本发明涉及耐盐基因及其应用。 本发明还涉及包含该基因的载体、 宿主 细胞和植物及生产植物的方法。 该基因可用于改善植物对盐胁迫环境的耐受 性。 背景技术

盐胁迫是限制植物生长和发育的主要非生物性 压力之一， 在农业上可能 引起重大损失。 人们付出了许多努力来研究植物对盐胁迫的响 应机制， 期望 能够据此开发出对盐胁迫耐受的品系。

一些生长在高盐环境中的植物种类进化出了复 杂的方式来适应所处的环 境， 这些植物可以作为盐耐受机制研究的基础。 芸薹科 (Brassicaceae family) (又名十字花科)盐芥属的盐生植物小盐芥 (7¾e//續 g e//a Ζζα/ορΜα)在遗传上是 一种很有价值的模式植物。 小盐芥与模式植物拟南芥 (^rab i c， w thaliana^ 于同一个科。 但与拟南芥不同的是， 小盐芥能够耐受极端的寒冷、 干旱和高 盐条件。 特别是当处于高达 500 mM NaCl的高盐条件时， 小盐芥仍然能够耐 受并且完成生命周期 (Inan G等， 2004, Salt cress. A halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol 135: 1718-1737)。这些属性使得小盐芥成为研究植物� �盐胁迫的响应和耐受机制的 优良对象。 但是， 目前尚不清楚小盐芥的具体耐盐机制。

在先前的研究中， 本发明的发明人使用能够在酿酒酵母 (H aromyces cerev^ae)中直接进行表达的 pGAD-GH穿梭载体为经过盐处理的小盐芥的地 上部分和根部构建了 cDNA文库 (Zhang YY等， 2008, Comparison Analysis of Transcripts from the Halophyte Thellungiella halophila. Journal of Integr Plant Biol, 50 (10): 1327-1335)。 其后， 利用这种高效的酵母体系， 通过大规模的胁 迫 -耐受筛选从小盐芥中分离了能够提高盐耐受� �的多个 cDNA克隆 (Chen AP 等， 2007 , Ectopic expression of ThCYP 1 , a stress-responsive cyclophilin gene from Thellungiella halophila, confers salt tolerance in fission yeast and tobacco cells. Plant Cell Rep, 26:237-245和 Liu N等, 2007 , Functional screening of salt stress-related genes from Thellungiella halophila using fission yeast system Physiol Plantarum 129: 671—678)。

本发明的发明人进一步发现了一个显示出显著 盐耐受性的克隆， 以此为 基础分离了 ThLEAl 基^。 本发明的发明人惊讶地发现这种基因在盐敏感 性 的酵母细胞中异位表达时能够显著改善酵母的 存活率， 尽管在酵母中不存在 与植物 LEA显示出序列同源性的蛋白质。经过分析和实 验还发现 ThLEAl无 论在非盐生植物中还是在酵母中都能够展现出 保守的盐耐受性， 能够保护处 于盐胁迫条件下酵母和植物细胞。 这不仅对植物的盐胁迫响应机制研究有很 大帮助， 还让人们能够通过 ThLEAl基因的转化和异位表达而将盐耐受性赋 予本来对盐份敏感的物种， 从而产生能够在盐胁迫条件下生长的品系。 发明 人由此完成了本发明。 发明内容

本发明涉及分离的多核苷酸， 其包含选自下组的核苷酸序列或由该序列 组成：

(1) SEQ ID ΝΟ: 1或 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；

(2) 与（1)的核苷酸序列的互补序列在低等严格条� ��、 中等严格条件、 优 选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；

(3) 与（1)的核苷酸序列具有至少 50%、 至少 60%、 至少 70%、 至少 75%、 优选至少 80%、更优选至少 85%、特别优选至少 90%、尤其是至少 95%或 98% 或 99%同一性的核苷酸序列；

(4) 与（1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋� ��质、 但在序列上不同 的核苷酸序列；

(5) 编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列： SEQ ID NO:2所示的氨基酸 序列， 或者， 由于一或多个 (例如 1-25个、 1-20个， 1-15个， 1-10个， 1-5个，

1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和 /或插入而与 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序 列不同的氨基酸序列， 或者， 与 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列具有至少 50%、 至少 60%、 至少 70%、 至少 75%、 优选至少 80%、 更优选至少 85%、 更优选至少 90%、 尤其是至少 95%或 98%或 99%同一性的氨基酸序列；

(6) (1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段； 或

(7) 与（1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸 序列。 本发明还提供分离的多核苷酸， 其包含与 SEQ ID NO: l中所示的核苷酸 序列基本相同的核苷酸序列。

本发明还涉及构建体， 其包含本发明的多核苷酸。

本发明还涉及表达盒， 其包含本发明的多核苷酸， 以及对所述多核苷酸 表达起调控作用的调控元件。 所述调控元件例如可以为与所述多核苷酸可操 作地连接的启动子， 包括但不限于组成型启动子、 组织特异性启动子或诱导 型启动子。 所述调控元件还可以例如为增强所述多核苷酸 表达的增强子、 减 弱所述多核苷酸表达的静默子、 终止所述多核苷酸转录的终止子等等。

本发明还涉及载体， 其包含本发明的多核苷酸。 所述载体可以是克隆载 体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。

本发明还涉及细胞， 其包含本发明的多核苷酸或本发明的构建体或 本发 明的表达盒或本发明的载体。 所述细胞可以是动物细胞， 植物细胞， 例如芸 薹科植物细胞， 或者 生物细胞， 例如细菌或真菌细胞， 例如酵母细胞。 所 述细胞可以是分离的、 离体的、 培养的、 或者是植物的一部分 。

本发明还涉及植物或者植物部分， 植物材料， 植物种子， 其包含本发明 的细胞。 所述植物可以是芸薹科植物， 例如白菜、 油菜、 甘蓝、 拟南芥或小 盐芥等， 也可以是其它植物， 例如单子叶植物如水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 高粱、 甘蔗、 燕麦、 或黑麦等， 或者其他双子叶植物如烟草、 大豆、 向曰葵、 甜菜、 辣椒、 马铃薯、 番茄等。 还涉及来自所述植物的转基因种子。

