BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft einen Probenbehälter, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist und ein Verfahren zur Herstellung des Probenbehälters. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe.

Die Tieftemperaturkonservierung (Kryokonservierung) von Zellen ist bisher die einzige Möglichkeit, Lebensprozesse auf zellulärer Ebene reversibel (vitalitätserhaltend) so anzuhalten, dass sie nach einer Erwärmung auf physiologische Temperaturen wieder anlaufen können. Die Kryokonservierung hat sich über große Biobanken in den letzten Jahrzehnten zu einem unverzichtbaren Element für Kliniken, Pharmaunternehmen, die Arterhaltung, den Umweltschutz und die Gesundheitsvorsorge entwickelt. Gelagert wird biologisches Material in tieftemperaturverträglichen Probenbehältern (Kryobehältern), z. B. Röhrchen, Straws und Beuteln, unterschiedlicher Größe. Bei der Kryokonservierung sind die gelagerten Biomaterialien unter Aufrechterhaltung der Vitalität des Probenmaterials gefroren, zumeist bei Temperaturen unterhalb -80 °C, für Lebendsammlungen unter -140 °C bis zur Temperatur des flüssigen Stickstoffs. Für eine kryo konservierte Probe oder eine für die Kryokonservierung vorgesehene Probe wird nachfolgend auch der Begriff„Kryoprobe" verwendet.

Für makroskopische Proben, wie z. B. Blut oder Gewebe, sind zahlreiche Techniken zur Probenlagerung bei tiefen Temperaturen entwickelt worden. In der modernen Medizin, Gentechnik und Biologie besteht die Tendenz, zunehmend kleine Proben einer Kryokonservierung zu unterziehen. Es werden beispielsweise kleine Suspensionsvolumina (Milliliter oder darunter) mit suspendierten Zellen oder Zellgruppen eingefroren. Die Kryokon- servierung von Zellen aus In-vitro-Kulturen erfolgt in überwiegendem Maße in einer Suspension. Die meisten der biomedizinisch relevanten Zellen benötigen jedoch zu ihrer Vermehrung und geordneten Entwicklung einen Substratkontakt. Daher werden Proben ggf. nach einer Kultivierung im substratgebundenen Zustand eingefroren.

Die Qualität der Proben ist von ausschlaggebender Bedeutung, da sie für Zelltherapien in Kliniken, die Entwicklung von Pharmaka und biotechnologischen Produkten, als nationale Ressourcen und vieles mehr Anwendung finden. Die Lagerzeit liegt bei einigen Tagen bis zu Jahrzehnten, mit einer Tendenz zur Langzeitlagerung. Die Proben werden in gekühlten Behältern gelagert, befinden sich zumeist in Metalleinschüben und Racks, mit denen sie bei neuen Einlagerungen oder Entnahmen Temperaturschwankungen unterliegen. Bei Lebendablagen (Zellen, Zellsuspensionen und Gewebeteilen) spielt nicht nur die ununterbrochene Kühlkette eine entscheidende Rolle, sondern auch die Vermeidung großer Temperatursprünge in der Tiefkühlphase. Da es bei der Entnahme gar nicht so selten vor- kommt, dass Kryobehälter sich auf Temperaturen von -80 °C bis -20 °C erwärmen, treten, obwohl sie noch gefroren sind, Qualitätsminderungen unerkannt auf, die nicht nur den Wert der Probe mindern, sondern auch bei ihrer Verwendung im klinischen Bereich zu lebensgefährlichen Situationen führen können. Selbst kurzzeitig aufgetauten Proben sieht man im wiedergefrorenen Zustand nicht an, dass sie dem Originalzustand nicht mehr ent- sprechen. Es geht aber vornehmlich nicht nur darum, ein Auftauen der Biomaterialien zu erkennen, sondern das Überschreiten einer Grenztemperatur im Bereich zwischen -140 °C und -20 °C zu dokumentieren. Eine Temperaturkontrolle und -dokumentation für jede Probe ist die Forderung und bislang nur selten - und wenn, dann mit hohem technischen Aufwand - zu erfüllen. Hinzu kommen umfangreiche Laboruntersuchungen nach dem Auf- tauen, die ebenfalls wertvolles Probenmaterial verbrauchen und selbst im Falle inzwischen wertlos gewordener Kryoproben Kosten erzeugen.

Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, einen Probenbehälter für eine kryokonservierte Probe bereitzustellen, der sich zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten bio- logischen Probe eignet. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Probenbehälters anzugeben. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden können und das sich durch eine vereinfachte Verfahrensführung auszeichnet.

Eine weitere Aufgabe ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, um an einem möglichst ein- fachen Marker oder Kennzeichen erkennen zu können, ob eine Kryoprobe sich über eine definierbare Grenztemperatur, und wenn auch nur kurzzeitig, erwärmt hat. Die Grenztemperatur muss im Bereich zwischen -20 °C und -140 °C vor dem Einfrieren festlegbar sein. Dies sollte an jeder einzelnen Kryoprobe und an damit Millionen von Proben rasch und leicht erkennbar möglich sein, darf die Biomaterialien nicht verändern und sollte be- reits im tiefgefrorenen Zustand erfolgen. Wenn möglich, sollte der Zustand der Probe auch im Lagerbehälter erfassbar sein, da jede Aus- und Einlagerung die Gefahr der Probenveränderung einer Vielzahl von Proben im Lagergut mit sich bringt, da in der Regel ganze Racks aufgezogen werden. Die Vorrichtung bzw. das Verfahren sollte leicht handhabbar, tieftemperaturtolerant und einstellbar sein. Es darf nur wenig oder keine Energie verbrauchen und möglichst nur geringste Kosten verursachen, da die Lagerung einer Bioprobe im gekühlten Zustand in ihren Gesamtaufwendungen nur wenige Euros kosten sollte. Diesem Anspruch müssen auch die einsetzbaren Materialien gerecht werden.

