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Title:
SELECTIVE RECOMBINANT MUTANTS OF MYCOBACTERIUM SMEGMATIS MC2 155 AND USE THEREOF FOR PRODUCING 1,4-ANDROSTADIENE-3,17-DIONE OR 4-ANDROSTENE-3,17-DIONE FROM NATURAL STEROLS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2015/128534
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to bacterial strains of the species M. smegmatis with the activity 3-ketosteroid-9α-hydroxylase inactivated or with the activities 3-ketosteroid-9α-hydroxylase and 3-ketosteroid-∆1-dehydrogenase, and to the use of said strains for obtaining substantially pure AD or ADD and steroids from same.

Inventors:
GARCÍA LÓPEZ JOSÉ LUIS (ES)
UHÍA CASTRO IRIA (ES)
GALÁN SICILIA BEATRIZ (ES)
Application Number:
PCT/ES2015/070144
Publication Date:
September 03, 2015
Filing Date:
February 27, 2015
Export Citation:
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Assignee:
CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION (ES)
International Classes:
C12P33/00; C12N9/02; C12R1/34
Domestic Patent References:
WO2009064924A12009-05-22
WO2003070925A22003-08-28
Foreign References:
CN101565709A2009-10-28
US3684657A1972-08-15
US3684657A1972-08-15
EP1232278A12002-08-21
Other References:
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LEDNICER D.; MITSCHER L: "The Organic Chemistry of Drug synthesis", vol. 1, 1977, WILEY
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JACKSON, M.; CAMACHO, L.R.; GICQUEL, B.; GUILHOT, C.: "Mycobacterium tuberculosis Protocols", 2001, HUMANA PRESS INC, article "Gene replacement and transposon delivery using the negative selection marker sacB", pages: 59 - 75
Attorney, Agent or Firm:
FUSTER OLAGUÍBEL, Gustavo (ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1 . Una cepa bacteriana de la especie M. smegmatis, caracterizada porque comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, y porque es capaz de producir por fermentación 1 ,4-androstadien-3, 17- diona (ADD) de manera sustancialmente pura.

2. Cepa bacteriana según la reivindicación 1 , caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 a- hidroxilasa se corresponde con:

a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ; o

b) una vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia.

3. Cepa bacteriana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa se corresponde con la secuencia de SEQ ID NO 1 .

4. Cepa bacteriana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa está delecionada total o parcialmente.

5. Cepa bacteriana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque corresponde a la cepa depositada con número de referencia identificativa del depositante MS6039 y fecha 4 de Julio de 2013 en la Colección Española de Cultivos Tipo; bajo el número de acceso CECT 8331 .

6. Una cepa bacteriana de la especie M. smegmatis, caracterizada porque comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 3- cetosteroide-A1 -deshidrogenasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente; y porque es capaz de producir por fermentación 4-androsten-3, 17-diona (AD) de manera sustancialmente pura. 7. Cepa bacteriana según la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de nucleotidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 a- hidroxilasa se corresponde con:

a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ; o

b) una vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleotidos de dicha secuencia.

8. Cepa bacteriana según la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de nucleotidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa se corresponde con:

a) la secuencia de SEQ ID NO 2; o

b) una vahante a la secuencia de SEQ ID NO 2 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleotidos de dicha secuencia.

9. Cepa bacteriana según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque la secuencia de nucleotidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa se corresponde con la secuencia de SEQ ID NO 1 .

10. Cepa bacteriana según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque la secuencia de nucleotidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 - deshidrogenasa se corresponde con la secuencia de SEQ ID NO 2.

1 1 . Cepa bacteriana según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizada porque la secuencia de nucleotidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa se corresponde con:

a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ; o

b) una vahante a la secuencia de SEQ ID NO 1 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleotidos de dicha secuencia;

y porque la secuencia de nucleotidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 - deshidrogenasa se corresponde con:

c) la secuencia de SEQ ID NO 2; o d) una vanante a la secuencia de SEQ ID NO 2 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleotidos de dicha secuencia.

12. Cepa bacteriana según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1 1 , caracterizada porque corresponde a la cepa depositada con referencia identificativa por el depositante MS6039-5941 y fecha 4 de Julio de 2013 en la Colección Española de Cultivos Tipo; bajo el número de acceso CECT 8332.

