Probenhaiterung für ein Mikroskop

Die Erfindung betrifft eine Probenhalterung für ein Mikroskop. Eine solche Probenhalterung umfaßt eine mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllte Probenkammer, in der sich eine Probe befindet, wobei die Probenkammer eine obere öffnung aufweist. Die Probenhalterung umfaßt weiter Mittel zur Translation der Probe relativ zu einem Detektionsobjektiv des Mikroskops, sowie Mittel zur Rotation der Probe um eine Rotationsachse, die in einer im wesentlichen horizontalen Ebene liegt, die mit der optischen Achse des Detektionsob- jektivs einen von Null verschiedenen Winkel einschließt.

Die erfindungsgemäße Probenhalterung ist insbesondere im Zusammenhang mit der Single-Plane-Illumina tion-Mikroskopie (SPIM) , auch als Selective-Plane-Illumination-Mikroskopie bezeichnet, anwendbar. Während mit der konfokalen Laser- Scanning-Mikroskopie die Probe in mehreren unterschiedlich tiefen Ebenen Punkt für Punkt abgetastet wird und daraus dreidimensionale Bildinformationen der Probe gewonnen werden, so beruht die SPIM-Technologie auf der Weitfeldmikroskopie und ermöglicht die dreidimensionale bildliche Darstellung von Proben auf der Grundlage von optischen Schnitten durch verschiedene Ebenen der Probe.

Dabei bestehen die Vorteile der SPIM-Technologie unter anderem in der größeren Geschwindigkeit, mit der die Bilderfassung erfolgt, einem geringeren Ausbleichen von biologischen Proben sowie einer erweiterten Eindringtiefe des Fokus in die Probe.

Prinzipiell werden bei der SPIM-Technologie Fluorophore, die in der Probe enthalten oder in die Probe eingebracht

sind, mit Laserlicht angeregt, das zu einem sogenannten Lichtblatt geformt ist bzw. auf eine Weise über die Probe geführt wird, daß sich effektiv, d.h. über den Zeitraum der Beobachtung, die Form eines Lichtblatts ergibt. Dabei wird mit jeweils einem Lichtblatt eine Ebene in der Tiefe der Probe beleuchtet, mittels dieser Beleuchtung wird ein Bild der Probe in dieser Ebene gewonnen. Wesentlich ist, dass Elemente in der Lichtblattebene auf die Detektorebene abgebildet werden, bzw. dass Lichtblatt- und Detektorebene zueinander konjugiert sind. In herkömmlichen Mikroskopaufbauten, in denen die Detektorebene senkrecht zur optischen Achse des Detektionsstrahlengangs steht, steht die Richtung, in der Licht detektiert wird, senkrecht oder zumindest nahezu senkrecht auf der Ebene, in der beleuchtet wird.

Die SPIM-Technologie ist beispielsweise beschrieben in Stelzer et al., Optics Letter 31,1477 (2006), in Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004), in der DE 102 57 423 Al und in der WO 2004/0530558 Al.

Aus diesen Veröffentlichungen ist u.a. ein Probenhalter bekannt, der ein optimales Ausrichten der Probe im Hinblick auf die Gewinnung von dreidimensionalen Bilddaten aus verschiedenen Blickrichtungen ermöglicht. Dazu wird die Probe in ein Gel, welches zu einem Kreiszylinder geformt wurde, eingebettet und dieser Gelzylinder in eine mit einem Immersionsmedium, beispielsweise Wasser, gefüllte Probenkammer eingebracht. Dabei darf sich der Brechungsindex des Gels nicht wesentlich vom Brechungsindex des umgebenden Immersionsmediums unterscheiden.

Der Gelzylinder, der die Probe umschließt, wird so in der Probenkammer positioniert, daß seine Rotationsachse in der Schwerkraftrichtung verläuft, was im Hinblick auf die Verformbarkeit des Gels Vorteile bei der Positionierung der Probe hat. Er wird so gelagert, daß er für die Bildaufnahmen innerhalb der Probenkämmer translatorisch verschoben und optional auch um seine Rotationsachse gedreht werden kann.

Die optische Achse des Detektionsobjektivs, welches das von der Probe kommende Detektionslicht aufsammelt, ist dabei annähernd senkrecht zur Rotationsachse des Gelzylinders ausgerichtet und verläuft dadurch nicht wie beim klassischen Mikroskopaufbau vertikal, sondern horizontal, d.h. senkrecht zur Richtung der Schwerkraft.

Für Bildaufnahmen, die mit großem Abbildungsmaßstab und großer numerischer Apertur gewonnen werden sollen, ist in der Regel die Verwendung von Detektionsobjektiven vorgesehen, die als Tauch- bzw. Immersionsobjektive ausgeführt sind. Dabei ragen die Tauchobjektive durch eine Wand der Probenkammer in die Probenkammer hinein und sind, um das Auslaufen des Immersionsmediums an der Stelle der Objektivdurchführung zu verhindern, an ihrem äußerem Umfang gegen die Probenkammerwand abgedichtet.