Diese Aufgaben werden durch Vorrichtungen und Verfahren mit den Merkmalen der un- abhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.

Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung werden die genannten Aufgaben durch einen Probenbehälter gelöst, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist und der an einem Bereich seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz trägt, deren Schmelztemperatur bei Normaldruck, also bei 1013,25 hPa, in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt. Die Schmelztemperatur kann auch in einem Bereich von -20 °C bis -100 °C liegen. Dadurch wird ein Probenbehälter bereitgestellt, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist. Der Probenbehälter ist ein für eine Kryokonservierung geeigneter Behälter, beispielsweise ein Röhrchen, ein Straw (auch als Samenröhrchen bezeichnet), ein Beutel zur Blut- oder Stammzellenlagerung, eine Box oder ein anderer für eine Kryokonservierung geeigneter Behälter. Derartige Behälter werden entsprechend auch als Kryoröhrchen, Kryostraw, Kryobeutel, Kryobox oder allgemein als Kryobehälter bezeichnet. Der Probenbehälter hat einen Aufnahmeraum zur Aufnahme der biologischen Proben. Der Aufnahmehohlraum kann eine kryokonservierte Probe enthalten.

Kryoröhrchen (engl, cryogenic tubes) werden auch als Biobank- oder Kryobankröhrchen bezeichnet. Kryoröhrchen weisen einen Aufnahmeraum auf, der einen inneren Hohlraum zur Aufnahme einer biologischen Probe ausbildet. Das Kryoröhrchen weist ferner üblicherweise einen Deckel zum Verschließen des Aufnahmeraums auf. Der Deckel kann einen Eingriff aufweisen, über den der Deckel mit einem Werkzeug gedreht werden kann. Das Kryoröhrchen kann auch ein Bodenelement aufweisen, das eine Kennung, z. B. in Form eines maschinenlesbaren Codes, aufweist.

Bei Überschreiten der Schmelztemperatur wird die festgefrorene Indikatorsubstanz flüssig. Daraufhin verändert sich ein Konfigurationszustand der Indikatorsubstanz auf der äußeren Oberfläche des Probenbehälters, z. B. bedingt durch die Schwerkraft und/oder die Oberflächenspannung. Beispielsweise kann die Indikatorsubstanz bei Überschreiten ihres Schmelzpunktes ihre Lage auf dem Probenbehälter und/oder ihre Oberflächenform ändern, was visuell oder durch eine Messeinrichtung festgestellt werden kann. Die Änderung des Konfigurationszustands bleibt auch bei einem Wiedergefrieren der Indikatorsubstanz erhalten. Die an einem Bereich der äußeren Oberfläche des Probenbehälters festge- frorene Indikatorsubstanz weist somit vorzugsweise eine Konfiguration auf, deren Form und/oder Anordnung sich bei Überschreiten einer Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz ändert.

Ein Probenbehälter, der an einem Bereich seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz trägt, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt, kann somit in vorteilhafter Weise zur Temperaturüberwachung einer kryokonser- vierten biologischen Probe verwendet werden. Der erfindungsgemäße Probenbehälter ist ferner kostengünstig herstellbar und beansprucht im Vergleich zu einem herkömmlichen Probenbehälter wenig zusätzlichen Bauraum.

Die Indikatorsubstanz kann somit auf eine Außenfläche eines Probenbehälters direkt auf- gebracht werden. Die Indikatorsubstanz kann ausschließlich durch Festfrieren an einer äußeren Oberfläche des Probenbehälters befestigt sein, d. h., die Indikatorsubstanz ist nicht durch weitere Befestigungselemente, wie ein Zusatzgefäß etc. am Probenbehälter gehaltert. Die Indikatorsubstanz kann freiliegend am Behälter festgefroren sein. Zur besseren Erkennbarkeit kann die Indikatorsubstanz einen Indikatorzusatz enthalten, der eine Detektierbarkeit einer physikalischen Eigenschaft der Indikatorsubstanz erhöht. Der Indikatorzusatz kann beispielsweise ein Farbstoff sein, so dass die Indikatorsubstanz farbig oder gefärbt, d. h. nicht transparent, ist und so deren Form und/oder Lage besser optisch erkennbar ist.

Als Farbstoff kommt grundsätzlich jeder Farbstoff in Frage, welcher mindestens die folgenden Bedingungen erfüllt:

- intensives Färbevermögen auch in kleinen Mengen und Konzentrationen (z. B. ausgehend von einer gesättigten Farblösung Zugabe im Bereich < 1 Volumen-%, in der Regel im Promille- oder Subpromille-Bereich).

- frosttolerant

- lichtecht bei den Versand- als auch den relevanten tiefen Temperaturen

- löslich in allen Bestandteilen der Indikatorsubstanz

- kein Entmischen beim Einfrieren

- keine Reaktion mit Kunststoffmaterialien, welche in Kontakt mit der Indikatorsubstanz kommen.

