CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención provee bloqueadores de hemicanales para el tratamiento de la epilepsia.

En particular, la presente invención se refiere a compuestos orgánicos que actúan como inhibidores selectivos de hemicanales formados por conexinas y que son útiles en el tratamiento de la epilepsia.

En otra realización de la presente invención se provee una composición que comprende compuestos inhibidores selectivos de hemicanales formados por conexinas útiles en el tratamiento de la epilepsia en combinación con otros compuestos antiepilépticos.

ANTECEDENTES

Actualmente, los tratamientos para la epilepsia y el manejo de las crisis epilépticas se enfocan en medicamentos con acción en blancos moleculares localizados en neuronas.

Los medicamentos existentes permiten controlar parcialmente las convulsiones solo en 70% de los casos mediante el bloqueo de los canales del ion sodio neuronales en el cerebro. Estos canales del ion sodio son los mismos que son determinantes para la excitabilidad del cerebro y para el disparo de las respuestas eléctricas neuronales.

Sin embargo, además de que los compuestos en uso actual no logran controlar en su totalidad las convulsiones, tales fármacos tienen efectos secundarios adversos, como el deterioro de la audición y no son eficientes en todos los pacientes. Es posible que sea necesario cambiar la dosis de vez en cuando o incluso puede que la epilepsia no mejore después de haber ensayado dos o tres fármacos anticonvulsivos (denominada "epilepsia resistente al tratamiento").

i Por ejemplo, entre los medicamentos existentes útiles en el tratamiento de la epilepsia se conocen carbamazepina, valproato y fenitoína, entre otros.

La fenitoína o difenilhidantoina es un compuesto utilizado para el manejo de las convulsiones, que reduce la conductividad eléctrica entre las neuronas, bloqueando los canales del ion sodio sensibles al voltaje. Se usa para controlar determinados tipos de convulsiones y también para tratar y prevenir las convulsiones que pueden aparecer durante o después de una cirugía del cerebro o del sistema nervioso. Este compuesto también se utiliza como agente anti-arrítmico pues bloquea los canales del ion sodio cardíacos.

De acuerdo a lo descrito en el estado del arte, en CL 1556-2014 se indica que si bien se conocen numerosos moduladores de conexinas y varias líneas de investigación sugieren que su uso puede tener utilidad terapéutica en el tratamiento de epilepsia, arritmias cardíacas, cáncer, accidente cerebrovascular u otras condiciones (Spray, Rozental et al. 2002), la mayor parte de ellos son inespecíficos, afectando la actividad no solo de los hemicanales, sino también de canales intercelulares formados por conexinas, por lo que los compuestos conocidos actualmente en la técnica presentan baja eficacia y mecanismos de acción inespecíficos o secundarios a la acción farmacológica en otros blancos terapéuticos que modifican la actividad de los hemicanales formados por conexinas y son por lo tanto, responsables de efectos secundarios que no permiten usarlos en forma crónica ni en dosis superiores para controlar efectivamente las patologías de interés. A partir de lo descrito, se desprende que en la actualidad, los bloqueadores de hemicanales formados por conexinas disponibles también inhiben las uniones en hendidura ("gap junctions"), que desempeñan un papel relevante en la coordinación de numerosas respuestas eléctricas y metabólicas en diversos tejidos. Por lo tanto, es deseable la obtención de compuestos bloqueadores selectivos de hemicanales, que no presenten efecto sobre los canales de las uniones en hendidura, que podrían ser útiles para diseñar racionalmente tratamientos terapéuticos para diversas enfermedades, minimizando los efectos secundarios no deseados. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . PTZ (pentilentetrazol) induce actividad de hemicanales en células cerebrales. Imágenes representativas del hipocampo en rebanadas de cerebro. Los distintos tipos celulares en rebanadas de cerebro de animales controles (dos paneles superiores de cada figura) o tratados con PTZ (dos paneles inferiores de cada figura). Las zonas blancas corresponden a la reactividad de cada marcador celular específico (Paneles a la izquierda : A, C, E, G, I, K, M, O, Q y S) y la captación de etidio en células del mismo campo(Paneles de la derecha : B, D, F, H, J, L, N, P, R Y T). Mastocitos (A-B), microglias (C-D), astrocitos (E-F), oligodendrocitos (G-H) y neuronas (l-J) de ratones controles y tratados con PTZ.