13. Uso de la cepa bacteriana definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la producción de ADD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales.

14. Uso de la cepa bacteriana definida en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 para la producción de AD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales.

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizada porque los esteróles naturales se seleccionan de colesterol o fitoesteroles.

16. Procedimiento para la obtención de ADD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar y esterilizar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales, en un polialcohol o un aceite vegetal, con la adición de sales minerales;

b) crecer un cultivo de la cepa bacteriana definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la mezcla obtenida en a);

c) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque en la etapa a) se añade un tensoactivo.

18. Procedimiento para la obtención de AD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de: a) preparar y esterilizar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales, en un polialcohol o un aceite vegetal, con la adición de sales minerales;

b) crecer un cultivo de la cepa bacteriana definida en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 en la mezcla obtenida en a);

c) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque en la etapa a) se añade un tensoactivo.

20. Procedimiento para la obtención de ADD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol o un aceite vegetal;

b) preparar un cultivo de la cepa bacteriana definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el cultivo celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura.

21 . Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque en la etapa a) se añade un tensoactivo.

22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21 , caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol, en presencia de un tensoactivo;

b) preparar un cultivo de la cepa bacteriana definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y obtener un sedimento celular de la misma;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el sedimento celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura.

23. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque en la etapa a) se añaden sales minerales. 24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque en la etapa a) se esteriliza la mezcla obtenida.

25. Procedimiento para la obtención de AD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol o un aceite vegetal;

b) preparar un cultivo de la cepa bacteriana definida en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el cultivo celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque en la etapa a) se añade un tensoactivo.

27. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 25 y 26, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol, en presencia de un tensoactivo;

b) preparar un cultivo de la cepa bacteriana definida en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 y obtener un sedimento celular de la misma;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el sedimento celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

28. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado porque en la etapa a) se añaden sales minerales.

29. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque en la etapa a) se esteriliza la mezcla obtenida.

30. ADD en forma sustancialmente pura, obtenible mediante el procedimiento definido en una cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 y 20 a 24. 31 . AD en forma sustancialmente pura, obtenible mediante el procedimiento definido en una cualquiera de las reivindicaciones 18, 19 y 25 a 29.

32. Uso de ADD según la reivindicación 30, para la preparación de esferoides.

33. Uso de AD según la reivindicación 31 , para la preparación de esferoides.

34. Un esferoide obtenible a partir de ADD definido en la reivindicación 30.

35. Un esferoide obtenible a partir de AD definido en la reivindicación 31 .

Description:
M LITANTES RECOM BINANTES SELECTIVOS DE MYCOBACTERIUM SMEGMATIS mc 2 155 Y SU USO PARA LA PRODUCCIÓN DE 1,4-ANDROSTADIEN-3,17-DIONA O 4-ANDROSTEN-3,17-DIONA A PARTIR DE ESTEROLES NATURALES

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra dentro del Área de la Biotecnología en los sectores de la Industria Química, de la Industria Farmacéutica y de la Industria Alimentaria, entre otras. El producto desarrollado hace que sea aplicable a la producción de esferoides mediante biotransformaciones bacterianas, pero especialmente para la producción de esferoides a partir de esferoides naturales.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Esferoides

Los esferoides son lípidos terpénicos con una estructura definida, que contienen un núcleo de ciclopentanoperhidrofenantreno o gonano con cuatro anillos fusionados (A- D); esta estructura básica se modifica por adición de diversos grupos funcionales, como carbonilos e hidroxilos (hidrófilos) o cadenas hidrocarbonadas (hidrófobas). La actividad fisiológica de los esferoides depende de su estructura, es decir, del tipo, número y posición de los grupos funcionales unidos al núcleo esferoide, así como de su ¡somería configuracional y estructural, es decir, estereoisomería y regioisomería, y del estado de oxidación de los anillos.

Los esferoides se encuentran muy difundidos en la naturaleza y están presentes en todo tipo de organismos. Así se han identificado cientos de esteróles y compuestos relacionados que se producen en las plantas, como por ejemplo los fitoesteroles; en los insectos, como por ejemplo los ecdisteroides; en los vertebrados, como por ejemplo, el colesterol, los corticoesteroides o las hormonas esteroideas; y en eucariotas inferiores (levaduras y hongos), como por ejemplo el ergosterol.