Vorzugsweise ist der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Triphenylmethan- farbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, insbesondere Xanthene, Azofarbstoffe sowie Phenazin- und Phenothiazinfarbstoffe umfasst. In spezielleren Ausführungsformen ist der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Oil Red, Methylrot, Brillantgrün, Rhodamin B, Neutralrot, Methylenblau oder andere Farbstoffe, die zur Anfärbung von Zellen in der Zytologie verwendet werden, umfasst. Der Indikatorzusatz können Partikel, insbesondere Nanopartikel sein, die eine Streuwirkung und/oder Polarisationswirkung der Indikatorsubstanz für auf die Indikatorsubstanz auftreffende elektromagnetische Strahlung erhöhen. Dadurch kann eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer optischen Transmissionsmessung, Streumessung und/oder Polarisationsmessung zuverlässiger detektiert werden. Der Indikator- zusatz können leitfähige Partikel sein. Durch Beimischen von leitfähigen Partikel kann die Leitfähigkeit oder Impedanz der Indikatorsubstanz beeinflusst werden. Auf diese Weise kann eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer Leitfähigkeitsmessung oder Impendanzmessung detektiert werden. Als Indikatorsubstanz kann eine Substanz ausgewählt werden, deren Schmelztemperatur einer vorbestimmten Grenztemperatur, deren Überschreiten überwacht werden soll, entspricht. Die Indikatorsubstanz ist eine Flüssigkeit oder eine Mischung verschiedener Flüssigkeiten, deren Schmelzpunkt der gewünschten Grenztemperatur entspricht. Lediglich beispielhaft kann als Indikatorsubstanz eine Mischung aus Wasser (H ₂ 0) und Ethanol (C2H6O), eine Mischung aus Wasser (H ₂ 0) und Kaliumhydroxid (KOH) oder eine Mischung aus Wasser und einem Gefrierschutzmittel gewählt werden. Das Mischungsverhältnis wird dabei gemäß dem jeweiligen Schmelzdiagramm, das den Verlauf des Schmelzpunktes in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis angibt, so eingestellt, dass der Schmelzpunkt des Flüssigkeitsgemisches den gewünschten Wert, nämlich die zu überwachende Grenztemperatur, aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorsubstanz mindestens einen Alkohol, welcher aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan- 1,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclo- pentanol, Benzylalkohol umfasst, ausgewählt ist. Besonders bevorzugt ist der mindestens eine Alkohol aus Propan-l,3-diol, Propan-l,2-diol und Butan-2-ol ausgewählt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorsubstanz mindestens zwei verschiedene Alkoholkomponenten:

a) einen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst;

b) einen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst, mit einem niedrigeren Schmelzpunkt als der Alkohol der Komponente a);

wobei das Mischungsverhältnis der Komponenten a) und b) so eingestellt ist, dass die Schmelztemperatur der Mischung innerhalb eines Temperaturbereichs von -20 °C bis -160 °C, insbesondere von -25 °C bis -160 °C oder -50 °C bis -150 °C, liegt.

Speziellere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz eine der folgenden Kombinationen der Komponenten a) und b) umfasst:

- Octan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Octan-l-ol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Octan-l-ol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Nonan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Nonan-l-ol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Nonan-l-ol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Propan-l,2-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Propan-l,2-diol und Propan-l,3-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Propan-l,2-diol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Propan-l,3-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Propan-l,3-diol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Pentan-l,5-diol und' Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Benzylalkohol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Pentan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Pentan-l-ol und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Cyclopentanol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Cyclopentanol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Cyclopentanol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;

- Cyclopentanol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; wobei der angegebene Wert des Mischungsverhältnisses sich jeweils auf den Anteil der erstgenannten Komponente in der Mischung aus beiden Komponenten bezieht.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst diese Indikatormischung beispielsweise Propan-l,2-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 40 bis 60 Vol.-% (ergibt eine Schmelztemperatur von ca. - 90 °C), Propan-l,2-diol und Propan-1,3- diol in einem Mischungsverhältnis von 30 bis 70 Vol.-%, oder Propan-l,3-diol und Butan- 2-ol in einem Mischungsverhältnis von 30 bis 70 Vol.-%.

Vorzugsweise umfasst die Indikatorsubstanz neben dem mindestens einen Alkohol noch mindestens einen Farbstoff wie oben beschrieben. Besonders bevorzugt ist dieser Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Oil Red, Methylrot, Brillantgrün und Rhodamin B umfasst.

Eine noch speziellere Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz zwei Alkohole a) und b), die aus Propan-l,3-diol, Propan-l,2-diol und Butan- 2-ol ausgewählt sind, vorzugsweise in einem Mischungsverhältnis wie oben angegeben, sowie einen Farbstoff, der aus Gruppe ausgewählt ist, welche aus Oil Red, Methylrot, Brillantgrün und Rhodamin B besteht, umfasst.

Die Konzentration des Farbstoffs in der Alkoholkomponente kann je nach Farbstoff und Alkohol stark variieren. In der Regel soll die Konzentration bei intensiver Färbung so niedrig wie möglich gehalten werden, damit die Farbmoleküle das Gefrier- und Schmelzverhalten der Alkohole, in denen sie gelöst werden, nicht verändern oder deren Viskosität erhöhen. Die Farbstoffkonzentration liegt dabei typischerweise in einem Bereich von < 10 Volumen-%, insbesondere < 1 % oder < 0,1 %, also im Prozent- oder Promille- bzw. Subpromillebereich.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung entspricht die zu überwachende Grenztemperatur nicht direkt der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz, sondern vielmehr der- jenigen Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur, bei der die Viskosität der geschmolzenen Substanz soweit abgenommen hat, dass der erforderliche Flüssigkeitstransport stattfinden kann. Diese Temperatur wird hier auch als Schwellentemperatur bezeichnet und liegt typischerweise in einem Temperaturbereich von 3-30 °C oder 5-30°C, beispielsweise 3-10 °C, 3-20 °C, 5-10 °C oder 5-20 °C, oberhalb der nominellen Schmelztemperatur.

In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Indikatorsubstanz daher dadurch gekenn- zeichnet, dass die flüssige Mischung in einem Temperaturbereich von 3-30 °C oder 5-30 °C oberhalb der Schmelztemperatur eine Viskosität in einem Bereich von 10 bis 10 ⁶ mPa*s, vorzugsweise 10 bis 10 ⁴ mPa*s, aufweist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der die festgefrorene Indikatorsub- stanz tragende Bereich eine Beschichtung, Aufrauung und/oder eine Strukturierung auf. Beispielsweise kann der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine haftverstärkende Strukturbeschichtung aufweisen. Dadurch wird die Haftung der festgefrorenen Indikatorsubstanz verbessert. Gemäß einem weiteren Aspekt kann der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine Verspiegelung aufweisen. Gemäß dieser Variante ist die Indikatorsubstanz somit auf einem verspiegelten Bereich der äußeren Wandung des Probenbehälters festgefroren. Bei dieser Ausführungsform ist eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer Messeinrichtung oder rein visuell besonders zuverlässig zu erfassen.