本发明还涉及分离的多肽 (也称蛋白质），其包含从如下组氨基酸序列� �选 择的氨基酸序列或由该序列组成：

(1) SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，

(2)由于一或多个 (例如 1-25个、 1-20个， 1-15个， 1-10个， 1-5个， 1-3 个)氨基酸残基的替代、 缺失和 /或插入而与 SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序 列不同的氛基酸序列，

(3)与 SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少 50%、 至少 60%、 至少 70%、 至少 75%、 优选至少 80%、 更优选至少 85%、 特别优选至少 90%、 尤 其是至少 95%或 98%或 99%同一性的氨基酸序列，

(4) (1)或 (2)或 (3)所述氨基酸序列的活性片段， 和

(5) 本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

本发明还提供分离的多肽， 其包含与 SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列 基本相同的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸和多肽 (也称蛋白质）能够赋予包含它的转基因生物� � 耐受性。 优选地， 本发明的多核苷酸和多肽能够提高其转基因宿 主细胞在含 盐环境下的存活率， 或改善其转基因生物在含盐环境下的生长状况 。

本发明还涉及生产植物的方法， 该方法包括： 从本发明的植物细胞再生 转基因植物， 或者将本发明的植物与另一植物杂交。 优选地， 所述另一植物 优选是耐盐植物。

本发明还涉及本发明的方法生产的植物。

本发明还涉及本发明的多核苷酸或本发明的构 建体或本发明的表达盒或 本发明的载体在改良植物耐盐性中的用途。 本发明还涉及改良植物耐盐性的 方法， 该方法包括制备含有本发明的多核苷酸或本发 明的构建体或本发明的 表达盒或本发明的载体的植物， 例如， 所述方法可以包括从本发明的植物细 胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一 植物杂交。

本发明还涉及提高植物耐盐性的方法， 该方法包括制备含有本发明的多 核苷酸或本发明的构建体或本发明的表达盒或 本发明的载体的植物， 例如， 所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转 基因植物或者将本发明的植物 与另一植物杂交。

本发明还涉及本发明的多核苷酸或本发明的构 建体或本发明的表达盒或 本发明的载体在提高植物耐盐性中的用途。 附图简述

图 1为 ThLEAl的序列分析。来自小盐芥的 7¾L&^基因的核苷酸序列和 推定的氨基酸序列。 氨基酸残基以单字母编码表示。 灰色框指明了 LEA1超 家族中存在的保守氨基酸序列。 起始和终止密码子以粗体显示。

图 2为 ThLEAl在经盐处理的小盐芥幼苗中的表达。 显示了从经过不同 处理时间的植物的莲座叶和根部提取的总 RNA。 顶部的数字指明了处理时间 (小时)。 上方的小图显示与 TTLL 基因特异性探针的杂交。 底部小图显示了 作为上样对照的用亚曱蓝染色的 rRNA。

图 3显示了酵母转化体对 NaCl的耐受性。显示了转化有空载体 (CK)和所 选 ThLEAl的酵母的培养物在系列稀释之后在含有不 同浓度 NaCl或不含 NaCl 的 SD平板上的生长情况， 图为生长 8日之后的照片。 图 4显示了经盐处理的 35S-ThLEAl转基因拟南芥。 （A)用于在植物中过 表达 ThLEAl的 35S默 动子构建体的示意图。（B)在 MS培养基或含有 lOOmM NaCl的 MS培养基上的萌发定量数据 (右侧小图）。 计算了在第 2天空载体对 照 (灰色条形)和 35S-ThLEAl植物 (白色条形）的萌发情况。 将结果参考未经处 理的对照进行标准化。 所示百分比为三次重复 (每次 40-80)的平均值± 80。 * 表示在 PO.01时极为显著 (斯氏 t检验)。 （C)4周龄植株的盐耐受性测定。 显 示了盐处理开始之后 24天时代表性植株的照片。

SE ID NO: 1： ThLEAl编码

CACTGGATAAo

SEQ ID NO:2: ThLEAl蛋白质序列

MQSMKETASNIAASAKSGMDKTKATLEEKAEKMKTQDPVEKQMAT

VGGGGTTGYGTGGGYTG _c

SEQ ID NO:3: ThLEAl cDNA序列

AGGACTTTCGCTTTCAAAAAAAAAAGAAAAAAA 具体实施方式

"LEA蛋白 "： LEA蛋白即胚胎发育晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant protein), 其是存在于植物的不同组织和细胞类型中的一 组蛋白质。 这种蛋白质最早被发现是因为它们在胚发育晚 期的高水平积累。

"ThLEAl基因"： ThLEAl基因是发明人在小盐芥中发现的编码 LEA样 蛋白的基因，故此命名为 ThLEAl基因。该基因最长的 cDNA的 ORF ( 483bp ) 编码一种 160个氨基酸的蛋白质， 即 ThLEA蛋白。 其 CDS如 SEQ ID NO: 1 所示， 编码的蛋白质的氨基酸序列示于 SEQ ID NO: 2。 在下文的实施例部分 将详细描述获得 ThLEAl基因的方法。

"相关 "/"可操作地连接 "指两个物理或功能相关的核酸序列。 例如， 如 果启动子或调节 DNA序列和编码 RNA或蛋白质的 DNA序列可操作地连 接或定位以至于调节 DNA序列将影响编码或结构 DNA序列的表达水平， 那么称启动子或调节 DNA序列与编码 RNA或蛋白质的 DNA序列 "相关"。

"嵌合基因 "是重组核酸序列， 其中启动子或调节核酸序列可操作地连 接编码 mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列， 或与编码 mRNA或作为蛋 白质表达的核酸序列相关， 使得调节核酸序列能调节相关核酸序列的转录 或表达。 嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中所发 现的正常可操作地 连接相关核酸序列。

"编码序列"： 指直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷 酸序列， 其可以为 DNA、 cDNA、 合成的或重组的核苷酸序列。 编码序列的边界通 常由开放阅读框决定。 开放阅读框的 5，端由起始密码子界定， 而 3，端由终 止密码子界定。 起始密码子通常为 ATG, 或者也可以是其它起始密码子如 GTG或 TTG。 终止密码子包括例如 TAA、 TAG, TGA。

