WU BIN (CN)
FAN MINGSONG (CN)
LI ZHIXIONG (CN)
SUN ZHAOLIN (CN)
CHEN MINGCANG (CN)
US20080206161A1 | 2008-08-28 | |||
CN101214253A | 2008-07-09 |
D' ABROSCA, B. ET AL.: "Structural characterization of phytotoxic terpenoids from Cestrum parqui", PHYTOCHEMISTRY, vol. 66, 25 October 2005 (2005-10-25), pages 2681 - 2688, XP027726800
LIN, J.T. ET AL.: "High-performance liquid chromatography of steroidal sapogenins", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 287, 1984, pages 105 - 112, XP026476520
上海序伦律师事务所 (CN)
权 利 要 求 书 WO 2013/097665 PCT/CN2012/087265 1 . 一种如式 I 其中, 取代基 选自于 -OH、 _SH、 卤素和 C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一种; 取代基 R2选自于 -OH、 -SH、 卤素、 硫酸酯基、 磷酸酯基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱 和烷烃取代的氨基、 通过 0-糖苷键连接的糖和通过 S-糖苷键连接的糖之一种。 2. 一种如式 III- I所示的皂苷衍生物, 式 III- I 。 3. 根据权利要求 2所述的呋 烷型皂苷衍生物, 其特征在于所述式 III- I的构象为 式 III- II所示, 式 III- II 4. 根据权利要求 1-3之一所述的呋 烷型皂苷衍生物, 由知母皂苷 Β-ΠΙ或知母皂 苷 Β-ΠΙ皂苷元制得。。 5. 根据权利要求 1-3之一所述的呋 烷型皂苷衍生物, 从知母或其提取物中制取而 得。 权 利 要 求 书 WO 2013/097665 PCT/CN2012/087265 6.根据权利要求 1-3之一所述的呋 烷型皂苷衍生物作为活性成分用于制备预防和 治疗抑郁症的药物、 食品或保健品。 7. 一种抗抑郁的给药方法, 对抑郁症患者给予有效治疗剂量的权利要求 1 -3之一所 述的呋 烷型皂苷衍生物。 8. 根据权利要求 7所述的抗抑郁的给药方法, 其特征在于所述的有效治疗剂量为每 天给予总量 0.05mg/kg-50mg/kg的所述呋甾烷型皂苷衍生物。 9. 一种用于抗抑郁的组合物, 其活性成分含有权利要求 1-3之一所述的呋 烷型皂 苷衍生物为活性成分。 10. 根据权利要求 9所述的用于抗抑郁的药物组合物, 将所含有的有效治疗剂量的 所述皂苷衍生物给予抑郁症患者。 |
本发明涉及一种皂苷衍生物, 尤其涉及一种呋 烷型皂苷衍生物, 以及该衍生物 在预防和治疗抑郁症中的应用。
龍
知母 (又名兔子油草, 穿地龙) 为百合科植物知母 (Anemarrhena asphodeloides) 的干燥根茎。 据《植物志》中记载, 其性苦寒, 有滋阴降火、 润燥滑肠、 利大小便之效。
中药材知母主要的化学成分有 体皂苷、 双苯吡喃酮类、 多糖类和木质素类等, 如: 知母皂苷 (甙) (timosaponin) A- I、 A- IK A-III、 A-IV、 B- I、 Β- Π禾口 B-III, 其 中, 知母皂苷 Α- Π、 A-IV结构尚不明。 以及知母皂苷 (amemarsaponin) A2, 即马尔考 皂 苷 元 -3-0-p-D- 吡 喃 葡 萄 糖 基 ( 1 → 2 ) -β-D- 卩比 喃 半 乳 糖 苷 B ( marlogenin-3-0-P-D-glucopyranosy ( 1 → 2) -β-D-galactopyranoside B) 去半乳糖替告 阜苷 ( desgalactotigonin ) F- 脱阜苷 ( F-gitonin)禾口异菝葜阜苷 ( smilageninoside)等。 此外, 还含有知母多糖 (anemaran) A/B/C/D、 顺 -扁柏树脂酚 (cis- hinokiresinol)、 单 甲基-顺 -扁柏树脂酚 ( monomethyl-cis-hinokiresinol )、 氧化-顺 -扁柏树脂酚 ( oxy- cis-himokiresinol )、 2,6,4'-三轻基 -4-甲氧基二苯甲酮 ( 2,6,4'-trihydroxy-4-methoxy benzophenone) 对-羟苯基巴豆油酸 (p-hydroxyphenyl crotonic acid)、 二十五烷酸乙烯 月旨(pentacosyl vinyl ester) β-谷甾醇( P.sitosterol)、芒果苷 ( mangiferin) 烟酸 (nicotinic acid)、 烟酰胺 (nicotinamide) 及泛酸 (pantothenic acid) 等。
知母皂苷 Β- Π对脑缺血造成的学习记忆障碍具有改善作用 (Neuroscience letter., 2007, 421, 147-151 知母皂苷 Α-ΠΙ主要通过抑制乙酰胆碱酯酶, 以及抑制炎症因子的 表达而对记忆缺失具有缓解作用 (Pharmacol. Biochem. Be., 2009, 93, 121-127 )。
已有诸多研究证明, 知母所含的这些物质对多种疾病具有治疗作用 , 如: 知母总 皂苷可用于治疗心肌缺血 (CN1682873A), 以知母皂苷 Α-ΠΙ和 B- II为主要成分制成的 药剂也已经用于治疗血栓性疾病 (WO2011/026259 )。 知母皂苷 Α-ΠΙ可诱发人宫颈癌细 胞凋亡,在体内和体外实验中都证明其具有治 疗结肠和直肠癌的作用(Cancer Res., 2008, 68, 10229-10237), 以及具有抑制血管内皮细胞增殖的显著效果, 对于治疗肿瘤和类风 湿性关节炎等疾病具有治疗作用 (CN102030812A)。
