Die Erfindung betrifft einen Inhibitor der 11 ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (11 ß-HSD).

Das Enzym 11 ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (11 ß-HSD) katalysiert die in Fig. 1 darge¬ stellte Gleichgewichtsreaktion zwischen Cortison und Cortisol, wobei zwei gewebespezifi¬ sche Isoformen bekannt sind, die als l lß-Hydroxy Steroid Dehydrogenase Typ 1 (llß-HSDl) und 11 ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 2 (1 lß-HSD2) bezeichnet werden. Während die l lß-HSDl vorwiegend in der Leber und im Fettgewebe vorkommt, ist die 1 lß-HSD2 haupt- sächlich in der Niere zu finden. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die 11 ß-HSD 1, die in vitro eine Aktivität sowohl als l lß-Dehydrogenase als auch als 11-oxo-Reduktase entwi¬ ckelt, in vivo hauptsächlich als Reduktase fungiert.

Es ist auch bekannt, dass Glucocorticoide, zu denen Cortisol gehört, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Diabetes Mellitus, Metabolischem Syndrom und Fettsucht spielen. Bei adipösen Patienten konnte beispielsweise ein gestörter Cortisolmetabolismus nachgewiesen werden, der offensichtlich auf eine deutlich erhöhte, l lß-HSDl Aktivität in der Leber und im subkutanen Fettgewebe zurückzuführen ist.

Es konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass Glucocorticoide die kognitiven Fähigkeiten beeinflussen (de Quervain et al. 1998). Das Enzym l lß-HSDl reguliert dabei die Glucocorti- coid- Aktivität im Gehirn. Die Hemmung der l lß-HSDl beeinflusst die kognitiven Fähigkei¬ ten bei älteren Menschen in positiver Weise (Sandeep et al. 2004).

In der Literatur wurde ebenfalls beschrieben, dass nach Gabe von Carbenoxolon, einem un¬ spezifischen l lß-HSDl Inhibitor, an Glaukom-Patienten eine Verbesserung zu beobachten ist. Die Autoren machen die Hemmung der l lß-HSDl für die Reduzierung des Augenin¬ nendrucks verantwortlich.

Auch bei der Entwicklung des Skeletts spielen Glucocorticoide eine essentielle Rolle, sind jedoch im Überschuss schädlich. Glucocorticoid-induzierter Abbau von Knochen wird zu¬ mindest teilweise auf die Hemmung der Knochenneubildung, hervorgerufen durch die Unter¬ drückung der Osteoblastenproliferation und Kollagensynthese, zurückgeführt.

Zur Behandlung u.a. der oben genannten Krankheitsbilder wurden in den vergangenen Jahren verschiedene Substanzen entwickelt, die die Aktivität der l lß-HSDl hemmen oder die Ge- -. 0 _

nexpression der l lß-HSDl regulieren (WO 02/072085 A3, US 2003/0166689, US 2003/0148349, US 2004/0048912). Diese Substanzen haben jedoch den Nachteil einer schlechten Pharmakokinetik.

Es sind ebenfalls Inhibitoren der l lß-HSDl mit triterpenoiden Grundgerüst (Steroide, Sapo- nine, Triterpenoide) bekannt (Dexamethason, Glycyrrhetinsäure, Carbenoxolon). Diese haben jedoch den Nachteil, dass sie nicht selektiv wirken, sondern auch die zweite vorkommende Isoform, llß-HSD2, hemmen. Die Inhibierung der llß-HSD2 aber bewirkt eine Hypervolä¬ mie durch Störung des Elektrolythaushalts in der Niere, was sich u. a. in einer Blutdruckstei- gerung bemerkbar macht.

Zur Umgehung der unerwünschten Nebenwirkungen selektiver 1 lß-HSDl Inhibitoren schlägt die WO 03/086410 Al vor, mit den Inhibitoren ein Diuretikum zu verabreichen. Die Gabe eines Diuretikums schränkt die Anwendung von l lß-HSD Inhibitoren jedoch stark ein, da z.B . Diuretika bei Patienten mit Diabetes kontraindiziert sind.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, einen Inhibitor der l lß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase mit guter Pharmakokinetik bereitzustellen, der die Isoform l lß-HSDl, nicht aber die Isoform l lß-HSD2 hemmt.