"cDNA"是指与 RNA分子互补的 DNA, 其是通过反转录酶从得自真核 细胞的成熟的、 经过剪接的 mRNA分子反转录而来的单链或双链的 DNA分 子。 如此， cDNA中不含本来可能存在于与之对应的基因组 DNA序列中的任 何内含子。

对应于：在本发明上下文中"对应于 "意指当不同 ^基因或蛋白质的 核酸编码序列或氨基酸序列互相比对时， "对应于"一些计数位置的核酸或 氨基酸是与这些位置比对，但不必是在相对于 特定 LEA各自核酸编码序列 或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或 氨基酸。 同样， 当特定 ^ 的编码或氨基酸序列与参照 LEA 的编码或氨基酸序列比对时， "对应于" 参照 LEA序列一些计数位置的该特定 LEA序列中核酸或氨基酸是与参照 LEA 的这些位置比对，但不必是在该特定 LEA蛋白质各自核酸编码序 列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸 或氨基酸。

这里所用的"表达盒 "意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列� � 达的核酸序列， 包含与目的核苷酸序列可操作地连接的调控元 件。 所述调 控元件可以是启动子、 增强子、 静默子、 终止子和 /或其它控制所述核苷酸 序列表达的元件， 如聚腺苷酸化序列等。 通常， 表达盒也包含核苷酸序列 正确翻译所需的序列。 包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的， 意指 至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一 是异源的。 表达盒也可以是 天然存在的， 但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。 然而， 通常， 表 达盒相对于宿主是异源的， 即， 表达盒的特定核酸序列不天然出现在宿主 细胞中， 必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细 胞的前体。 表达盒 中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱 导型启动子控制， 其中仅当 宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时， 所述诱导型启动子才起始转录。 表 达盒中的核苷酸序列的表达也可以受组织特异 性启动子控制。 如果是多细 胞生物体的情况， 如植物， 启动子也可以是对特定组织， 或器官或发育阶 段特异的。

"基因 "是位于基因组内的限定区域， 除了前述编码核酸序列外， 包含 其它主要是调节性的核酸序列， 所述调节性核酸序列负责编码部分的表 达， 即转录和翻译控制。 基因也可以包含其它 5，和 3，非翻译序列和终止序 列。 进一步可以存在的元件是， 例如内含子。

"异源 "核酸序列是与其被引入的宿主细胞不天然相� �的核酸序列， 包 含非天然存在的天然存在核酸序列的多拷贝。

"同源重组"是同源核酸分子间核酸片段的相互� ��换。

当核酸序列编码与参照核酸序列编码的多肽有 相同氨基酸序列的多 肽时， 该核酸序列与参照核酸序列是"同类编码"。

"分离的"核酸分子或"分离的 "蛋白质是人工地与其天然环境分离而存 在， 因此不是天然产物的核酸分子或蛋白质。 分离的核酸分子或蛋白质可 以以纯化形式存在， 或者可以存在于非天然环境， 例如重组宿主细胞或转 基因植物中。

天然： 指在未转化细胞的基因组中存在的基因。

天然存在： 术语"天然存在"用于描述可以在自然界中发现� ��客体， 其 与人工产生的客体不同。 例如， 可以从自然来源分离， 并没有在实验室有 意进行人工修饰的、生物体（包括病毒）中存 在的蛋白质或核苷酸序列是"天 然存在 "的。

"核酸分子"或"核酸序列"是可以从任何来源分� �的单或双链 DNA或

RNA的线性片段。 在本发明上下文中， 优选地， 核酸分子是 DNA片段。

"核酸分子"也称多核苷酸分子。

"植物"是在任何发育阶段的任何植物， 特别是种子植物。

"植物细胞"是植物的结构和生理学单位， 包含原生质体和细胞壁。 植 物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式 ， 或作为高等有组织的单位 如， 例如植物组织， 植物器官或整个植物的一部分。

"植物细胞培养物"意指各种发育阶段的植物单� ��如， 例如原生质体， 细胞培养细胞， 植物组织中的细胞， 花粉， 花粉管， 胚珠， 胚嚢， 合子和 胚的培养物。

"植物材料"指叶， 茎， 根， 花或花的部分， 果实， 花粉， 卵细胞， 合 子， 种子， 插条， 细胞或组织培养物， 或植物的任何其它部分或产物。 "植物器官"是植物清楚的和明显结构化和分化� ��部分， 如根， 茎， 叶， 花蕾或胚。

这里所用的"植物组织"意指组织成结构和功能� ��位的一组植物细胞。 包括植物中或培养物中植物的任何组织。 该术语包括但不限于整个植物， 植物器官，植物种子，组织培养物和组织成结 构和 /或功能单位的任何植物 细胞组。 该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定 类型植物组织的联 合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植 物组织。

"启动子"是编码区域上游非翻译的 DNA序列，其包含 RNA聚合酶的 结合位点， 并起始 DNA的转录。 启动子区域也可以包含作为基因表达调 节物的其它元件。

"原生质体"是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的� ��离的植物细胞。

"调节元件"指参与控制核苷酸序列表达的序列� �� 调节元件包含可操作 地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。 通常它们也包含核苷酸序列 正确翻译所需的序列。

"改组的"核酸是通过改组方法， 如这里所述的任何改组方法产生的核 酸。 通过人工的和可选地循环的方式（物理地或实 际上）重组两个或多个核 酸 (或字符串）产生改组核酸。 一般地， 在改组方法中利用一步或多步筛选 步骤以鉴定目的核酸； 可以在任何重组步骤前或后进行该筛选步骤。 在一 些 (但不是所有）改组实施方式中， 期望在筛选前进行多轮重组以增加待筛 选库的多样性。 可选地， 可以循环重复重组和陣选的全部过程。 根据上下 文， 改组可以指重组和陣选的全部过程， 或可替代地， 可以仅指全部过程 的重组部分。

基本相同： 在两个核酸或蛋白质序列上下文中的短语"基� �相同 "指当 比较和比对以获得最大对应时， 如利用下面序列比较算法之一或目测所测 定的， 具有至少 60%, 优选 80%, 更优选 85%, 更优选 90%, 甚至更优选 95 %和最优选至少 99%核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序 列或亚 序列。 优选地， 基本同一性存在于至少约 50个残基长度的序列区域， 更 优选至少约 100个残基的区域上， 最优选地， 在至少约 150残基中的序列 基本相同。在特别优选的实施方式中，在编码 区整个长度中序列基本相同。 而且， 基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同的 功能。

