Milieu de culture sélectif polyvalent pour l'isolement et la sélection de bactéries résistantes à la colistine et à la vancomycine.

La présente invention concerne un nouveau milieu de culture permettant la croissance de bactéries multi-résistantes de fort intérêt clinique. Il est en effet capable d'isoler et de sélectionner les bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine telles que des entérobactéries ainsi que les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine telles que des entérocoques, à partir d'échantillons cliniques ou de souches bactériennes. Ce milieu présente également la propriété de pouvoir isoler des souches bactériennes à Gram-négatif habituellement présentes dans les prélèvements pulmonaires des patients atteints par la mucoviscidose.

Les infections causées par des entérobactéries multi-résistantes et les Entérocoques résistants à la vancomycine représentent un problème majeur de santé publique à travers le monde.

Les Entérobactéries (à savoir la famille des Enterobacteriaceae) sont fréquemment rencontrées en pathologie infectieuse. Elles sont les hôtes de l'homme et des animaux chez lesquels elles résident principalement au niveau de l'intestin. On peut cependant les retrouver dans la cavité buccale, les régions humides de la peau en particulier le périnée, les fosses nasales et les voies génitales féminines dans lesquelles elles peuvent constituer une flore transitaire. L'espèce Escherichia coli y joue un rôle prépondérant en raison de sa présence constante et de sa large prédominance sur les autres espèces. D'autres espèces comprennent des Entérobactéries pathogènes des genres Proteus et Klebsiella ainsi que Citrobacter, Ha f nia, Providencia, Enterobacter, Morganella, et Yersinia.

Klebsiella pneumoniae et Escherichia coli à elles deux représentent 90% des infections par des entérobactéries. L'émergence mondiale d'Entérobactéries multirésistantes, en particulier des bactéries productrices de carbapénèmases, a conduit à la réutilisation de la colistine en tant que traitement antibiotique de dernier recours (1-3) contre les Entérobactéries pathogènes.

La colistine (ou polymyxine E), un produit obtenu par fermentation de Paenibacillus polymyxa, est constituée de composés peptidiques polycationiques à savoir la Colistine A de formule (la) laquelle comprend une chaîne d'acide gras: (S)-6-methyloctanoyl et la colistine B de formule (Ib) ci-après laquelle comprend (chaîne d'acide gras: 6-methylheptanoyl)(4). Il s'agit d'une classe d'antibiotique développée dans les années 1950. La Colistine est administrée soit par voie parentérale sous la forme d'une prodrogue inactive : le colistiméthate de sodium (CMS), soit par voie orale ou topique sous forme de sulfate de colistine.

Au cours des 10 dernières années, l'utilisation de la colistine s'est généralisée, entraînant l'apparition de résistances à la colistine (1, 3). Ce phénomène s'est particulièrement illustré chez les animaux en raison de l'utilisation intensive de la colistine dans les aliments vétérinaires dans de nombreux pays (2, 5, 6). On a constaté l'émergence de résistances acquises par mutation chromosomique spontanée vis à vis de la colistine. La colistine est un antibiotique qui possède un fort pouvoir d'induction spontanée de mutants résistants au sein d'une même population bactérienne.

Le mécanisme de résistance des souches intrinsèquement résistantes à la colistine est différent de celui de souches non intrinsèquement résistantes à la colistine mais résistantes à la colistine de façon acquise par mutation chromosomique spontanée (non transférable) ou par l'acquisition d'un plasmide de résistance (transférable de bactérie à bactérie). Les différents mécanismes conférant la résistance aux polymyxines, notamment à la colistine aboutissent à la modification du lipide A, un constituant du lipopolysaccharide (LPS), entraînant une réduction de l'affinité des polymyxines aux agents pathogènes (7). Jusqu'à récemment, tous les gènes de résistance à la colistine connus étaient d'origine chromosomique (8). Liu et ses collègues ont rapporté le premier mécanisme de résistance à la colistine à médiation plasmidique, qu'ils ont appelé gène mcr-1 (6), suivi récemment par le gène mcr-2 et les variants de mcr-1 (9).

Ces gènes plasmidiques codent pour une phosphoéthanolamine transférase capable de modifier le lipide A en lui ajoutant une phosphoéthanolamine, réduisant ainsi les interactions électrostatiques entre la colistine et le LPS (6). L'étude originale a rapporté la forte capacité de transfert in vitro de mcr-1, suggérant que ce gène de résistance est susceptible de se propager rapidement parmi les principaux pathogènes humains (10-12). Cette découverte soulève ainsi des inquiétudes en raison de l'absence de mise sur le marché de nouveaux antibiotiques. La recherche du gène mcr-1 a été effectuée sur des souches dont le mécanisme de résistance était inconnu et un nombre important d'entre elles le possédait (13-14).

Il est important de détecter cette résistance à la colistine car le cas échéant les cliniciens doivent adapter le traitement et isoler le patient. Le développement d'une méthode efficace de détection précoce de ces souches résistantes à la colistine est ainsi devenu une priorité (15-17).

La majorité des bactéries possédant le gène mcr-1 ont une faible Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de colistine, de l'ordre de 4 - 8 pg/mL (5). Les bactéries intrinsèquement résistantes à la colistine ont une CMI supérieure à 16 pg/mL.

Actuellement, les milieux de culture pour sélectionner les bactéries résistantes à la colistine sont adaptés pour isoler des bactéries intrinsèquement résistantes (à l'exception du milieu Superpolymyxin), c'est à dire fortement résistantes à une CMI supérieure à 16 pg/mL et ils n'ont pas de caractère polyvalent, ils ne permettent pas de sélectionner les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine en particulier.

En outre, les milieux sélectifs pour Entérobactéries comprennent du lactose afin de les sélectionner sélectivement par rapport aux autres bactéries à Gram-négatif (non fermentantes). Les milieux de culture commerciaux disponibles contenant des polymyxines ne permettent pas l'isolement de bactéries faiblement résistantes à résistance acquise du type mcr-1 (voir Tableau 1 ci-après en annexe), excepté un nouveau milieu de culture sélectif pour l'isolement des bactéries à Gram-négatif résistantes aux polymyxines, nommé SuperPolymyxin, comprenant une gélose EMB (éosine et bleu de méthylène) et contenant 3,5 pg/mL de colistine, 10 pg/mL de daptomycine et 5 pg/mL d'amphotéricine B et 10 g/ de lactose(23) (voir Tableau 1 ci-après en annexe).

La quasi-totalité des bactéries à Gram-positif sont résistantes à la colistine. En conséquence, pour sélectionner sélectivement les bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine notamment ayant le gène de résistance mcr-1, le milieu de culture SuperPolymyxin comprend un antibiotique anti-Gram-positif, à savoir la daptomycine (18).

Un inconvénient du milieu Superpolymyxin est qu'il ne permet pas d'isoler et sélectionner les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine du fait que la daptomycine inhibe la plupart des bactéries résistantes à la vancomycine.

En outre, si on remplace la daptomycine par la vancomycine dans le milieu SuperPolymyxin, les bactéries Escherichia coli possédant le gène mcr-1 ne poussent plus. Le milieu perd donc la capacité de sélection des principales bactéries résistantes à la colistine que sont les E coli ce qui explique le choix de la daptomycine dans le milieu Superpolymyxin. Les auteurs Nordmann et al (18) suggèrent que la combinaison de colistine et vancomycine inhibe la sélection de bactéries à Gram-négatif.

Un premier but de la présente invention est de fournir un milieu de culture amélioré de sensibilité suffisante pour isoler non seulement les bactéries à Gram-négatif, notamment les Entérobactéries, fortement et intrinsèquement résistantes à la colistine mais également les bactéries plus faiblement résistantes à résistance acquise à la colistine.

Un autre but de la présente invention est également de fournir un milieu de culture apte à détecter en outre des bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, notamment les Entérocoques sans nuire à l'aptitude du milieu à détecter les bactéries résistantes à la colistine. Il est important de détecter ces deux résistances car la colistine et la vancomycine sont des antibiotiques de dernier recours et si des souches résistantes à ces deux antibiotiques se propagent dans un hôpital on risque de ne plus pouvoir traiter les patients. Il est donc primordial de détecter ces bactéries afin de pouvoir isoler les patients porteurs.

Les milieux sélectifs pour les bactéries à Gram-positif sont en général des géloses enrichies au sang sans chromogène sans sucre et additionné d'antibiotique anti Gram-négatif tels que le milieu étudié ci-après :CNA ( colistine-acide nalidixique)/esculine).

Un autre inconvénient du milieu Superpolymyxin est qu'il ne permet pas d'isoler et de sélectionner efficacement certaines bactéries à Gram négatif présentes dans les prélèvements pulmonaires de patients atteints de mucoviscidose (voir tableau E ci-après).

