La présente invention concerne un procédé de mise en évidence, dans un échantillon biologique (plasma ou sérum), d'un déficit de la voie de synthèse de l'aldostérone permettant un diagnostic différentiel des masses surrénaliennes bénignes/malignes. Autrefois événement exceptionnel en clinique, la mise en évidence de masses surrénaliennes est maintenant un événement fréquent (2-3 % des scanners et échographies abdominales, quel que soit le motif de la prescription) venant corréler la fréquence des masses surrénaliennes retrouvées, de longue date, à l'autopsie de sujets non sélectionnés (7 à 10 %) et plus fréquente encore dans les populations d'hypertendus.

Parmi ces masses souvent bénignes, il faut absolument reconnaître précocement le cortico-surrélanome malin (fréquemment appelé carcinome surrénalien) en raison de son caractère souvent asymptomatique (30 à 40 % des cas), de sa difficulté diagnostique, de son très mauvais pronostic et de son traitement curatif uniquement chirurgical. Or, actuellement, il n'existe aucun marqueur de ce cancer, certes rare mais qu'il faut reconnaître. En effet, il n'existe aucun signe fiable ni radiologique ni biologique et les critères de décision ne sont pas clairs, la taille qui doit alerter le clinicien variant selon les auteurs entre 3 et 6 cm.

Ces cancers ne se traduisent qu'exceptionnellement par un hyperaldostéronisme (quelques cas seulement rapportés dans le monde) et l'invention, basée sur les résultats d'études cliniques, montre que c'est le dysfonctionnement de la voie de synthèse de l'aldostérone (depuis la désoxycorticostérone) qu'il faut rechercher ; ce dysfonctionnement aboutit fréquemment à un hypoaldostéronisme mais aussi à une aldostéronémie normale qu'il faut savoir distinguer d'un faux hyperaldostéronisme résultant de la technique de dosage. En effet, la production en quantité non négligeable de stéroïdes rares, non habituellement recherchés dans les pathologies tumorales surrénaliennes en particulier malignes, vient fausser le taux de l'aldostérone déterminé par les techniques courantes.

La présente invention a pour objet un procédé permettant de mettre en évidence, in vitro, dans un échantillon biologique (plasma ou sérum) que celui-ci provient d'un individu présentant un carcinome surrénalien caractérisé en ce que l'on mesure dans l'échantillon, le rapport des concentrations en aldostérone à celles des concentrations de DOC et au moins à un de ses dérivés non hydroxylés en 11 β. Ce rapport est inférieur à une valeur prédéterminée.

Le rapport de ces concentrations déterminées comme ci-dessous permet d'appréhender le dysfonctionnement de la 11 β hydroxylase sur la voie de l'aldostérone retrouvé dans les carcinomes surrénaliens.

Par précurseurs de l 'aldostérone, on entendra les minéralocorticoïdes suivants : la désoxycorticostérone (DOC), la 18- hydroxydésoxycorticostérone ( 18-OH DOC) (voie de dérivation de la DOC), la corticostérone (B) et la 18-hydroxy-corticostérone ( 18-OH B). En effet la Demanderesse a découvert que la discordance entre les taux plasmatiques et sériques d'aldostérone et ceux de ses précurseurs, dans le contexte d'une pathologie tumorale, constitue un marqueur précoce de malignité et qu'il est donc fondamental de s'assurer qu'un hyperaldostéronisme n'est pas un faux positif dû à l'accumulation de steroïdes non habituellement recherchés par les techniques courantes. L'hyperaldostéronisme, dans le contexte d'une pathologie tumorale, permet de reconnaître une tumeur bénigne (l'adénome de Conn par exemple).

Les carcinomes représentent des cancers chimiorésistants et radioresistants qui se traduisent très fréquemment par un dysfonctionnement précoce de la voie de synthèse de l'aldostérone, qui peut intervenir à différentes étapes de cette biosynthèse, mais dont le "verrouillage" se situe au niveau des dernières étapes expliquant le caractère exceptionnel des hyperaldostéronismes, retrouvé dans la littérature sur les carcinomes surrénaliens.

Ce dysfonctionnement aboutit à une accumulation de steroïdes qu'il faut savoir distinguer de l'aldostérone.

Il est donc essentiel de doser l'aldostérone par une méthode présentant une limite de détection très basse et une excellente spécificité dans l'échantillon. L'échantillon biologique est un prélèvement sanguin, sérum ou plasma. De préférence dans le procédé selon l'invention, dans une première étape, on sépare l'aldostérone de ses différents précurseurs, puis on dose respectivement chacun de ces composés par la même technique ou par des techniques présentant une spécificité et un seuil de sensibilité identique. L'emploi de cette technique fait de l'aldostérone une molécule informationnelle d'alerte qui confirme le diagnostic lorsqu'elle est mise en relation avec les taux des autres molécules de cette voie métabolique. Ce marqueur se révèle également intéressant dans l'orientation vers l'imagerie des hypertensions artérielles à aldostérone normale (dosée en routine) ou basse, dans le diagnostic des métastases surrénaliennes d'un autre cancer (effondrement de l'ensemble de la voie de l'aldostérone), dans un complément des critères histologiques de malignité qui sont très difficiles, dans la recherche précoce de récidive éventuelle, dans la surveillance des masses non encore opérées en complément de l'imagerie, dans le suivi postopératoire en absence de traitement palliatif par l'Op' DDD (orimétène).