Gemäß einem weiteren Aspekt kann der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine Elektrodenanordnung aufweisen. Die Elektrodenanordnung kann beispielsweise als Gold- oder Platinelektroden ausgeführt sein. Gemäß dieser Variante ist die Indikatorsubstanz somit auf der Elektrodenanordnung festgefroren, insbesondere derart, dass ein über die Elektrodenanordnung messbarer Widerstand oder eine Impedanz davon abhängt, ob die Indikatorsubstanz sich auf der Elektrodenanordnung befindet oder nicht. So kann anhand des gemessenen Widerstands bestimmt werden, ob sich die Indika- torsubstanz noch im ursprünglich angebrachten festgefrorenen Zustand auf der Elektrodenanordnung befindet ober ob die Indikatorsubstanz bei Überschreiten ihres Schmelzpunktes durch das Flüssigwerden aus dem Bereich der Elektrodenanordnung herausgeflossen ist.

Zusätzlich zum Probenbehälter kann ferner eine Messeinrichtung vorgesehen sein, die ausgebildet ist, den Widerstand bzw. die Impedanz der Elektrodenanordnung zu erfassen.

Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Indikatorsubstanz in einer vorbestimmten Anord- nung auf die äußere Oberfläche des Probenbehälters aufgebracht ist. Die an einem Bereich der äußeren Oberfläche des Probenbehälters festgefrorene Indikatorsubstanz kann somit eine bestimmte Anordnung aufweisen, die sich bei Überschreiten einer Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz ändert, z. B. unter dem Einfluss der Schwerkraft. Die Anordnung kann eine Zahl, ein Buchstabe, ein Symbol, eine Kennung und/oder eine ande- re Struktur darstellen, die für einen Nutzer visuell leicht erkennbar ist. Ist die Anordnung nach einer Kryolagerung noch unverändert erkennbar, wurde die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz bei der Kryolagerung nicht überschritten. Hat sich die Anordnung verändert oder ist verschwunden, kann daran festgestellt werden, dass die Schmelztemperatur und damit eine kritische Grenztemperatur überschritten wurde. Ein Nutzer kann somit auf einfache Weise durch eine visuelle Sichtprüfung feststellen, ob ein unerwünschter Temperaturanstieg über die Schmelztemperatur bzw. über die zu überwachende Grenztemperatur stattgefunden hat.

Gemäß einem weiteren Aspekt kann die auf der äußeren Oberfläche aufgebrachte Indika- torsubstanz durch festgefrorene Tropfen der Indikatorsubstanz erhalten sein. Dies ermöglicht eine genaue Dosierbarkeit der aufzubringenden Indikatorsubstanz und eine präzise Anordnung der Indikatorsubstanz, z. B. unter Verwendung einer Tropfenschussvorrichtung. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können mehrere unterschiedliche Indikatorsubstanzen, deren unterschiedliche Schmelztemperaturen jeweils in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegen, an verschiedenen Bereichen der äußeren Oberfläche des Probenbehälters aufgebracht sein. Dies bietet den Vorteil, dass mehrere Temperaturgrenzwerte bei der Kryolagerung überwacht werden können bzw. dass die erreichten Temperaturintervalle, in die die Probe gelangt ist, genauer eingegrenzt werden können. Bei einer vorteilhaften Variante dieser Ausgestaltungsform ist der Probenbehälter ein Kryoröhrchen, und mehrere verschiedene Indikatorsubstanzen, die sich in ihren Schmelztemperaturen unterscheiden, sind jeweils in Form von aneinander gereihten festgefrorenen Tropfen auf einen Aufnahmezylinder des Kryoröhrchens aufgebracht. Die verschiedenen Indikatorsubstanzen können insbesondere jeweils in Form von bandförmig, bei- spielsweise ringförmig, aneinander gereihten festgefrorenen Tropfen auf der Außenfläche des Aufnahmezylinders des Kryoröhrchens angeordnet sein, wobei die verschiedenen Indikatorsubstanzen in Axialrichtung des Kryoröhrchens versetzt zueinander angeordnet sind. Diese Anordnung ist visuell einfach auf Änderungen zu überprüfen. Die Axialrichtung entspricht der Längsrichtung des Kryoröhrchens.

Beispielsweise kann die Indikatorsubstanz in Axialrichtung umso tiefer oder höher angeordnet sein, je niedriger ihr Schmelzpunkt im Vergleich zu den Schmelzpunkten der anderen Indikatorsubstanzen ist. Mit anderen Worten können die verschiedenen Indikatorsubstanzen nach ihren Schmelztemperaturen in absteigender oder aufsteigender Reihenfolge sortiert in Axialrichtung angeordnet sein. Dies ermöglicht eine visuell besonders einfach durchzuführende Eingrenzung der Temperaturintervalle, in die die im Probenbehälter gelagerter Probe gelangt ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die festgefrorene Indika- torsubstanz zumindest an einem Teilbereich ihrer Oberfläche ein Muster und/oder eine Oberflächenstruktur aufweisen, beispielsweise ein eingeformtes oder eingeprägtes Muster. Ein Muster oder eine Oberflächenstruktur verschwindet oder verändert sich zumindest beim Flüssigwerden der Indikatorsubstanz, so dass anhand des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins des Musters überprüft werden kann, ob die Schmelztemperatur zumindest zeitweise überschritten wurde. Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform kann auf dem Muster und/oder der Oberflächenstruktur eine transparente oder semi-transparente

Schutzabdeckung angeordnet sein. Dadurch kann das Muster vor externer mechanischer Beschädigung geschützt werden.