Un autre but de la présente invention est de fournir un milieu de culture sélectif qui permet d'isoler les bactéries retrouvées dans les prélèvements pulmonaires de patients atteints de mucoviscidose de façon plus performante. D'autre part, certaines des souches naturellement résistantes à la colistine testées comme contrôle ont été inhibées sur le milieu SuperPolymyxin, notamment des souches de Morganella morganii et Providencia alcalifaciens.

Un autre inconvénient du milieu Superpolymyxin est qu'il ne permet de bien visualiser les colonies car celles-ci apparaissent en rose sur fond rouge du fait du chromogène EMB. Un autre but de la présente invention est de fournir un milieu de culture qui fournisse une meilleure visibilité des colonies de bactéries après culture, et de surcroit une visibilité différentiée entre les bactéries à Gram-positif et bactéries à Gram-négatif.

Dans Nordmann et al (18) les auteurs n'ont pas démontré la capacité de sélection sur les dites bactéries par culture d'échantillons biologiques directement sans préparation préalable des bactéries et notamment des échantillons de selles. Un autre but de la présente invention est de fournir un milieu qui permettent d'isoler et de sélectionner les dites bactéries par culture d'échantillons biologiques directement sans préparation préalable des bactéries et notamment des échantillons de selles pour la sélection des Entérobactéries résistantes à la colistine et des Entérocoques résistants à la vancomycine. Pour ce faire, la présente invention fournit un milieu de culture solide sélectif polyvalent pour isoler et sélectionner, à partir d'échantillons en contenant, des bactéries choisies parmi (a) les bactéries à Gram-négatif fermentantes et non fermentantes résistantes à la colistine et (b) les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, caractérisé en ce qu'il est constitué essentiellement d'une gélose d'agar additionnée d'un agent chromogène consistant dans du pourpre de bromocrésol, un sucre et de deux composés antibiotiques consistant dans la vancomycine et la colistine.

La présence de vancomycine permet d'éviter la contamination des cultures par des souches à Gram-positif présentes dans des échantillons cliniques et confère aussi une 2ième sélectivité très intéressante au milieu à savoir l'isolement des bactéries résistantes à la vancomycine.

On a découvert de façon surprenante et non élucidée que la mise en œuvre d'une combinaison de colistine et vancomycine dans un milieu de culture permet la double sélectivité revendiquée avec les propriétés avantageuses conformes à tous les buts de l'invention sous réserve de mettre en œuvre un agent chromogène spécifique à savoir l'agent chromogène le Pourpre de Bromocrésol. En particulier, avec les autres chromogènes et cette combinaison d'antibiotiques, certaines des bactéries sensibles à la colistine ou à la vancomycine concernées poussaient et/ou certaines bactéries résistantes à la colistine ou à la vancomycine concernées étaient inhibées.

Le pourpre de bromocrésol, ou bromocrésol pourpre, ou violet de bromocrésol, ou « purple » nommé plus complètement « 5',5"-dibromo-o-crésolsulfonephthaléine », est un colorant de la famille des sulfonephtaléines. De préférence, dans le milieu selon l'invention, le dit sucre est du glucose.

L'agent chromogène pourpre de bromocrésol combiné au glucose dans de l'agar permet en outre de mieux identifier les colonies de bactéries à Gram négatif aussi bien les bactéries fermentantes (Entérobactéries) que les bactéries non fermentantes ainsi que les bactéries à Gram-positif par une couleur contrastée jaune sur fond violet plus contrastée dans tous les cas.

En outre, le glucose comme substrat glucidique de fermentation permet une différenciation de l'aspect des colonies des bactéries à Gram-négatif, notamment d'Entérobactéries, celles-ci étant de tailles plus importantes, à savoir de 2-3mm, que les colonies d'Entérocoques de tailles plus petites à savoir de 0.1-lmm.

Plus particulièrement, un milieu de culture selon l'invention comprend dans de l'eau des concentrations de:

- 2 à 10% en poids en agar contenant de 0.01 à 0.1% de dit agent chromogène pourpre de bromocrésol, - 0.1 à 10% en poids de sucre, de préférence de glucose,

- 2 à 8 pg/mL de sulfate de colistine, et

- 25 à 100 pg/mL de vancomycine.

Plus particulièrement encore, un milieu de culture selon l'invention comprend :

- 3.1% en poids en agar contenant de 0.065% de bromocrésol pourpre, - 0.75% de glucose,

- 4.pg/mL de sulfate de colistine, et

- 50.pg/mL de vancomycine.

La présente invention fournit également une méthode d'isolement et de sélection de bactéries choisies parmi (a) les bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine, (b) les bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine, caractérisé en ce qu'on réalise une culture d'un d'échantillon biologique en contenant, de préférence un échantillon de prélèvement clinique, à l'aide d'un milieu de culture sélectif polyvalent solide selon l'invention. Dans un premier mode de réalisation, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont des Entérobactéries.

Plus particulièrement, les dites entérobactéries pathogènes sont choisies parmi les bactéries suivantes Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Providencia, Morganella, Citrobacter, Ha f nia et Yersinia.

Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine comprennent Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Proteus vu Ig a ris, Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri, Morganella morganiiet Serratia marcescens.

Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine comprennent Escherichia coli.

Dans un autre mode de réalisation, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont des bactéries présentes dans les prélèvements cliniques, de préférence des prélèvements pulmonaires, de patients atteints par la mucoviscidose.

Plus particulièrement, les dites bactéries présentes dans les prélèvements cliniques des patients atteints par la mucoviscidose sont choisies parmi :

- les bactéries naturellement résistantes à la colistine suivantes : Burkholderia cepacia, Chryseobacterium gleum, Chryseobacterium oranimense, Chryseobacterium indologenes, Inquilinus limosus, Pandoraea pulmonicola, Brevundimonas diminuta, Shewanella xianemensis, Shewanella putrefaciens eX. Ochrobactrum anthropi ^' ; et

- les bactéries ayant une résistance acquise à la colistine suivantes : Acinetobacter pitti, Acinetobacter nosocomialis, Achromobacter xylosoxidans, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii. Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont choisies parmi (il) des bactéries naturellement résistantes à la colistine, (i2) des bactéries résistantes à la colistine de façon acquise par mutation chromosomique spontanée et (i3) des bactéries résistantes à la colistine par l'acquisition d'un plasmide de résistance contenant le gène mcr-1 ou un autre gène pouvant conférer la résistance à la colistine. Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-négatif résistantes à la colistine sont choisies parmi des bactéries résistantes à la Colistine par l'acquisition d'un plasmide de résistance contenant le gène mcr-1.

Dans un autre mode de réalisation, les dites bactéries sont des bactéries à Gram- positif résistantes à la vancomycine choisies parmi :

- les bactéries ayant une résistance acquise à la vancomycine des genres Staphylococcus et Enterococcus, et

- les bactéries naturellement résistantes à la vancomycine des genres Pediococcus, Weissela, Lactobacillus et Leuconostoc. Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram positif résistantes à la vancomycine sont choisies parmi les bactéries des genres suivants : Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus gallinarum, Leuconostoc lactis, Weissela cibaria et Weissela confusa.

Plus particulièrement encore, les dites bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine sont des Entérocoques.

Plus particulièrement encore, on réalise une culture d'un échantillon de prélèvement clinique, de préférence de selles.

Plus particulièrement encore, un procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes consistant à: a) inoculer ledit milieu de culture avec un échantillon comprenant des dites bactéries; b) incuber ledit milieu de culture inoculé dans des conditions appropriées pour la croissance des dites bactéries présentant une dite résistance à la colistine ou à la vancomycine, de préférence pendant 24 heures à 48 heures, de préférence de 24 à 36 heures, et c) détecter les colonies formées sur ledit milieu inoculé et cultivé, lesdites colonies contenant lesdites bactéries qui présentent une dite résistance.

Selon la présente invention, il a été démontré que le milieu selon l'invention est capable d'isoler toutes les souches à Gram-négatif résistantes à la colistine que ce soit de haut niveau (CMI élevée) ou de bas niveau (CMI faible) et ayant une résistance intrinsèque ou acquise et avec une sensibilité de 100%.

Le milieu selon l'invention peut être utilisé comme outil de dépistage sur des échantillons de selles positifs en PCR pour le gène mcr-1, et permet ainsi l'isolement de nouvelles souches résistantes porteuses du gène mcr-1. Cet isolement est facilité sur le milieu selon l'invention, en raison de la couleur jaune des colonies correspondant aux Entérobactéries recherchées.