Die Aufgabe wird durch einen Inhibitor mit den Merkmalen des Hauptanspruches gelöst. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Inhibitors wie¬ der.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die von der l lß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase katalysierte Gleichgewichtsreaktion,

Fig. 2 ein berechnetes Modell der räumlichen Verhältnisse der Inhibie¬ rung der 11 ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase durch den erfin¬ dungsgemäßen Inhibitor anhand des bevorzugten Ausführungs¬ beispiels 3ß,7ß,23-Trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al, Fig. 3 ein HPLC-Profϊl zur Untersuchung der Inhibition der humanen l lß-HSDl-Reduktase-Aktivität anhand der Cortisol / Cortison Relation,

Fig. 4 ein HPLC-Profil zur Untersuchung der Inhibition der l lß- HSDl-Dehydrogenaseaktivität anhand der Cortisol / Cortison Relation und

Fig. 5 die Wirkung des in einem Extrakt aus Momordica charantia ent- haltenen Inhibitors nach der Erfindung auf die Aktivität der 11 ß- HSDl (A5 B) und der 1 lß-HSD2 (C).

Die Erfindung umfasst chemische Verbindungen mit einem Gonan-Grundgerüst, das an der Position C9 oder an der Position C 8 einen Kohlenstoffsubstituenten trägt, der sp2 oder sp3 hybridisiert ist. Dabei kann in Position 17 ein weiterer Substituent sitzen, wie es in den natür¬ lich vorkommenden Gonanen der Fall ist, oder Cl 7 kann auch eine einfache Methylengruppe darstellen.

[1] [2]

Eine funktionelle Gruppe R am Kohlenstoffsubstiuenten kann sein: -F, -Cl, -Br, -OH, =0, - CO2H -SH, -S-Alkyl, -O-Alkyl, -O-Aryl, -O-Carbonsäure, -S-Carbonsäure, -NH2, sekundärer Aminstickstoff, tertiärer Aminstickstoff, ein Glukon oder ein Ester. R kann auch eine funktio¬ nelle Gruppe sein, die oben nicht aufgeführt ist, die aber als Wasserstoff-Donor oder - Akzeptor agiert und somit zu den katalytisch wichtigen Aminosäuren des katalytischen Zent¬ rums Wasserstoffbrückenbindung(en) bilden kann.

Der Substituent kann auch eine innermolekulare Brücke zu irgendeinem Kohlenstoffatom im Gonan-Grundgerüst bilden. Das Gonan-Grundgerüst kann gesättigte und ungesättigte Bin¬ dungen oder auch aromatische Ringe in der Struktur aufweisen. Theroretische Berechnungen und Modellierungversuche zeigen, dass ein Substituent sowohl an der Position 9 als auch an der Position 8 eines Gonan-Grundgerüstes mit dem katalytischen Zentrum der l lß-HSDl in Wechselwirkung treten kann. In Fig. 2 ist die Wechselwirkung eines bevorzugten erfindungsgemäßen selektiven Inhibitors mit der l lß-HSDl exemplarisch dargestellt. Mittels Molecuar modelling wurde 3ß,7ß,23-Trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al in die Kristallstruktur der menschlichen l lß-HSDl eingefügt. Aus Gründen der Anschaulich¬ keit ist nur das katalytische Zentrum mit eingebundenem Inhibitor dargestellt. Die Wasser¬ stoffbrückenbindung, die die Aldehydfunktion am Cl 9 (= Substituent am C9) des Inhibitors mit der OH-Gruppe der katalytisch wichtigen Aminosäure Serin 169 der l lß-HSDl eingeht, und die den ersten Schritt der Katalyse der Reduktion der Aldehydgruppe zum Alkohol dar¬ stellt, ist gestrichelt dargestellt.

Der zweite Schritt der Katalyse, die notwendige Hydrid-Übertragung vom Cofaktor (NADPH) auf den Kohlenstoff der Carbonylfunktion von 3ß,7ß,23-Trihydroxycucurbita-5,24- dien-19-al, funktioniert nicht mehr, da der Carbonyl-Kohlenstoff nicht an der richtigen Stelle im Enzym positioniert ist, um das Hydrid-Ion zu akzeptieren. Der katalytische Prozess wird arretiert.