为了进行序列比较，通常，一个序列作为参照 序列而与检测序列比较。 当利用序列比较算法时， 将检测和参照序列输入到计算机中， 如果必要的 话指定亚序列的坐标， 并指定序列算法程序的参数。 然后， 根据选定的程 序参数， 序列比较算法将计算出检测序列相对于参照序 列的百分序列同一 性。

例如， 通过 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)的局部同 源性算法，通过 Needleman & Wimsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)的同源性 比对算法， 通过 Pearson & Lipman, Proc. Nat 7. Acad. Sci. USA 85 : 2444 ( 1988)的相似性检索方法， 通过这些算法的计算机化实施 (Wisconsin Genetics软件包中 GAP, BESTFIT, FASTA和 TFASTA , Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)或通过目测（通常参见， Ausubel等， 下文)可以进行用于比较的序列的最佳比对。

适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个 算法例子是 BLAST算 法， 在 Altschul等， J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)中描述了该算法。 通 过国家生物技术信息中心（http://www. Ncbi.nlm. nih. gov/)公众可得到进行 BLAST分析的软件。 该算法包括： 通过鉴定出查寻序列中长度为 W的短 字而首先鉴定出高分值序列对 (HSPs) , 所述短字在与数据库序列中相同长 度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分 Τ。 Τ 称为相邻字记分阈值 (Altschul等， 1990)。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的� ��索去发现包 含它们的更长的 HSPs。 然后， 这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可 能远的延伸， 直到积累比对分值不再增加。对于核苷酸序列 ， 用参数 M (成 对匹配残基的奖励分值;总是大于零)和 N (错配残基的罚分值；总是小于零） 计算积累分值。 对于氨基酸序列， 用记分矩阵计算积累分值。 当积累比对 分值从获得的最大值回落数量 X, 由于一个或更多负分值残基比对积累， 积累分值达到或低于零， 或两个序列的任一个到达终点时， 每个方向的字 命中延伸停止。 BLAST算法的参数 W, T和 X决定了比对的敏感性和速 度。 BLASTN程序（对于核苷酸序列）使用字长值 (W)l l , 期望值 (E) 10 , 截 断值 100 , M=5 , N=-4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸序� �， BLASTP 程序使用字长值 (W)3 ,期望值 (E) 10和 BLOSUM62记分矩阵 (参见， Henikoff & Henikoff, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 89： 10915 (1989))为缺省值。

除了计算百分序列同一性外， BLAST 算法也进行两个序列间相似性 的统计学分析（参见， 例如 Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993))。 BLAST 算法提供的一个相似性测定是最小和概率 (Ρ(Ν)) ,其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出� �匹配的概率的指示。 例如， 如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小 和概率少于约 0.1 , 更优选少于约 0.01 , 最优选少于约 0.001 , 那么认为检测核酸序列与参照 序列相似。

两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分 子在严格条件下互相 杂交。 短语"特异性杂交"指当该序列存在于复杂混合� ��（例如， 总细胞 的） DNA或 RNA中时， 在严格条件下， 分子仅与特定核苷酸序列结合， 形 成双螺旋或杂交。 "基本结合"指探针核酸和靶核酸间互补杂交， 并且包含 较少的错配， 通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配 ， 以实现靶核 酸序列的期望检测。

在核酸杂交试验如 Southern和 Northern杂交上下文中 "严格杂交条件" 和 "严格杂交漂洗条件 "是序列依赖性的， 并且在不同环境参数下是不同 的。 较长的序列在较高温度特异性杂交。 在 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes ,第 I部分第 2章' Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York中可以发现 核酸杂交的大量指南。一般地， 对于在限定离子强度和 pH下的特定序列， 高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点 (丁„ 约 5 °C。 典型地， 在"严格 条件"下， 探针将与其靶亚序列杂交， 而不与其它序列杂交。

丁„ ₁ 是 (在限定离子强度和 pH条件下）50%靶序列与完全匹配的探针杂 交时的温度。对于特定的探针，非常严格的条 件选择为等于 T _m 。在 Southern 或 Northern印迹中在滤膜上有多于 100个互补残基的互补核酸杂交的一个 严格杂交条件的例子是在 42°C , 具有 lmg肝素的 50%曱酰胺， 过夜进行 该杂交。 高严格性漂洗条件的例子是 72°C , 0.15M NaCl约 15分钟。 严格 漂洗条件的例子是在 65 °C , 0.2 X SSC漂洗 15分钟 (参见， Sambrook, 下 文， SSC 緩冲液的描述)。 通常， 在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以 除去背景探针信号。 对于例如多于 100个核苷酸的双螺旋而言， 中严格性 漂洗的例子是 45 °C , l x SSC漂洗 15分钟。对于例如多于 100个核苷酸的 双螺旋而言， 低严格性漂洗的例子是 40 °C , 4-6 X SSC漂洗 15分钟。 对于 短探针 (例如， 约 10到 50个核苷酸）， 严格条件通常包括在 pH7.0到 8.3 的少于约 1.0M Na离子的盐浓度， 通常约 0.01到 l.ONa离子浓度 (或其它 盐）， 通常温度至少是约 30°C。 通过添加去稳定剂如曱酰胺也可以获得严 格条件。 一般地， 在特定杂交测定中， 信噪音比就无关探针所观察到的值 高 2χ(或更高)表明特异杂交的检测。 在严格条件下不互相杂交的核酸如果 它们编码的蛋白质是基本相同的， 那么它们仍是基本相同的。 例如， 当用 遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸 拷贝时， 就会出现这种情 况。