La culture sur le milieu selon l'invention de ces échantillons permet d'isoler des bactéries à Gram-positif naturellement résistantes à la vancomycine telles que Pediococcus, Lactobacillus, Weissela, mais également des Entérocoques résistants à la vancomycine qui constituent des bactéries d'intérêt clinique. Le milieu selon l'invention a également montré une sensibilité de 100% pour l'isolement de ces bactéries, reconnaissables par leurs colonies, de couleur contrastée avec le glucose (jaune sur fond violet) également, mais plus petites (0.1-lmm) que les entérobactéries (2-3mm). Sur le milieu SuperPolymyxin, seules les E. coli sont efficacement différenciables avec un reflet métallique, toutes les autres souches sont rouges/rosées sur gélose rouge.

Ce milieu de culture permet l'isolement des bactéries dans les prélèvements pulmonaires des patients atteints de mucoviscidose d'efficacité comparable au milieu Cepacia de référence pour ces bactéries. Enfin, en termes de coûts, la comparaison des prix des géloses est inférieure pour le milieu selon l'invention par rapport aux milieux SuperPolymyxin et Cepacia.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre faite en référence à la figure 1 qui illustre les aspects des colonies obtenues par culture d'un échantillon clinique de selle (écouvillon rectal) sur milieu LBJMR selon l'invention pour les bactéries A= E coli; B= K. pneumoniae et C= E. faecium. Les espèces des colonies ayant différents aspects A (2 grosses colonies d' E coli) et B (15 colonies de tailles moyennes de K. pneumoniae) sont résistantes à la colistine (CMI de 2 et 64 pg/mL, respectivement), et C ( toutes les petites colonies d' .E faecium) est résistante à la vancomycine avec une CMI>256 pg/mL. 1- Matériels et méthodes

1-1 Souches bactériennes et échantillons Un ensemble de 102 souches d'Entérobactéries a été utilisé, parmi lesquelles 76 souches possèdent une résistance acquise à la colistine (1, 19-21) dont 33 souches avec le gène mcr-1 (22-25), 6 souches sont naturellement résistantes et 20 souches sont sensibles à la colistine (Tableau 2 ci-après en annexe). Cet ensemble de 102 souches comprend 31 souches de E. coli, 35 souches de Klebsiella pneumoniae. Les gènes de résistance connus éventuellement impliqués ont été séquencés comme décrit précédemment (1). La détection par PCR du gène mcr-1 a été réalisée comme décrit par Chabou et al. (15).

Cet ensemble comprenait également 26 souches de bactéries à Gram-positif, incluant 8 Entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) (26), 3 genres intrinsèquement résistants et 15 souches sensibles (27) (Tableau 2 ci-après en annexe). Les gènes de résistance à la vancomycine vanA et vanB ont été recherchés par PCR comme précédemment décrit sur les souches résistantes (28).

Un ensemble de 1073 échantillons de selles a été utilisé, dont 899 d'origine humaine et provenant de différentes régions du monde : Marseille, France (212), Angers, France (128), Thaïlande (212), Laos (189), Nigeria (143), Sénégal (15). Les autres échantillons étaient d'origine animale : poulets d'Algérie (10), rongeurs du Cambodge (21) et du Laos (60), cochons (16) et chèvres (46) du Laos ; et quelques-uns (21) issus de l'environnement du Laos (eau, sol).

1-2 Tests de sensibilité aux antibiotiques Les CMI de la colistine et de la vancomycine ont été déterminées par la méthode des

E-test (bioMérieux, Marcy-l'Étoile, France) et évaluées en suivant les recommandations du système expert de l'EUCAST (http://www/eucast.org). Les CMI de la Daptomycine ont également été déterminées par cette méthode pour les 4 souches de référence Enterococcus faecium (DSM 17050, 25698, 25697 et 13590). Des colonies fraîches ont été repiquées sur le milieu Trypticase Soy Agar (TSA, Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) puis mises en suspension dans l'eau stérile afin d'obtenir une densité optique égale à 0,5 MacFarland (1,5X108 UFC/mL) comme recommandé par l'EUCAST. Dans les premières expérimentations concernant la mise au point du milieu de culture, 10 microlitres de la solution ont été directement étalés avec une ose sur les différents milieux afin d'obtenir un inoculum bactérien de 106 UFC. Afin d'évaluer les limites de détection de chaque bactérie, des dilutions au dixième en cascade ont été effectuées dans du tampon phosphate (PBS), et 10 pL de chaque dilution ont été déposés sur les géloses. La concentration bactérienne viable a été calculée par comptage de colonies en les étalant en parallèle sur une gélose TSA pour contrôle. Ces expérimentations ont été menées en duplicat.

La croissance ou l'inhibition de ces bactéries a été observée après 24H d'incubation à

37°C. 1-3 Développement du milieu LBJMR selon l'invention

1-3-1 Choix de la base d'agar

Afin de choisir le milieu le plus adapté à la sélection d'Entérobactéries résistantes à la colistine, dont les souches possédant le gène mcr-1, 8 espèces représentatives ont été cultivées à la quantité de 10 ⁶ UFC sur cinq milieux de culture additionnés de différentes concentrations de sulfate de colistine (MP Biomedicasl, Illkirch, France), allant de 0 à 32 pg/mL. Les espèces cultivées comprenaient 4 souches de Klebsiella pneumoniae et 4 souches d'Escherichia coli, dont 2 souches sensibles et 2 souches résistantes à la colistine pour chacune de ces deux espèces, comprenant 2 souches d'E. coli possédant le gène mcr-1 (24). Les géloses suivantes ont été préparées en suivant les recommandations du fabricant : Drigalski Lactose Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France), DifcoTM Violet Red Bile Agar (VRBL) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne), BBLTM Eosin Methylen Blue Agar (EMB) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne), BBLTM MacConkey II Agar (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne), le DifcoTM Purple Agar Base additionné de lactose (BCP), et le DifcoTM Purple Agar Base additionné de glucose. Il s'agit de milieux de culture bactérienne sélectifs et chromogéniques utilisés habituellement pour l'isolement des Entérobactéries. Leur différenciation est basée sur la fermentation lactique.

La composition de ces 5 géloses est explicitée ci-après. a) Milieu Drigalski Lactose Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) : - agar + bleu de bromothymol et cristal violet ou violet de gentiane + lactose. b) Milieu VRBL (Violet Red Bile Agar) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) : - agar+ rouge neutre-cristal violet ou violet de gentiane+ sels biliaires+ lactose. c) Milieu EMB (Eosin Methylen Blue Agar) (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) : - agar+ Eosine et bleu de méthylène+ lactose. d) Milieu MacConkey II Agar (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne) :

- agar+ cristal violet et rouge neutre +lactose le colorant différentie les bactéries lactose + et lactose - et e) Milieu BCP (Purple Agar Base (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne)) additionné de lactose :

- agar + pourpre de bromocresol + lactose. f) Milieu Purple Agar Base (Beckton-Dickinson, Heidelberg, Allemagne)) additionné de glucose :

- agar +pourpre de bromocresol + glucose.

On entend dans la présente description par « agar », un polymère d'agar-agar à savoir un polymère de galactose (galactane) contenu dans la paroi cellulaire de certaines espèces d'algues rouges appartenant aux familles des Gelidiacées {Gelidium et Pterocladia ) et des Gracilariacées {Gracilaria).

1-3-2 Développement du milieu sélectif : choix du sucre fermenté et ajustement de la sélectivité.

Pour permettre la sélectivité de toutes les souches résistantes à la colistine, la concentration en colistine a été ajustée à l'aide de 24 souches représentatives de la plupart des résistances à la colistine (5 souches bactériennes intrinsèquement résistantes, 8 souches d'Entérobactéries comportant des résistantes acquises, 7 souches sensibles servant de contrôle et 4 souches à Gram-positif sensibles à la vancomycine).

Ces différentes souches ont été inoculées sur gélose Purple agar base additionnée de 7.5 g/L de glucose ou de 10 g/L de lactose (laboratoires Humeau, La Chapelle-sur-Erdre, France), et à des concentrations différentes de colistine (0, 4 ou 8 pg/mL) et de vancomycine (0 ou 50 pg/mL).

Pour la sélectivité des souches résistantes à la vancomycine, la concentration de vancomycine a ensuite été adaptée en utilisant 26 souches représentatives de la résistance à la vancomycine (3 genres bactériens intrinsèquement résistants, è souches d'Entérocoques résistantes (VRE), et 15 souches sensibles) (Tableau 2 en annexe), sur des géloses calibrées à 4 pg/mL de colistine et avec des concentrations croissantes de vancomycine (0, 12.5, 25, 50 et 100 Mg/mL). Ces différentes concentrations ont également été évaluées avec l'ensemencement de 10 selles.