Beispielsweise kann das Muster oder die Oberflächenstruktur ein eingeprägtes Muster sein. Ein eingeprägtes Muster kann beispielsweise erhalten sein durch eine Formgebung der Indikatorsubstanz in flüssigem Aggregatszustand in einer Form und durch nachfolgendes Gefrieren der geformten Indikatorsubstanz.

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitgestellt, umfassend einen erfindungsgemäßen Probenbehälter, wie in diesem Dokument beschrieben, sowie eine Messeinrichtung, die ausgebildet ist, eine Konfigurationsänderung, insbesondere eine Änderung der Form, Anordnung und/oder Lage, der festgefrorenen Indikatorsubstanz zu erfassen.

Die Messeinrichtung kann je nach Ausführungsform zweckmäßig ausgeführt sein. Bei der Ausführungsform, bei der der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine Elektrodenanordnung aufweist, kann die Messeinrichtung ausgebildet sein, einen Widerstand oder eine Impedanz der Elektrodenanordnung zu messen, wie vorstehend bereits beschrieben wurde.

Bei der Ausführungsform, bei der der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Be- reich eine Verspiegelung aufweist, kann die Messeinrichtung beispielsweise ausgebildet sein, einen Messstrahl, z. B. einen elektromagnetischen Strahl, auf die auf der Verspiegelung festgefrorene Indikatorsubstanz zu richten und einen reflektierten Messstrahl zu erfassen, falls dieser reflektiert wird. Bei Überschreiten der Indikatorsubstanz wird diese im flüssigen Aggregatszustand am Probenbehälter herunterfließen, so dass der Mess- strahl jetzt direkt auf die verspiegelte Fläche trifft, die zuvor noch von der festgefrorenen Indikatorsubstanz verdeckt war. Der Messstrahl wird nun an der verspiegelten Fläche reflektiert, was von der Messeinrichtung detektiert werden kann. Sobald die Messeinrich- tung somit einen reflektierten Messstrahl detektiert, kann auf eine zumindest kurzzeitige Überschreitung der Schmelztemperatur geschlossen werden. Bei der Ausführungsform, bei der der die festgefrorene Indikatorsubstanz ein Muster oder eine Oberflächenstruktur aufweist, kann die Messeinrichtung beispielsweise ausgebildet sein, optisch zu erfassen, ob das Muster oder die Oberflächenstruktur noch vorhanden ist oder nicht. In analoger Weise kann die Messeinrichtung beispielsweise ausgebildet sein, zu erfassen, ob die Anordnung der Indikatorsubstanz noch vorhanden ist oder nicht, etc.

Mit dem Begriff Probenbehälter wird insbesondere ein für eine Kryokonservierung ausge- legter Behälter bezeichnet. Der Probenbehälter ist vorzugsweise unter Verwendung tief- temperaturverträglichen Kunststoffmaterials für Temperaturen unter -140 °C hergestellt. Das Kunststoffmaterial kann ohne Veränderung und ohne Schaden wiederholte Temperaturwechsel tolerieren. Es wird vorzugsweise ein Kunststoffmaterial verwendet, dessen Wasseraufnahmefähigkeit < 1 % der Eigenmasse, insbesondere < 0.1 % der Eigenmasse beträgt. Erfindungsgemäße Kryospeicherelemente basieren beispielsweise auf Polyurethan oder Polyethylen.

Mit dem Begriff„biologische Probe" wird biologisches Material wie Zellen, Gewebe, Zellbestandteile, biologische Makromoleküle etc. bezeichnet, welches im Probenbehälter der Kryokonservierung unterzogen wird - ggf. in einer Suspension und/oder im Verbund mit einem Substratmaterial. Im Aufnahmeraum kann somit ein Substrat angeordnet sein, das zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen, die Teil der biologischen Probe sind, eingerichtet ist. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Probenbehälters, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen eines Probenbehälters, der zur Aufnahme einer biologischen Probe ausgelegt ist. Der Probenbehälter ist vorzugsweise ein Kryoprobenbehälter.

Das Verfahren umfasst ferner das Aufbringen einer Indikatorsubstanz, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt, an einem Bereich der äußeren Oberfläche des Probenbehälters im flüssigen Aggregatszustand sowie das Gefrieren der aufgebrachten Indikatorsubstanz.

Gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird vor dem Aufbringen der Indikatorsubstanz im flüssigen Aggregatszustand der Probenbehälter auf eine Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz gekühlt. Dadurch kann ein schnelles Festfrieren der ausgebrachten Indikatorsubstanz erzielt werden.

Beispielsweise kann die Indikatorsubstanz im flüssigen Aggregatszustand tropfenförmig mittels einer Tropfendepositionsvorrichtung, z. B. einer Tropfenschussvorrichtung, auf die äußere Oberfläche des tiefgekühlten Probenbehälters aufgebracht werden. Tropfenschussvorrichtungen, z. B. ausgeführt als Piezo-Druckdüse oder Piezo-Druckkopf, sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und hier nicht näher beschrieben. Gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel des Verfahrens erfolgen das Aufbringen der flüssigen Indikatorsubstanz und das anschließende Gefrieren gemäß der folgenden Schritte:

Zunächst erfolgt ein teilweises Eintauchen des Probenbehälters in einen mit einer Indikatorsubstanz im flüssigen Aggregatszustand gefüllten Behälter, so dass an einer Stelle die Indikatorsubstanz an einer Außenseite des Probenbehälters anhaftet. Anschließend erfolgt ein Positionieren des Probenbehälters an einer Hohlform, derart, dass die am Probenbehälter anhaftende Indikatorsubstanz eine Prägung im Innenraum der Hohlform ausfüllt. Nachdem die Indikatorsubstanz in der Hohlform gefroren wurde, wird die Hohlform von der am Probenbehälter festgefrorenen Indikatorsubstanz entfernt. Hierdurch wird die durch die Hohlform in eine Oberfläche der Indikatorsubstanz eingebrachte Prägung freigelegt.