近来相关研究还表明, 知母总皂在多种抑郁模型上具有抗抑郁作用, 可能与其增 强去甲肾上腺素能及 5-羟色胺能神经系统有关(中药新药与临床药 , 2007, 18, 29 )。 通过动物实验验证, 知母中所含有的菝葜皂苷元对小鼠实验性抑郁 有一定作用,可以影 响小鼠脑内多巴胺和单胺氧化酶的活性,而使 该类皂苷元具有抗抑郁活性(Biol. Pharm. Bull., 2006, 29, 2304-2306 )。 伊佳等人的研究发现, 知母皂苷 B- II具有抗抑郁活性, 其 作用机制可能与增强脑内 5-HT和 DA神经系统作用有关 (CN101214253A; 药学实践 杂志, 2010, 28, 283-287)。
中医认为, 抑郁症多因忧思过度, 劳伤心脾为病, 治疗应以宁心安神, 养血滋阴 为主。因此,在大部分用于中医治疗抑郁症的 处方中,知母也是一味较为常用的中药材。 临床上当前应用较为常用的抗抑郁药物有:三 环和四环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、 选择性 5-HT重吸收抑制剂 (SSRI)、 非典型抗抑郁药和锂盐等。
近年来, 临床上应用最广的 SSRI类药物一一氟西汀存在诸多不良反应, 如: 全身 或局部过敏, 胃肠道功能紊乱等 (中国现代应用药学, 2008, 25, 763-765; 中国新药 杂志, 2001, 10, 20; 实用医学杂志, 2004, 20, 318-319 )。 有研究指出, 幼儿患者服 用氟西汀后有可能增加自杀倾向,亦有报道称 服用氟西汀可能引起暴力倾向增强和先天 性心血管出生缺陷。
SSRI类药物——舍曲林 (Sertraline) 是美国处方量较大的抗抑郁品牌药, 但易引 起患者窦性心动过速和 ST-T改变等 (中国新药与临床杂志, 2002, 21, 711-713 )不良 反应,在治疗抑郁发作过程中会在一定程度上 引起躁狂发作或转躁(国外医学精神病学 分册, 2004, 31, 104)。
文拉法辛和氯米帕明虽一样易于耐受, 但约有 1/3的用药者会发生恶心反应, 特别 在开始用药的几周中较为明显。 已发现的文拉法辛所致的不良反应有恶性综合 征、诱发 躁狂、 紫癜、 幻觉、 骤停致幻觉、 戒断反应、 5-HT综合征、 胸闷、 眩晕、 低血压、 停 经和眼压升高等, 对儿童的转躁率较高 (临床精神医学杂志, 2002, 12, 382)。
据世界卫生组织专家预测, 到 2020年抑郁症的社会总负担在所有疾病负担中 上 升为第一位,而用于治疗抑郁症活性的药物中 所含的活性分子主要依靠化学合成的方式 获取, 大都存在毒副作用大、抗抑郁谱狭窄和价格昂 贵等问题, 我们国家目前接受治疗 的抑郁症患者仅有 2%, 对家庭和社会具有潜在的极大危害。 因此, 研发安全、 有效和 价廉的抗抑郁创新药物显得尤为必要。
中药和天然药物是创新药物研究开发的重要源 头之一。 近年来, 国际和国内对贯 叶连翘等具有抗抑郁作用的天然药物研究和开 发取得了一系列成果 (中国现代中药, 2009, 11, 6-9; 中成药, 2006, 28, 713-716; 广东医学, 2005, 859-860; 南京中医 药大学学报, 2001, 17, 294-298; 解放局药学学报, 2003 , 19, 426-428 ; 药学实践杂 志, 2004, 22, 104-105; Pharm. Biol., 2006, 44, 503-510)。 但至今未见治疗抑郁症的 中药新药上市, 也鲜有这方面化学结构与药效机制关系的研究 报道。 发明内容
本发明的一个目的在于提供一种 体皂苷衍生物, 具有抗抑郁的药理作用, 可作 为活性成分用于制备治疗和预防抑郁症的药物 。
本发明的另一个目的在于提供一种呋 烷型皂苷衍生物, 具有抗抑郁的药理作用, 可作为活性成分用于制备治疗和预防抑郁症的 药物。
本发明的又一个目的在于提供一种由知母皂苷 Β-ΠΙ或从中药材知母中制取而得的 呋甾烷型皂苷衍生物, 具有抗抑郁的药理作用。
本发明的再一个目的在于提供一种组合物, 以所提供的皂苷衍生物为活性成分制 成药物、 食品和保健品, 单独或与其它物质组合用于预防和治疗抑郁症 。
本发明所称的 "皂苷衍生物"是指皂苷衍生物以及所成的药学 可接受的盐, 如: 但不仅限于盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 乙酸盐、 钾盐、 钠盐、 钙盐、 镁盐、 钡盐、 锰盐、 锌盐、 铁盐和季铵盐等。
本发明所称的 "呋 烷型皂苷衍生物" 是指呋 烷型皂苷衍生物以及所成的药学 上可接受的盐, 如: 但不仅限于盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 乙酸盐、 钾盐、 钠盐、 钙盐、 镁盐、 钡盐、 锰盐、 锌盐、 铁盐和季铵盐等。
本发明所称的 "从中药材知母中制取而得的呋 烷型皂苷衍生物" 是指该衍生物 与各种无机酸、无机碱、有机酸或有机碱所成 的化合物, 包括从中药材知母中制取呋甾 烷型皂苷衍生物的过程中,呋 烷型皂苷衍生物及其生成该衍生物的直接或间 接的前体 化合物 (如: 知母皂苷 Β-ΠΙ ) 与制取所使用的各种试剂所成的药学上可接受 的盐, 如: 盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 乙酸盐、 钠盐、 钾盐或季铵盐等。
本发明所称的 "中药材知母" 是指百合科植物知母 (Anemarrhena asphodeloides) 的各个部分, 如: 根、 茎、 页和果实等, 由于从该植物的根茎中能够制取最多的目标皂 苷衍生物, 因此本发明优先选择其干燥的根茎。这些知母 药材的选料和炮制过程是否符 合中药材加工工艺和标准不得限定本发明。
本发明所称的 "抑郁症(depression) "属情感性精神障碍性疾病(mood disorders), 是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的 综合征。通常所说的抑郁症是指临床上的 重症抑郁症 (major depression) (中国实验方剂学杂志, 2005, 11, 46; 药学实践杂志, 2008, 26, 282)。 抑郁症的患者常伴有焦虑症状, 焦虑又可加重抑郁的发展 (中国临床 康复, 2006, 10, 58 )。 抑郁症发作以心境低落为主, 与其处境不相称, 可以从闷闷不 乐到悲痛欲绝, 甚至发生木僵。 严重者可出现幻觉、 妄想等精神病性症状。 某些病例的 焦虑与运动性激越很显著。 其诊断标准也以心境低落为主, 并伴有至少有以下所列 4 项: (1 ) 兴趣丧失、 无愉快感; (2) 精力减退或疲乏感; (3 ) 精神运动性迟滞或激越;
( 4) 自我评价过低、 自责, 或有内疚感; (5 ) 联想困难或自觉思考能力下降; (6) 反 复出现想死的念头或有自杀、 自伤行为; (7) 睡眠障碍, 如失眠、 早醒, 或睡眠过多;