Ein wesentlicher Nachteil dieses Aufbaus besteht darin, daß für den horizontal ausgerichteten Detektionsstrahlengang ein spezieller Aufbau des Mikroskops erforderlich ist, da Standard-Mikroskope mit vertikalem Detektionsstrahlengang operieren. Sollen neben SPIM andere Kontrastverfahren zum Einsatz kommen, so ist der spezielle Mikroskop-Aufbau entsprechend mit Mehraufwand auszurüsten. Zudem ist bei der

Verwendung von Tauchobjektiven ein Wechsel des Detektions- objektivs aufgrund der Abdichtung äußerst schwierig. Ein ähnlicher Aufbau ist bei Voie et al, Hearing Research 171, 119 (2002), und bei Voie et al, J. of Microscopy 170, 229 (1993) beschrieben. Dabei werden sowohl horizontale als auch vertikale Ausführungen des Detektionsstrahlengangs beschrieben. Die Rotationsachse, um die die Probe rotiert, ist horizontal ausgerichtet. Die Rotationsantriebsachse ragt seitlich in eine aus Polyacetal gefertigte Probenkammer hinein, welche ansonsten die Probe und eine geeignete Umgebungsflüssigkeit enthält. Die Probe wird an dieser Achse in die Kammer gehalten und ist von allen Seiten von der Umgebungsflüssigkeit umgeben, außer an der Verbindung zur Achse. Die Probenkammer ist zu allen Seiten hin abgedichtet, sie kann aber auch - bei vertikalem Aufbau des Detektionsstrahlengangs - oben offen sein, wobei jedoch dann die Linse des Detektionsobjektivs nicht die Immersionsflüssigkeit kontaktiert. Eine Translation der Probe wird durch eine Bewegung der gesamten Kammer erreicht. über die Halte- rung der Probe bei horizontaler Rotationsachse werden keine weiteren Angaben gemacht.

Eine lichtblattförmige Beleuchtung der Probe wird ebenfalls in der US 3,398,634 beschrieben, wobei ein übliches Mikroskopstativ zum Einsatz kommt, eine Rotation der Probe wird nicht beschrieben.

In der US 5,680,484 wird eine Probenhalterung in Form eines mit einer Flüssigkeit gefüllten, durchsichtigen Zylinders beschrieben, der an zwei Stellen an seinem Umfang gehalten wird und mit einem Riemenantrieb in Rotation versetzt wird. Das Einspannen eines solchen Glaszylinders in die Vorrichtung, sowie der Wechsel der Probe in einem solchen Glaszy-

linder gestaltet sich jedoch relativ aufwendig. Mittel zur Translation der Probe werden nicht beschrieben.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Probenhalte- rung der Eingangs beschriebenen Art dahingehend weiterzuentwickeln, daß sie SPIM-Messungen in hoher Qualität wie mit einer vertikalen Rotationsachse und einem horizontalen Detektionsstrahlengang zuläßt, ohne jedoch die Nachteile eines solchen Aufbaus und die Beschränkung allein auf ein SPIM aufzuweisen. Die Probenhalterung soll insbesondere in ein Standard-Mikroskop-Stativ integriert werden können, was eine senkrechte Detektion impliziert. Neben SPIM sollen auch die am Standard-Mikroskop bereits etablierten Kontrastverfahren zum Einsatz kommen können. Darüber hinaus soll ein einfacher Wechsel zwischen Tauch- und Trockenobjektiven möglich sein.

Diese Aufgabe wird bei einer Probenhalterung der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, daß die Probe in ein transparentes Einbettmedium eingebettet ist, welches eine höhere Festigkeit als die Immersionsflüssigkeit aufweist und die Probenkammer Mittel zur horizontalen Lagerung der eingebetten Probe gegen die Wirkung der Schwerkraft aufweist. Die eingebettete Probe wird nicht, wie bei Voie et al. in die Probenkammer gehalten, sondern gegen die Schwerkraft abgestützt, d.h. in der Probenkammer entsprechend beispielsweise auf einem Bett gelagert. Auf diese Weise kann verhindert werden, daß sich das Einbettmedium mit der Probe durchbiegt oder abbricht, so daß bei der Bildaufnahme mit Rotation eine ausreichende Reproduzierbarkeit gegeben ist.

Bevorzugt ist das Einbettmedium aus einem Gel gefertigt. Das Gel kann beispielsweise aus einem Gemisch aus 98-99% Wasser und l%-2% Agarose bestehen. Ein Gel bietet den Vorteil, daß zum einen die Probe in diesem Gel fixiert ist, so daß die Probe nicht direkt in einem Halter gehalten werden muß, zum anderen, daß das Gel so gefertigt werden kann, daß es im wesentlichen die gleichen Brechungseigenschaften wie die umgebende Immersionsflüssigkeit aufweist. Wird Wasser als Immersionsflüssigkeit verwendet, so eignet sich das eben beschriebene Gel aus Wasser und Agarose aufgrund seines hohen Wasseranteils besonders gut. Diffusion ist im Gel nahezu ungehindert möglich, so dass ein weiterer Vorteil darin besteht, dass im Falle lebenden Proben eine NährstoffVersorgung bewerkstelligt werden kann. Auch andere Einbettmedien wie beispielsweise mit Flüssigkeit gefüllte Glasbehältnisse oder andere transparente Behältnisse können verwendet werden.

Vorteilhaft ist das Einbettmedium zylinderförmig, beispielsweise als Glasröhrchen oder Gelzylinder ausgestaltet. Diese regelmäßige geometrische Form bietet den Vorteil einer einfachen Handhabung insbesondere im Hinblick auf die Lagerung und Rotation der Probe. Zudem ergibt sich für jeden Rotationsstellung der gleiche Winkel zwischen der Grenzfläche von Einbett- und Immersionsmedium und dem Lich- blatt. Andere Geometrien sind denkbar, wenn die unterschiedlichen Winkel für unterschiedliche Rotationsstellungen berücksichtigt werden.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Mittel zur Translation einen im Raum verfahrbaren Probentisch, auf dem die Probenkammer angeordnet ist. Die Probenkammer kann beispielsweise fest auf dem Probentisch mon-

tiert sein. Eine Translation der Probe wird dann erreicht, indem die ganze Probenkammer bewegt wird, wobei die Probe in der Probenkammer sich relativ zu dieser nicht bewegt. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn ein Bildstapel aufgenommen werden muß, da gegenüber einer Translation der Probe in der Probenkammer eine höhere Stabilität erreicht wird. äquivalent und mit der gleichen Wirkung kann anstelle des Tisches auch das Detektionsobjektiv bewegt werden.