Die l lß-HSDl Selektivität kommt dadurch zustande, dass die erfindungs gemäßen selektiven Inhibitoren nicht mit dem katalytischen Zentrum der 11 ß-HSD2 interagieren können, dement¬ sprechend die Katalyse der 11 ß-HSD2 nicht beeinflussen.

Als l lß-HSDl hemmende aktive Wirkstoffe komiten u. a. die in Momordica charantia und Momordica foetida vorkommenden Cucurbitane identifiziert werden. Cucurbitane gehören zu der Klasse der Triterpenoide mit Gonan-Grundgerüst. Cucurbitane als Inhaltstoffe von M. charantia wurden zum ersten Mal 1980 beschrieben (Okabe et al. 1980). Seitdem sind acht verschiedene Cucurbitan-Strukturen, in Form verschiedenster Glycoside, aus M. charantia und M. foetida isoliert und charakterisiert worden.

Im Folgenden wird das experimentelle Vorgehen zur Charakterisierung eines erfindungs ge¬ mäßen Inhibitors beispielhaft beschrieben.

100 g der als Tee erhältlichen, getrockneten Früchte von Momordica charantia wurden pulve¬ risiert, in eine Extraktionshülse gegeben und mit einer Soxhlet-Extraktionsapparatur mit 500 ml Chloroform heiß extrahiert. Nach acht Stunden wurde die Extraktion beendet und das Chloroform abdestilliert. Es blieben ca. 350 mg einer braunen, pastösen Masse zurück. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgenommen und auf präparative Dünnscliichtchroma- tographieplatten (TLC-Platten, Kieselgel 60) aufgetragen. Als Laufmittel wurde Ethylacetat / Toluol (2:1) eingesetzt. Nach dem Lauf wurde die TLC-P latte in fünf Fraktionen aufgeteilt, das Kieselgel abgekratzt und die Substanzen mit Ethylacetat eruiert.

Fraktion 1 : eine dominante Bande, 7,7 mg / Fraktion 2: drei dicht beieinander laufende Ban¬ den, 72,1 mg / Fraktion 3: eine dominante Bande, 33 mg / Fraktion 4: eine dominante Bande, 15,9 mg / Fraktion 5: eine dominante Bande, 25,8 mg

Die Fraktionen wurden auf ihre inhibierende Aktivität der menschlichen llß-HSDl getestet. Dazu wurden sie in jeweils 200 μl DMSO aufgenommen. Fraktion 4 enthält hemmende Akti¬ vität. Erneute Dünnschi chtchromatographie mit Ethylacetat / n-Hexan (2:1) als Laufmittel. Nach dem Lauf konnten vier dominante Banden isoliert (Fraktion 4.1 bis 4.4) werden.

Fraktion 4.1 : 0,8 mg / Fraktion 4.2: 3,9 mg / Fraktion 4.3 : 0,7 mg / Fraktion 4.4: 7,8 mg

Die Fraktionen wurden zur Prüfung der hemmenden Aktivität in 200 μl DMSO aufgenom¬ men. Hemmende Aktivität befindet sich in Fraktion 4.4. Erneute Dünnschichtchroma¬ tographie mit Ethylacetat als Laufmittel ergeben zwei dominante Banden (Fraktion 4.4.1 und 4.4.2).

Fraktion 4.4.1 : 1,7 mg / Fraktion 4.4.2: 4,1 mg

Fraktion 4.4.1 enthält die hemmende Aktivität. Gaschromatographie / Massenspektroskopie- Analyse zeigt, dass es sich um eine reine Substanz handelt und identifizierte die Substanz als Verbindung mit folgender Formel:

3ß,7ß,23-Trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al Dieses Cucurbitan hemmt selektiv 1 lß-HSDl. Die Aktivität von 1 lß-HSD2 wird nicht beein- flusst. Dabei ist dieses Cucurbitan lediglich als Modellsubstanz anzusehen:

Theoretische Berechnungen und Molecular Modelling zeigen, dass die Aldehydfunktion am C- 19 mit dem katalytischen Zentrum der 1 lß-HSDl in Wechselwirkung treten kann und so¬ mit den katalytischen Prozess blockiert. Auch die anderen Cucurbitane aus Momordica cha- rantia besitzen dieses funktionalisierte C- 19 Atom und können somit in der gleichen Weise wirken. Dabei kann es sich bei der Funktionalität auch um einen Alkohol, Acetal oder Semia- cetal handeln. Die Funktionalität am C- 19 kann auch durch chemische Modifikation, das heißt Einführen eines Wasserstoffakzeptor oder Wasserstoffdonor, erreicht werden. Bei Was¬ serstoffdonatoren kann es sich z. B. um Stickstoffatome (Amine) handeln, bei Wasserstoffak¬ zeptoren, z.B. um Fluor- Atome.

Diese isolierte Substanz wurde hinsichtlich ihrer inhibierenden Funktion auf die menschliche 11 ß-HSD Typ 1 und Typ 2 getestet.

Die Präparation von gereinigter 1 lß-HSDl aus menschlicher Leber, menschlichen Leber- mikrosomen und rekombinanter menschlicher 1 lß-HSDl, überexprimiert in der Hefe Pichia pastoris, wurde nach den Angaben aus der Literatur vorgenommen (Blum et al. 2000, Maser et al. 2002).

Die l lß-HSD2 wurde aus menschlichen Plazentamikrosomen gewonnen. Die Placentaproben wurden in 4 Volumenteilen Homogenisierungpuffer (20 mM Tris / HCl, 250 mM Sucrose, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, pH 7,4) mit einem Glass-Teflon Potter-Elvehjem aufgeschlossen. Das Homogenat wurde bei 600 x g für 10 min und bei 10.000 x g für 10 min zentrifugiert, um die Zellkerne, Mitochondrien und Zelltrümmer abzutrennen. Der Überstand wurde danach bei 170.000 x g für eine Stunde zentrifugiert um die Mikrosomen abzutrennen. Das erhaltene Pel¬ let, das die Mikrosomen enthält, wurde wieder in Homogenisierungpuffer aufgenommen, so dass die Proteinendkonzentration ungefähr 20 mg / ml beträgt.

Für die Analyse der Inhibition der Reduktase- Aktivität der 1 lß-HSDl wurde die Carbonylre- duktion von Cortison zu Cortisol gemessen. Ein typischer Reaktionsansatz enthielt: 10 μl ge¬ reinigte 1 lß-HSDl, 10 μl einer 5 mM Cortison-Lösung (Endkonzentration: 500 μM), 20 μl NADPH-regenerierendes System (2 mg NADP, 6 mg Glukose-6-Phosphat, 5 μl Glukose-6- Phosphat-Dehydrogenase, 100 μl eines 20 mM Phosphatpuffer pH 7,4 und 100 μl 0,1 M Magnesiumchlorid-Lösung). Nach Zufügen der zu testenden in DMSO gelösten Fraktionen, wurde der Ansatz auf 100 μl mit 20 niM Phosphat-Puffer, pH 7,4, aufgefüllt. Der Ansatz wurde für drei Stunden bei 37 0C inkubiert.

Zur Analyse der Inhibition der Dehydrogenase-Aktivität der l lß-HSDl wurde die Oxidation von Cortisol zu Cortison gemessen. Der Ansatz wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Veränderung, dass das NADPH-regenerierende System durch 20 μl 10 niM NADP- Lösung ersetzt wurde und Cortisol anstatt Cortison als Substrat eingesetzt wurde. Die Inkuba¬ tionszeit betrug eine Stunde.

Dieselben Bedingungen wurden benutzt, um die Inhibition der l lß-HSD2 Dehydrogenase- Aktivität zu messen. Anstatt gereinigter llß-HSDl Fraktionen wurden 10 μl Plazentamikro- somen eingesetzt. Auch wurde das NADP gegen 20 μl 10 mM NAD-Lösung ausgetauscht, da l lß-HSD2 nicht NADP sondern NAD als Cofaktor benutzt. Die Inkubationszeit betrug auch hier eine Stunde.