Figura 2. Efecto de PTZ sobre la activación de hemicanales en los distintos tipos celulares es tiempo dependiente.

Figura 3. Carbenoxolona, un bloqueador no selectivo de hemicanales y canales de uniones en hendidura, bloquea actividad hemicanales formados por conexinas y canales formados por panexinas inducida por PTZ en macroglias y neuronas.

Figura 4. Molécula D4 bloquea la actividad de hemicanales formados por conexina inducida por PTZ en células cerebrales. Imágenes representativas del hipocampo de rebanadas en cerebro. Los distintos tipos celulares se muestran en blanco en los paneles de la izquierda: microglias (A, C, E), astrocitos (G, I, K) y neuronas (M, O, K) de ratones controles, inducidos con PTZ y pre-tratados con molécula D4 y PTZ. La captación de Etd se observa en blanco en los paneles de la derecha para cada tipo celular, respectivamente, de ratones control (B, H, N), ratones tratados con PTZ (D, J, P) y los ratones pre-tratados con molécula D4 y luego tratados con PTZ (F, L, R).

Figura 5. Molécula D4 bloquea actividad hemicanales inducidas por PTZ en las células cerebrales. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos bloqueadores de hemicanales formados por conexinas para el tratamiento de la epilepsia.

La presente invención provee además una composición que comprende dichos compuestos en combinación con otros compuestos antiepilépticos.

En una realización preferente de la presente invención se provee una composición de bloqueadores de hemicanales formados por conexinas con un compuesto antiepiléptico o anticonvulsivante, como por ejemplo, fenitoina para el control total de las convulsiones epilépticas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A diferencia de los medicamentos utilizados actualmente para el tratamiento de la epilepsia, que corresponden a medicamentos con acción en blancos moleculares localizados en neuronas, la presente invención provee un tratamiento enfocado en las glías, que son las responsables del estado inflamatorio que se desencadena cuando se exacerba la actividad neuronal, y que en condiciones normales nutren a las neuronas y mantienen el medio ambiente para que la neuronas funcionen normalmente. Por el contrario, si las glias expresan mucha actividad de hemicanales no pueden cumplir dichas funciones normales dejando a las neuronas en un estado de excitación desregulado, que podría conducir a excitotoxicidad o muerte neuronal. Por esto, la hipótesis inicial para desarrollar la presente invención es que el aumento de la actividad neuronal produce una alta liberación de neurotransmisores y de iones potasio que activan las glías (micro- y macro- glias), las que inician un estado inflamatorio, que se perpetúa favoreciendo la recurrencia del aumento de actividad neuronal.

Por ello, con un tratamiento enfocado en reducir o evitar la neuroinflamacion al reducir la actividad de los hemicanales formados por conexinas en las células gliales, se previene la recurrencia de la alta actividad neuronal y la excitoxicidad.

Consistente con este mecanismo, se ha demostrado que en otras condiciones que desencadenan la respuesta de neuroinflamacion como son el infarto cerebral y la enfermedad de Alzheimer, y el uso de estrategias de solo utilidad solamente experimental demostramos que la actividad de los hemicanales gliales aumenta significativamente y participa en la degeneración celular. En el infarto cerebral en presencia de alta glicemia no solo induce muerte neuronal sino que además mueren células gliales, y estudios in vitro han demostrado que la inhibición de los hemicanales drásticamente reduce la muerte astroglial en cultivos celulares expuestos a alta glucosa y falta de oxígeno, condición que imita el infarto cerebral (Orellana y col., Glia 2010'). Además, hemos demostrado que el péptido beta amiloideo, responsable de la neuroinflamación presente en la enfermedad de Alzheimer, aumenta la actividad de los hemicanales gliales y por ende las células liberan más glutamato y ATP induciendo muerte neuronal (Orellana y col., J Neurochem 201 1 "; Orellana y col., J Neurosci 201 1 ^ii¡ ). En consecuencia, el uso de inhibidores de hemicanales formados por conexinas permite reducir drásticamente el deterioro cerebral y por ende, mejora sustancialmente la calidad de vida del paciente.