Die Mittel zur horizontalen Lagerung der Probe umfassen bevorzugt einen Horizontalhalter, der die eingebettete Probe aufnimmt. Bei der Verwendung eines Gelzylinders ist insbesondere eine rohrförmige Form des Horizontalhalters zu bevorzugen. Dabei wird die Größe des Gelzylinders an den Durchmesser des Horizontalhalters angepaßt, so daß der GeI- zylinder an seinen Enden von dem Horizontalhalter nahezu formschlüssig umfaßt wird. Der Horizontalhalter seinerseits ist entsprechend gelagert oder wird entsprechend in der Probenkammer gelagert oder gehalten, so daß eine Durchbiegung des Gelzylinders verhindert wird. Dabei ist der Horizontalhalter bevorzugt so ausgestaltet, daß er um die Rotationsachse, um die die Probe rotiert, gedreht werden kann. Wenn die Probe - beispielsweise in einem Gelzylinder - am oder im Horizontalhalter fixiert ist, so kann auf diese Weise die Probe selbst rotiert werden.

Bevorzugt umschließt der Horizontalhalter das Einbettmedium teilweise, wobei das Einbettmedium mit seinen nicht umschlossenen Bereich auf einem Stützelement gelagert ist. Diese Ausgestaltung ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das Einbettmedium Rotationssymmetrie aufweist, da das Stützelement dann besonders einfach konstruiert werden kann, so daß das Einbettmedium darauf abrollen kann. Ver-

wendet man beispielsweise einen Gelzylinder, so umschließt ihn ein Horizontalhalter, der rohrförmig ausgestaltet ist, dann beispielsweise nur auf 40% seiner Länge. Wird die Probe allerdings am freien Ende des Gelzylinders in diesen eingebracht und wird nicht bis in die Mitte in bezug auf die Längsachse eingeschoben, so kann der Horizontalhalter auch einen größeren Bereich des Gelzylinders umfassen, was die Stabilität erhöht. In diesem Fall kann auf das Stützelement unter Umständen auch verzichtet werden, wenn der umfaßte Bereich für ausreichende Stabilität des Gelzylinders sorgt.

Das Stützelement kann vorteilhaft eine Kontaktfläche aus Teflon aufweisen, auf der das Einbettmedium gelagert ist. Eine solche Kontaktfläche bietet den Vorteil, daß Reibung und Haftung äußerst gering gehalten werden. Bei der Verwendung eines Gelzylinders kann die Kontaktfläche entsprechend der Krümmung dieses Zylinders geformt sein, bei Rotation des Zylinders kann dieser dann auf der Kontaktfläche abrollen. Für rein translatorische Bewegungen können auch ebene Kontaktflächen verwendet werden, das Einbettmedium kann dann beispielsweise quaderförmig ausgestaltet sein.

In einer alternativen Ausgestaltung kann das Stützelement auch aus mehreren Rollen gefertigt sein, auf denen das Einbettmedium gelagert ist. Bei Rotation eines zylinderförmigen Einbettmediums rotieren diese Rollen entgegengesetzt zum Stützelement. Die Rollen können beispielsweise als Glaszylinder gefertigt sein, wodurch gewährleistet ist, dass ein Durchlichtkontrastverfahren, d.h. eine Beleuchtung von unten bewerkstelligt werden kann. Aber auch eine Be- schichtung mit Teflon oder anderen Materialien sind denkbar.

Bei einem zylinderförmigen Einbettmedium kann auch der gesamte Horizontalhalter aus solchen Rollen aufgebaut sein, die dann entsprechend angetrieben sind, um die Probe zu rotieren. Sie können in der Probenkammer fest montiert sein.

In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung umschließt der Horizontalhalter das Einbettmedium im wesentlichen vollständig, weist jedoch mindestens eine Aussparung auf, durch die die Probe beleuchtet und von der Probe kommendes Licht detektiert wird. Ist der Horizontalhalter aus Glas oder einem anderen transparenten Material, so kann auf die Aussparung ggf. auch verzichtet werden. Umschließt der Horizontalhalter das Einbettmedium auf diese Weise, so muß dieses nicht unbedingt Rotationssymmetrie aufweisen. Das für einen transparenten Horizontalhalter verwendete Material sollte, sofern das Einbettmedium vollständig umschlossen wird, einen Brechungsindex aufweisen, der dem Brechungsindex des umgebenden Immersionsmediums im wesentlichen gleich ist. Bei der Wahl von nichttransparenten Materialien muß der Horizontalhalter eine Aussparung an der Stelle aufweisen, wo sich die Probe im Einbettmedium befindet, wenn dieses in den Halter eingesetzt ist, so daß die Probe beleuchtet und von der Probe kommendes Licht detektiert werden kann.

Die Rotation der Probe kann realisiert werden, indem der Gelzylinder direkt oder indirekt mit einem Antrieb gekoppelt wird, der den Gelzylinder in Rotation versetzt, ohne daß der Horizontalhalter rotiert wird. Aus Stabilitätsgründen vorteilhafter ist es jedoch, den Horizontalhalter mit darin enthaltenem Gelzylinder rotieren zu lassen. Zweckmäßig umfassen die Mittel zur Rotation der Probe daher einen Rotationsantrieb für die Rotation des Horizontalhalters.

Ein solcher Rotationsantrieb kann auf verschiedene Weise realisiert werden.