Il est essentiel pour la mise en oeuvre du procédé, que chaque stéroïde soit dosé séparément, de manière fine, et en particulier l'aldostérone, pour laquelle les techniques de routine classiques ne permettent pas une mesure spécifique. L'aldostérone est, selon l'un des aspects de l'invention, séparée tout d'abord des autres steroïdes par une chromatographie de partage, par exemple sur papier. Il appartiendra à l'homme du métier d'adapter cette technique ou de la remplacer par toute technique permettant la séparation et la récupération des différents minéralocorticoïdes, comme par exemple la C.LH.P. Le pourcentage de récupération de chaque stéroïde à l'issue de cette étape doit être évalué avec exactitude et on emploie un traceur de perte lors des étapes de séparation et de récupération ; on peut notamment ajouter à l'échantillon les différents steroïdes à doser, marqués, en quantité connue.

Après séparation, chaque minéralocorticoïde en cause est dosé par une méthode spécifique, en particulier par immunodosage. Les méthodes ELISA ou par R1A sont connues de l'homme du métier et bien adaptées à la mise en oeuvre du procédé; il importe alors d'employer des anticorps présentant une bonne spécificité, et un faible pourcentage de réactions croisées avec les autres minéralocorticoïdes. La précision est évaluée à l'aide de contrôles contenant des quantités connues du minéralocorticoïde à doser.

En effet, il est important de pouvoir prendre en compte des variations portant sur de faibles concentrations, et il faut s'assurer que les variations mesurées ne sont pas provoquées par des fluctuations de la méthode de dosage.

Le procédé selon l'invention consiste donc à mesurer dans un prélèvement biologique, un abaissement de la concentration en aldostérone par rapport à celle de ses précurseurs. Le rapport des concentrations en aldostérone aux concentrations en DOC et en au moins un dérivé non hydroxylé en 11 β de la DOC est généralement inférieur ou égal à 20% dans les échantillons plasmatiques ou sériques provenant d'un individu présentant un carcinome surrénalien. De manière avantageuse on mesure le rapport aldostérone/(DOC + 18-OH EXX!). La Demanderesse a ainsi montré que, dans un échantillon provenant d'un tel individu, ce rapport est inférieur ou égal à 20%.

Dans un certain nombre d'échantillons provenant de patients présentant un carcinome surrénalien, la mesure de l'un des rapports définis ci-dessus donne une valeur inférieure ou égale à 10%.

Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Exemple 1 - Méthode de dosage des hormones

Les taux plasmatiques de désoxycorticostérone (DOC), 18- hydroxydésoxycorticostérone ( 18-OH DOC), corticostérone (B), 18-hydroxy- corticostérone ( 18-OH B) et aldostérone (aldo) sont déterminés en duplicate par une méthode RIA à l'aide d'anticorps polyclonaux de lapins préparés au laboratoire, et qui présentent des pourcentages de réactions croisées très bas.

Pour chaque dosage, on utilise un 1 ml de plasma, auquel on ajoute une quantité connue du stéroïde tritié que l'on souhaite doser, comme traceur de perte technique. Les échantillons sont traités par 15 ml de dichlorométhane contenant 0J % de triéthylamine pour le dosage des composés 18-hydroxylés. Le stéroïde est séparé par une chromatographie de partage sur papier, à l'aide d'un système adapté aux performances de l'anticorps utilisé pour le dosage d'un stéroïde donné, comme indiqué ci- dessous :

Stéroïde dosé Système de chromatographie DOC Méthyl cyclo hexane/méthanol eau 10/8-2 B Benzène heptane/méthanol eau 7-3/8-2

18-OH B Benzène heptane/méthanol eau 7-3/8-2

18-OHDOC Benzène heptane/méthanol eau 7-3/8-2

Aldostérone Benzène heptane/méthanol eau 7-3/8-2

Le papier chromatographique (Whatman 2) est préalablement lavé dans du méthanol en cours de distillation dans un appareil Soxlett. Les pourcentages de récupération après extraction et chromatographie varient de 40 à 60 % (calculés pour chaque extrait à l'aide d'un traceur de perte) et sont pris en compte pour le calcul des résultats. Après élution, la quantité de stéroïde est déterminée par RIA dans un tampon phosphate 0,25 M/1 à pH 7, contenant de l'azide de sodium (2 g/1) et de la gélatine (1 g/1). La précision de la méthode est évaluée pour chaque série de dosage

à l'aide de contrôles composés de quantités variables et connues, de stéroïde froid en solution dans du plasma dépourvu de stéroïde, de pool de plasma de patients ayant des taux connus de steroïdes, ainsi que d'essais totalement dépourvus de plasma permettant l'évaluation des blancs. Quand les valeurs des contrôles s'écartent de 20 % ou plus des valeurs attendues, les résultats ne sont pas pris en considération. Les coefficients de variation intra et inter-essais sont respectivement de 5 à 12 % et de 10 a 15 %. La concentration la plus basse en aldostérone pouvant être détectée à partir de 1 ml de plasma est de 0,5 ng/100 ml.