Para mostrar las propiedades de la molécula 2-quinolinacarboxilato de 2-(4- clorofenilo)-2-oxo-1 -feniletilo, (D4) como droga anticonvulsionante se utilizó un modelo agudo de epilepsia en ratones C57BL/6, el cual se emplea para generar actividad epiléptica en un cerebro normal inducido con un agente químico convulsionante. Como agente epileptogénico se utilizó PTZ (Pentilentetrazol) y para determinar la dosis efectiva se realizó una curva dosis respuesta, como se muestra en el Ejemplo 1 .

Opcionalmente, es posible utilizar otros compuestos inhibidores de hemicanales formados por conexinas, tales como 1 -benzil 4-clorfeníl-piperacina para el tratamiento de la epilepsia.

En los últimos 5 años se ha descrito a través de diferentes modelos de epilepsia en roedores cambios en los niveles de RNAm y expresión de conexinas y panexinas asociadas a procesos epileptogénicos (Mylvaganam et al., 2014 ^iv ). Mediante el uso de ratones knockout para panexina 1 (Panxl ) se ha demostrado que la activación de canales formados por Panxl contribuye en la hiperactividad neuronal durante el episodio epileptogénico (Santiago et al., 201 1 ^V ). Sin embargo, no se ha estudiado la contribución de células gliales durante una convulsión epiléptica. Para determinar la participación de hemicanales formados por conexinas en los distintos tipos celulares cerebrales en el tiempo, se realizó un curso temporal para medir actividad de hemicanales a los 10, 20 y 30 min post administración de PTZ mediante la técnica de captación de colorante, tal como se muestra en el Ejemplo 2. Para determinar que la actividad de hemicanales en las macroglias y neuronas es mediada por hemicanales y canales formados por conexinas y panexinas, respectivamente, se caracterizó por su sensibilidad al bloqueador carbenoxolona (Cbx), un bloqueador no selectivo de ambos (hemicanales y canales formados por conexinas y panexinas, respectivamente) como se muestra en el Ejemplo 3.

En los ratones tratados con PTZ se demostró que este compuesto agonista no selectivo de los receptores GABAA, provoca que los animales desarrollen convulsiones antes de los 10 minutos post-administración, seguido de un período de varias horas donde los ratones manifiestan muy baja actividad motora y contracturas esporádicas. Sin embargo, los animales que recibieron inhibidores de hemicanales solo manifiestan las convulsiones antes de los 10 minutos post-administración de PTZ pero después su comportamiento es similar al de los animales no tratados con PTZ.

Además, la aplicación de PTZ a rebanadas de cerebro indujo la apertura de hemicanales gliales.

Ventajas A diferencia de los actuales tratamientos para la epilepsia enfocados en blancos moleculares localizados en neuronas, la presente invención se enfoca en las glias. Esto es porque el aumento de la actividad neuronal produce mayor liberación de neurotransmisores y de iones potasio que producen activación de las glías, que inician un estado inflamatorio que perpetúa un desbalance del microambiente neuronal favoreciendo la recurrencia del aumento de actividad neuronal.

Por lo tanto, si el tratamiento se enfoca en reducir o evitar la neuroinflamación se previenen las recurrencias de las crisis epilépticas, mejorando sustancialmente la calidad de vida del paciente.

Además, el uso combinado de bloqueadores de hemicanales de conexinas en conjunto con una droga de uso actual, permite evitar completamente las crisis epilépticas, superando ampliamente el 70% en el control de las convulsiones alcanzado por los medicamentos actuales que bloquean los canales de sodio en el cerebro. De esta forma mejoraría aún más la inclusión social y la calidad de vida de los pacientes con esta condición.

Tal como fue mencionado, un 30% de los pacientes epilépticos no responden a las drogas de uso actual, por lo que el uso de los inhibidores de hemicanales como agentes terapéuticos resulta en una solución relevante en los casos refractarios.