In einer einfachen Ausgestaltung der Erfindung sind Rotationsantrieb und Horizontalhalter über eine direkte Kupplung verbunden. Bei dieser Ausgestaltung werden in eine Wand der Probenkammer öffnungen geschnitten, durch die der Antrieb geführt wird. Entsprechend muß die Probenkammer dann an dieser Stelle mit einer Dichtung abgedichtet werden.

In einer anderen Ausführung weisen die Mittel zur Rotation der Probe einen Riemen- und/oder Zahnrad-Rotationsantrieb auf. Der Antrieb ist dabei oberhalb der Kammer angeordnet, und über Riemen oder Zahnräder durch die obere öffnung der Kammer hindurch mit dem Horizontalhalter verbunden. Dabei muß darauf geachtet werden, daß die Mechanik nicht von der Flüssigkeit in irgendeiner Weise beeinträchtigt wird. Die Wirkungsweise ist wie bei einem direkten Antrieb, ermöglicht also genaues Positionieren. Der Antrieb vermeidet jedoch die Verwendung von Dichtungen, die Probe ist außerdem von oben gut zugänglich.

In einer anderen bevorzugten Ausführung weisen die Mittel zur Rotation der Probe eine Magnetkupplung zur Kupplung von Horizontalhalter und Rotationsantrieb durch eine Wandung der Probenkammer hindurch auf. Bei dieser Ausführung kann sowohl auf eine öffnung der Probenkammer mit Dichtung als auch auf eine aufwendige Mechanik, wie beim mechanischen Antrieb verzichtet werden. Der Antrieb auf der Außenseite der Probenkammer ist dabei mit einem Magneten versehen, ein gegenpolig ausgerichteter, gleichartiger Magnet ist am Horizontalhalter befestigt. Bei jeder Drehung des Motors und des Antriebs dreht sich der Horizontalhalter dann entspre-

chend mit. Die beiden Magneten sind nur durch die Wandung der Probenkammer getrennt, beispielsweise durch die Unterseite einer quader- oder zylinderförmigen Probenkammer.

Diese Ausgestaltung kann zweckmäßig ergänzt werden, indem die Mittel zur Translation einen Translationsantrieb aufweisen, der die Translationsbewegung ebenfalls über die Magnetkupplung auf den Halter überträgt. Auf diese Weise sind zumindest Translationsbewegungen in der Kammer in einer E- bene möglich. Ein Motorblock mit dem Rotationsantrieb kann beispielsweise durch den Translationsantrieb bewegt werden, auch die Unterbringung beider Antriebe in einer Einheit ist möglich.

Sind Rotationsantrieb und Horizontalhalter über eine direkte Kupplung verbunden, so umfassen auch die Mittel zur Translation der Probe vorteilhaft einen Translationshalter, der den Horizontalhalter mindestens teilweise umschließt und über eine direkte Kupplung mit einem Translationsantrieb gekuppelt ist. über einen solchen direkten Antrieb läßt sich mindestens die Translation in einer Richtung, nämlich der Richtung der Rotationsachse, realisieren. Bei entsprechender Ausgestaltung der öffnungen in der Wand der Probenkammer sowie der Dichtungen kann auch die Bewegung in den anderen Raumrichtungen zumindest in begrenztem Umfang realisiert werden.

Wird die gesamte Kammer bei der Translation bewegt, beispielsweise auf einem Tisch, so steht bei der Verwendung von Immersionsmedien und bei Bewegung in Richtung des Beleuchtungsstrahlengangs die Gefahr einer nichtkonstanten optischen Weglänge, gemessen zwischen dem letzten optischen Element des Beleuchtungsstrahlengangs und dem Schnittpunkt

zwischen Beleuchtungs- und Detektionsachse . Zwar kann dies u.U. bei Verwendung einer niederaperturigen Beleuchtung vernachlässigt werden, ansonsten müssen jedoch adaptive E- lemente in den Beleuchtungsstrahlengang um dieses Problem, das bei lichtblattförmiger Beleuchtung auftritt, zu umgehen. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung verfügt die Probenkammer daher über eine bewegliche Wand, die über einen Abstandshalter mit einem Beleuchtungsobjektiv verbunden ist. Bewegt sich die Probenkammer, so bleibt die bewegliche Wand immer an der gleichen Stelle, da sie über den Abstandshalter mit dem Beleuchtungsobjektiv verbunden ist. Bei dem Beleuchtungsobjektiv handelt es sich dabei um das letzte Element des Beleuchtungsstrahlengangs. Durch die Verwendung des Abstandshalters wird gewährleistet, daß die optische Weglänge bei Bewegung der Proben entlang der Beleuchtungsrichtung stets konstant bleibt.

Eine andere Alternative besteht darin, nicht die Probenkammer auf einen Probentisch zu bewegen, sondern die Probe in der Probenkammer selbst. In einer solchen Ausgestaltung umfassen die Mittel zur Rotation und Translation der Probe einen mechanischen Arm, der durch die obere öffnung in die Probenkammer greift und dort die Probe auf einem Horizontalhalter hält, mit einem Rotationsantrieb, bevorzugt einem Riemen- oder Zahnradantrieb zur Rotation der Probe sowie einem Translationsantrieb zur Translation der Probe in der Probenkammer. Diese Antriebe können alle in einem Motorblock integriert sein, von dem aus der Arm entsprechend gesteuert und bewegt wird. Das Wechseln der Probe ist auch in diesem Fall ohne Probleme möglich, da die Kammer von oben leicht zugänglich ist.

Die vorangehend beschriebene Probenhalterung ist so konzipiert, daß sie mit einem Standard-Mikroskop, beispielsweise einem Auflicht- oder Durchlichtmikroskop mit vertikaler Beleuchtung und vertikal angeordnetem Detektionsobjektiv verwendet werden kann. Nur der Probentisch muß leicht modifiziert werden, um die Probenkammer aufzunehmen.