1-3-3 Isolement de souches mcr-1 à partir d'échantillons de selles. Dix échantillons de selles de poulet en provenance d'Algérie, précédemment criblés en RT-PCR pour le gène mcr-1 (5 selles positives et 5 selles négatives) ont été utilisées (12, 13). Une étape préalable d'enrichissement a été effectuée en inoculant environ 1 g de selle dans un bouillon Trypticase Soja (TSB) (bioMérieux, Marcy-l'Étoile, France), ensuite incubé pendant 24h à 37°C (1). 100 μΙ_ de chaque bouillon pur ou dilué ont été déposés puis étalés au râteau sur la gélose Purple agar base additionnée de 7,5 g/L de glucose, 4 pg/mL de colistine et 0, 25, 50, 100 ou 200 pg/mL de vancomycine, incubée à 37°C.

Chaque colonie présentant une morphologie différente a été isolée sur TSA, puis les espèces ont été identifiées par spectrométrie de masse du type MALDI-TOF MS. Pour chaque entérobactérie, la CMI de la colistine a été déterminée par E-test. La présence de mcr-1 a été recherchée par PCR pour chaque isolât résistant à la colistine.

1-4 Évaluation du milieu LBJMR selon l'invention.

1-4-1 Sensibilité et Spécificité

La sensibilité et la spécificité du milieu LBJMR à détecter toutes les Entérobactéries résistantes à la colistine que ce soit naturellement ou pas acquisition de cette résistance, ont été évaluées sur 76 souches d'Entérobactéries résistantes à la colistine figurant dans la Table 2.

Pour la sélectivité du milieu à détecter les souches à Gram-positifs résistantes à la vancomycine, 11 souches de bactéries à Gram-positifs résistantes à la vancomycine ont été utilisées. Et, pour l'analyse des souches des espèces bactériennes présentes dans la mucoviscidose, 15 souches ont été utilisées.

Les bactéries ont été ensemencées à 10 ⁴ UFC sur le milieu LBJMR et sur le milieu TSA en parallèle comme témoin de croissance.

1-4-2 Dépistage sur des prélèvements cliniques. Les ADN de 1063 selles ont été analysés par PCR en temps réel, les positifs ont ensuite été confirmés par PCR standard. Les échantillons dont les ADN ont été positifs pour mcr-1 ont ensuite été ensemencés sur milieu LBJMR. Les souches positives obtenues ont été conservées à -80°C. 1-5 Comparaison entre le milieu LBJMR et d'autres milieux sélectifs contenant des polymyxines.

1-5-1 Sensibilité et spécificité.

Pour effectuer ces tests, 30 souches possédant le gène mcr-1, 10 souches d'Entérobactéries sensibles à la colistine et 41 souches résistantes (intrinsèque et acquise) ont été utilisées. Les milieux de culture LBJMR et SuperPolymyxin (19), ont été comparés à d'autres milieux de culture dont le milieu Columbia ANC + 5% de sang de mouton (bioMérieux, Marcy-l'Étoile, France) utilisé pour l'isolement des streptocoques, le milieu Cepacia utilisé pour l'isolement de Bulkhoderia cepacia et le milieu EMB (Sigma-AIdricht, Saint-Louis, USA) qui est ici utilisé comme contrôle et qui sert usuellement à l'isolement des conformes. Les limites de détection ont été déterminées comme décrit précédemment (19).

Enfin, 8 souches d'Entérocoques résistantes à la vancomycine, 3 souches d'espèces bactériennes intrinsèquement résistantes à la vancomycine, 10 souches d'Entérocoques sensibles à la vancomycine, ainsi que les 20 souches bactériennes correspondantes aux prélèvements de patients atteints de mucoviscidose ont été inoculées sur le milieu LBJMR et le milieu SuperPolymyxin de la même manière.

1-5-2 Dépistage sur des prélèvements.

Afin de comparer la sélectivité des milieux SuperPolymyxin et LBJMR, 10 selles humaines en provenance de Thaïlande ont été mises en culture. 5 d'entre elles ont donné des cultures positives sur le milieu LBJMR, 5 d'entre elles sont négatives par PCR. 1-5-3 Analyse comparative du milieu LBJMR et du milieu SuperPolymyxin.

Afin d'évaluer et de comparer la composition des milieux LBJMR et SuperPolymyxin, 3 géloses de milieu LBJMR ont été modifiées en mélangeant les composants de ces deux milieux : remplacement de la base Purple agar base par ΕΜΒ, remplacement de la vancomycine par la daptomycine (lOpg/mL), ajout de l'amphotéricine B (5pg/mL) afin d'étudier leurs effets sur la croissance des Entérobactéries. 30 souches mcr-1 ont été ensemencées sur ces trois milieux en parallèle du milieu LBJMR, du milieu Superpolymyxin et du milieu EMB seul.

Un test complémentaire a ensuite été effectué pour étudier le changement de base d'agar en créant un milieu SuperPolymyxin modifié avec remplacement de l'EMB par le Purple agar base. Ce milieu a été comparé par l'ensemencement de 8 souches mcr-1 (6 souches E coli et 2 souches K. pneumoniaë), avec le milieu LBJMR, le milieu SuperPolymyxin et le milieu LBJMR modifié par remplacement de son agar.

Enfin, différentes souches ont été inoculées à 104 UFC sur les géloses des milieux LBJMR, SuperPolymyxin et EMB seul ou additionné soit de colistine (4 pg/mL), soit de vancomycine (50 pg/mL), soit des deux. Ces souches étaient composées de 15 souches possédant le gène mcr-1 (5 souches de K. pneumoniaë et 10 souches d'E coli), 5 souches résistantes à la colistine mais par un autre mécanisme (5 souches d'E. coli) et 10 souches sensible à la colistine afin de voir si toutes les souches résistantes à la colistine étaient présentes sur les 2 géloses. En parallèle, ont été testées 7 souches d'Entérocoques résistants à la vancomycine et 10 souches d'Entérocoques sensibles à la vancomycine afin de voir si les géloses permettent une sélectivité des souches résistantes à la vancomycine.

1- 5-4 Analyses statistiques.

Les données ont été analysées par un test du Chi2 pour une comparaison appariée de la nouvelle gélose sélective et du milieu Cepacia. La signification a été évaluée à p <0,01. Pour démontrer la corrélation entre les différentes méthodes de détection, un test de

Fisher a été réalisée, avec une significativité évaluée à p <0,05.

2- Résultats.

2-1 Développement du milieu LBJMR selon l'invention. 2-1-1 Comparaison des bases d'agar. Sur les 8 souches testées, l'agar Purple agar base a été retenu pour le milieu LBJMR, remplissant les conditions adéquates avec les plus faibles concentrations de colistine car les souches sensibles étaient inhibées, les bactéries résistantes (CMI>2 pg/mL) ne l'étaient pas (Tableau 3 en annexe). Les autres milieux testés ont été éliminés car avec 8 pg/mL de colistine, le milieu MacConkey a permis la croissance des souches sensibles, et certaines souches résistantes ont été inhibées sur les milieux Drigalski, EMB et VRBL. Les différentes couleurs des colonies sur la gélose Purple agar base, violet ou jaune, en fonction de la fermentation du glucose étaient intéressantes pour une identification rapide des Entérobactéries présentes dans les échantillons cliniques (Figure 1). Les essais ont ensuite été réalisés sur gélose Purple agar base avec l'ajout de 4 ou 8 pg/mL de colistine et de vancomycine afin d'inhiber les bactéries Gram-positives.

2-1-2 Développement du milieu sélectif.

Les tests réalisés sur les 24 souches ont donné les résultats recherchés uniquement pour le Purple agar base ajouté à 4 pg /mL de colistine et 50 pg/ml de vancomycine. En effet, les souches résistantes à la colistine ne sont pas affectées par la présence des deux antibiotiques, alors que les souches sensibles le sont (Tableau A).

Tableau A : Développement du milieu sélectif pour les souches résistantes à la colistine.

(+) Croissance (-) Pas de croissance

Souches bactériennes CMI de Agar Purple agar base additionné de colistine + colistine vancomycine ^g/mL)

^g/mL) 0 0+50 4 + 0 4 + 50 8 + 0 8 + 50

Souches naturellement résistantes à la colistine

M. morganii PMI 02 >256 + + + + + +

P. mirabilis FH112 >256 + + + + + +

P. vulgaris >256 + + + + + +

P. alcalifaciens TH44 >256 + + + + + +

S. marcescens E13 128 + + + + + +

Résistance acquise à la colistine

E. aerogenes 1509 >256 + + + + + +

E. asburiae LH74 >256 + + + + + +

E. cloacae NH52 >256 + + + + + +

K. pneumonia LH140 96 + + + + + +

K. pneumonia TH224 4 + + + + + +

E. coli LH257 6 + + + + + +

E. coli P17 4 + + + + + +

S. enterica 100RC3 8 + + + + + +

Souches sensibles à la colistine

K. lôneumonia TH20 0.125 + + - - - -

P. vulgaris PI 00 0.94 + + - - - -

S. enterica 0.94 + + - - - - E. asburiae P113 0.19 + + - -

E. cloacae NH151 0.50 + + - -

E. cloacae NH74 0.38 + + - -

E. coli 169 0.096 + + - -

Souches à Gram-positif

Staphylococcus aureus >256 + - + +

Enterococcus faecium >256 + - + +

Enterococcus faecalis >256 + - + +

Enterococcus gallinarum >256 + - + +

Pour la mise au point de la sélectivité des souches résistantes à la vancomycine, la vancomycine a été fixée à 50 pg/mL après le test sur les 17 souches d'Entérocoques. En effet, à cette concentration la croissance des souches à Gram-positifs résistantes à la vancomycine (CMI>4 pg/mL) est réalisée mais permet l'inhibition des souches sensibles.