下面是杂交 /漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克� �与本发明参 照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列： 参照核苷酸序列与参照核苷酸 序列优选在 50°C , 7%十二烷基硫酸钠（SDS), 0.5M NaP0 ₄ , ImM EDTA 中杂交， 在 50°C , 2 X SSC, 0.1% SDS中漂洗， 更期望在 50°C , 7%十二 烷基硫酸钠（SDS), 0.5M NaPO ₄ , ImM EDTA中杂交， 在 50°C , 1 X SSC, 0.1% SDS中漂洗，更期望在 50°C , 7%十二烷基硫酸钠（SDS), 0.5M NaPO ₄ , ImM EDTA中杂交， 在 50°C , 0.5 X SSC, 0.1% SDS中漂洗， 优选地， 在 50 °C , 7%十二烷基硫酸钠（SDS), 0.5M NaP0 ₄ , ImM EDTA 中杂交， 在 50 °C , 0.1 X SSC, 0.1% SDS中漂洗， 更优选地， 在 50°C , 7%十二烷基硫 酸钠（SDS), 0.5M NaPO ₄ , ImM EDTA中杂交， 在 65°C , 0.1 X SSC, 0.1% SDS中漂洗。

两个核酸序列或蛋白质基本相同的另一个指标 是第一核酸编码的蛋 白质与第二核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或 特异结合。 因此， 蛋白质通 常与第二蛋白质基本相同， 例如， 其中两个蛋白质仅仅由于保守性置换而 不同。

"合成的 "指包含天然序列中不存在的结构特征的核苷� �序列。 例如， 称更密切地类似双子叶和 /或单子叶植物基因 G+C含量和正常密码子分布 的人工序列是合成的。

"转化 "是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过� �，特别地， "转化" 意指 DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。

"转化的 /转基因的 /重组的 "指已经引入异源核酸分子的宿主生物体， 如细菌或植物。 核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者 核酸分子也 可以作为染色体外分子存在。 这种染色体外分子可以是自主复制的。 转化 的细胞， 组织， 或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物， 也包含其转 基因子代。 "非转化的"， "非转基因的"， 或"非重组的"宿主指不含有异源 核酸分子的野生型生物体， 例如细菌或植物。

本文所用的术语"多核苷酸"、 "多核苷酸分子"、 "多核苷酸序列"、 "编码 序列"、 "开放阅读框 (ORF)"等包括单链或双链的 DNA和 RNA分子， 可包含 一个或多个原核序列， cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组 DNA序列， 化学合成的 DNA和 RNA序列， 以及有义和相应的反义链。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷 酸分子的方法是本领域技 术人员已知的， 并可按照已描述的重组技术 (参见 Maniatis 等， 1989, 分子克 隆， 实验室手册, 冷泉港实验室出版社， 冷泉港， 纽约； Ausubel等， 1989, 分子生物学当前技术, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience , NY; Sambrook等， 1989, 分子克隆， 实验室手册, 第 2版， 冷泉港实验室出版社， 冷泉港，纽约； Innis等 (编）， 1995 , PCR策略, Academic Press, Inc. , San Diego; 和 Erlich (编）， 1992, PCR技术， 牛津大学出版社， New York)完成。 植物转化

在特别优选实施方式中， 在高等生物体例如植物中表达至少一种本发 明的赋予盐耐受性的蛋白。 可将本发明核苷酸序列插入到表达盒中， 然后 优选地，表达盒稳定整合在所述植物基因组中 。在另一个优选实施方式中， 核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。 在另一个优选实施方式中， 核苷酸序列包含在农杆菌中。 按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或 双子叶植物， 包括但不限于玉米， 小麦， 大麦， 黑麦， 甘薯， 豆， 豌豆， 菊苣， 莴苣， 甘蓝， 花椰菜， 花茎甘蓝， 芜菁， 萝卜， 菠菜， 芦笋， 洋葱， 大蒜， 胡椒， 芹菜， 笋瓜， 南瓜， 大麻， 夏南瓜， 苹果， 梨， 温椁， 瓜， 李子， 樱桃， 桃子， 油桃， 杏， 草莓， 葡萄， 木莓， 黑莓， 菠萝， 鳄梨， 蕃木瓜， 芒果， 香蕉， 大豆， 番茄， 高粱， 甘蔗， 甜菜， 向日葵， 菜籽油 菜， 三叶草， 烟草， 胡萝卜， 棉花， 苜蓿， 稻， 马铃薯， 茄子， 黄瓜， 拟 南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。 特别优选的是水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 燕麦、 黑麦、 甘蔗、 甜菜、 大豆、 马铃薯。 优选地， 用于本发明的植 物是芸薹科植物。优选地，所述植物是芸薹属 植物， 包括黑芥 CSra c« « gra)、 欧洲油菜 (Sraw ca ""jms")、 ^^. Brassica oleraceae) . 克 (Brassica rapa)、 埃 塞俄比亚齐 (βΓβ β carinata)、 ^-^(Brassica juncea)。 所述植物也可以 芸 薹科的其它植物。

一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物 物种中， 可以在该物种 中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同 物种的其它品种， 特别包括 商业品种中。

优选地， 在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列， 由此在转基因植 物中引起相应的赋予植物耐盐性的蛋白的生物 合成。 以这种方式， 可产生 具有改良性状的转基因植物。 为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序 歹 ¹ J , 本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。 所有生物体都有特定的密码 子使用偏爱性， 这是本领域已知的， 可以在保持本发明所述核苷酸序列编 码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏 爱性。 而且， 从有至少约 35%, 优选多于约 45%, 更优选多于 50%, 最优选多于约 60%GC含量的 编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达 。 尽管可以在单子叶植物和 双子叶植物物种中充分地表达优选的基因序列 ， 但可以修饰序列以适应单 子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏好和 GC含量偏好， 因为这些偏好 已被证明是不同的（Murray等， Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989))。 此外， 可筛选核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常 规剪接位点的存在。 利用公 开专利申请 EP 0 385 962(Monsanto), EP 0 359 472(Lubrizol)和 WO 93/07278(Ciba-Geigy)中所述的方法， 用本领域熟知的位点定向诱变技术， PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需 要进行的所有改变，如上 述那些改变。

在本发明一个实施方式中， 根据这里并入作为参考文献的美国专利 5,625,136中公开的方法可制备合成基因。在该方 法中， 利用了玉米优选的 密码子， 即最常编码玉米中那个氨基酸的单密码子。 特定氨基酸的玉米优 选密码子可以来源于， 例如玉米的已知基因序列。 在 Murray 等， Nucleic Acids Research 17: 477-498 (1989)中教导了玉米植物 28个基因的玉米密码 子使用， 这里并入这篇文献的公开内容为参考文献。