Besonders geeignet läßt sich die erfindungsgemäße Probenhalterung jedoch in einem Mikroskop mit lichtblattförmiger Beleuchtung senkrecht zur optischen Achse des Detektionsob- jektivs und im wesentlichen senkrecht zur Rotationsachse verwenden, beispielsweise in einem Single-Plane- Illumination-Mikroskop (SPIM) verwenden. Da die Integration in standardmäßige Mikroskopaufbauten jedoch möglich ist, können auch weitere Kontrastmethoden und anderer Mikroskopieverfahren wie Epifluoreszenzmikroskopie, Ein-Photonen- Laser-Scanning-Mikroskopie oder Zwei-Photonen-Mikroskopie angewandt werden.

Die Erfindung soll im folgenden anhand von mehreren Beispielen näher erläutert werden. In den dazugehörigen Zeichnungen zeigt

Fig.l eine übersichtsskizze über den grundlegenden Aufbau einer Probenkammer und ihre Integration in ein Mikroskop,

Fig.2a und b jeweils einen Horizontalhalter, eine die Probe von zwei Seiten hält,

Fig.3a einen Horizontalhalter, der eine Probe an einer Seite hält,

Fig.3b ein Stützelement zur Lagerung des Einbettmediums,

Fig.4a-c verschiedene Antriebe zur Rotation des Horizontalhalters mit der Probe,

Fig.5 eine beispielhafte Anordnung, mit der eine Rotation und Translation der Probe erreicht wird, ohne die Probenkammer zu bewegen,

Fig.6 eine alternative Anordnung, mit der ebenfalls die Probe in der Probenkammer bewegt werden kann und

Fig.7 eine Probenkammer mit beweglicher Wand und einem Abstandshalter zur Konstanthaltung der optischen Weglänge .

In Fig.l ist zunächst der allgemeine Aufbau einer Proben- halterung skizziert, die in einem Mikroskop 1 untergebracht ist. Bei dem Mikroskop 1 kann es sich beispielsweise um ein Standard-Mikroskop zur Auflicht- oder Durchlichtuntersu- chung handeln, aber auch Laser-Scanning-Mikroskope sind denkbar. Insbesondere kann das Mikroskop 1 auch ein Single- Plane-Illumination-Mikzoskop (SPIM) sein, bei dem Beleuch- tungs- und Detektionsstrahlengang einen von Null verschiedenen - bevorzugt, wie in Fig.l dargestellt, einen Winkel von 90° - bilden und die Beleuchtung zudem nur in einer einzigen Ebene mit einem sogenannten Lichtblatt erfolgt. Das dargestellte Mikroskop 1 weist u.a. ein Detektionsob- jektiv 2 auf, mit dem von der Probe kommendes Licht detek- tiert wird, und dessen optische Achse vertikal verläuft. Eine Probenkammer 3 ist im Strahlengang auf einem für die Aufnahme der Probenkammer 3 geeigneten Probentisch 4 angeordnet, wobei das Mikroskop 1 hier von der Seite und die Probenkammer 3 perspektivisch dargestellt sind. Die Probenkammer 3 ist oberhalb des Mikroskops 1 im Detail dargestellt. Sie ist mit einer Immersionsflüssigkeit, beispielsweise Wasser oder PBS (Phosphate Buffered Saline) gefüllt und kann aus Glas, Delrin oder einem anderen, geeigneten transparenten Material gefertigt sein. Die Probenkammer 3 weist eine obere öffnung auf, das Detektionsobjektiv 2 kann

in die Kammer und in die Flüssigkeit hineinragen, muß jedoch nicht. Es können sowohl Immersions- bzw. Tauchobjektive als auch normale Objektive verwendet werden. In der Probenkammer 3 befindet sich ein transparentes Einbettmedium, in dem eine Probe eingebettet ist. Wird als Immersionsflϋs- sigkeit Wasser verwendet, so kann das Einbettmedium wie im vorliegenden Beispiel als Gelzylinder 5 aus einem Gemisch von ca. 98% Wasser und 2% Agarose ausgestaltet sein. Bei Verwendung anderer Immersionsflüssigkeiten sind andere Einbettmedien denkbar. Auch mit einer entsprechenden Flüssigkeit gefüllte Glaszylinder kommen beispielsweise in frage. Der Gelzylinder 5 mit der Probe kann um eine Rotationsachse 6 rotieren, die gemäß Fig.l senkrecht zu einer Detektion- sachse 7 und damit im wesentlichen horizontal liegt. Die Beleuchtung erfolgt gemäß Fig.l senkrecht zur Detektion- sachse 7 in einer einzigen Beleuchtungsebene 8, wobei die Beleuchtungsrichtung auch senkrecht zur Rotationsachse 6 liegt. Der Fokus des Detektionsobjektivs 2 ist auf die Beleuchtungsebene 8 eingestellt.