Le glucose a été choisi comme substrat glucidique de fermentation en raison de sa meilleure différenciation entre les différentes espèces (les colonies résistantes étaient jaunes contrastées sur fond violet).

La préparation finale du milieu LBJMR selon l'invention est présentée dans le tableau B.

Tableau B : Composition du milieu LBJMR.

Concentration

Composés Solutions Quantité

finale

Purple Agar Base 31 g 31 g/L (3,10%)

Glucose 7,5 g 7,5 g/L (0,75 %)

Eau distillée 991 mL

Sulfate de Colistine 1 mg/mL 4 mL 4 pg/mL

Vancomycine 10 mg/ml 5 mL 50 pg/mL

2-1-3 Isolement de souches mcr-1 à partir d'échantillons de selles. La mise en culture sur le milieu LBJMR des 10 selles de poulets en provenance d'Algérie a permis l'isolement de souches d'E. coli positives au gène mcr-1 par PCR à partir de 3 des 5 selles positives pour mcr-1. Les seuils de positivité (Ct) des échantillons étaient 26.32, 29.09 et 30.56 avec le système d'amorces PE1, 26,56, 29,8 et 31 avec PE2 (12), et les CMI en colistine de 4, 3 et 4 pg/ml, respectivement pour les souches isolées. Parmi elles, seul l'isolât 235 avait préalablement été détecté sur le milieu Cepacia (13). Les 2 autres selles positives pour mcr-1, avec des valeurs de Ct largement supérieures à 30 cycles obtenues avec les deux systèmes PCR, n'ont pas permis l'isolement d'Entérobactérie, comme pour les dix selles négatives en PCR. Un test de Fischer a été réalisé pour mettre en évidence la corrélation entre les résultats positifs obtenus par les deux méthodes de détection: RT-PCR et la culture. Le résultat est significatif d'une valeur de 0,02. Il était également important si l'on considère comme positif seulement les deux échantillons positifs avant 30 cycles, avec une valeur p de 0,03. 2-2 Évaluation du milieu LBJMR.

2-2-1 Sensibilité et Spécificité.

Les 76 Entérobactéries résistantes aux polymyxines ont poussé sur le milieu LBJMR et toutes les bactéries sensibles y ont été inhibées, ce qui lui donne une sensibilité et une spécificité de 100% pour l'isolement des bactéries à Gram-négatifs résistantes à la colistine. L'aspect de ces souches sur le milieu LBJMR est présenté dans la Figure 1. Les 8 Entérocoques résistants à la vancomycine ont pu être détectées sur le milieu LBJMR, contrairement aux Gram-positifs sensibles à la vancomycine ce qui démontre bien la sélectivité du milieu à isoler aussi les bactéries résistantes à la vancomycine.

Des souches provenant de prélèvements de patients atteints par la mucoviscidose, ont poussé ce qui confirme bien la possibilité de pouvoir isoler ce type de bactéries également sur le milieu LBJMR (à l'exception des Chryséobacterium qui sont sensibles à la vancomycine).

2-2-2 Dépistage sur des prélèvements cliniques.

Parmi les 1063 selles testées, 84 étaient positives en RT-PCR et confirmées en PCR standard. Parmi elles, nous avons mis en culture sur LBJMR les 27 selles qui étaient positives avant 30 cycles en RT-PCR, ainsi que les 24 selles positives entre 30 et 35 cycles et dont les migrations sur gel après PCR standard étaient les plus marquées. Sur 51 échantillons ainsi mis en culture, 13 sont revenus positifs, permettant l'isolement de 14 souches avec le gène mcr-1, dont 12 souches d'E coli et 2 souches de K pneumoniae. L'un des échantillons, FHM128, a en effet permis l'isolement de deux souches, une souche d'E coli et une souche de K. pneumoniae. Parmi ces isolats, 4 étaient connus, les souches de K. pneumoniae FHA60 et FHM128, et les souches d'E. coli TH99 et P6, isolées lors de précédentes études sur milieu Cepacia (1,18,19). Le milieu LBJMR nous a permis d'isoler 10 nouvelles souches possédant le gène mcr-1, démontrant ainsi son efficacité supérieure au milieu Cepacia dans la détection des souches résistantes à la colistine même à CMI basses. En effet, les CMI de la colistine de ces souches allaient de 2 à 6 pg/mL. (Le fait qu'il y ait si peu de cultures positives en comparaison du nombre de PCR positives s'explique par le fait que les échantillons ont été conservés à -80°c depuis 3 à 4 ans, les bactéries sont possiblement mortes.).

2-3 Comparaison entre le milieu LBJMR selon l'invention et d'autres milieux sélectifs contenant des polymyxines.

2-3-1 Sensibilité et Spécificité par rapport aux autres milieux.

Les résultats de tous les milieux testés sont résumés dans le Tableau C. Sur les 33 souches possédant le gène mcr-1, toutes les souches ont poussé sur le milieu LBJMR, le milieu SuperPolymyxin, et le milieu EMB avec une limite de détection de 10 ¹ UFC/mL. Les souches sensibles ont été inhibées sur chaque gélose. En revanche, les germes intrinsèquement résistants M. morganii et P. alcalifaciens utilisés comme contrôle ont été inhibés sur SuperPolymyxin. À 10 ⁴ UFC de bactéries, seulement la moitié des souches possédant le gène mcr-1 sont cultivées sur le milieu Cepacia (tableau D). En considérant les 21 souches possédant le gène mcr-1 mais présentant une CMI faible (<8 pg/mL), seulement 5 d'entre elles ont poussé sur le milieu Cepacia. Les sensibilités des milieux LBJMR (100%) et Cepacia (47%), ont été comparées à l'aide d'un test statistique Chi2, le milieu LBJMR est significativement plus sensible que Cepacia. Le milieu EMB a servi de témoin de croissance, celui-ci n'étant pas sélectif, et toutes les souches ont pu croître dessus, mêmes aux plus basses concentrations. La gélose CNA n'était pas adaptée, avec la croissance de seulement deux souches possédant le gène mcr-1 en raison de la présence de l'acide nalidixique. Tableau C : Comparaison de la sensibilité de différents milieux de culture contenant de la colistine pour l'isolement d'Entérobactéries résistantes à la colistine.

Souches Nombre Milieux de culture

bactériennes de souches LBJMR SP ^a Cepacia EMB ^b ANC (1) (2) (3)

Souches mcr-1 positives

E. coli 23 23 23 14 23 4 23 23 0

K. pneumoniae 7 7 7 7 7 0 7 7 7

Souches résistantes intrinsèquement à la colistine

M. morganii 1 1 0 1 1 0 1 1 1

S. marcescens 1 1 1 1 1 0 1 1 1

P. mirabilis 1 1 1 1 1 0 1 1 1

P. vulgaris 1 1 1 1 1 0 1 1 1

P. alcalifaciens 1 i 0 0 i 0 i i i

Souches sensibles à la colistine

E. coli 2 0 0 0 0 0 0 0 0

K. pneumoniae 3 0 0 0 0 0 0 0 0

S. enterica 2 0 0 0 0 0 0 0 0

E. cloacae 1 0 0 0 0 0 0 0 0

E. asburiae 1 0 0 0 0 0 0 0 0

P. vulgaris 1 0 0 0 0 0 0 0 0

(SP ^a ) : Milieu SuperPolymyxin ;

(EMB ^b ) : Eosine - Méthylène Blue;

(ANC ⁰ ) : Acide Nalidixique - Colistine ;

(1) : Purple Agar Base + glucose + colistine + daptomycine ;

(2) : Purple Agar Base + glucose + colistine + vancomycine + amphotéricine B ;

(3) : EMB Agar + colistine + vancomycine.

Tableau D : Comparaison de la sensibilité des milieux de culture LBJMR et Cepacia. L'inoculum de chaque souche a été calibré à 10 ⁴ UFC

souches résistantes à la colistine mais par un autre mécanisme différent de mcr-1. 2-3-2 Analyse comparative du milieu LBJMR et du milieu SuperPolymyxin.