( 8 )食欲降低或体重明显减轻; 以及 (9) 性欲减退。 而社会功能受损, 给本人造成痛 苦或不良后果则属于病情发展的严重标准。就 其病程角度, 患者符合症状标准和严重标 准至少已持续 2周; 可存在某些分裂性症状, 但不符合分裂症的诊断。若同时符合分裂 症的症状标准, 在分裂症状缓解后, 满足抑郁发作标准至少 2周(中国精神障碍分类与 诊断标准 [M], 济南: 山东科学技术出版社, 2001, 28-35 )。
本发明所称的 "抗抑郁" 是指能对抑郁症患者的症状起到治疗、 改善或治愈的目 的, 以使患者的病情得到改善以致恢复正常。
本发明所称的 "强迫游泳实验 (Forced Swimming Test, FST) "或 "强迫游泳的抑 郁症动物模型"是指通过将实验动物 (如: 小鼠) 置于一个局限的环境中 (如: 水中), 动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱 , 从而提供了一个无可回避的压迫环境, 一段时间的实验后, 动物即表现出典型的 "不动状态", 实际上动物放弃逃脱的希望, 反映了一种被称之为 "行为绝望状态", 记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过 程中的一系列参数。该系统使用摄像头对实验 过程录像并用相应软件对图像进行跟踪分 析, 减少人为操作, 数据具有客观性。 强迫游泳的抑郁症动物模型, 是研究人类抑郁症 药理学及其发病机理、筛选观察抗抑郁药物研 究中可靠的实验模型,其主要的特点是药 物作用的高度特异性, 该实验能够很好的将抗抑郁药物与强安定和抗 焦虑药加以区别, 而且大多数抗抑郁药所产生的效应与临床效价 显著相关 (Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 1977, 229, 327-336; Neurosei. Biobehav. Rev., 1995, 19, 377-395 )。
本发明所称的 "悬尾实验 (Tail Suspension Test, TST) " 是一种经典而又能快速 评价抗抑郁药物药效的方法。其原理是利用小 鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱, 从而放 弃挣扎, 进入特有的抑郁不动状态, 实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态 , 抗 抑郁药物能明显地缩短改变其状态。
本发明所称的 "生物体"、 "动物 "或"患者"是指人、野生动物和家畜(Livestocks 野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。 家畜是为了提供食物来源而人工词养的动 物, 如: 但不仅限于狗、 猫、 鼠、 大鼠、 仓鼠、 猪、 兔、 奶牛、 水牛、 公牛、 绵羊、 山 羊、 鹅和鸡等。 给予治疗的 "患者"、 "动物"或 "生物体"优先选择哺乳动物, 尤其是 人。
本发明所称的 "预防" 是指在未被临床标准认定的疾病前, 各种用于防止疾病发 生或发展的手段或措施, 包括医学、物理或化学的方法, 以阻止和降低疾病各种症状的 发生或发展。
本发明所称的 "治疗" 是指为了阻止和降低疾病的发生或发展, 使疾病病程的发 展或加重得以抑制、 遏制、 减轻、 改善、 减缓、 停止、 延迟或反转, 所描述的保持和 / 或用药时的疾病的、紊乱的或病理学状态的各 种指标包括减轻或减少症状或并发症, 或 治愈或消除疾病、 紊乱或状况。
本发明所称的 "食品" 是指包括本发明提供的各种皂苷衍生物制成可 食用的单一 化合物或组合物。 该种单一化合物或组合物的生产和制造应当符 合相关食品安全标准, 但是这些食品安全标准不得限定本发明。
本发明所称的 "保健品" 是指将包括本发明提供的各种皂苷衍生物制成 可食用的 单一化合物或组合物以施于患者,起到对疾病 进行预防和治疗的目的。其属于本发明所 称的食品, 但其生产、 制造和销售还应当符合各种相关的要求、 标准和规范。
本发明所称的 "药物" 是指可以用于预防或治疗某种疾病的单一化合 物、 多种化 合物形成的组合物、中药材及其提取物,或指 以单一化合物为主要活性成分的组合物或 制剂 (formulation), 还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂 。 "药物"应理解为 不仅指根据一国之法律规定,通过其设立的行 政机构审批并准予生产的产品,还指在为 了获得通过审批和准予生产的过程中,所形成 的含单一化合物为活性成分的各类物质形 态。 "形成"应理解为通过化学合成、 生物转化或购买等途径获得。
本发明所称的 "制剂" 是指含有本发明异黄酮类化合物的有利于给药 (drug delivery) 的剂型, 如: 但不仅限于, 水溶液注射剂、 粉针剂、 丸剂、 散剂、 片剂、 贴 剂、 栓剂、 乳剂、 霜剂、 凝胶剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 气雾剂、 喷雾剂、 粉雾剂、 缓释剂 和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂 中常规使用的, 如: 但不仅限于,等渗剂、 缓冲液、 矫味剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 崩解剂和润滑剂等; 也可以是为了与所述 物质相适应而选择使用的, 如: 乳化剂、 增溶剂、 抑菌剂、 止痛剂和抗氧剂等, 这类辅 料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶 解性或改变化合物的释放速率和吸收速 率等, 从而改善本发明化合物在生物体内的代谢, 进而增强给药效果。 此外, 还可以为 实现特定的给药目的或方式, 如: 缓释给药、 控释给药和脉冲给药等, 而使用的辅料, 如: 但不仅限于, 明胶、 白蛋白、 壳聚糖、 聚醚和聚酯类高分子材料, 如: 但不仅限于, 聚乙二醇、 聚氨酯、 聚碳酸酯及其共聚物等。 所称的 "有利于给药"的主要表现有: 但 不仅限于提高治疗效果、 提高生物利用度、 降低毒副作用和提高患者顺应性等。