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen eines Probenbehälters, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologische Probe ausgelegt ist und der an einem Bereich seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz trägt, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt. Der Probenbehälter kann ferner gemäß den in diesem Dokument beschriebenen Ausführungsformen und Varianten ausgeführt sein. Zur Vermeidung von Wiederholungen sollen rein vorrichtungsgemäß offenbarte Merkmale auch als verfahrensgemäß offenbart gelten und beanspruchbar sein. Der Probenbehälter kann eine kryokonservierte biologische Probe in seinem Aufnahmeraum aufweisen. Der Probenbehälter kann bei Lagertemperatur unterhalb der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz gelagert werden, zur kryokonservierten Lagerung der biologischen Probe.

Das Verfahren umfasst ferner das Feststellen, ob eine durch ein zeitweises Überschreiten der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz erfolgte Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz stattgefunden hat, insbesondere ob eine Änderung der Form oder Anordnung, insbesondere Lage, der Indikatorsubstanz stattgefunden hat. An dieser Veränderung kann sofort durch Anschauen oder auch technisch automatisiert festgestellt werden, ob die zu überwachende Grenztemperatur überschritten wurde.

Die zuvor beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung sind miteinander kombinierbar. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen: FIG. 1-4 schematische Ansichten verschiedener Ausführungsbeispiele eines Probenbehälters, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist;

FIG. 5A, 5B, 6A jeweils ein Schmelzdiagramm eines Flüssigkeitsgemisches;

FIG. 6B eine Tabelle mit Schmelzpunkten einiger reiner Flüssigkeiten; und

FIG. 7 eine Mischbarkeitsmatrix von Lösemitteln. Gleiche oder funktional äquivalente Elemente sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen bezeichnet und werden zum Teil nicht gesondert beschrieben. Die Figur 1A zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines Probenbehälters 10, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist. Die Figur 1A illustriert ferner stark schematisiert die Herstellung eines solchen Probenbehälters 10.

Der Probenbehälter 10 ist ein Kryoröhrchen, das in Figur 1A im komplett zugeschraubten Zustand dargestellt ist. Das Kryoröhrchen umfasst ein zylindrisches Aufnahmeteil 1, das einen Aufnahmeraum 2 ausbildet, in dem eine biologische Probe (Bioprobe) 6 gelagert ist Die biologische Probe kann eine Zellsuspension sein. Das zylindrische Aufnahmeteil 1 ist mit einem Deckel 3 verschlossen. Das Kryoröhrchen weist ferner ein Bodenteil 4 auf.

Der Probenbehälter 10 befindet sich in Figur 1A bereits auf der Lagertemperatur, z. B. bei -140 °C, mindestens aber unterhalb des Schmelzpunktes der Indikatorsubstanz 8. Das Kryoröhrchen trägt an einem Bereich 11 seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz 12, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt.

Hierbei ist je nach Temperaturgrenzwert, der bei der Kryolagerung überwacht werden soll, eine geeignete Flüssigkeit oder ein Flüssigkeitsgemisch als Indikatorsubstanz 12 aus- zuwählen.

Über die Auswahl geeigneter Flüssigkeiten und das Mischungsverhältnis von Flüssigkeiten kann deren Schmelzpunkt auf einen gewünschten Wert, insbesondere in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C, festgelegt werden.

Beispielhaft ist in Figur 5A der Verlauf des Schmelzpunktes als Funktion des Mischungsverhältnisses aus einem Alkohol und Wasser angegeben, mit dem bei moderater Viskositätserhöhung mit abfallender Temperatur ein Temperaturbereich zwischen 0 °C und -118 °C abgedeckt werden kann. Soll z. B. ein Temperaturgrenzwert von -118 °C überwacht werden, kann der Ethanolanteil auf 93,5 % festgelegt werden. Schmelzpunkte bis zu einem Wert von knapp unter -60 °C können auch durch Zumischung von Kaliumhydroxid (KOH) zu Wasser eingestellt werden, was in Figur 5B anhand eines Schmelzdiagramms gezeigt ist. Auch eine Mischung aus Wasser und Gefrierschutzmittel kann als Indikatorsubstanz verwendet werden, was durch das Schmelzdiagramm der Figur 6A illustriert ist. Die Tabelle der Figur 6B führt Gefrierpunkte/Schmelzpunkte weiterer reiner Flüssigkeiten auf, die alleine oder als Mischung mit einer anderen Flüssigkeit als Indikatorsub- stanz verwendet werden können. Weitere als Indikatorsubstanz geeignete Flüssigkeitsgemische sind Chloroform-Zyklohexan-Gemische oder andere mischbare Flüssigkeiten, die z. B. aus der Mischbarkeitsmatrix von Lösemitteln der Figur 7 entnommen werden können. Falls mehrere Temperaturgrenzwerte bei der Kryolagerung überwacht werden sollen bzw. falls die erreichten Temperaturintervalle, in die die Probe gelangt ist, genauer eingegrenzt werden sollen, können entsprechend mehrere verschiedene Indikatorsubstanzen mit verschiedenen Schmelzpunkten verwendet werden, was nachfolgend noch anhand von Figur 2 beschrieben wird.