Concernant les Entérocoques résistants à la vancomycine, ils ont été inhibés sur le milieu SuperPolymyxin (car présence de daptomycine) mais pas sur le milieu LBJMR (tableau E). Le milieu LBJMR possède donc comme avantage par rapport au milieu SuperPolymyxin de pouvoir également isoler spécifiquement les souches résistantes à la vancomycine.

Enfin, les résultats de culture de selles sur les 2 milieux avaient la même sensibilité pour les souches Gram-négatives résistantes à la colistine mais seul le milieu LBJMR permettait la détection des Gram-positifs résistants à la vancomycine. (Tableau E). Exemple Figure 1 : à partir d'un prélèvement biologique positif à Entérococcus faecium résistant à la vancomycine, nous avons pu isoler 2 souches d'Entérobactéries sur le milieu LBJMR uniquement et surtout nous avons pu aussi détecter la présence 2 souches dont une de K. pneumoniae et une souche d'E coli résistantes à la colistine. Le milieu LBJMR a donc permis à partir d'un même prélèvement clinique de détecter à la fois 2 souches à Gram-négatif résistantes à la colistine et une souche à Gram-positif résistante à la vancomycine.

Les avantages du milieu LBJMR en comparaison avec le milieu SuperPolymyxin sont :

- Sensibilité de 100% pour l'isolement des Entérocoques résistants à la vancomycine ;

- Visualisation facile et rapide de la croissance des bactéries d'intérêt ; - Isolement des bactéries présentes chez les patients atteints de mucoviscidose ;

- Visualisation facilitée des souches d'E. coli]

- Spécificité de 100% pour les germes résistants à la colistine ; et

- Possibilité d'isoler sur la même gélose des Entérocoques résistants à la vancomycine et des Bacilles à Gram-négatif résistants à la colistine (Figure 1). Tableau E : Comparaison des géloses et limite de détection des Gram-positifs

(UFC/mL) Souches bactériennes Isolais CMI ^g/mL) : LBJMR Superpolymyxin

Gram-positifs résistants à la vancomycine vancomycine

E. faecium DSM 17050 >256 10 ¹ >10 ⁵

E. faecium DSM 13590 >256 10 ¹ >10 ⁵

E. faecium DSM 25698 >256 10 ² >10 ⁵

E. faecium DSM 25697 >256 10 ¹ >10 ⁵

E. faecium VRE 24 10 ⁴ >10 ⁵

E. faecium FHM-VRE1 >256 10 ³ >10 ⁵

E. faecium FHM-VRE2 >256 10 ¹ >10 ⁵

E. faecalis JH2-2 : Tn 1549 64 10 ³ >10 ⁵

W. cibaria P18A >256 10 ¹ >10 ⁵

W. confusa P18B >256 10 ¹ >10 ⁵

L. lactis P18C >256 10 ¹ >10 ⁵

Gram-positifs sensibles à la vancomycine vancomycine

S. aureus CFJVIarseille 1 >10 ⁵ >10 ⁵

S. aureus FHM-SA NC >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecium TH26 0.75 >10 ⁵ >10 ⁵

349 0.75 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecium TH12 2 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecium LH165 0.75 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecium A17 0.75 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecium TH43 0.75 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecium TH95 0.75 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecium 282 0.75 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecalis JH2-2 : C2 3 >10 ⁵ >10 ⁵

E. faecalis JH2-2S 2 >10 ⁵ >10 ⁵

E. gallinarum SE3 1.5 >10 ⁵ >10 ⁵

E. casseliflavus SE3 1 >10 ⁵ >10 ⁵

E. hirae LH111 1.5 >10 ⁵ >10 ⁵

Gram-négatifs non-fermentants liés à la mucoviscidose résistantes à la colistine

Colistine

B. cepacia FHM-BC1 >256 10 ¹ 10 ¹

B. cepacia FHM-BC2 24 10 ¹ 10 ⁵

A. xylosoxidans FHM-AX 3 10 ¹ >10 ⁵

0. anthropi FHM-OA NC 10 ² >10 ⁵

I. limosus FHM-IL >256 10 ⁴ 10 ⁴

S. maltophilia FHM-SM 12 10 ³ >10 ⁵

P. pulmonicola FHM-PP >256 10 ¹ 10 ³ P. aeruginosa FHM-P ACOLR 1 >256 10 ¹ 10 ¹

P. aeruginosa FHM-PACOLR2 NC 10 ⁵ >10 ⁵

P. aeruginosa FHM-P ACOLR3 NC 10 ² >10 ⁵

S. putrefaciens FHM-SP NC 10 ³ >10 ⁵

A. baumannii AB-COLR1 8 10 ² 10 ¹

Gram-négatifs non-fermentants liés à la mucoviscidose sensibles à la colistine

P. aeruginosa FHM-P A4 2 >10 ⁵ >10 ⁵

P. aeruginosa FHM-P A5 0.50 >10 ⁵ >10 ⁵

P. aeruginosa FHM-P A6 0.38 >10 ⁵ >10 ⁵

S. xianemensis 111P 0.125 >10 ⁵ >10 ⁵

S. xianemensis 111A 0.094 >10 ⁵ >10 ⁵

2-3-3 Mise en évidence de la synergie.

Les cultures sur les différents milieux composés ont mis en évidence une inhibition systématique des souches d'E. coli positives pour le gène mcr-1 sur la gélose EMB ajoutées à de la colistine et de la vancomycine, alors que les K. pneumoniae étaient bien présentes. Pour les autres milieux LBJMR modifiés, la sensibilité était de 100% pour les souches résistantes à la colistine. Ainsi, une potentielle synergie a été mise en évidence entre les composants de la gélose EMB (éosine et/ou bleu de méthylène) avec les antibiotiques testés (vancomycine et/ou colistine), empêchant la croissance des souches E coli possédant le gène mcr-1 (Tableaux C et F).

En explorant cette piste, ce résultat a été imputé à l'effet de la colistine ou de la vancomycine seule. En effet la sensibilité de la gélose EMB additionnée de colistine était de 100% également, tandis que celle qui ne contient que la vancomycine seule a permis la croissance de toutes les Entérobactéries. En revanche, l'addition des deux antibiotiques à la gélose EMB a de nouveau montré l'inhibition des souches d'E. coli mcr-1 positive, mais pas de souches d'E. coli résistantes à la colistine mais possédant un mécanisme différent (Tableau F). La synergie est donc efficace sur les souches ayant une CMI basse de la colistine, et concerne l'addition de colistine et de vancomycine ensemble avec la gélose EMB. Si l'on ne peut imputer cette inhibition à la seule présence de la vancomycine, on remarque que les souches d'E. co/i e donnent plus leur aspect métallique (vert scarabée), mais sont roses comme les souches K. pneumoniae. Il existe donc une altération due à la vancomycine.

Concernant les Gram-positifs, les résultats sont confirmés : le milieu LBJMR est sensible à 100% pour l'isolement des Entérocoques résistants à la vancomycine, alors que le milieu SuperPolymyxin les inhibe tous (sensibilité des souches à la daptomycine). On relève une sensibilité diminuée de la gélose EMB additionnée de vancomycine seule ou associée avec la colistine. En effet seuls les Entérocoques résistants à la vancomycine avec une CMI>256 pg/mL ont pu être détectées. Enfin, l'ajout seul de colistine n'a pas affecté leur croissance. La composition du milieu LBJMR apparaît donc supérieure ici.

Tableau F : Étude de synergie entre la colistine, la vancomycine et la gélose EMB.

La colistine est la vancomycine ont été ajoutés, seuls ou ensemble, aux mêmes concentrations que dans le LBJMR, 4 et 50 pg/mL, respectivement. Les nombres indiquent le nombre de souches ayant poussé sur les géloses dans chaque catégorie.

Souches Nombre LBJMR SP EMB EMB EMB EMB

VCN CT VCN CT

K. pneumoniae mcr-1 5 5 5 5 5 5 5

E. coli mcr-1 10 10 10 9 9 2 10

E. coli R non mcr-1 5 5 5 4 4 4 5

E. coli sensibles 10 0 0 8 0 0 10

E. faecium ERV 6 6 0 4 6 4 6

E. faecalis ERV 1 1 0 0 1 0 1

E. faecium sensible 8 0 0 0 8 0 8

E. faecalis sensible 2 0 0 0 2 0 2

W. cibaria 1 1 0 1 1 1 1

SP : SuperPolymyxin,

EMB : Eosine - Méthylène Blue,

VCN: Vancomycine,

CT: Colistine

ANNEXE : TABLEAUX 1 à 3

Tableau 1. Comparaison des différents milieux de culture contenant des polymyxines.