本发明所称的 "有效治疗剂量" 指能减缓各种病理学意义上的症状而使用本发 明 化合物作为活性成分的量, 所给的量一般根据生物体的体重确定, 如: 每天给予总量 0.05mg/kg-50mg/kg o 根据生物体及其病情的实际情况, 所用的量和所用的次数亦可以 调整,如:每天 2次以上给予总量 0.05-0.5mg/kg、 0.6_lmg/kg、 l_10mg/kg、 l l_25mg/kg、 26_40mg/kg或 41_50mg/kg。 根据药物的剂型的不同, 所给的要亦会发生变化, 如: 普 通片剂需要给予 10mg/kg, 而采用缓控释制剂则所需的量更低。本发明 体皂苷衍生物 的特定剂量需要根据具体的情况加以确定, 如: 给药的方式、 给药途径、 给药时患者的 状态以及在治疗时的病理学状况等。
本发明所称的 "基础化合物" 是以 "氢" 代替化合物结构式上所有可变的取代基 而获得的化合物。 举例而言, 将 "氢" 同时代替如下式 I所示结构中的取代基 F 、 R 2 和 R 3 获得的化合物, 即为基础化合物。
本发明所称的 "取代基" 是指取代基础化合物上特定位置氢原子的一种 或几种无 机或有机基团的统称, 其可为原子、 分子、 离子、 化合物和聚合物等。
本发明所称的 "卤素" 包括氟、 氯、 溴和碘, 并以 _F、 -Cl、 -Br和 -I的集合方式 作为取代基应用于基础化合物。
本发明所称的 "硫酸酯基" 为 _OS0 3 H、 _OS0 3 Na、 _OS0 3 K禾口 _OS0 3 NH 4 。
本发明所称的 "磷酸酯基" 为 -OPO(HO) 2 , 以及其上氢被取代所成的药学上可接 受的盐。
本发明所称的 "三氟乙酸基" 为 _OCOCF 3 。
本发明所称的 "取代的氨基" 为氨基上氢被 C1-C3饱和烷烃部分或全部取代的氨 基, 如: 但不仅限于甲氨基和二甲氨基。
本发明所称的 " C1-C3饱和烷烃"为碳原子数 1-3的直链或支链烷烃。 其中, 字母 C表示碳原子, 其后数字为正整数, 如: 1、 2或 3等, 表示基团所含的碳原子个数, 如: 甲烷、 乙烷和丙烷等。
本发明所称的 "糖", 亦称 "糖类", 为化学或生物化学中一类基本的有机物, 是 以 C、 H和 0元素组成的多羟基 (大于 2个) 醛、 多羟基酮 (大于 2个) 以及能水解 而生成多羟基醛或多羟基酮的有机化合物。按 其分子结构可分为 "单糖"、 "二糖 "和"多 糖"。 由若干个单糖分子经由糖苷键缩合而成的有机 化合物, 亦称 "糖链"。 本发明优先 选择单糖或二糖作为取代基应用于基础化合物 。
本发明所称的 "单糖 (monosaccharide) " 是指以 C、 H和 0元素组成的一种有机 化合物,也是构成其它糖类物质的基本单元, 一般是含有 3-6个碳原子的多羟基醛或多 羟基酮的有机物。优先选择碳原子为 5或 6的多羟基醛或多羟基酮有机物,也称"戊糖" 和 "已糖"如: 但不仅限于核糖、 木糖、 阿拉伯糖、 葡萄糖、 甘露糖、 半乳糖、 阿洛酮 糖、 果糖、 山梨糖、 塔格糖、 古洛糖、 伊杜糖、 塔罗糖、 阿洛糖和阿卓糖等。 本发明单 糖结构中, 0元素可为 S元素部分或全部替代。
本发明所称的 "二糖(disaccharide) "是指以 C、 H和 0元素组成一种有机化合物, 一般是由 2个单糖分子通过缩合和失水而成糖苷键的方 连接而成,熟知的二糖如: 蔗 糖、 乳糖、 纤维二糖、 海藻糖和麦芽糖等。 单糖分子之间所成的糖苷键如: 但不仅限于 α-1,1-、 α-1,2-、 α-1,3-、 α-1,4-、 β-1,4-和 α-1,6-等几种糖苷键形式。 本发明二糖结构中,
0元素可为 S元素部分或全部替代。
本发明所称的 "多糖 (polysaccharide) "也包括寡糖 (oligosaccharide) , 是指以 C、
H和 0元素组成的一种有机化合物, 一般是由 3个以上单糖分子通过缩合和失水而成 糖苷键的方式连接而成的线性或分支的聚合物 。 优先选择 3-15个单糖分子由糖苷键连 接而成的线性或分支的聚合物, 熟知的多糖如: 龙胆三糖、 松三糖、 洋槐三糖、 毛蕊花 糖、 水苏糖和棉籽糖等。 单糖分子之间所成的糖苷键如: 但不仅限于 α-1,4-、 β-1,4-和 α-1,6-等几种糖苷键形式。 本发明多糖结构中, 0元素可为 S元素部分或全部替代。
本发明所称的 " C1-C6的醇"为一个或多个羟基取代的直链或支链 的饱和或不饱和 烃。 其中, 字母 C表示碳原子, 其后数字为正整数, 如: 1、 2、 3、 4或 5等, 表示基团所 含的碳原子个数, 如: 甲醇、 乙醇、 丙醇、 异丙醇和正丁醇等。
本发明提供的一种皂苷衍生物, 具体为呋 烷型皂苷衍生物, 其结构如式 I所示。 其中, 表示一种取代基, 选自于 -OH、 -SH、 卤素和 C1-C3饱和烷烃取代的氨基之 一种基团; R 2 表示一种取代基, 选自于 -OH、 -SH、 卤素、 硫酸酯基、 磷酸酯基、 三氟 乙酸基、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基、 通过 0-糖苷键连接的糖和通过 S-糖苷键连接的 糖之一种基团。
本发明提供的另一种皂苷衍生物, 其结构如式 I所示, 其中 表示一种取代基, 选自于 -0H、 -SH、 卤素和 C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一种基团; R 2 表示一种取代 基, 选自于 -0H、 -SH、 卤素、 硫酸酯基、 磷酸酯基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱和烷烃取 代的氨基、 通过 0-糖苷键连接的单糖和通过 S-糖苷键连接的单糖之一种基团。
本发明提供的另一种皂苷衍生物, 其结构如式 I所示, 其中 表示一种取代基, 选自于 -0H或 -SH; R 2 表示一种取代基, 选自于 -0H、 _SH、 卤素、 硫酸酯基、 磷酸酯 基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基、 通过 0-糖苷键连接的单糖和通过 S-糖 苷键连接的单糖之一种基团。
本发明提供的另一种皂苷衍生物, 其结构如式 II所示, 其中 R 2 表示一种取代基, 选自于 -0H、 -SH、 卤素、 硫酸酯基、 磷酸酯基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱和烷烃取代的 氨基、 通过 0-糖苷键 单糖之一种基团。
本发明提供的 一种皂苷衍生物, 其结构如式 III- I所示。
本发明提供的另一种皂苷衍生物, 其结构如式 ΠΙ- Π所示。 式 ΠΙ- Π