以这种方式可以优化核苷酸序列以便在任何植 物中的表达。 公认基因 序列的所有或任何部分都可以优化或合成。 即， 也可以利用合成或部分优 化的序列。

为了翻译的有效起始，可能需要修饰邻近起始 曱硫氨酸的序列。例如， 通过包含已知在植物中有效的序列可以修饰它 们。 Joshi提出了植物适合的 共有序列（NAR 15: 6643-6653 (1987)), Clonetech提出了进一步的翻译起始 子共有序列（1993/1994 目录， 210页）。 这些共有序列适合与本发明核苷酸 序列一起使用。 向包含所述核苷酸序列， 直到和包含 ATG (同时保持第二 个氨基酸没有被修饰）或可替代地直到和包含 ATG后的 GTC (具有修饰转 基因第二个氨基酸的可能性)的构建物中引入� �序列。

可将作为其天然序列或作为如上所述优化合成 序列的本发明新的 ThLEAl 基因可操作地与在植物中表达的各种启动子， 包括组成型， 诱导 型， 时序调节， 发育调节， 化学调节， 组织优选和组织特异性启动子相融 合以制备重组 DNA分子， 即嵌合基因。 启动子的选择将随着表达时间和 空间需要而变化， 而且也取决于靶物种。 因此， 可以使用在叶， 主茎或茎 杆， 穗， 花序（例如， 穗状花序， 圓锥花序， 穗轴等）， 根， 和 /或幼苗中表 达本发明核苷酸序列。 尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在 单子 叶植物中是可起作用的， 反之亦然， 但是理想地， 选择双子叶植物启动子 用于双子叶植物中的表达， 单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表 达。 然而， 没有限制所选启动子的起源， 只要启动子起作用驱动期望细胞 中核苷酸序列的表达就足够了。

优选的组成型启动子包括 CaMV 35S和 19S启动子 (Fraley等， 1994 年 10月 4日公布的美国专利号 5,352,605)。另外优选的启动子来源于在大 多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因的任 何一种。 可以容易地修饰 McElroy等 (Mol. Gen. Genet. 231 : 150-160 (1991))所述的启动子表达盒以 用于 ThLEAl基 的表达, 该基因表达盒特别适合在单子叶植物宿主中使 用。

另一个优选的组成型启动子来源于泛素， 它是已知在许多细胞类型中 积累的另一种基因产物。 从几种物种， 例如向日葵 (Binet 等， 1991. Plant Science 79: 87-94) , 玉米（Christensen 等， 1989. Plant Molec. Biol. 12 ： 619-632)和拟南芥 (Norris等 1993. Plant Molec. Biol. 21 : 895-906)克隆了泛 素启动子， 可用于转基因植物中。 已发展了转基因单子叶植物系统中的玉 米泛素启动子， 并且在专利公布 EP 0 342 926中公开了其序列和用于单子 叶植物转化的载体。 泛素启动子适合在转基因植物， 特别是单子叶植物中 新直立密穗基因的表达。

除了适合启动子的选择外， 植物中 ThLEAl蛋白表达的构建可以连接 在异源核苷酸序列下游的适合的转录终止子。 可得到几种这种终止子， 并 且它们是本领域已知的（例如来源于 CaMV的 tml, 来源于 rbcS的 E9)。 任 何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可 以用在本发明中。 明增强表达的序列， 如内含子序列（例如来源于 Adhl和 bronzel)和病毒前 导序列（例如来源于 TMV,MCMV和 AMV)。

有可能优选将本发明核苷酸序列的表达靶向到 植物中不同细胞定位。 在一些情况下， 可能期望定位在细胞溶质中， 而在其它情况下， 可能优选 定位在一些亚细胞细胞器中。 转基因所编码的酶的亚细胞定位采用了本领 域熟知的技术。 通常， 操作编码来源于已知靶向细胞器的基因产物的 靶肽 的 DNA, 使之融合到核苷酸序列的上游。 已知用于叶绿体的许多这种靶 序列， 并且已知证明了它们在异源构建中的功能。 本发明核苷酸序列的表 达也可靶向到宿主细胞的内质网或液泡中。 实现上述这些目的的技术是本 领域熟知的。

可用于植物转化的大量转化载体是植物转化领 域技术人员已知的， 并 且本发明的核酸分子可以与任何这种载体联合 使用。 载体的选择将依赖于 用于转化的优选转化技术和靶植物物种。 对于一些靶物种， 可以优选不同 的抗生素或除草剂选择性标记。 通常用在转化中的选择性标记包括赋予对 卡那霉素和相关抗生素抗性的 基因（Messing & Vierra. , 1982. Gene 19: 259-268; 和 Bevan等， 1983. Nature 304: 184-187) , 赋予对除草剂膦丝菌素 抗性的 bar基因，（White等， 1990. Nucl. Acids Res 18: 1062,和 Spencer等， 1990. Theor. Appl. Genet 79: 625-631) , 赋予对抗生素潮霉素抗性的 hph基 @ (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931) , 和赋予对 methatrexate 抗性的 dhfr 基因（Bourouis 等， 1983. EMBO J. 2 (7) ： 1099-1 104) , 赋予对草甘磷抗性的 EPSPS基因（U. S.专利号: 4,940, 935和 5,188, 642) ,和提供代谢甘露糖能力的甘露糖 -6-磷酸异构酶基因（美国专利 号 5, 767, 378和 5,994, 629)。 然而， 选择性标记的选择对本发明不是至关 重要的。