Bei der Verwendung eines Gelzylinders 5 besteht die Gefahr der Durchbiegung des Zylinders. Bei einer Rotation der Probe, beispielsweise zur Erzeugung eines dreidimensionalen Bildes der Probe, könnte diese Durchbiegung dazu führen, daß die aufgenommenen Bilder nicht exakt zusammen passen bzw. daß die Aufnahmen oder Messungen nicht reproduzierbar sind. Im schlimmsten Fall kann es auch zu einem Durchbrechen des Gelzylinders 5 und dem damit verbundenen Verlust der Probe kommen. Um eine Durchbiegung bzw. einen Durchbruch zu verhindern, muß der Gelzylinder 5 entsprechend gelagert werden. In Fig.2a ist eine erste Möglichkeit zu einer solchen Lagerung dargestellt. Der Gelzylinder 5 mit einer Probe 9 wird von einem Horizontalhalter 10, der bevor-

zugt rohrförmig ist, gehalten. Der Horizontalhalter 10 nimmt die eingebettete Probe 9 auf, der Gelzylinder 5 ist im Horizontalhalter 10 fixiert. Der Horizontalhalter ist so gelagert, daß er um die Rotationsachse des Gelzylinders 5 rotieren kann, wie hier durch den runden Pfeil angedeutet. Der Horizontalhalter 10 kann aus transparentem Material gefertigt sind, welches dann bevorzugt den gleichen Brechungsindex wie die umgebende Flüssigkeit aufweist. Der Horizontalhalter 10 in Fig.2a besteht aus zwei Teilen, die mit Stegen 11 verbunden sind, so daß der Horizontalhalter 10 die Probe 9 nicht vollständig umschließt, sondern etwa in der Mitte eine Aussparung 12 aufweist, durch die die Probe 9 beleuchtet werden kann, und durch die von der Probe 9 kommendes Licht detektiert werden kann. Die Aussparung kann sich auch an einer anderen Stelle entlang des Horizontalhalters 10 befinden. Der in Fig.2a gezeigte Horizontalhalter 10 kann dafür ausgelegt sein, an zwei Stellen mit seinem Umfang mit der Probenkammer verbunden zu sein, bei einer quaderförmigen Probenkammer beispielsweise an zwei gegenüberliegenden Seiten. Die beiden Teile des Horizontalhalters 10 können fest verbunden sein. In diesem Fall wird der Gelzylinder 5 durch eine öffnung an der Ober- oder Unterseite in den rohrförmigen Horizontalhalter 10 eingeführt, alternativ ist auch eine lösbare Verbindung der beiden Teile über die Stege mittels Schrauben etc. denkbar.

Der gesamte Horizontalhalter 10 - d.h. mit beiden Teilen - ist rotierbar gelagert. Wird er in Rotation versetzt, so dreht sich der Gelzylinder 5 mit. Eine andere Ausführung eines Horizontalhalters 10 ist in Fig.2b gezeigt. Auch hier besteht der Horizontalhalter 10 aus zwei Teilen, die jeweils an gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer 3 gehalten werden können. Beide Teile weisen an einander ge-

genüberliegenden Seiten sägezahnartige Profile auf, an denen sie ineinander greifen. Für die Probenpräparation können die beiden Seiten vollständig ineinander geschoben werden, was die Aufnahme des Gelzylinders 5 erleichtert. Andere Profile, die die gleiche Funktion erfüllen, sind äquivalent verwendbar. Für die Messung und die Fixierung in der Probenkammer 3 werden die beiden Teile auseinandergezogen und entsprechend an zwei gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer arretiert. Die beiden Seiten sind hier nicht direkt miteinander verbunden, ihre Bewegung erfolgt jedoch synchron. Alternativ können beide Teile auch durch einen geeigneten Arretiermechanismus miteinander verbunden werden. Der Horizontalhalter 10 kann dann wahlweise an beiden Seiten oder auch nur an einer Seite in der Probenkammer fixiert werden. Die beiden Teile müssen auch nicht zwangsläufig mit der Probenkammer verbunden sein, auch andere Lagerungen innerhalb der Probenkammer sind denkbar, sofern sichergestellt ist, daß die Kopplung zu einem Antrieb, der den Gelzylinder 5 bzw. den Horizontalhalter 10 in Rotation versetzt, gewährleistet ist. Die Verbindung mit der Probenkammer 3 erhöht einerseits die Stabilität, andererseits jedoch auch den konstruktiven Aufwand.

Während der in Fig.2 beschriebene Horizontalhalter 10 die Probe 9 im wesentlichen vollständig umschließt und die Probe mit ihm rotiert wird, sind auch Horizontalhalter 13 denkbar, die das Einbettmedium, insbesondere den Gelzylinder 5, nur teilweise umschließen und in denen das Einbettmedium in seinem nicht umschlossenen Bereich auf einem Stützelement 14 gelagert ist, welches nicht mitrotiert. Eine solche Anordnung ist beispielsweise in Fig.3a dargestellt. Der Horizontalhalter 13 ist ebenfalls rohrförmig ausgebildet und an seinem linken Ende geschlossen. Der Gel-

zylinder 5 wird vom Horizontalhalter 13 teilweise umschlossen. In einem nichtumschlossenen Bereich wird er vom Stützelement 14 gehalten. Dieses Stützelement 14 kann beispielsweise eine Kontaktfläche aus Teflon aufweisen, auf der das Einbettmedium gelagert ist und abrollen kann. Dabei muß ein Kompromiß gefunden werden bezüglich der Ausdehnung der Kontaktfläche entlang der Zylinderachse, zum einen im Hinblick auf die Verhinderung der Durchbiegung, wofür eine möglichst große Fläche zu bevorzugen ist, zum anderen im Hinblick auf Reibungsverluste, wofür die Kontaktfläche möglichst klein ausgestaltet werden sollte. Beleuchtung und Detektion der Probe finden selbstverständlich im nicht umschlossen Bereich des Gelzylinders 5 statt. Horizonalhalter 13 und Süt- zelement 14 sind auf einem Ständer 15 angeordnet, der in der Probenkammer 3 positioniert werden kann. Bei der Rotation des Gelzylinders 5 wird das Stützelement 14 nicht mit rotiert, es findet also ein Abrollprozess statt. Der Horizontalhalter 13 kann mit dem Gelzylinder 5 zusammen rotieren. In diesem Fall ist das Stützelement 14 über eine Kupplung mit dem Horizontalhalter 13 verbunden und es besteht kein direkter Kontakt zwischen beiden. Der Gelzylinder 5 kann auch unabhängig vom Horizontalhalter 13 rotieren. Er muss dann entsprechend anderweitig mit dem Rotationsantrieb gekoppelt sein. Das Stützelement 14 kann dann direkt mit dem Horizontalhalter 13 verbunden sein.