本发明提供的各种 体皂苷衍生物, 可采用多种方式制取而得, 如将知母皂苷 Β- III或知母皂苷 Β-ΠΙ皂苷元溶于溶剂, 加入各种必要试剂后, 在惰性气体 (如: 但不仅限 于氮气、 氢气或氦气)保护下反应, 反应结束后, 采用三甲胺、 三乙胺、 碳酸氢钠或硫 代硫酸钠等淬灭剂终止反应。 所得产物采用填料为硅胶、 氧化铝、 ODS 或大孔树脂等 的柱层析分离, 分离所用的溶剂如: 但不仅限于四氢呋喃、 石油醚、 乙酸乙酯、 DMF、 吡啶、 二氯甲烷、 乙醇、 甲醇或水之一种或几种。
本发明提供的一种获取本发明各种皂苷衍生物 较为直接方法, 以知母皂苷 Β-ΠΙ为 原料进行水解后分离而得, 其具体方法如: 按知母皂苷 Β-ΠΙ重量份数与溶剂 (溶剂可 为 10v/ V %-100W V %Cl-C6醇的水溶液以及其它常见有机溶剂的 水溶液, 或水中加入助 溶剂, 如: 表面活性剂) 体积比 1: 0.2-10, 将知母皂苷 Β-ΠΙ溶解于容器中, 按知母皂 苷 Β-ΠΙ重量份数与无机酸(如:盐酸和硫酸等 体积比 1: 1-4加入无机酸,于 60°C -100 °C反应 1-10小时, 之后停止反应, 反应液中加入适量碱液(如: 碳酸氢钠和氢氧化钠) 中和至 pH6_8, 按知母皂苷 Β-ΠΙ重量份数与正丁醇体积比 1: 1-10萃取 1_3次, 合并 正丁醇萃取部分, 减压回收溶剂, 得固体物。 固体物用常用有机溶剂 (如: 乙腈和甲醇 等)溶解, 经分析型、 半制备型或制备型 HPLC或开放 ODS柱分离并收集主要色谱峰, 含有本发明目标产物的溶液经回收溶剂后,得 到微黄色或白色产物, 即为本发明呋甾烷 型皂苷衍生物。
多种直接或间接的方法可以获得本发明所提供 的各种皂苷衍生物、 药学上可接受 的盐或其组合物。 本领域技术人员可以预见, 从知母或其提取物中先提取知母皂苷 B- III (如: CN101307090A) , 再经上述公开的酸水解方法即可间接制取本发 明提供的各 种呋 烷型皂苷衍生物, 如: 将从中药材知母中获取的知母皂苷 Β-ΠΙ进行水解后, 经 分离制得式 I所示的呋 烷型皂苷衍生物。 此外, 通过知母皂苷 Β-ΠΙ皂苷元也可获得 本发明的目标衍生物, 以及其它诸如: 有机合成、 从生物体代谢产物中提取、 分离和纯 化、化学全合成和生物催化和转化等方式同样 也能获得这些衍生物。本发明所列举的各 种制备方法应当理解为对实施本发明技术方案 进行的必要公开。本领域技术人员可以根 据教科书和实验手册的教导, 以及通过必要的实验获得本发明皂苷衍生物, 这些所记载 的获得皂苷衍生物的方法不得作为对本发明的 限定。
本发明提供的各种皂苷衍生物可以作为唯一的 或主要的活性成分用于制备预防或 治疗病毒性疾病的药物,或与其它一种或多种 具有抗抑郁作用的化学物质或药物一并给 予生物体。 这些化学物质如: 但不仅限于知母提取物、 知母总皂苷及其水解物、 知母皂 苷 Β- Π及其水解物、 知母皂苷 Β-ΠΙ皂苷元、 知母皂苷 Β-ΠΙ及其水解物、 三环和四环类 抗抑郁药、 单胺氧化酶抑制剂、 选择性 5-HT重吸收抑制剂 (SSRI)、 非典型抗抑郁药 和锂盐等。所称的 "一并给予生物体"是指本发明各种皂苷衍生物 独或与其它一种或 多种具有抗抑郁作用的化合物或药物混合后经 单一的给药途径, 如: 但不仅限于, 口服 ( Oral)、 鼻腔 ( Nasal )、 (面) 颊 ( Buccal )、 透皮 ( Transdermal )、 肺部 ( Pulmonal) 阴道 (Vaginal)、 皮下 (Subcutaneous) 或静脉 (Intravenous) 给予生物体; 或与其它一 种或多种具有抗抑郁作用的化学物质或药物分 别经多种的给药途径给予生物体, 如: 但 不仅限于速释的口服制剂与缓控释的埋植制剂 配合。
经强迫游泳实验和悬尾实验证明,将有效治疗 剂量的本发明式 I所示的呋 烷型皂 苷衍生物给予生物体, 能使生物体抑郁症状得到改善或消除。 由此表明, 本发明提供的 呋甾烷型皂苷衍生物具有显著的抗抑郁活性, 以其为活性成分制成药物、 食品和保健品, 应用于抑郁症的预防和治疗。
本发明提供的一种药物组合物, 以所提供的各种呋 烷型皂苷衍生物为活性成分 用于预防和治疗抑郁症。
本发明提供的一种食品, 以所提供的各种呋 烷型皂苷衍生物为活性成分用于预 防和治疗抑郁症。
本发明提供的一种保健品, 以所提供的各种呋 烷型皂苷衍生物为活性成分用于 预防和治疗抑郁症。
本发明技术方案实现的有益效果:
本发明式 I所示的呋甾烷型皂苷衍生物, 尤其是如式 III- I和 III- II所示的结构构 象的呋 烷型皂苷衍生物, 具有显著的抗抑郁药理活性, 可作为活性成分制成药物、食品 和保健品, 单独或与其它物质组合用于抑郁症的预防和治 疗。 附图说明
图 1为式 III- I 1H NMR if (400MHz, Pyr-t 5 );
图 2为式 III- I 13 C-NMR谱和 DEPT135谱 ( 100MHz, Pyr-t 5 );
图 3为式 III- II HMBC谱 (Pyr-t 5 );
图 4为式 III- II ROESY谱 (Pyr-t 5 );
图 5为式 III- II HMBC相关图, 图中 代表氢碳远程相关关系;
图 6为式 III- II ROESY相关图, 图中 "一→"代表氢氢 NOE相关关系。 具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。 本发明实施例仅用以说明本发明的技 术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发 明进行了详细说明,本领域的普通技术人 员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改 或者等同替换, 而不脱离本发明技术方案 的精神和范围, 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未明确指明, 则均购自于西格玛一奥德里奇 (Sigma— Aldrich)。
1 2 以知母皂苷 Β-ΠΙ为反应起始物制取呋甾烷型皂苷单糖衍 物, 具体步骤如下:
( 1 )将 0.05mol知母皂苷 Β-ΠΙ溶于 300ml体积比为 10v/v%的甲醇溶液(水或 30v/v% 乙醇溶液或 lw/v%吐温溶液)中,加入 0.5m卜 lml浓硫酸, 80°C -150°C反应 1小时 _6小时。
( 2) 将上述反应液用氢氧化钠调节 pH=6_7。
( 3 ) 用 900ml-1200ml正丁醇分 3次萃取步骤 (2) 中和后所得溶液, 萃取液减压浓 缩至蒸干。
( 4 ) 用水将上述固体溶解, 并使皂苷吸附于 ODS柱后, 用 40v/ V %-60W V %的甲醇 洗脱, 收集洗脱液。