Nach der Inkubationszeit wurde die Reaktion durch Hinzugeben von 250 μl Ethylacetat ge¬ stoppt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt und die wässrige Phase noch zwei¬ mal mit je 250 μl Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organischen Phasen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in einer SpeedVac (Thermosavant) abdestilliert. Der Rückstand wurde in 50 μl Methanol / H2O (58:42, v/v) aufgenommen und 10 μl dieser Lösung der HPLC- Detektion der Glukokorticoide zugeführt.

Fig. 3 und Fig. 4 zeigen die original HPLC-Daten um das Cortisol / Cortison-Verhältnis nach Inhibition humaner 1 lß-HSDl mit wässrigen Extrakten von M. charantia zu analysieren. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind nur drei verschiedene Konzentrationen (b, c und d) an Extrakten von M. charantia gezeigt. Kurve a zeigt die ursprüngliche Aktivität ohne Zusatz von M. charantia Extrakt. Fig. 3 zeigt die Inhibition humaner 1 lß-HSDl Reduktase- Aktivität anhand des Cortisongehalts im Ansatz, Fig. 4 die Inhibition der 1 lß-HSDl Dehydrogenaseak- tivität anhand des Cortisolgehalts im Ansatz. Wässrige M. charantia Extrakte haben keinen Einfluss auf die Aktivität humaner 1 lß-HSD2 (Daten nicht gezeigt; siehe Fig. 5C).

In Fig. 5 ist die Quantifizierung der 1 lß-HSD Inhibition durch wässrige M. charantia Extrakte dargestellt. Um das Ausmaß der Inhibition abzuschätzen wurde die Fläche unter der Kurve des Cortisols- oder Cortison-Peaks aus dem HPLC-Chromatogrammen (siehe Fig. 3, Fig. 4) in Prozent umgerechnet. Die l lß-HSD Aktivitäten ohne M. charantia Extrakte dienten als Kontrolle und wurden als 100 % betrachtet. Fig. 5 A zeigt die Inhibition der l lß-HSDl Reduktaseaktivität, Fig. 5B die Inhibition der l lß- HSDl Dehydrogenaseaktivität, Fig. 5C zeigt das Fehlen einer Inhibition der l lß-HSD2 De- hydrogenaseaktivität durch verschiedene Mengen an M. charantia Extrakt.

Als Modellsubstanz für natürlich vorkommende Gonane mit Substituenten in 9-Position sind die unten aufgeführten Verbindungen zu sehen, isoliert aus den Pflanzen Momordica charan¬ tia und Momordica foetida. Sie inhibieren l lß-HSDl, aber nicht die zweite Isoform, l lß- HSDl.

[5] [6]

U]

R = -H, -Me, -Glukon, -Acetyl.

Als Modellsubstanz für synthetische Gonane mit Substituent in 9-Position sind die unten auf¬ geführten Verbindungen zu sehen:

[12] [13]

Als Modellsubstanz für synthetische Gonane mit Substituent in 8-Position sind die unten auf¬ geführten Verbindungen zu sehen:

[20] [21]

Schließlich ist nach der Erfindung vorgesehen, dass der erfindungsgemäße Inhibitor, bei¬ spielsweise in Form einer der oben aufgeführten Substanzen, Bestandteil eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Diabetes, Metabolischem Syndrom, Fettsucht, Hyperlipoproteinämien, Hyperglykämie, Hyperinsulinämie, Arteriosklerose, Demenz, De¬ pressionen, Osteroporese, Glaukom und Viruserkrankungen ist. Bevorzugt enthält das Arz¬ neimittel dabei einen den Inhibitor enthaltenden Extrakt aus Momordica charantia oder Mo- mordica foetida oder den aus Momordica charantia oder Momordica foetida isolierten Inhibi¬ tor.

Literatur: Blum et al. (2000) Toxicology. 144: 113-120. de Quervain et al. (1998) Nature. 394 : 787-790. Maser et al. (2002) Biochemistry. 41: 2459-2465. Nobel et al. (2001) J Eur Biochem. 268: 4113-4125. Okabe et al. (1980) Chem Pharm Bull. 28(9): 2753-2762. Sandeep et al. (2004) Proc Natl Acad Sei. 101 : 7734-7739.