Wie in Fig.3b dargestellt, kann das Stützelement 14 auch aus mehreren Rollen 16 aufgebaut sein, auf dem der Gelzylinder 5 mit der Probe 9 gelagert und die bei Rotation des Gelzylinders 5 entgegengesetzt zu diesem rotieren, so daß ein mechanisches Abrollen möglich ist. Die Oberflächen dieser Rollen 16 können auch mit Teflon beschichtet sein. Auch Rollen 16 aus Glas sind verwendbar. Bei Glas ergibt sich

der Vorteil, daß eine Durchlicht-Beleuchtung von der Unterseite - d.h. entgegen der Richtung der Schwerkraft - möglich wird. Alternativ kann auch der gesamte Horizontalhalter aus mehreren solcher Rollen aufgebaut sein, wobei der Gelzylinder 5 dann in Rotation versetzt wird, indem die Rollen des Horizontalhalters entsprechend angetrieben werden.

Damit die Probe 9 im Gelzylinder 5 rotiert werden kann, ist bei der Probenhalterung ein Rotationsantrieb vorgesehen, der den Gelzylinder 5 rotiert. In Fig.4a-c sind verschiedene Möglichkeiten für einen solchen Rotationsantrieb dargestellt, wobei der Gelzylinder 5 zusammen mit dem Horizontalhalter rotiert wird und der Rotationsantrieb zusammen mit der Probenkammer 3 fest auf einem in den drei Raumrichtungen x, Y und Z verfahrbaren Probentisch 17 montiert sind. Dieser realisiert also die Translation der Probe 9 im Raum. Probe 9 und Probenkammer 3 bewegen sich also nicht unabhängig voneinander. Vorteilhaft bei solchen Ausführungen ist, daß die Probe 9 bei der Aufnahme eines Bildstapels nicht direkt translatorisch relativ zu dem sie umgebenden Medium bewegt werden muß. Aus Stabilitätsgründen zur Verhinderung oszillatorischer Bewegungen des Gelzylinders 5 kann dies von Vorteil sein. Eine andere Möglichkeit der Realisierung der Aufnahme eines Bildstapels liegt darin, das Detektionsobjektiv 2 zu bewegen und den Probentisch 17 festzuhalten. Auf die Darstellung des Horizontalhalters wurde der übersichtlichkeit halber verzichtet, seine Funktion wird durch eine Lagerung 18 symbolisiert. In Fig.4a ist links neben der Probenkammer 3 ein Rotationsantrieb 19 angeordnet, der mittels einer Magnetkupplung den Horizontalhalter an den Rotationsantrieb 19 durch eine Wandung der Probenkammer 3 hindurch kuppelt. Dazu weist der Rotations-

antrieb 19 einen Magneten 20 auf, ein entsprechender Magnet 20 ist am Horizontalhalter auf der Seite, die dem Rotationsantrieb 19 zugewandt ist, gegegenpolig angebracht. Bei jeder Drehung des Motors des Rotationsantriebs 19 dreht sich der Horizontalhalter und damit der Gelzylinder 5 entsprechend mit. Bei dieser Anordnung muß die Probenkammer 3 nicht durchbrochen werden, um Zugang für einen Antrieb zu schaffen, Dichtungsprobleme können somit vermieden werden. ähnliches gilt auch für die in Fig.4b dargestellte Variante, bei der die Mittel zur Rotation der Probe 9 einen oberhalb der Probenkammer 3 angeordneten Riemen- und/oder Zahnrad-Rotationsantrieb 21 aufweisen. Der in Fig.4b dargestellte Rotationsantrieb 21 besteht aus einem Motor mit einem Arm, der über die obere öffnung der Probenkammer 3 ragt. Das äußere Ende des Arms rotiert, an diesem ist eine Riemen 22 eingespannt, der gleichzeitig mit dem Horizontalhalter verbunden ist und diesen entsprechend in Drehung versetzt. Aus Stabilitätsgründen ist der Riemen verzugsweise aus Metall gefertigt. Alternativ kann auch ein Zahnradantrieb verwendet werden.

In Fig.4c schließlich ist ein dritter Rotationsantrieb 23 gezeigt, der mit dem Horizontalhalter über eine direkte Kupplung verbunden ist. Für diesen Zweck muß eine öffnung in der Probenkammer 3 geschaffen werden, die mittels einer Dichtung 24 abgedichtet wird.

Während in den eben erläuterten Beispielen die Rotationsantriebe 19, 21 oder 23 sowie die Probenkammer 3 auf dem Probentisch 17 befestigt sind, was bei translatorischer Bewegung dazu führt, daß sich Probe 9 und Probenkammer 3 gemeinsam bewegen, sind auch Probenhalterungen denkbar, bei denen die Probe 9 unabhängig von der Probenkammer 3 bewegt