Basado en el desarrollo de la presente invención, en que fue observado que el tratamiento con fenitoina no previene las convulsiones inducidas por PTZ después de los 10 minutos de tratamiento. Sin embargo, los bloqueadores de hemicanales formados por conexinas las previenen completamente.

Por lo tanto, tal como muestran los ejemplos, el uso combinado de bloqueadores de hemicanales formados por conexinas y otro agente antiepiléptico permite controlar las crisis epilépticas completamente y ofrece una solución en los casos refractarios a la terapia.

De acuerdo a los criterios evaluados no hubo efectos colaterales observados en las dosis evaluadas (ver Ejemplo 4), donde la puntuación fue de cero para todas las variables en cada tratamiento estudiado. Además, la mortalidad fue de cero en todas las concentraciones evaluadas, demostrando el bajo riesgo del uso de dicho compuesto.

Para determinar la efectividad de la molécula D4 como anti-epiléptico se evaluó como tratamiento previo a la inducción de epilepsia con PTZ como se muestra en el Ejemplo 5. En una realización de la invención, se proveen procedimientos de uso de bloqueadores de hemicanales formados por conexinas y elaboración de medicamentos útiles para tratar la epilepsia.

En otra realización de la invención, se proveen procedimientos de uso de bloqueadores de hemicanales formados por conexinas y elaboración de medicamentos útiles para tratar la epilepsia en combinación con compuestos que bloquean los canales del ion sodio en el cerebro.

En otra realización de la invención, se provee una composición que comprende bloqueadores de hemicanales formados por conexinas en combinación con fenitoína para tratar la epilepsia. EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Uso de pentilentetrazol (PTZ) en un modelo donde se inducen episodios epileptoqénicos en ratones C57BL/6.

Como agente epileptogénico se utilizó PTZ (Pentilentetrazol), inhibidor de los receptores GABAA, ampliamente utilizado en el estudio y desarrollo de fármacos anticonvulsionantes.

Para determinar la dosis efectiva se realizó una curva dosis respuesta en base a los antecedentes disponibles en la literatura. Ratones machos adultos de 2 meses fueron separados en jaulas individuales para la administración vía intraperitoneal PTZ de una dosis única de 65, 70, 75, 80 y 90 mg/kg de peso del ratón. Se observó que la dosis de 70 mg/kg induce convulsiones, desde estereotipos faciales (movimientos faciales) a convulsiones mioclonica (postura de canguro), clónica (caída sobre el costado) y tónico-clónica (caída de espalda), sin ser letal (Tabla 1 ).

Dosis superiores (> 100 mg/kg) inducen episodios epileptogénicos, pero con un porcentaje de mortalidad del 100% a los 5 min post administración del agente convulsionante, mientras que una dosis menor (< 65 mg/kg) no se inducen episodios epileptogénicos evidentes. Tabla 1 . Dosis respuesta de PTZ en ratones adultos C57BL/6

Ejemplo 2: Activación de hemicanales en células cerebrales inducida por PTZ es tiempo dependiente.

Ratones machos adultos de 2 meses fueron inyectados vía i.p. con PTZ (70 mg/kg) o tampón fosfato salino (PBS) como control. Los ratones fueron sacrificados después de 10, 20 y 30 min post tratamiento para extraer los cerebros y generar rebanadas coronales de 400 μιη de espesor utilizando un vibrátomo. Las rebanadas se estabilizaron durante 1 h previo a la captación de colorante, inmersas en ACSF (líquido cefalorraquídeo artificial) burbujeado con 95% O2 y 5% CO2 y a temperatura ambiente. Rebanadas de cerebro fueron incubadas con el colorante bromuro de etidio (Etd, 4 μΜ) durante 10 minutos. Posteriormente, las rebanadas fueron lavadas y fijadas durante 1 h con paraformaldehído (4%). Las rebanadas de cerebro fueron incubadas durante 40 min con solución de bloqueo (PBS, gelatina 0,2%, tritón 1 %). Posteriormente, las muestras se incubaron toda la noche a 4°C con el anticuerpo primario contra marcadores moleculares de los diferentes tipos celulares: anti-mastocito "Transmembrane tyrosine kinase" receptor CD1 17 (CD1 17); anti-microglias Integrin aM (CD1 1 b); anti-astrocitos "glial fibrillary acidic protein" (GFAP); anti-oligodendrocitos "proteolipid protein" (PLP) y antineurona neuronal-market (NeuN). Después de lavar con PBS (solución salina tamponada con fosfato), se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado a Cy2 durante 2 horas a temperatura ambiente y evitando la luz.