Composition en antibiotiques : Polymyxine B (B), Colistine (C), Amphotéricine B (AB), Anisomycine (A) Cycloheximide (CH), Nystatine (N)

Milieux Composition en agents sélectifs ( g/mL) Utilisation Référence

Gram-négatifs Gram- Levures

Polymyx Autres positifs

[ne

LBJMR ³ 4 (C) Vancomycine Gram-négatifs Cette étude

50 colistine- résistants

Gram-positifs

vancomycine- résistants

SuperPolymyxin 3,5 (C) Daptomycine 5 (AB) Entérobactérie Nordmann et

10 s colistine- al., 2016 Bleu de résistantes

méthylène 65

Éosine 400

Martin-Lewis Agar 7,5 (C) Triméthoprime 5 Vancomycine 4 20 (A) Neisseria sp. Martin and

Lewis, 1977

Thayer-Martin Agar 7,5 (C) Vancomycine 3 2,57 (N) Neisseria sp. Thayer and

Martin, 1966

MTM ^b Agar 7,5 (C) Triméthoprime 5 Vancomycine 3 2,57 (N) Neisseria sp. Martin and

Lester, 1971

NYC ^C Agar 7,5 (C) Triméthoprime 3 Vancomycine 2 20 (A) Neisseria sp. Fauer et ai,

1973

Cepacia 35,7 (B) Ticarcilline 100 Bulkhoderia Gilligan et ai, cepacia 1985

OFPBL ^d Agar 35,7 (B) Bacitracine 2,7 Bulkhoderia Welch, 1987 cepacia

Bulkhoderia Cepacia 17.8 (B) Gentamicine 5 Ticarcilline 100 Bulkhoderia Gillian et ai, Agar cepacia 1985

Bulkhoderia Cepacia 71.4 (B) Gentamicine 10 Vancomycine Bulkhoderia Henry, 1997 Agar Sélectif 2.5 cepacia

CNA ^e 10 (C) Acide nalidixique Streptococcus Ellner et ai,

10 sp. et autres 1966

Gram-positifs

BCYE ^f Sélective Agar 9,4 (B) Glycine 3000 Vancomycine 1 80 (CH) Legionella sp. Dennis et ai, with GPVC ⁹ 1984

BCYE Sélective Agar with 16 (C) Vancomycine 80 (CH) Legionella sp. Bopp et al., CCVC ^h 0,5 1981

Cefalotine 4

BCYE Agar Sélectif avec ",9 (B) Glycine 3000 Vancomycine 1 80 (A) Legionella sp. Ta et al., 1995 GPVA

BCYE Agar Sélectif avec 4.76 (B) Vancomycine 80 (A) Legionella sp. Stout et ai, PAV ^] 0,5 1982

BCYE Agar Sélectif avec 9.52 (B) Cefamandole 2 80 (A) Legionella sp. Edelstein, PAC ^k 2007

BCYE Agar Sélectif avec 9.4 (B) Glycine 3000 Vancomycine 1 Legionella sp. Murray, 2007 DGVP ¹

CPC ^m 66.34 (C) Vibrio sp. Vanderzant

11.9 (B) and

Splittstoesser, 1992

Campylobacter Agar 0.3 (C) Novobiocine 5 Cephazoline 50 (CH) Campylobacter Butzler, 1973 Butzler 15 sp.

Bacitracin

337.8

Campylobacter Agar 0.3 (B) Triméthoprime 5 Vancomycine Campylobacter Skirrow, 1977 Skirrow 10 sp.

Campylobacter Agar 0.3 (B) Triméthoprime 5 Vancomycine 2 (AB) Campylobacter Blaser et ai, Blaser-Wang 10 sp. 1978

Cefalotine 15

Campylobacter Agar 0.3 (B) Triméthoprime 5 Rifampicine 5 50 (CH) Campylobacter Bolton and Preston sp. Robertson,

1982

Brucella sélectif 1 (B) Bacitracine 100 (CH) Brucella spp. Jones and

500 Brinley, 1958 Oxford 20 (C) Fosfomycine 10 Cefotetan 2 400 (CH) Lister/a Curtis et ai,

Acriflavine 5 monocytogene 1989

s

Oxford modifié 10 (C) Moxalactam 20 Listeria Lee et ai, monocytogene 1989 s

PALCAM" 10 (B) Ceftazidime 8 Listeria spp. van Nerren et

Acriflavine 5 al., 1989

MYP° 11.9 (B) Bacillus cereus Mossel, 1967

Middlebrook 7H11 Agar 2.38 (B) Triméthoprime 20 Carbenicilline 20 (AB) Mycobacteriac Cohn et al,

50 eae 1968

SPS ^P Agar 10 (B) Sulfadiazine 120 Clostridium Angelotti et al, perfringens 1962

TSN Agar 20 (B) Néomycine 50 Clostridium Marshall et ai, perfringens 1965

SFP ^r Agar 3,57 (B) Kanamycine 12 Clostridium Shahidi and perfringens Ferguson, 1971

LB modifié 2 (C) Vancomycine Gram-négatifs Von

50 colistine- Wintersdorff et résistants ai, 2016

MacConkey modifié 2 (C) Gram-négatifs Meinersmann colistine- et ai, 2016 résistants

a LBJMR : Notre milieu de culture, bMTM : Modified Thayer-Martin, NYCc : New York City, dOFPBL :

Oxidation/Fermentation, Polymyxine B, Bacitracine, Lactose, eCNA : Colistine, Acide nalidixique, fBCYE : Buffered Charcoal, Yeast Extract, gGPVC : Glycine, Polymyxine B, Vancomycine et Cycloheximide, hCCVC : Cephalotine,

Colistine, Vancomycine et Cycloheximide, iGPVA : Glycine, Polymyxine B, Vancomycine et Anisomycin, jPAV :

Polymyxine B, Anisomycine, Vancomycine, kPAC : Polymyxine B, Anisomycine, Céfamandole, IDGVP : Dyes,

Glycine, Vancomycine, Polymyxine B, mCPC : Cellobiose, Polymyxine B, Colistine, nPALCAM : Polymyxine B,

Acriflavine, Lithium, Ceftazidime, Esculine, Mannitol, oMYP : Mannitol, Egg Yolk, Polymyxine B, pSPS : Sulfite,

Polymyxine B, Sulfadizine, qTSN : Trypticase , Sulfite, Néomycine, rSFP : Shahidi Ferguson Perfringens. 0 Tableau 2. Liste des souches étudiées et leurs Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI)

pour la colistine (Gram-négatifs) ou la vancomycine (Gram-positifs).

Souches bactériennes Isolats Origine Echantillons CMI Mécanismes Références

de résistance

Entérobactéries avec une résistance acquise à la colistine

Escherichia coli SE65 Algérie Humain 4 mcr- ^■ 1 (Berrazeg et al., 2016)

117R Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

1R Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

1R 2104 Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

44A Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

6R Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

85R Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

95R Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

96R Arabie Saoudite Humain 4 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016)

134R Arabie Saoudite Humain 3 mcr- ^■ 1 (Leangapichart et al., 2016) 143R Arabie Saoudite Humain 3 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016)

LH121 Laos Humain 16 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

LH140 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

PhoP E375K

LH257 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

LH57 Laos Humain 8 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

PhoP E375K

LH1 Laos Humain 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

LH30 Laos Humain 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

TH214 Thaïlande Humain 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

TH99 Thaïlande Humain 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

FHA102 France Humain 12 pmrA A 159V (Olaitan et al., 2016)

FHM19 France Humain 12 pmrA P7-Q12 (Olaitan et al., 2016)

(del 6aa)

FHA113 France Humain 12 pmrA T156K (Olaitan et al., 2016)

NH94 Nigeria Humain 12 pmrA 192 (Olaitan et al., 2016)

insertion

TH176 Thaïlande Humain 6 Inconnu (Olaitan et al., 2016)

LB4 France Humain 16 Inconnu De cette étude

235 Algérie Poulet 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

SA9 Algérie Poulet 3 mcr-1 De cette étude

SE3 Algérie Poulet 3 mcr-1 De cette étude

P6 Laos Cochon 6 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

P10 Laos Cochon 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

P17 Laos Cochon 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2016)

FHA60 France Humain 8 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016)

FHM128 France Humain 4 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016)

119R Arabie Saoudite Humain 3 mcr-1 (Leangapichart et al., 2016)

LH131 Laos Humain 32 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain mgrB Stop et al., 2016)

LH61 Laos Humain 24 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain mgrB Sub et al., 2016)

LH17 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain pmrB T157P et al., 2016)

LH92 Laos Humain 12 mcr-1 (Olaitan et al., 2014; Rolain et al., 2016)