werden kann. Eine solche Probenhalterung ist beispielsweise in Fig.5 dargestellt. Der Gelzylinder 5 mit der Probe 9 wird von einem Horizontalhalter 13 teilweise umschlossen und ragt in die Probenkammer 3 hinein. Der Horizontalhalter 13 ist über eine direkte Kupplung mit einem nichtgezeigten Rotationsantrieb direkt gekuppelt, so daß die Probe 9 rotiert werden kann. Der Horizontalhalter 13 wiederum ist mindestens teilsweise von einem Translationshalter 25 umfaßt, mit dem eine translatorische Bewegung entlang der drei Raumrichtungen durchgeführt werden kann. Auch der Translationshalter 25 ist mit einem entsprechenden, nicht gezeigten Translationsantrieb gekuppelt. Translation und Rotation werden über direkte Kupplungen der entsprechenden Halter mit den zugehörigen Antrieben erreicht, so daß eine Seitenwand der hier kubisch dargestellten Probenkammer 3 durchbrochen werden muß. Zur Abdichtung der Probenkammer sind daher zwei Dichtungen 26 und 27 notwendig: Dichtung 26 dichtet den Horizontalhalter 13 gegenüber dem Translationhalter 25 ab, die Dichtung 27 den Translationshalter 25 gegenüber der Probenkammer 3. Beide Dichtungen 26 und 27 können jeweils in bezug auf die ihnen zugeordnete Bewegungsform optimiert werden. Insbesondere weist die Dichtung 27 eine Grundflexibilität auf, die auch Translationsbewegungen senkrecht zur Richtung der Rotationsachse möglich macht. Hierzu eignet sich beispielsweise eine elastische Folie an der Durchbruchstelle, die den Translationshalter mit der Probenkammerwand verbindet. Darüber hinaus läßt sich der Horizontalhalter 13 mit einer entsprechenden Lagerung gemäß Fig.3 versehen. Selbstverständlich ist es auch möglich, nur eine einzige Dichtung zu verwenden. Bei der in Fig.5 beschriebenen Anordnung kann die Probe 9 unabhängig von der Probenkammer 3 bewegt werden. Auf diese Weise kann vermieden werden, daß sich die optische Weglänge des Beleuch-

tungsstrahlengangs ändert, was insbesondere im Hinblick auf Verwendung der Probenhalterung mit einem SPIM mit lichtblattförmiger Beleuchtung ein wesentlicher Vorteil ist, da die Beleuchtung dann nicht adaptiert werden muß.

Auch mit der in Fig.6 gezeigten Probenhalterung läßt sich die optische Weglänge konstant halten, sie bietet darüber hinaus gegenüber der in Fig.5 beschriebenen Vorrichtung den Vorteil, daß translatorische Bewegungen in allen drei Raumrichtungen ohne spezielle Abdichtungen ausgeführt werden können. Dazu ist ein mechanischer Arm 28 vorgesehen, der durch die obere öffnung in die Probenkammer 3 greift und dort die Probe 9 auf einem Horizontalhalter 13 hält, der hier wiederum nur angedeutet ist. Oberhalb der Probenkammer 3 ist der mechanische Arm mit einem Translations-Rotations- Antrieb 29 verbunden. Die Rotationsbewegung wird mittels Zahnrädern 30 auf den Horizontalhalter 13, der mit entsprechenden Mitteln ausgestattet ist, übertragen. Auch zweiseitig gehaltene Horizontalhalter können verwendet werden. Alternativ kann auch ein Riemenantrieb verwendet werden. Auf diese Weise läßt sich der gesamte Probenarm 28 mit der Probe 9 unabhängig von der Probenkammer 3 in dieser bewegen. Der mechanische Arm 28 ist dabei bevorzugt so ausgestaltet, daß er mit dem Horizontalhalter 13 auf dem Boden der Probenkammer aufsetzen kann, so daß das Auftreten von Schwingungen bei ausschließlicher Rotation der Probe 9 im wesentlich unterdrückt wird.

Eine andere Möglichkeit, die optische Weglänge bei der Translation in eine Richtung konstant zu halten, besteht darin, die Probenkammer 3 mit einer beweglichen Wand 31 auszustatten. Eine solche Vorrichtung ist in Fig.7 dargestellt. Sie zeigt eine Draufsicht auf die Probenkammer 3

entlang der optischen Achse des Detektionsobjektives . Die Probenkammer 3 und mit ihr die darin gelagerte Probe 9 kann in Pfeilrichtung bewegt werden, so daß auf andere Bereiche bzw. Tiefen in der Probe 9 fokussiert werden kann. Rechts von der Kammer ist ein Beleuchtungsobjektiv 32 dargestellt, stellvertretend für das letzte optische Element im Beleuchtungsstrahlengang. Die bewegliche Wand 31 ist gegenüber der restlichen Kammer beweglich, wozu sie an ihren Rändern mit Dichtungen 33 versehen ist. über einen Abstandshalter 34 ist sie mit dem Beleuchtungsobjektiv 32 verbunden. Wird nun die Probenkammer 3 entlang der durch den Doppelpfeil angedeuteten Richtung bewegt, so verbleibt die bewegliche Wand 31 an ihrem Platz. Der Abstand zwischen beweglicher Wand 31 und dem Beleuchtungsobjektiv 32 wird auf diese Weise konstant gehalten, so daß auch die optische Weglänge sich nicht ändert.

Bezugszeichenliste

1 Mikroskop

2 Detektionsobjektiv

3 Probenkämmer

4, 17 Probentisch

5 Gelzylinder

6 Rotationsachse

7 Detektionsachse

8 Beieuchtungsebene

9 Probe

10, 13 Horizontalhalter

11 Steg

12 Aussparung

14 Stützelement

15 Ständer

16 Rolle

18 Lagerung

19, 21, 23 Rotationsantrieb

20 Magnete

22 Riemen

24, 26, 27 Dichtung

25 Translationshalter

28 mechanischer Arm

29 TransIations-Rotations-Antrieb

30 Zahnrad

31 bewegliche Wand

32 Beleuchtungsobjektiv

33 Dichtung

34 Abstandhalter