Der Bereich 11 des in Figur 1A gezeigten Kryoröhrchens trägt die Indikatorsubstanz 12 in Form von in der Axialrichtung A (dargestellt durch den vertikalen Pfeil in Figur 1) reihen- förmig angeordneten festgefrorenen Tropfen 13. Die Tropfen 13 der Indikatorsubstanz 12 werden dabei wie folgt auf das Kryoröhrchen aufgebracht: Auf die kalte Oberfläche des Bereichs 11 des Kryoröhrchens wird über eine Tropfenschussvorrichtung 7 die warme oder vorgekühlte Indikatorsubstanz 8 im flüssigen Aggregatszustand tropfenweise aufgeschossen, z. B. über Piezo-Druckdüsen. Die Tropfen 8 gefrieren auf der tiefkalten Oberfläche, wie in Figur 1A durch die Bezugszeichen 13 dar- gestellt.

Zur Verbesserung der Haftung kann der Oberflächenbereich 11, der zur Halterung der Indikatorsubstanz vorgesehen ist, in seinen Eigenschaften so verändert werden, dass eine gute Benetzung und Haftung der Tropfen erfolgt, z. B. durch Aufrauen des Bereichs 11 und/oder durch Aufbringen einer Struktur oder chemischen Beschichtung auf den Bereich

11. Die Tropfen 13 erstarren auf der Oberfläche, wie in Figur 1A gezeigt. Überschreitet die Kryoprobe bei der Lagerung zu irgendeinem Zeitpunkt die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 8, dann verflüssigen sich die gefrorenen Tropfen 13 und fließen vollständig oder partiell zusammen. Es ergibt sich dann ein Bild, das in etwa so aussieht wie in Figur 1B dargestellt.

Befindet sich die Indikatorsubstanz 12 nach einer Kryolagerung nicht mehr in dem in Figur 1A gezeigten Zustand, sondern in einem Zustand, bei dem die Tropfen zumindest teilweise zusammengeflossen sind wie in Figur 1B schematisch illustriert, dann kann daraus ge- schlössen werden, dass die Schmelztemperatur und damit eine kritische Grenztemperatur überschritten wurde. Wird dagegen nach einer Kryolagerung eine unveränderte Anordnung der Indikatorsubstanz vorgefunden, ist die Probe 6 ordnungsgemäß durchgehend unterhalb der Schmelztemperatur gelagert worden. Ein Nutzer kann somit auf einfache Weise durch eine visuelle Sichtprüfung feststellen, ob ein unerwünschter Temperaturanstieg über die Schmelztemperatur bzw. über die zu überwachende Grenztemperatur stattgefunden hat.

Über die Möglichkeit, mit Piezo-Systemen sehr feine Tropfensysteme zu verschießen, las- sen sich auf der Oberfläche des Probenbehälters auch größere Tropfenareale oder auch

Buchstaben, Muster und rasch erkennbare Strukturen bis hin zu Barcodes und anderen Kennungen erzeugen. Diese Strukturen gehen verloren, wenn die kritische Temperatur der Indikatorsubstanz überschritten wird. Beispielhafte Anordnungen sind in Figur IC und Figur 1D dargestellt.

Figur IC zeigt einen Probenbehälter 10a, der an einem Bereich 11 seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz 12a trägt, die aus einem größeren Tropfenareal und/oder mehreren regelmäßig übereinander und nebeneinander angeordneten gefrorenen Tropfen 13a aus Indikatorsubstanz gebildet ist. Figur 1D zeigt einen Proben- behälter 10a, der an einem Bereich 11 seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz 12b trägt, die in Form eines Buchstabens aufgebracht ist. Geht die Anord- nung der Indikatorsubstanz 12a oder 12b bei der Kryolagerung verloren, kann wiederum auf ein zumindest zeitweises Überschreiten der Schmelztemperatur geschlossen werden.

Die Figur 2A zeigt erneut ein auf der Lagertemperatur befindliches Kryoröhrchen 20 und eine Tröpfchenschussvorrichtung 7.

Ringförmig werden in diesem Beispiel, wie in Figur 1A gezeigt, eine Reihe von Indikatorsubstanztropfen 8 bandförmig auf einen Bereich 21 der äußeren tiefkalten Oberfläche des Kryoröhrchens 1 gebracht, wo sie festfrieren.

In dem Ausführungsbeispiel der Figur 2 werden verschiedene Indikatorsubstanzen 23a, 23b und 23c, deren Schmelztemperaturen unterschiedlich sind, verwendet. Lediglich beispielhaft kann die Indikatorsubstanz 23a eine Schmelztemperatur von -60 °C, die Indikatorsubstanz 23b eine Schmelztemperatur von -70 °C und die Indikatorsubstanz 23c eine Schmelztemperatur von -80 °C aufweisen. Bringt man die verschiedenen Indikatorsubstanzen so wie in Figur 2A gezeigt auf das Kryoröhrchen auf, wobei ihre Schmelztemperaturen von oben nach unten abnehmen, so lässt sich ebenfalls bei Überschreiten einer oder mehrerer Schmelztemperaturen an der Struktur erkennen, dass eine unstatthafte Temperaturerhöhung stattgefunden hat.

In Figur 2B ist beispielhaft der Fall dargestellt, dass lediglich die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 23a (oberer Tropfenring in Figur 2A) überschritten wurde, so dass nur der obere Tropfenring in Figur 2B nach unten geflossen ist, was wiederum sehr leicht von außen detektiert werden kann und die Bioprobe im Inneren nicht kontaminiert.

Figur 3A zeigt in der linken Teilfigur ein Kryoröhrchen analog zu den Figuren 1 und 2, bei dem sich an dem Bereich 31 der äußeren Oberfläche, auf den die Indikatorsubstanz 32 aufgebracht wird, noch eine Elektrodenanordnung 33, 34 befindet, z. B. in Form miniaturisierter Gold- oder Platinelektro-den.