在另一个优选的实施方式中， 将本发明的核苷酸序列直接转化到质体 基因组中。 质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修 饰就能表达细菌 基因， 并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读 框。 在美国专利 5,451 ,513、 5,545,817 和 5,545,818 中， PCT 申请号 WO 95/16783 中和 McBride等， （1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 ,7301 -7305中详尽地描述 了质体转化技术。 叶绿体转化的基本技术包括例如利用生物轰击 或原生质 体转化 (例如氯化钙或 PEG介导的转化)将位于目的基因和选择标记侧� �的 克隆质体 DNA的区域一起弓 1入适合的靶组织中。 1到 1.5kb侧翼区域， 称 为导向序列， 可促进与质体基因组的同源重组， 因此允许原质体系特定区 域的置换或修饰。 最初， 可利用在提供了对壮观霉素和 /或链霉素抗性的叶 绿体 16S rRNA 和 rpsl2 基因的点突变作为转化的选择标记（Svab, Z., Hajdukiewicz, P.,和 Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87,8526- 8530; Staub, J. M"和 Maliga, P. (1992) Plant Cell 4,39-45)。 这以约每 100次 靶叶片轰击 1次的频率产生了稳定的同质转化体。 这些标记间存在的克隆 位点可以用来产生用于导入外源基因的质体靶 向载体（Staub, J. M.，和 Maliga, P. (1993) EMBO J. 12,601-606)。通过用显性选择标记，编码壮观霉 素去毒酶 (spectinomycin-cletoxifying enzyme)氨基糖苷类 -3，-腺苷醜转移酶 的细菌 aadA基因置换隐性 rRNA或 r-蛋白质抗生素抗性基因可获得转化 频率的显著增加（Svab, Z.和 Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,913-917)。 以前， 该标记成功地用于高频率转化绿藻 Chlamyclomonas re " wri¾ 质体基因组 (； Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089)。 其它用于质体转化的选择标记是本领域已知的 ， 并且包含 在本发明范围内。 通常， 转化后需要约 15到 20个细胞分裂周期以达到同 质状态。 通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在 的所有几千个环形 质体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大 大高于核表达基因的优势， 使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白 质的 10%。在优选实施方式 中， 将本发明核苷酸序列插入到质体靶向载体中， 并且转化进入期望的植 物宿主质体基因组中。 获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因 组而 言属同质的植物， 优选地， 该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。

下列实施例只是举例描述本发明， 而不用来限制本发明的范围。 本领 域技术人员明白， 可以使用其他具体实施方案实现本发明的目的 ， 这些具 体实施方案同样包含在本发明的范围内。 实施例 实施例 1. 大规模鉴定和 7¾LE ^基因的分离

使用出芽酿酒酵母菌株 G19 {MATa leu2-3, 2-112, trpl-1, 簡3-3， ade2-l, his3-ll canl-100, 15( ) e 人 · // .'.'e 进行盐耐受基因的大规模鉴定。 G19 菌株是一种盐敏感性酵母菌株， 该菌株中缺失了编码质膜 Na ⁺ 输出泵的基因 ENA1 , 致使 G19酵母菌株与野生型酵母相比对于外部 Na ⁺ 浓度更加敏感。

为了进行盐耐受基因的大规模鉴定， 用 Gal4启动子衍生的 AD融合盐芥 cDNA转化 G19酵母细胞， 并涂布在含有 400 mM NaCl的选择培养基上。 选 出能够在含盐的选择平板上存活的转化体。 在 10 ⁶ 个酵母转化体中， 选择了 超过 100个转化体进行后续盐耐受性确认，并分离出 插入的 cDNA用于测序。 基于与其他物种中同源物进行比较的序列分析 ， 选择存在完整的或几乎完整 的 ORF 的推定盐耐受性候选株的基因以确认它们在植 物中赋予盐耐受的能 力。

选出一个对高盐分展现出可观耐受性的 cDNA克隆。 序列分析显示其含 有的植物 cDNA编码一个 LEA样蛋白。 将该基因命名为 ThLEAl。 ThLEAl cDNA长 701 bp (如 SEQ ID NO:3所示）， 并且具有最长为 483 b 的开放阅 读框（图 1A) (如 SEQ ID ΝΟ: 1所示）。 推定的氨基酸序列由 160个氨基酸组 成， 如 SEQ ID NO:2所示， 分子量大约为 16.3 kDa, 等电点为 9.19。 实施例 2. ThLEAl的异位表达赋予酵母盐耐受性

将全长或基本上全长的 ThLEAl CDS(SEQ ID NO: 1)插入到酿酒酵母 /大 肠杆菌穿梭载体 pGAD GH (Clontech)中并在组成型酵母启动子 ADH1的调控 下， 将这种插入了 SEQ ID NO: l的穿梭载体用于转化酵母 G19细胞。 并将空 载体转入酵母细胞作为对照。 可以用本领域所熟知的各种方法将所述载体转 入酵母细胞中， 例如参见冷泉港实验手册 （Methods In Yeast Genetics A Laboratory Course Manual , 1990年出版， 由 MarkD.Rose等人编写） 39-52页 提供的方法。

在 SD 选择培养基平板 (0.67%不含氨基酸的细菌-酵母用含氮基底 (Bacto-yeast nitrogen base without amino acids)、 2%葡萄糖、 2%细菌用琼月旨 (Bacto-agar)、 0.062%-Lea dropout)上选出转化体并接种到液体 SD选择培养基 (0.67%不含氨基酸的细菌 -酵母用含氮基底、 2%葡萄糖、 0.062%-Lea dropout) 中， 在 30°C下培养， 直到生长至对数期晚期 /静止期。 将饱和培养物液体 SD 选择培养基稀释 io、 100或 1000倍。 将 2微升稀译后的培养物点样至含有 NaCl (300mM、 350mM、 400mM)和不含 NaCl的 SD培养基上， 30°C培养 8 天， 并记录生长情况。

转化后的酵母细胞在盐胁迫条件下具有改进的 存活率 (参见图 3)。 从图 3 中可见， 当培养基中的盐含量对于酵母细胞达到有毒浓 度时， 含有空载体的 对照酵母生长艮差， 而转入了 ThLEAl 的酵母细胞显示了更好的盐耐受性和 更好的生长， 表明 ThLEAl为酵母细胞赋予了盐耐受功能。 实施例 3. ThLEAl对盐胁迫的转录应答

为了研究 ThLEAl在盐条件下的应答， 对小盐芥幼苗进行盐处理并分析 了 TTLL&^基因的转录。

本实施例使用小盐芥山东生态型（Shandong ecotype)(中国科学院遗传与 发育生物学研究所)。 使表面灭菌后的种子在含有 2%蔗糖和 0.8%琼脂的 MS 培养基 (见下表)上 22°C萌发并生长。 将长出 2-4片真叶的幼苗转移至土壤中 培养， 并以 16小时光照期在 24°C下培养。 对五周龄的幼苗施加胁迫处理， 即用 500 mM NaCl (1升）浇灌幼苗， 并在第 0、 1、 4、 8、 12和 24小时 (从浇 盐水的时间开始取样)采样。