Finalmente, las rebanadas de cerebro fueron lavadas y montadas en medio de montaje Flouromount G y observadas directamente al microscopio confocal laser-scanning (Nikon Eclipse Ti). Imágenes consecutivas fueron tomadas con objetivo 40X a intervalos de 1 pm secuencialmente con dos láser (argón, 488 nm y helio/neón, 543 nm). En la figura 1 , en la región de hipocampo, se observan imágenes representativas de mastocitos (1 .A,C), microglias (1 .E,F), astrocitos ( 1 .1 , K) , oligodendrocitos (1 .M,O) y neuronas (1 .Q,S) y la captación de Etd - de los ratones control y ratones inducidos con PTZ (1 .B,D, 1 .F,H, 1 .J,L, 1 .N,P, 1 .R,T). Las rebanadas de cerebro de animales tratados con 70 mg/kg PTZ son positivas a alta actividad de hemicanales (fluorescencia de etidio vista como blanco brillante lo que revela alta actividad de hemicanales con respecto a sus controles. Barra de calibración= 10 μπΊ.

El promedio de datos de la captación de etidio fue normalizado a la condición control (línea punteada) de cada tipo celular. Los resultados revelan que PTZ aumenta secuencialmente la actividad de los hemicanales primero en astrocitos y oligodendrocitos (Figura 2. A), luego de 30 min en mastocitos, microglias y neuronas (Figura 2. B y C). Estos resultados sugieren que la activación de hemicanales en las macroglias (astrocitos y oliogdendrocitos) podría desencadenar la hiperactividad neuronal durante el episodio epileptogénico. Los resultados obtenidos se expresaron como la media ± SEM. Las muestras se determinaron mediante la prueba Student's t-test ( ^* p < 0,05).

Ejemplo 3: Activación de hemicanales en células cerebrales inducida por PTZ es bloqueada por carbenoxolona.

Ratones machos adultos de 2 meses fueron inyectados vía intraperitoneal con PTZ (70 mg/kg) o PBS como control. Transcurrido 30 min post inyección del tratamiento se evaluó la acción de Cbx a dos concentraciones, 10 μΜ para bloquear hemicanales formados por panexinas y 100 μΜ para bloquear tanto hemicanales formados por conexinas como canales formados por panexinas. Los ratones fueron sacrificados para extraer los cerebros y obtener rebanadas coronales de 400 μιη de espesor. Las rebanadas, una vez estabilizadas, fueron tratadas con Cbx durante 20 min y a continuación fueron incubadas con el colorante bromuro de etidio (4 μΜ) durante 10 minutos. Posteriormente, las rebanadas fueron fijadas y se continuó con el proceso de tinción por inmunofluorescencia como se describió anteriormente. El promedio de datos de la captación de etidio fue normalizado a la condición control (línea punteada) de cada tipo celular. Los resultados demuestran que ambas concentraciones de Cbx bloquean la captación de etidio (actividad de hemicanales y canales formados por conexinas y panexinas, respectivamente) inducida por PTZ a la condición basal en astrocitos (Figura 3A), oligodendrocitos (Figura 3B) y neuronas (Figura 3C). Estos resultados sugieren la participación de actividad hemicanales formados por conexinas y canales formados por panexinas en el episodio epileptogénico. Los resultados obtenidos se expresaron como la media ± SEM. Las muestras se determinaron mediante la prueba Student's t- test ( ^* p < 0,05).