Hoy en día los productos farmacéuticos de tipo esteroideo son de gran importancia para mantener nuestra calidad de vida, ya que muchos esferoides se utilizan como agentes anti-tumorales, anti-inflamatorios, anti-microbianos, anti-virales, anti-fúngicos, anti-estrogénicos, anti-convulsivos y antialérgicos. Además otros se utilizan como agentes para la prevención y terapia de muchas otras enfermedades, tales como los cánceres hormona-dependientes de mama y de próstata, ciertas formas de cáncer de colon, la obesidad, la diabetes, la artritis reumatoide, la hipertensión, el asma, el eczema, las inflamaciones, los trastornos metabólicos, enfermedades neurodegenerativas en ancianos, o enfermedades del sistema nervioso central, entre otras muchas. Se incluyen aquí andrógenos, esferoides anabólicos, estrógenos, y corticosteroides, entre otros.

Alrededor de 300 fármacos esteroideos han sido aprobados hasta la fecha para su uso en clínica, y este número tiende a crecer. Los medicamentos esteroideos se encuentran entre los productos médicos más comercializados y representan la segunda gran categoría de fármacos junto con los antibióticos. La producción anual de esferoides se estima en más de un millón de toneladas, con un mercado de miles de millones de euros.

Muchos esferoides utilizados como fármacos se sintetizan químicamente, pero desde hace mucho tiempo se conoce que la transformación microbiana de los esferoides es una herramienta poderosa para la generación de nuevos fármacos esteroideos, así como para la producción eficiente de productos intermedios clave para la síntesis química de tales fármacos. Las bioconversiones permiten modificar los esferoides en posiciones de la molécula difícilmente disponibles o accesibles para los agentes químicos, y la funcionalización de la molécula puede ser realizada regio- y estéreo- específicamente. Más aún, mediante la bioconversión se pueden completar varias reacciones en un solo paso. Estas y otras ventajas de las biotransformaciones han supuesto una amplia expansión de las tecnologías microbianas en el campo de esferoides, de tal manera que las aplicaciones de los microorganismos para la modificación de esferoides se han revisado en numerosos artículos a lo largo de los últimos años (por ejemplo, Marina V. Donova et al,, Microbial steroid transformations: current state and prospecta. Appí. Microbio!. Biotechnoí. 2012,; 94, 1423-1447).

Preparación de esferoides

Los principales productos intermedios para la síntesis industrial de fármacos esteroideos son 4-androsten-3,17-diona (en adelante, AD), 9a-hydroxy-4-androsten- 3, 17-diona (en adelante, 9-OH-AD), y 1 ,4-androstadien-3,17-diona (en adelante, ADD). Por lo tanto, la producción económica y eficiente de estos intermedios es una necesidad imperante en la industria farmacéutica. En el catabolismo de los microorganismos, la enzima 3-cetosteroide-A1 - deshidrogenasa es la responsable de transformar AD en ADD, y la enzima 3- cetosteroide 9a-hidroxilasa, la responsable de transformar AD en 9-OH-AD.

Las enzimas con actividad 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa contienen un solo tipo de subunidad y están codificadas por un único gen denominado genéricamente kstD.

Por otra parte, las enzimas descritas con actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa poseen dos subunidades proteicas y por lo tanto estas enzimas están codificadas por dos genes diferentes, denominados genéricamente kshA (que codifica el componente oxigenasa de la enzima) y kshB (que codifica el componente reductasa de la enzima), respectivamente.

Para la obtención de los mencionados productos intermedios, una de las principales materias primas empleadas en la industria química de esferoides son las sapogeninas, tal como la diosgenina. Alternativamente también se utilizan como matenales de partida en la industria de los esferoides algunos esteróles naturales, como son los esferoides 3p-alcoholes, que contienen un doble enlace en la posición 5-6 y una cadena lateral alifática en C-17. Entre estos esferoides se encuentran el colesterol, el cual se conoce como el esterol animal, o los fitoesteroles, los cuales son mezclas de esteróles derivados de plantas, principalmente de origen de soja, como por ejemplo sitosterol, estigmasterol, campesterol, y brasicasterol. Desde la década de los 1980, la transformación microbiana de fitoesterol viene siendo un foco de investigación en el campo de los esferoides (Marina V. Donova et al., Microbial steroid transformations: current state and prospecta . Appl. Microbio!. Biotechnoi. 2012, 94, 1423-1447).