MS培养基成

使用 浓 成分

度 (mg/L)

硝酸钾 KN0 ₃ 1900

硝酸铵 NH ₄ N0 ₃ 1650

大量元素

磷酸二氢钾 KH ₂ P0 ₄ 170

硫酸镁 MgS0 ₄ .7H ₂ 0 370

氯化钙 CaCl ₂ .2H ₂ 0 440

碘化钾 KI 0.83

硼酸 H ₃ B0 ₃ 6.2

微量元素

硫酸锰 MnS0 ₄ .4H ₂ 0 22.3

硫酸锌 ZnS0 ₄ .7 H ₂ 0 8.6

钼酸钠 Na2Mo0 ₄ .2 H ₂ 0 0.25 硫酸铜 CuS0 ₄ .5 H ₂ 0 0.025

氯化钴 CoCl ₂ .6 H ₂ 0 0.025

乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠

37.3

铁盐 Na ₂ .EDTA

硫酸亚铁 FeS0 ₄ .7H ₂ 0 27.8

肌醇 100

甘氨酸 2

有机成分 盐酸 ¾胺素 VB1 0.1

盐酸吡哆醇 VB6 0.5

烟酸 VB5或 VPP 0.5

糖 (sucrose) 30g/L

琼脂 (agar) 7 g/L 通过将经过盐处理的小盐芥的叶片和根样品在 液氮中冻干并进行研磨来 分离总 RNA,方法基本如 Soni R和 Murray A， 1994, Isolation of intact DNA and RNA from plant tissue. Anal Biochem 218: 474-476 中所述。 将研磨得到的 1 OOrng植物粉末与 600μ1提取緩冲液 (50mMTris-HCl H 6.0, 10 mM EDTA, 2% SDS, 100 mM LiCl))以及在 65°C加热过的酚 /氯仿 1: 1混合， 涡旋振荡并在 4 °C以 12000rpm离心 15分钟。 将上清液用酚抽提 2次并用等体积的 4 M LiCl 沉淀， 再进行离心（12000rpm, 15min)。 离心之后， 将 RNA沉淀用 50μ1ΤΕ緩 冲液 (10 mM Tris-Cl, pH 7.5. 1 mM EDTA.)重悬。 再次用酚抽提上清液， 并加 入十分之一体积的 3M NaAc和 3倍体积的无水乙醇进行沉淀。离心（12000rpm, 15min) 沉淀 RNA后用 75%乙醇洗涤 RNA沉淀并在 50μ1 TE緩冲液中重悬。

对于 Northern 印迹， 将 15 微克总 RNA 上样至每个泳道中。 使用 Ready-primed标" ^己试剂盒 (Amersham International)^ ThLEAl 全长 CDS 以 [a- ³² P] dCTP标记，使用标记后的片段来进行探测。根� �标准流程在高严格条 件下进行杂交和洗涤。

如图 2中所示， 在 4小时处理后， ThLEAl受到了强烈的诱导。 此外， ThLEAl的转录物在根中的积累超过了地上部分。 这个结果指出 ThLEAl确实 是能够由盐诱导的基因。 实施例 4. ThLEAl在拟南芥中的过表达与拟南芥盐耐受性的 改善 为了确认赋予植物盐耐受性的能力， 将 ThLEAl克隆至经过修饰的二元 载体 pGreen中（参见图 4A),在模式植物拟南芥中进行过表达并进行盐� �受测 定。

为了过表达选出的盐耐受相关性盐芥基因，将 包含 SEQ ID NO: 1的 cDNA 片段从 GAD GH载体中切出，并克隆至带有修饰的 pGreen二元载体 (Hellens RP 等 , 2000 , pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mQdiatQd plant transformation. Plant Mol Biol 42: 819-832)中并 置于 35S双启动子的调控下 (参见图 4A) , 从而在拟南芥中进行过表达。

将这种构建体引入含有 Sou 质粒 (Hellens RP等，见上)的根癌土壤杆菌 {Agrobacterium t mefaciens)EHA 105菌株中。所得细菌用于通过植株真空渗入 法 (Bent AF 和 Clough SJ (1998) Agrobacterium germ-line transformation: transformation of Arabidopsis without tissue culture. In Plant Molecular Biology Manual, 2nd ed, S.B. Gelvin and R. A. Schilperoot, eds (Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers): 1-14)转化野生型拟南芥 (哥伦比亚 生态型）。 并以空载体 pGreen作为对照， 以同样的方法转化野生型拟南芥。

将获得的种子用 10%漂白剂进行表面灭菌， 并用无菌水洗涤 3次。 将无 菌种子悬浮在 0.15%琼脂糖中并铺板到含有 1.5% 糖的 MS培养基上。 为了 选择转基因植物，向培养基中加入 50 mg/mL卡那霉素。将平板叠放在黑暗中， 于 4°C条件下放置 2-4天， 然后移入 24 °C的组织培养室， 以 16小时光照期进 行培养。 将 1周龄的植株转移至盆中， 移入温度和光照条件类似的温室， 直 至形成种子。 为了选择纯合品系，分析 T2代种子在卡那霉素存在下的萌发状 态。 只有分离率约为 3 : 1的 T3植株才被使用。

盐胁迫处理在盆中进行， 用 NaCl溶液浇灌 4周龄的拟南芥植株， 每 4 天一次， 且 NaCl溶液的浓度逐渐增加， 具体为 50mM、 100mM、 150mM、 200mM、 250mM、 250mM, 共六次。 之后为植物拍照。

转化了 ThLEAl 的拟南芥植物与使用空载体作为对照的植物相 比， 在含 盐的平板上生长时或在土壤中生长并用 NaCl处理时，均显示出增强的盐耐受 性 (参见图 4B)。 35S-ThLEAl转基因植物在含盐培养基上的萌发率� �为 46%, 远高于对照品系的约 22%。 在连续的盐处理之后， 35S- 7¾LE^转基因植物 的存活率约为 38%, 而空载体对照植物完全无法存活 (参见图 4C)。 这些结果 表明异位表达 7¾L&^能够改善拟南芥的盐耐受性。