Ejemplo 4: Molécula D4 no afecta viabilidad en ratones C57B/6

Para evaluar la toxicidad o letalidad de la molécula D4 se inyectaron ratones adultos de 2 meses vía intraperitoneal en dosis crecientes (0,2; 2; 20; 200 y 2.000 mg/kg de peso del ratón) y se dejaron en observación durante 72 horas. Terminado el tiempo de observación se evaluaron los aspectos conductuales y fisiológicos de los animales en base al Protocolo de Supervisión de acuerdo a los criterios de Bioética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile que rigen en el laboratorio. Las variables consideradas incluyeron datos fisiológicos (pérdida de peso), aspecto (postura) y comportamiento espontáneo (actitud frente a estimulo). De acuerdo a los criterios evaluados no hubo efectos colaterales observados en ninguno de las dosis evaluadas, la puntuación fue de cero para todas las variables en cada tratamiento estudiado, considerando que una puntuación de 0-3 es normal (Tabla 2). Además, la mortalidad fue de cero en todas las concentraciones evaluadas. La evaluación de mortalidad de la molécula D4 como droga anticonvulsionante administrada en ratones previa a la inducción de epilepsia con PTZ fue de cero (Tabla 3). Tabla 2: Protocolo de Supervisión para Ratones tratados con molécula D4.

PUNTUACION TOTAL de 0 a 1 2

Nota: Cuando un animal obtiene una puntuación de 3 en más de un parámetro, todos los "3" pasan a "4" Las mediciones son realizadas por personal capacitado, que conoce el comportamiento basal o habitual de los animales en estudio.

Medidas correctoras sugeridas de acuerdo a la puntuación obtenida para cada animal son las siguientes:

- De 0-3 Normal

- De 4-6 Supervisar cuidadosamente.

- De 7-12 Sufrimiento intenso

Criterios de punto final: Puntuaciones entre 7-12 debieran ser indicadores de que el animal presenta un deterioro significativo o sufrimiento intenso.

Tabla 3. Molécula D4 (2-quinolinacarboxilato de 2-(4-clorofenilo)-2-oxo-1 - feniletilo) como droga anticonvulsionante no es letal.

células cerebrales

Ratones machos adultos de 2 meses fueron inyectados vía intraperitoneal con 2 mg/kg de molécula D4, en dos instancias: seis y una hora antes de la administración de PTZ (70 mg/kg). En el caso de los animales control se usa tampón fosfato salino (PBS). Transcurrido 30 min post-administración de PTZ los ratones fueron sacrificados para extraer los cerebros y medir posteriormente la actividad de los hemicanales con la técnica de captación de etidio. Mediante inmunofluorescencia y visualización en microscopía confocal se identificaron los tipos celulares.

Los animales pre-tratados con molécula D4 no manifiestan convulsiones y/o contracturas corporales ni cambios conductuales evidentes a diferencia de los ratones controles. En la Figura 4 se muestran las imágenes representativas de la región de hipocampo donde se obverva en blanco microglias (4. A, C, E), astrocitos (4.G, I, K) y neuronas (4.M, O, Q). La captación de Etd se observa en blanco en los paneles de la derecha para cada tipo celular, respectivamente, de ratones control (4.B, H, N), ratones tratados con PTZ (4.D, J, P) y los ratones pre- tratados con molécula D4 y luego tratados con PTZ (4.F, L, R). Las rebanadas de cerebro de animales tratados con 70 mg/kg PTZ son positivas a la fluorescencia de Etd, lo que revela alta actividad de hemicanales con respecto a sus controles, mientras que las rebanadas provenientes de ratones pre- tratados con la molécula D4 no son positivas a Etd al igual que los controles . Barra de calibración= 10 pm.

El promedio de datos de la captación de etidio fue normalizado a la condición control (ver Figura 5, línea punteada) de cada tipo celular. Los resultados demuestran que el pre-tratamiento con molécula D4 bloquea la actividad de los hemicanales inducida por PTZ y la activación basal en microglias, astrocitos y neuronas. Estos resultados indican que la molécula D4 es un bloqueador efectivo de la actividad de hemicanales durante un episodio epileptogénico. Los resultados obtenidos se expresaron como la media ± SEM. Las muestras se determinaron mediante la prueba Student's t-test ( ^* p < 0,05).