Hasta hace muy poco tiempo, los procesos de biotransformación microbianos de esferoides se realizaban utilizando microorganismos naturales, bien directamente sin modificación alguna, o bien mutados mediante procedimientos convencionales. Recientemente, se están aplicando asimismo técnicas de ingeniería genética. No obstante, hasta la fecha no se ha logrado producir AD o ADD en forma pura a partir de colesterol, fitoesteroles u otros esteróles naturales.

Mutagénesis clásica y mutagénesis insercional al azar con transposones Numerosas publicaciones y patentes describen estos procesos y los microorganismos empleados. Por ejemplo, se han descrito procesos de producción de AD y ADD a partir de esteróles naturales, mediante cepas aisladas de suelo de Mycobacterium sp. y posteriormente mutadas mediante irradiación con luz ultravioleta (ver patente US 3684657 (1972); y William J. Marsheck et al, Microbial Degradation of Sterols, Appl Microbio!., 1972, 23(1), 72-77).

Mediante mutagénesis al azar utilizando un transposón se ha obtenido un muíante insercional de Mycobacterium smegmatis (en adelante, M. smegmatis) bloqueado en el componente oxigenasa KshA de la enzima 3-cetoesteroide 9a-hidroxilasa que acumula mezclas de AD y ADD a partir de β-sitosterol (Attila Andor et ai, Generation of useful insertionally blocked sterol degradation pathway mutants of fast-growing mycobacteria and cloning, characterization, and expression of the terminal oxygenase of the 3- ketosteroid 9ct-hydroxylase in Mycobacterium smegmatis me 2 155. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 6554-6559)

Hay que señalar que los mutantes que han sido aislados por mutagénesis clásica o por mutagénesis insercional al azar con transposones, generalmente son inadecuados para los procesos industriales, debido a su inestabilidad genética y/o sus bajas eficiencias de bioconversión. Más aún, estas cepas suelen producir mezclas de AD y ADD y la dificultad de separar estos dos productos es un cuello de botella clave para la transformación microbiana de los fitoesteroles en la industria.

Biología molecular e ingeniería genética

Recientemente se han aplicado las nuevas tecnologías de biología molecular e ingeniería genética para obtener cepas modificadas genéticamente capaces de acumular AD, ADD y otros productos intermediarios del metabolismo de los esferoides. Estas técnicas están basadas en el conocimiento de los genomas de las bacterias que metabolizan los esteróles.

En este sentido son conocidos varios genomas de bacterias que metabolizan esteróles como por ejemplo los genomas de M. smegmatis mc 2 155 (GenBank CP000480.1 ), Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank AL123456.3) o Rhodococcus jostii RHA1 (GenBank CP000431 .1 ). Más concretamente se han descrito algunos de los genes implicados en el catabolismo del colesterol en algunas bacterias (José L. García et al., Catabolism and biotechnological applications of cholesterol degrading bacteria. Microb. Biotechnol. 2012, 5, 679-699)

También se ha desarrollado un método para la construcción de mutantes de deleción selectiva de genes en el género Rhodococcus y mediante este procedimiento se delecionó el gen kstD1 que codifica la enzima 3-cetoesteroide-A1 -deshidrogenasa (KstD1 ) en Rhodococcus erythropolis SQ1 , pero la cepa muíante aún poseía una gran actividad residual de la enzima KstD y no acumulaba intermediarios (Robert van der Geize R et al., Unmarked gene deletion mutagenesis of kstD, encoding 3-ketosteroid Delta l-dehydrogenase, in Rhodococcus erythropolis SQ1 using sacB as counter- selectable marker, FEMS Microbiol Lett. 2001, 18, 205(2), 197-202). Sin embargo, cuando se inactivaron los genes kstD1 y kstD2 se observó una acumulación de 90H- AD (Lubbert Dijkhuizen et al., Microbial 9(ct)-hydroxylation of steroids, Solicitud de Patente EP1232278A 1).