( 5 ) 将溶液减压回收, 蒸干即得呋 烷型皂苷单糖衍生物 2 (NMR: 详见表 1 )。 实施例 2 呋 烷型皂苷衍生物的制取
(1) 将 0.05mol知母皂苷 Β-ΠΙ溶于 300mL体积比为 10%的甲醇溶液 (水或 30%乙醇 溶液或 1%吐温溶液) 中, 加入 2mL_4mL浓盐酸, 80_15(TC反应 1小时〜 6小时。
(2) 将上述反应液用氢氧化钠调节 pH=6_7。
(3) 用 900mL-1200mL正丁醇分 3次萃取步骤 (2) 中和后所得溶液, 萃取液减压 浓缩至蒸干。
(4) 用水将上述固体溶解, 并使皂苷吸附于 ODS柱后, 用 40W V %~60W V %的甲醇 洗脱, 收集洗脱液。
(5) 将溶液减压回收, 蒸干即得呋 烷型皂苷单糖衍生物 2 (NMR: 详见表 1)。
3 T1 2
以知母皂苷 Β-ΠΙ为反应起始物制取呋甾烷型皂苷单糖衍 物, 具体步骤如下:
(1) 将 O.lmol知母皂苷 Β-ΠΙ溶于 600ml体积比为 1(^ %的甲醇溶液中, 加入 3 Om卜 5 Oml浓盐酸, 80°C - 100°C反应 2小时。
(2) 用氢氧化钠调节至 pH=6_7。
(3)用 1.8L-2.4L正丁醇分 3次萃取步骤 (2) 中和后所得溶液, 萃取液减压浓缩至 蒸干。 ( 4 ) 用水将上述固体溶解, 并使皂苷吸附于 ODS柱后, 用 40v/ V %-60W V %的甲醇 洗脱, 收集洗脱液。
( 5 ) 将溶液减压回收, 蒸干即得知母皂苷 Β-ΠΙ的苷元 3 ( NMR : 30.63(1-C); 27.14(2-C); 66.07(3-C); 34.41(4-C); 37.04(5-C); 26.97(6-C); 28.65(7-C); 35.27(8-C); 40.02(9-C); 35.57(10-C); 21.38(11-C); 40.15(12-C); 43.88(13-C); 54.83(14-C); 31.39(15-C); 84.59(16-C); 64.68(17-C); 14.45(18-C); 24.26(19-C); 103.59(20-C); 11.83(21-C); 152.38(22-C); 34.41(23-C); 23.62(24-C); 33.68(25-C); 68.76(26-C); 17.16(27-C))。
( 6 ) 将 0.05mol知母皂苷 B-III的苷元和 0.05mol-0.07mol试剂 Tl用二氯甲烷溶解, 在氮气保护下降温到 -20°C -0°C, 加入 0.91m卜 1.4mlCF 3 S0 3 Si(CH 3 ) 3 , 反应 40分钟 _1小时 后停止。
( 7) 加入三乙胺淬灭反应, 减压旋干溶剂。
( 8 ) 沉淀加入到 200mLCH 2 Cl 2 -MeOH (2: Ι, ν/v)溶液中, 再加入 lmol/L_1.5mol/L 的甲醇钠甲醇溶液 50ml, 反应 3-5小时, 蒸干反应液
( 9 ) 用水将上述固体溶解, 并使皂苷吸附于 ODS柱后, 用 40v/ V %-60W V %的甲醇 洗脱, 收集洗脱液。 将溶液减压回收, 蒸干即得呋 烷型皂苷单糖衍生物 2。
施例 4 呋 烷型皂苷碘代衍生物的制取
3 4 以实施例 3制得的知母皂苷 Β-ΠΙ的苷元 3为反应起始物, 制取呋 烷型皂苷碘代衍 生物, 具体步骤如下:
( 1 ) 将实施例 3 中第 (5 ) 步得到的皂苷苷元 0.05mol 和 0.05mol 碘化钠溶于 150m卜 200ml 2-丁酮中, 在 25 °C -50°C反应 1小时 _3小时。
( 2) 反应结束后, 将反应液倒入 1.25L-2L水中, 过滤, 并用水洗两次。
( 3 ) 将滤饼干燥, 用甲醇重结晶。
( 4)过滤,干燥产物,即得呋 烷型皂苷碘代衍生物 4(NMR: 30.60(1-C); 27.27(2-C); 66.05(3-C); 37.37(4-C); 40.68(5-C); 27.22(6-C); 29.64(7-C); 34.92(8-C); 40.02(9-C); 35.57(10-C); 21.38(11-C); 40.15(12-C); 43.88(13-C); 54.83(14-C); 31.39(15-C); 84.59(16-C); 64.68(17-C); 14.45(18-C); 24.26(19-C); 103.59(20-C); 11.83(21-C); 152.38(22-C); 17.14(23-C); 32.62(24-C); 35.82(25-C); 32.87(26-C); 20.23(27-C) )。
以实施例 3制得的知母皂苷 Β-ΠΙ的苷元 3为反应起始物, 制取呋 烷型皂苷溴代衍 生物, 具体步骤如下:
(1) 将实施例 3 中第 (5) 步得到的皂苷苷元 0.05mol溶于 250ml-300mlCH 2 Cl 2 中, 加入 25m卜 30ml 三氟化硼-乙醚络合试剂 ( CAS: 109-63-7 ), 滴加醋酸酐 0.05mol-0.1mol, 20°C-60°C反应 30分钟 _1小时, 用饱和 NaCl水溶液 1L洗反应液, 再用 750ml_lL水洗反应液, 分出有机相, 用 Na 2 S0 4 干燥; 将有机相过滤, 旋干滤液, 用硅胶柱层析纯化产物, 展开剂为体积比 6:1的石油醚与乙酸乙酯。
(2) 将步骤 ( 1) 所得产物溶解于 250ml-300ml 四氢呋喃溶液中, 加入 0.05mol-0.1molNBS和 0.005moH).01mol(Ph) 3 P, 常温反应 5小时 _7小时。
(3) 过滤反应液, 减压旋蒸干溶剂, A200mLCH 2 Cl 2 -MeOH(2 : l,v/v)溶液萃 取, 加入 1 mol/L- 1.5mol/L的甲醇钠甲醇溶液 50ml_ 100ml, 20°C _50°C反应 5小时- 8小时。
(4)减压蒸馏, 浓缩反应, 用乙醇和乙酸乙酯混合液重结晶, 得到终产物呋甾烷 型皂苷溴代衍生物 7 (NMR: 31.52(1-C); 26.44(2-C); 33.85(3-C); 38.32(4-C); 40.68(5-C); 27.22(6-C); 29.64(7-C); 34.92(8-C); 40.02(9-C); 35.57(10-C); 21.38(11-C); 40.15(12-C);
43.88(13-C); 54.83(14-C); 31.39(15-C); 84.59(16-C); 64.68(17-C); 14.45(18-C);
24.26(19-C); 103.59(20-C); 11.83(21-C); 152.38(22-C); 34.41(23-C); 23.63(24-C); 35.43(25-C); 68.07(26-C); 17.04(27-C))。