LB1 France Humain 32 mgrB Stop Non publié

FHM169b France Humain 8 mgrB Stop (Olaitan et al., 2014)

LH12 Laos Humain 32 mgrB Stop (Olaitan et al., 2014)

pmrA E35A

LH74 Laos Humain 12 mgrB sub (Olaitan et al., 2014)

NH53 Nigeria Humain 4 mgrB Sub (Olaitan et al., 2014)

TH20 Thaïlande Humain 32 mgrB IS 1 (Olaitan et al., 2014)

TH196 Thaïlande Humain 8 mgrB IS 1 (Olaitan et al., 2014)

TH28 Thaïlande Humain 8 mgrB IS2 (Olaitan et al., 2014)

TH213 Thaïlande Humain 12 mgrB IS3 (Olaitan et al., 2014)

LH70 Laos Humain 12 pmrA G53C (Olaitan et al., 2014)

TH34 Thaïlande Humain 24 pmrB S205P (Olaitan et al., 2014) TH54 Thaïlande Humain 16 pmrB T157P (Olaitan et al., 2014)

TH224 Thaïlande Humain 4 pmrB T157P (Olaitan et al., 2014)

FHM120b France Humain 64 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

FHA105 France Humain 24 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

FHM77 France Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

LH140 Laos Humain 16 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

LH94 Laos Humain 16 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

LH375 Laos Humain 12 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

LH102 Laos Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

TH205 Thaïlande Humain 64 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

TH68 Thaïlande Humain 64 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

TH176 Thaïlande Humain 12 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

TH21 Thaïlande Humain 12 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

TH114 Thaïlande Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

TH164 Thaïlande Humain 6 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

TH166 Thaïlande Humain 3 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

LB3 France Humain 64 Inconnu De cette étude

Klebsiella oxytoca FHA41 France Humain 12 mgrB IS 1 (Olaitan et al., 2014; Olaitan and Rolain, 2015)

FHA124 France Humain 6 Inconnu (Olaitan et al., 2014)

Enterobacter EA15090 France Humain >256 PmrA (Diene et al., 2013) aerogenes

Enterobacter asburiae LH74 Laos Humain > 256# Inconnu Non publié

Enterobacter cloacae NH131 Nigeria Humain 64# Inconnu Non publié

NH132 Nigeria Humain > 256# Inconnu Non publié

NH52 Nigeria Humain > 256# Inconnu Non publié

SB1 France Humain 2 mcr-1 Non publié

Salmonella enterica 65RC Arabie Saoudite Humain 16 Inconnu (Olaitan et al., 2015)

100RC3 Arabie Saoudite Humain 8 Inconnu (Olaitan et al., 2015)

Entérobactéries avec une résistance intrinsèque à la colistine

Proteus mirabilis FH112 France Humain >256 Intrinsèque

Proteus vulgaris PV148 France Humain >256 Intrinsèque

Providencia TH44 Thaïlande Humain >256 Intrinsèque

alcalifaciens

Providencia rettgeri H1734 France Humain >256 Intrinsèque

Morganella morganii FM102 France Humain >256 Intrinsèque

Serratia marcescens E13 Laos Environne 128 Intrinsèque

ment

Gram-négatifs non fermentants liés à la mucoviscidose

Burkholderia cepacia FHM-BC1 France Humain 24 Inconnu

FHM-BC2 France Humain >256 Inconnu

Chryseobacterium FHM-CG France Humain >256 Intrinsèque

gleum

Chryseobacterium FHM-CO France Humain >256 Intrinsèque

oranimense

Chryseobacterium FHM-CI France Humain >256 Intrinsèque

indologenes Brevundimonas FHM-BD France Humain 32 Inconnu

diminuta

Achromobacter xyloso FHM-AX France Humain 3 Inconnu

xidans

Stenotrophomonas FHM-SM France Humain 12 Inconnu

maltophilia

Inquilinus limosus FHM-IL France Humain >256 Intrinsèque

Pandoraea FHM-PP France Humain >256 Inconnu

pulmonicola

Shewanella FHM-SP France Humain NC Intrinsèque

putrefaciens

Ochromobacter FHM-OA France Humain NC Intrinsèque

anthropi

Pseudomonas FHM- France Humain >256 Inconnu

aeruginosa PACOLR1

FHM- France Humain NC Inconnu

PACOLR2

FHM- France Humain NC Inconnu

PACOLR3

Autres gram-négatifs non-fermentants résistant à la colistine

Acinetobacter AB-COLR1 France Humain 8 Inconnu

baumannii

AB-COLR2 France Humain NC Inconnu

Acinetobacter ABG13R France Humain NC Inconnu

nosocomialis

Gram-négatifs sensibles à la colistine

Enterobacter asburiae P113 France Humain 0, 19 Sensible

Enterobacter cloacae NH151 Nigeria Humain 0,50 Sensible

NH74 Nigeria Humain 0,38 Sensible

Klebsiella pneumoniae CIP 82.91 Humain 0,125 Sensible

LB2 France Humain 0,128 Sensible

TH20S Thaïlande Humain 0,125 Sensible

TH28S Thaïlande Humain 0,125 Sensible

Proteus vulgaris P100 Algérie Humain 0,94 Sensible

Salmonella enterica 108R Arabie Saoudite Humain 1 Sensible (Olaitan et al., 2015)

122R Arabie Saoudite Humain 0,5 Sensible (Olaitan et al., 2015)

Escherichia coli ATCC25922 0,094 Sensible

CIP 76.24

161 Algérie Poulet 0,094 Sensible

169 Algérie Poulet 0,094 Sensible

FHM88S France Humain 0,125 Sensible De cette étude

TH134S France Humain 0,094 Sensible De cette étude

LH53S Laos Humain 0,094 Sensible De cette étude

LH165S Laos Humain 0,074 Sensible De cette étude

TH77S Thaïlande Thaïlande 0,064 Sensible De cette étude

282S Algérie Poulet 0,074 Sensible De cette étude

FHM19S France Humain 0,125 Sensible De cette étude

Pseudomonas FHM-PA4 France Humain 2 Sensible

aeruginosa

FHM-PA5 France Humain 0,50 Sensible

FHM-PA6 France Humain 0,38 Sensible

Shewanella 111P France Humain 0,125 Sensible

xianemensis 111A France Humain 0,094 Sensible

Acinetobacter ABG13S France Humain 0,064 Sensible

nosocomialis

Acinetobacter pitti MK France Humain 0,125 Sensible

Gram-positifs résistants à la colistine

Enterococcus faecium DSM 17050 Allemagne Humain >256 vanA

DSM13590 Allemagne Humain >256 vanA

DSM25698 Corée du Sud Humain >256 vanA

DSM25697 Corée du Sud Humain >256 vanA

FHMVRE1 France Humain >256 Sensible De cette étude

FHMVRE2 France Humain >256 Inconnu De cette étude

VRE France Humain 24 Inconnu Non publié

Enterococcus faecalis JH2-2: Tn France Humain 64 vanB (Launay et al., 2006)

1549

Weissela cibaria P18A Laos Cochon >256 Inconnu De cette étude

Weissela confusa P18B Laos Cochon >256 Inconnu De cette étude

Leuconostoc lactis P18C Laos Cochon >256 Inconnu De cette étude

Gram-positifs sensibles à la vancomycine

Staphylococcus aureus CF_Marseill France Humain 1 Sensible (Rolain et al., 2009) c

FHM-SA France Humain NC Sensible Non publié

Enterococcus faecium TH26 Thaïlande Humain 0,75 Sensible De cette étude

349 Algérie Poulet 0,75 Sensible De cette étude

TH12 Thaïlande Humain 2 Sensible De cette étude

LH165 Laos Humain 0,75 Sensible De cette étude

A17 Algérie Poulet 0,75 Sensible De cette étude

TH43 Thaïlande Humain 0,75 Sensible De cette étude

TH95 Thaïlande Humain 0,75 Sensible De cette étude

282 Algérie Poulet 0,75 Sensible De cette étude

Enterococcus faecalis JH2-2 : C2 Thaïlande Humain 1,5 Sensible De cette étude

JH2-2S Thaïlande Humain 1,5 Sensible De cette étude

Enterococcus SE3 Algérie Poulet 1,5 Sensible De cette étude gallinarum

Enterococcus SE3 Algérie Poulet 1,5 Sensible De cette étude casseliflavus

Enterococcus hirae LH111 Laos Humain 1 Sensible De cette étude

Tableau 3. Comparaison de différentes bases d'agar additionné de colistine à différentes concentrations permettant la détection de souche résistantes à la colistine en incluant les souches ayant une CMI basse.

Souches résistantes à la colistine

b Souches sensibles à la colistine

(+) Croissance bactérienne (-) Pas de croissance bactérienne

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