También se ha demostrado que es posible acumular ADD a partir de fitoesteroles en la bacteria Rhodococcus erythropolis SQ1 bloqueada en la enzima 3-cetoesteroide 9a- hidroxilasa de dos componentes oxygenasa (KshA) y reductasa (KshB) mediante ingeniería genética por deleción de los dos genes kshA y kshB que codifican esta enzima (R. van der Geize, et al., Molecular and functional characterization of kshA and kshB, encoding two components of 3-ketosteroid 9ct-hydroxylase, a class IA monooxygenase, in Rhodococcus erythropolis strain SQ1. Molecular Microbiology 2002, 45(4), 1007-1018) (Robert Van der Geize et al., Identification of 3-ketosteroid 9a- hydroxylase genes and microorganisms blocked in 3-ketosteroid 9ct-hydroxylase activity, Solicitud de patente WO 03/070925). El problema que surge en este caso es que la cepa posee al menos tres actividades KshA y la deleción de un solo KshA hace que el ADD que se acumula se metabolice por la acción de estas enzimas adicionales (Robert van der Geize, et al., Characterization of a Second Rhodococcus erythropolis SQ1 3-Ketosteroid 9ct-Hydroxylase Activity Comprising a Terminal Oxygenase Homologue, KshA2, Active with Oxygenase-Reductase Component KshB. Appl. Environ. Micorbiol. 2008, 74, 7197-7203). Un problema adicional que presentan estos microorganismos modificados genéticamente es que solo se puede acumular ADD a partir de AD, pero no a partir de fitoesteroles, ya que la producción de ADD a partir de fitoesteroles naturales está inhibida por razones que actualmente se desconocen.

También mediante ingeniería genética se ha inactivado y aumentado la actividad de la enzima 3-cetoesteroide-A1 -deshidrogenasa (KsdD) en la bacteria Mycobacterium neoaurum NwlB-01 para producir mezclas de AD y ADD a partir de fitoesteroles (Wei Wei et al., Inactivation and Augmentation of the Primary 3-Ketosteroid- - Dehydrogenase in Mycobacterium neoaurum NwlB-01: Biotransformation of Soybean Phytosterols to 4-Androstene-3, 17-Dione or 1,4-Androstadiene-3, 17-Dione, Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 4578-4582).

Mediante mutagénesis al azar utilizando transposones se han encontrado mutantes de M. smegmatis y de Mycobacterium phlei que no crecen en β-sistosterol y que acumulan mezclas de AD, ADD y otros intermediarios en el medio de cultivo en presencia de β- sitosterol {Attila Andor et al., Generation of useful insertionally blocked sterol degradation pathway mutants of fast-growing mycobacteria and cloning, characterization, and expression of the terminal oxygenase of the 3-ketosteroid 9alpha- hydroxylase in Mycobacterium smegmatis mc(2) 155. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 6554-6559). Se ha podido comprobar que uno de estos mutantes tenía el transposón insertado en el gen kshA. El problema que presentan estos mutantes de transposición es que debido a la naturaleza de los transposones son muy inestables. Además se acumula en forma de mezcla el AD y el ADD lo que dificulta su posterior separación.

Recientemente en una cepa aislada de Rhodococcus ruber strain Chol-4 (Laura Fernández de las Heras et al., Morphological, Physiological, and Molecular Characterization of a Newly Isolated Steroid-Degrading Actinomycete, Identified as Rhodococcus ruber strain Chol-4. Curr. Microbiol. 2009, 59, 548-553), se ha demostrado la acumulación de 9a-hidroxi-4-androsten-3,17-diona (9-OH-AD) a partir de AD mediante la deleción de 3 genes de kstD (kstD1, kstD2 y kstD3) que codifican 3- cetoesteroide-A1 -deshidrogenasa (Laura Fernández de las Heras et al., Molecular characterization of three 3-ketosteroid-A(1)-dehydrogenase isoenzymes of Rhodococcus ruber strain Chol-4. J. Steroid Biochem. Mol. Bioi, 2012, 132, 271-281). En este caso tampoco se ha demostrado que se pueda acumular 9-OH AD con las bacterias modificadas genéticamente a partir de esteróles naturales. Se han descrito cepas mutantes de M. smegmatis (Anna Brzostek et al., Identification and targeted disruption of the gene encoding the main 3-ketosteroid dehydrogenase in Mycobacterium smegmatis. Microbiology 2005, 151, 2393-2402) con uno o dos genes con actividad 3-cetosteroide-A(1)-deshidrogenasa (ksdD) delecionados. Se han identificado hasta 6 genes putativos que codifican posibles KsdDs, de los cuales se seleccionan dos por homología. La deleción de uno de ellos proporciona una cepa muíante capaz de acumular una mezcla de AD y 9-OH-AD a partir de colesterol, no obstante no se elimina totalmente la degradación de AD a ADD, lo que confirma la presencia de varios genes homólogos con actividad KsdD. La deleción de dos genes conduce a la obtención de una mezcla de AD y 9-OH-AD, sin la formación detectable de ADD.