以实施例 3制得的知母皂苷 Β-ΠΙ的苷元 3为反应起始物, 制取呋 烷型皂苷磷酸酯代 衍生物, 具体步骤如下:
( 1 )将实施例 3中第 (5 )步得到的皂苷苷元 0.05mol溶于 200ml四氢呋喃中降温 至一 -50°C-20°C, 向其中缓缓加入 0.25mol-0.3mol的焦磷酰氯, 保持温度不变, 反应 1小时 -3小时。
(2) 用水稀释反应液, 升温到 40°C-60°C左右, 向其中加入一定量 Na 2 C0 3 至无气泡 放出, 在 25°C-35°C搅拌反应 0.5小时 -1.5小时, 过滤, 分层, 下层水溶液在 50°C下旋蒸至 无明显气泡。 向其中加入盐酸, 调节 pH=l_2, 析出白色沉淀。
( 3 ) 过滤沉淀, 用酸洗涤沉淀三遍, 烘干得产物呋 烷型皂苷磷酸酯代衍生物 8 (NMR: 30.60(1-C); 27.27(2-C); 66.05(3-C); 37.37(4-C); 40.68(5-C); 27.22(6-C); 29.64(7-C);
34.92(8-C); 40.02(9-C); 35.57(10-C); 21.38(11-C); 40.15(12-C); 43.88(13-C); 54.83(14-C); 31.39(15-C); 84.59(16-C); 64.68(17-C); 14.45(18-C); 24.26(19-C); 103.59(20-C); 11.83(21-C); 152.38(22-C); 33.43(23-C); 24.12(24-C); 34.82(25-C); 71.13(26-C); 16.21(27-C))。
实施例 7 呋 烷型皂苷硫酸酯代衍生物的制取
代衍生物, 具体步骤如下:
(1) 将实施例 3中第 (5) 步得到的皂苷苷元 0.05mol溶于 300mLDMF中, 通入 氮气保护, 降温至 -15°C-0°C。将 0.05moH).lmolEt 3 N*SO 3 与 0.4moH).6mol对甲苯磺酸 加入反应液, 反应 3小时 -5小时。
(2)加入 0.05mo卜 0.07mol三乙胺, 之后加入与溶液 1: 1体积比的甲醇。 继续搅 拌, 反应 3小时 -5小时; 升温至 20°C-30°C, 继续搅拌, 搅拌 2小时 -4小时。
(3) 真空旋干溶剂, 用水将上述固体溶解, 并使皂苷吸附于 ODS柱后, 用 4(^ %_7(^ %的甲醇洗脱, 收集洗脱液。
(4) 将溶液减压回收, 蒸干得到固体。
(5)用 50m卜 60ml的 lmol/L的 NaOH溶液溶解固体, 加热到 40°C-70°C, 搅拌 1小时 -3小时。
(6)蒸干溶剂,用丙酮重结晶,过滤,得产物呋 烷型皂苷硫酸酯代衍生物 9(NMR: 30.60(1-C); 27.27(2-C); 66.05(3-C); 37.37(4-C); 40.68(5-C); 27.22(6-C); 29.64(7-C); 34.92(8-C); 40.02(9-C); 35.57(10-C); 21.38(11-C); 40.15(12-C); 43.88(13-C); 54.83(14-C); 31.39(15-C); 84.59(16-C); 64.68(17-C); 14.45(18-C); 24.26(19-C); 103.59(20-C); 11.83(21-C); 152.38(22-C); 33.43(23-C); 24.12(24-C); 32.82(25-C); 84.13(26-C); 17.41(27-C))。
10 11
以实施例 3制得的知母皂苷 Β-ΠΙ的苷元 3为反应起始物, 制取呋甾烷型皂苷三氟 乙酸基取代衍生物, 具体步骤如下:
(1) 将实施例 3中第 (5) 步得到的皂苷苷元 0.05mol溶于 250mlCH 2 Cl 2 中, 加 入 50m卜 60ml 三氟化硼-乙醚络合试剂, 滴加醋酸酐 0.1mol-0.13mol, 20°C-40°C反应 1 小时 -2小时, 用饱和 NaCl水溶液 1L洗反应液, 再用 750ml水洗反应液, 分出有机相, 用 Na 2 S0 4 干燥; 将有机相过滤, 旋干滤液, 用硅胶柱层析纯化产物, 展开剂为体积比 6:1的石油醚与乙酸乙酯。
(2)将(1)中产物溶于 250mlCH 2 Cl 2 中,降温至 -40°C--15°C,加入 0.075mo卜 O.lmol 三氟乙酰三氟甲磺酸酯 (TFAT), 反应 2小时 -4小时。
(3) 反应结束, 加入碳酸氢钠淬灭反应, 继续搅拌 30分钟 -1小时, 升高温度至 20 °C-30°C, 继续搅拌 30分钟 -1小时。 3/:i O S9i/-8l£ s99/-6oiAV
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S¾ ^sEE^^^ 水溶液。 Liebermann-Burchard和 Molish反应呈阳性, 证明该化合物为知母皂苷。 [a] 2 D e = -66.0 (c 0.05 mg/ml, pyridine )。
HR-ESI-MS (正离子模式) 显示 [M+Na]+ w/z 601.3713 (计为 C 33 H 56 0 9 Na: 601.3711 ), 确定其分子式为 C 33 H 55 0 8 。
核磁共振谱提示结构中含有一分子葡萄糖, 氢谱 (1H-MNR, 见图 1 ) 中 δ 4.87 (d, J = 7.7 Hz) 为葡萄糖端基质子信号, 确定为 构型。 综合分析 13 C-NMR谱和 DEPT谱 (见图 2), 确定 26个苷元上的碳信号中存在 4个甲基碳信号, 12个亚甲基碳信号, 13个次甲基碳信号和 4个季碳信号。该化合物苷元部分的碳谱和氢 数据均与知母皂苷 B3相似, 说明它与知母皂 苷 B3具有相似的母核。 在 HMBC谱(见图 3 ) 中, H21与 C20和 C22存在远程相关, 说明双键 的位置与知母皂苷 B3—致。 另外 4.87 (Η-Γ) 葡萄糖端基质子与 75.22 (C-26) 存在远 程相关, 确定糖苷化的位置, 即葡萄糖与 26-OH相连成苷。 相对立体构型由 ROESY谱 (见 图 4) 确定, 即 H-5质子与 H-19质子存在 NOE相关, 确定 A环和 B环为顺式构型。 其它 NMR 数据及相关关系见表 1、图 5和图 6。该化合物未见文献报道,为新化合物,命 为 timosaponin Bill -4 (或简称: ΒΠΙ -4)。
表 1 式 III- II所示衍生物的 NMR数据
式 III- II
No.