Wird die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 32 überschritten, fließt diese aus dem Elektrodenbereich heraus, wodurch sich der Widerstand bzw. die Impedanz ändert, was durch Abtasten der Elektroden 33, 34 detektiert werden kann. Ein Zustand des Kryoröhrchens 30, bei dem die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 32 überschritten wurde, ist in der rechten Teilfigur in Figur 3A gezeigt. In der Darstellung 3B ist eine Ausführung des Kryoröhrchens 30a gezeigt, bei der auf sich auf zwei Bereichen 31 der äußeren Oberfläche des Kryoröhrchens jeweils eine verspiegelte Fläche 35a, 35b befindet, auf die die Indikatorsubstanz 32a, 32b aufgebracht wird. Optisch, visuell oder über einen Messstrahl 100 kann festgestellt werden, ob sich die Indikatorsubstanz 32a, 32b noch auf diesen ursprünglichen Positionsfeldern auf der verspiegel- ten Fläche 35a, 35b befindet. Ist dies der Fall, ist die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz nicht überschritten worden. In der rechten Teilfigur der Figur 3B ist dagegen ein Zustand gezeigt, bei dem die Indikatorsubstanz 32a, 32b durch Schmelzen und Abfließen diesen Bereich verlassen hat. Hier kann somit auf eine zwischenzeitlich erfolgte Überschreitung der Schmelztemperatur und damit der zu überwachenden Grenztemperatur geschlossen werden.

Ferner können unterschiedliche Indikatorsubstanzen gewählt werden, so dass die Indikatorsubstanz 32a auf der ersten verspiegelten Fläche 35a eine Schmelztemperatur aufweist, die einem ersten zu überwachenden Temperaturgrenzwert entspricht und dass die Indikatorsubstanz 32b auf der zweiten verspiegelten Fläche 35b eine Schmelztemperatur aufweist, die einem zweiten zu überwachenden Temperaturgrenzwert entspricht.

Figur 4 illustriert schematisch in der zeitlichen Abfolge der Figuren 4A, 4B, 4C, und 4D die Herstellung eines weiteren Kryoröhrchens 40, das für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist.

In Figur 4A ist ein Probenbehälter in Form eines typischen verschlossenen Kryoröhrchens (Tube) 1, wie es in Kryobiobanken verwendet wird, in einer Schnittansicht gezeigt. Es um- fasst in der Regel ein Aufnahmevolumen 2 für die Bioprobe, in dem sich die Biomaterialien befinden. Die Bioprobe ist z. B. hier eine Zellsuspension 6. Das Kryoröhrchen umfasst ferner einen Deckel 3, der das Gefäß verschließt und oben einen Eingriff 4 besitzt, über den der Deckel 3 mit einem Werkzeug (nicht gezeigt) im Fall der Automatisierung gedreht werden kann. Diese Kryoröhrchen 1 können auch einen Boden 4 enthalten, in den optio- nal ein Barcodeviereck oder eine andere Kennung eingefügt ist. In dieser Form, zumeist senkrecht in Aufnahmen stehend, werden die Kryoröhrchen 1 in den Tieftemperaturbehältern gelagert. Das Kryoröhrchen kann sich bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und kurz oberhalb des Schmelzpunktes der Indikatorsubstanz 42 befinden. Diese liegt in flüssiger Form in einem Behälter 46 vor, in den der Boden 4 des Kryoröhrchens, wie in Figur 4B gezeigt, getaucht wird. Dadurch haftet ein Teil 42a der Indikatorsubstanz 42 in flüssiger Form am Boden 4 an. Das Kryoröhrchen mit der Indikatorsubstanzmenge 42a wird nun in eine strukturierte Form 44 gedrückt und auf Lagertemperatur gebracht. Dadurch nimmt die Indikatorsubstanz 42b die Oberflächenstruktur und Prägung 45 des Innenraums der Form 44 in inverser Weise an.

Das in Figur 4C gezeigten Kryoröhrchen 40 trägt somit an seiner Unterseite eine festgefrorene Indikatorsubstanz, die an einem Teilbereich ihrer Oberfläche ein eingeprägtes Muster 43 oder eine Oberflächenstruktur aufweist. Zum Schutz während der weiteren Lagerung wird diese erstarrte Struktur mit einer Kappe 47 bedeckt, die z. B. optisch- transparent ausgeführt werden kann, so dass eine automatische Identifizierung der Struktur über ein Kamerasystem oder einen optischen Messstrahl 101 kontrolliert werden kann.

Gehen das in die Indikatorsubstanz 42b eingeprägte Muster 43 oder die eingebrachte Struktur verloren oder verändern sich, ist die Kryoprobe wieder zu irgendeinem Zeitpunkt über die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 42b gebracht worden. Das Kryoröhrchen 40 ist somit zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt. Nachfolgend kann mittels der festgefrorenen Indikatorsubstanz 42b zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Lagervorgangs überprüft werden, ob eine unerwünschte, wenn auch nur zeitweise Erwärmung der Kryoprobe stattgefunden hat. Hierzu wird geprüft, ob das in die Indikatorsubstanz 42b eingeprägte Muster 43 verloren gegangen ist oder sich verändert hat. Ist dies der Fall, kann auf ein Überschreiten der zu überwachenden Grenz- temperatur(en) geschlossen werden.

Erzeugt man eine Struktur, in der ein fließender oder gruppenweiser Übergang von sehr feinen zu gröberen Strukturelementen realisiert wird, so kann über die Veränderungen der Struktur auch ein sehr kurzzeitiges Überschreiten des Schmelzpunktes erkannt werden. Die geometrisch kleinsten und feinsten Strukturen verändern sich zuerst.

Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsbeispiele beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen ausgeführt werden können und Äquivalente als Ersatz verwendet werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen. Folglich soll die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsbeispiele begrenzt sein, sondern soll alle Ausführungsbeispiele umfassen, die in den Bereich der beigefügten Patentansprüche fallen. Insbesondere beansprucht die Erfindung auch Schutz für den Gegenstand und die Merkmale der Unteransprüche unabhängig von den in Bezug genommenen Ansprüchen.