAIL ( 114-281 其原因可能是低浓度时， 被细胞内吞的 rTRAIL 突变体 -vcMMAE偶联物并未积累足够量的 MMAE来诱导细胞凋亡，所以在高浓 度时杀伤效果更好。 然而不管是低浓度还是高浓度下， N109C-VCMMAE 比 S96C-vcMMAE的杀伤力更强。

对于正常细胞 HEK293， TRAILC 114-281 )、 rTRAIL突变体及其 MMAE 偶联物都毒性较小。

9、 偶联物在荷瘤动物模型中的分布

以 N109C-vcMMAE为例， 采用荧光标记法实时跟踪偶联物在小鼠体 内的走向， 观察偶联物的肿瘤靶向能力。

( 1 ) 荷瘤动物模型的建立

选用体重约 20g 的无胸腺小鼠， 在其前腿一侧腋下皮下注射 10 ⁷ 个 NCI-H460细胞， 三天后即可见到明显出瘤现象。

(2) 偶联物的荧光标记

荧光标记物采用 Cy5这一近红外激发的染料， 方便荧光穿透动物皮 肤，达到实时活体观测的目的。 Cy5标记的具体步骤参考厂家（Lumiprobe) 的说明书。

(3 ) 给药并实时观测

将 200 含有约 50 μ _§ Cy5标记的偶联物尾静脉注射入荷瘤小鼠体 内。 空白组注射等量的生理盐水。

利用小动物活体成像仪（型号： NightOWLN320)每隔 24小时观察小 鼠体内荧光分布。 观察前， 小鼠禁食 12小时， 用乙醚麻醉。 连续观察 4 天， 直至小鼠全身荧光全部消失。 第 4天后处死小鼠， 分离心脏、 肝脏、 脾脏、 肺、 肾脏、 肿瘤组织， 利用小动物活体荧光成像仪对偶联物在实验 组小鼠体内器官的具体分布进行验证。 成像结果如图 7所示。 图中白色箭 头所指的为肿瘤部位。

由图 7可见， 第三天大部分的荧光已经聚集到肿瘤部位， 而第四天更 是只剩肿瘤部位有荧光。处死小鼠后对各组织 的荧光检测结果也与活体实 时检测相一致。 表明 N109C-vcMMAE具有良好的肿瘤靶向效应。

10、 偶联物抗肿瘤活性的分子机理研究

下面以 NCI-H460细胞为例， 以激光共聚焦手段观察 rTRAIL突变体 -vcMMAE偶联物在肿瘤细胞内的行为。 操作步骤为：

①用 1M HC1和 70%乙醇浸泡玻片， 超声 30分钟， 双蒸水洗涤 5~6次。 然后灭菌待用；

②将灭好菌的玻片置入 24孔板中， 细胞以 10 ⁴ 个 /孔的密度铺板， 37°C过 夜培养；

③给药： N109C-vcMMAE、 S96C-vcMMAE分别稀释至终浓度 1 g/mL， 不同时间点 （lh， 4h， 8h， 12h) 按步骤 4处理细胞了， 空白对照为不 给药的培养基；

④玻片用冷的 PBS洗涤三次， 然后用 4%多聚甲醛常温固定 10 min _;

⑤再用 PBS洗涤三次；

⑥力卩 0.1% Triton X-100室温透化 10 min;

⑦ PBS洗涤三次后， 加 2% BSA封闭 30 min;

⑧一抗孵育： 将兔抗人 rTRAIL多抗用 1% BSA/PBS稀释至 1 g/mL， 室 温孵育 45 min。

⑨二抗孵育： 将 FITC标记的羊抗兔二抗用 1% BSA/PBS稀释 500倍， 室 温孵育 45 min。

⑩ DAPI细胞核染色：， PBS洗涤三次后，每个玻片上滴加用 PBS稀释 1000 倍的 DAPI, 以刚好覆盖细胞为宜， 25 孵育2 1^11左右；

© 封片： PBS洗涤后， 玻片上加一滴抗荧光淬灭剂， 倒扣在载玻片上， 然后用指甲油封住玻片四周；

© 共聚焦检测。 检测结果见图 8。

图 8 中显蓝色荧光的为细胞核， 显绿色荧光的是 rTRAIL 突变体 -vcMMAE偶联物。 在给药一个小时后， 大量 N109C-vcMMAE已经进入 细胞内； 4小时后， 越来越多的 N109C-vcMMAE进入到细胞内， 并开始 慢慢聚集； 8小时后， 细胞内已经有更多的聚集点； 12小时后， 细胞内的 聚集点逐渐减少， 细胞开始出现凋亡现象， 表现为细胞核出现异质化。

推断 rTRAIL 突变体 -vcMMAE 偶联物的作用机理为： 偶联物通过 rTRAIL 突变体与肿瘤细胞表面的死亡受体结合， 并被肿瘤细胞内吞， 形 成吞噬体； 吞噬体进一步与溶酶体融合，溶酶体中的组织 蛋白酶 Cathepsin 水解偶联物中的二肽连接臂， 释放出 MMAE; MMAE在肿瘤细胞中发挥 作用， 抑制微管蛋白二聚化， 从而诱导细胞凋亡。 其诱导凋亡机制如图 9