<¾ (J in Hz) Sc
1 1.89 (m) 30.64
2 1.94 (m), 1.33 (m) 27.14
3 4.42 (m) 66.07
4 1.63 (m), 1.55 (m) 34.41
5 2.17 (m) 37.04
6 1.34 (m), 1.18 (m) 26.97
7 1.76 (m), 1.59 (m) 28.65
8 1.52 (m) 35.27
9 1.80 (m) 40.12
10 - 35.57
11 1.79 (m), 1.40 (m) 21.38
12 1.39 (m), 1.27 (m) 40.15
13 - 43.88
14 1.49 (m) 54.82
15 1.89 (m), 1.51 (m) 31.39
16 4.88 (m) 84.59
17 2.55 (d, 10.1) 64.68
18 0.75 (s) 14.45
19 1.05 (s) 24.26
20 - 103.59
21 1.67 (s) 11.83
22 - 152.38
23 1.56 (m) 34.41
24 2.23 (m), 1.04 (m) 23.62
25 1.63 (m) 33.68
26 4.11 (dd, 5.7, 9.2), 3.52 (dd, 6.9, 9.2) 75.22
27 1.08 (m) 17.16
1 ' 4.87 (m, 7.7) 105.19
2' 4.07 (m) 75.21
3' 4.28 (m) 78.53
4' 4.28 (m) 71.68
5' 4.00 (m) 78.60
6' 4.59 (m),4.43 (m) 62.82
实施例 11 抗抑郁活性验证
FST和 TST两种行为绝望模型对绝大多数抗抑郁药敏感 , 操作简单、 快捷, 被广泛 用于该类药物的筛选, 本实施例也以此模型对实施例 1-实施例 9所制得的衍生物的抗抑 郁药理作用进行验证。
实验选用雄性 ICR小鼠, 体重 (20 ±2 ) g, 购自中科院上海药物所实验动物中心, 自由摄食饮水, 室温 (23 ± 2) V , 自然光照。 所有小鼠随机分组为 10只 /笼, 于词养环 境中适应 3天后开始实验, 实验前禁食 12小时, 饮水自由。 具体给药方法为: 空白对照 组一组, 给等体积的生理盐水。
FST验证实验
1 ) 具体操作: 连续给药 6天, 末次给药后 1小时进行测试。 首先利用开野法测定小 鼠的自主活动, 即将小鼠单独置于圆柱型玻璃缸内, 计时 4min, 记录后 2min内的抬臂 次数。 然后将小鼠单独放入高 20cm、 直径 14 cm的圆柱型玻璃缸中, 缸内水深 10 cm, 水温 23-25 °C。 从小鼠入水后计时 6min, 记录后 4min内的累计不动时间 (判定不动标准: 小鼠在水中停止挣扎, 或呈漂浮状态, 仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面)。 各 组小鼠平行操作。
2 ) 实验数据处理: 实验结果以均值士标准误 (x ± SE ) 表示。 采用 t检验进行统计 分析, 判断是否具有显著性意义。 首先对其自主活动指标进行 t检验, 其1> > 0.05说明小 鼠的自主后动没有影响, 以避免中枢兴奋药的干扰。 然后对强迫游泳实验指标进行 t检 验, 空白对照组与高中低剂量三组实验组分别比较 ,判断是否具有抗抑郁作用及抗抑郁 作用强度与剂量的关系。
TST验证实验
1 ) 具体操作: 连续给药 6天, 末次给药后 1小时进行测试。 首先利用开野法测定小 鼠的自主活动, 即将小鼠单独置于圆柱型玻璃缸内, 计时 4min, 记录后 2min内的抬臂 次数。 然后用胶带将小鼠尾在距尾尖 2cm处粘在横杠上, 四周以板隔离动物视线, 横杠 距地面约 25cm, 使小鼠距地面约 10cm, 计时 6min, 记录后 4min内累计不动时间, 各组 小鼠平行操作。
2 ) 实验数据处理: 实验结果以均值士标准误 (x ± SE ) 表示。 采用 t检验进行统计 分析, 判断是否具有显著性意义。 首先对其自主活动指标进行 t检验, 其1> > 0.05说明小 鼠的自主后动没有影响, 以避免中枢兴奋药的干扰。 然后对悬尾实验指标进行 t检验, 空白对照组与高中低剂量三组实验组分别比较 ,判断是否具有抗抑郁作用及抗抑郁作用 强度与剂量的关系。
通过动物实验验证本发明制取的衍生物对抗抑 郁的作用, 结果和数据见表 2和表 3。 腹腔注射分别给予小鼠 10mg/Kg各种化合物, 另设空白对照组 (生理盐水)。 对小鼠自主活 动的指标进行 t检验, 无显著差异, 说明这些化合物都对小鼠的自主活动无影响。 分别对小 鼠强迫游泳和悬尾试验的不动时间进行 t检验, 结果表明, 实施例 1 -实施例 9所制得的各种 衍生物均能明显缩短小鼠强迫游泳和悬尾的不 动时间, 提示它们具有显著的抗抑郁活性。 腹腔给药对 ICR小鼠强迫游泳不动时间的影响
不动时间 ±SE (平均 给药剂量 (mg/Kg) 动物数 (只)
值, 秒) 生理盐水 0.1ml/10g 10 190.00土 7.85 实施例 1 (化合物 2) 10 10 86.60土 8.76** 实施例 2 (化合物 2) 10 10 89.67 ±10.72* 实施例 3 (化合物 2) 10 10 103.50土 6.59* 实施例 4 (化合物 4) 10 10 105.72土 8.25* 实施例 5 (化合物 7) 10 10 110.65土 9.59* 实施例 6 (化合物 8) 10 10 111.58土 10.26* 实施例 7 (化合物 9) 10 10 116.38土 8.96* 实施例 8(化合物 11) 10 10 109.28土 10.35* 实施例 9(化合物 12) 10 10 1071土 10.25* 表示 P<0.05; "** " 表示 P<0.01。
表 3 腹腔给药对 ICR小鼠悬尾不动时间的影响
不动时间 ±SE (平均 给药剂量 (mg/Kg) 动物数 (只)
值, 秒) 生理盐水 0.1ml/10g 10 119.90土 5.65 实施例 1 (化合物 2) 10 10 42.30土 6.28** 实施例 2 (化合物 2) 10 10 43.26土 10.62* 实施例 3 (化合物 2) 10 10 53.34土 10.34* 实施例 4 (化合物 4) 10 10 57.28土 9.98* 实施例 5 (化合物 7) 10 10 59.26土 10.09* 实施例 6 (化合物 8) 10 10 52.58±11.27* 实施例 7 (化合物 9) 10 10 61.36土 9.81* 实施例 8(化合物 11) 10 10 54.98±7.98** 实施例 9(化合物 12) 10 10 59.76土 10.34*
*,, 表示 P<0.05; "**,, 表示 P<0.01。