Exemple 2

A titre d'exemple, on rapporte ici les résultats obtenus pour 33 patients explorés par ce procédé, qui se répartissent ainsi : - 10 carcinomes surrénaliens asymptomatiques,

- 04 carcinomes surrénaliens symptomatiques,

- 01 métastase surrénalienne d'un autre cancer,

- 01 cancer surrénalien guéri,

- 17 tumeurs bénignes. Parmi les patients asymptomatiques, tous étaient de découverte fortuite sauf un et asymptomatique sur le plan de l'endocrinologie.

Par "asymptomatique" on entend asymptomatique au plan endocrinologique ; ces patients ne présentaient aucun signe clinique ou biologique endocrinien. Parmi ces patients, certains présentaient une hypertension artérielle, mais l'origine endocrinienne de cette hypertension artérielle avait été rejetée en raison de taux plasmatiques de cortisol, d'aldostérone et de méthanéphrine urinaire normaux. Tous les sujets étaient adultes, n'étaient pas traités et avaient un régime normosodé. Dans ces différents cas de masses surrénaliennes, l'étude des produits finaux des trois voies de la stéroïdogénèse surrénalienne ne sont pas toujours contributifs à la décision chirurgicale. Mais, même en présence de masses surrénaliennes de petite taille, le rapport proposé précédemment trouvé bas ou effondré constituait un signe d'alerte, puisqu'il s'oppose au rapport trouvé pour les masses bénignes. Les résultats qui caractérisent les carcinomes de petite taille sont analogues dans les carcinomes de grande taille.

Une étude plus large, portant sur 87 patients (incluant les 33 présentés ici) à permis d'affirmer la valeur du rapport proposé antérieurement pour le situer maintenant à 20 %. Les cas d'adénomes présentés dans la première série de 33 patients et ayant un rapport (patients n° 6, 7 et 17) supérieur à 10% mais inférieur à 20 % (augmentation du nombre de cas étudiés), viennent étayer la précocité du dysfonctionnement de la voie de l'aldostérone comme signe d'alerte puisque le suivi de ces patients a montré récemment soit une rechute controlatérale (patient 6 et 7) soit l'apparition de métastases. Ceci illustre bien la difficulté de l'histologie et renforce l'intérêt du marqueur de malignité présenté ici.

Le tableau suivant montre que la mesure des précurseurs de la voie de l'aldostérone révèle que la masse est sécrétante mais qu'elle présente un dysfonctionnement de la voie de synthèse de l'aldostérone qui se caractérise par une impossibilité de la voie à aboutir à la synthèse du produit final (l'aldostérone). Des masses jugées non sécrétantes sur la base de l'aldostérone seule et des steroïdes de la voie du cortisol et des androgènes surrénaliens présentent cependant des anomalies de la voie de l'aldostérone qui corrèlent l'histologie : une discordance entre le taux d'aldostérone et celui de ses précurseurs se retrouvant dans tous les cas de carcinomes surrénaliens. Ce dysfonctionnent de la voie de l'aldostérone constaté pour des masses importantes se retrouve également pour des masses bien inférieures à la taille recommandée pour la décision chirurgicale (6 cm). La reconnaissance de ce signe dans des masses de petites tailles suggère que l'altération de la voie de l'aldostérone, lors du développement tumoral, est précoce puisqu'elle est retrouvée dans des masses de petite taille et a constitué un signe d'alerte suscitant une imagerie de contrôle qui s'est révélée positive pour le patient 9 par exemple. L'interprétation de ce dysfonctionnement de la voie de l'aldostérone est facilitée par un index de dysfonctionnement mettant en rapport le taux d'aldostérone X 100 sur les taux de DOC et de 18-OH DOC qui se révèle inférieur à 20 dans pratiquement tous les cas de carcinomes.

Le suivi postopératoire montre la normalisation du fonctionnement de la voie de l'aldostérone rapportée antérieurement dans les cas de guérison en l'absence de traitement par l'Op' DDD (orimétène).

Dans ce tableau, les concentrations sont exprimées en pg/ml.

Les valeurs normales sont les suivantes :

Aldostérone : 30-100 (pg/ml)

t

Un O LΠ o n

VOIE DE L'ALDOSTÉRONE

18-OHB Aldo AldoXIOO DOC+18OHDOC 2.8 75 0.6 0.6

4 18

8

5

2.5 34 23 40

7 58 33 46 11