De todo lo anterior se deduce que hasta el momento no se ha conseguido obtener mediante mutagénesis dirigida una bacteria recombinante que sea capaz de producir AD o ADD en forma pura a partir de colesterol, fitoesteroles u otros esteróles naturales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a cepas modificadas genéticamente de M. smegmatis me 2 155, con uno o más genes implicados en el catabolismo del colesterol inactivados funcionalmente o delecionados total o parcialmente, así como a procesos para producir AD o ADD de forma sustancialmente pura, sin mezclas entre sí o mezclas con 9-OH- AD o 9-OH-ADD, a partir de esteróles naturales, ya sea a partir de colesterol o de fitoesteroles, utilizando dichas cepas modificadas.

Así, un primer aspecto de la invención es una cepa bacteriana de la especie M. smegmatis, la cual comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, la cual es capaz de producir por fermentación ADD de manera sustancialmente pura.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de dicha cepa bacteriana para la producción de ADD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales. Un tercer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de ADD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de: a) preparar y esterilizar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales, en un polialcohol o un aceite vegetal, con la adición de sales minerales;

b) crecer un cultivo de la cepa bacteriana definida anteriormente;

c) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de AD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de: a) preparar y esterilizar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales, en un polialcohol o un aceite vegetal, con la adición de sales minerales;

b) crecer un cultivo de la cepa bacteriana definida anteriormente en la mezcla obtenida en a);

c) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

Otro aspecto se refiere a un procedimiento para la obtención de ADD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol o un aceite vegetal;

b) preparar un cultivo de la cepa bacteriana definida anteriormente;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el cultivo celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere a ADD en forma sustancialmente pura, obtenible mediante el procedimiento anteriormente definido.

Asimismo la invención se refiere al uso de dicho ADD para la preparación de esferoides, así como a un esferoide obtenible a partir de dicho ADD, definido anteriormente.

Según otro aspecto, la invención se refiere a una segunda cepa bacteriana, de la especie M. smegmatis, la cual comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 a-hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, así como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente; la cual es capaz de producir por fermentación AD de manera sustancialmente pura.

Otro aspecto de la invención es el uso de esta segunda cepa bacteriana para la producción de AD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales.

Un aspecto adicional es un procedimiento para la obtención de AD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol o un aceite vegetal, en presencia de un tensoactivo;

b) preparar un cultivo de dicha segunda cepa bacteriana anteriormente definida;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el cultivo celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

La invención en otro aspecto se refiere a AD en forma sustancialmente pura, obtenible mediante el procedimiento definido anteriormente. Asimismo, la invención se refiere, en un aspecto adicional, al uso de dicho AD para la preparación de esferoides. Adicionalmente, la invención se refiere a un esferoide obtenible a partir de dicho AD.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Construcción de M. smegmatis CECT 8331 (MS6039).

En primer lugar, utilizando como molde el genoma de M. smegmatis ίτκ^ δδ se amplificaron mediante PCR dos fragmentos de ADN, uno en la región aguas arriba del gen MSMEG_6039 y otro en la región aguas abajo del mismo gen. Los dos fragmentos de ADN generados se digirieron con enzimas de restricción y se clonaron en el plásmido pJQ200x, generando el plásmido pJQ6039. El plásmido pJQ6039 se transformó mediante electroporacion en células de la cepa M. smegmatis ίτκ^ δδ competentes y se procedió a un proceso de selección de la cepa muíante. La cepa muíante CECT 8331 (MS6039) se obíuvo iras dos pasos de selección; en un primer paso se seleccionaron recombinantes simples (gentamicina resistentes, sacarosa sensibles y xylE positivos) y éstos se sembraron en una placa de agar 7H10 con 10% de sacarosa para seleccionar sucesos de doble recombinación. Las colonias resistentes a sacarosa, sensibles a gentamicina y no portadoras del gen xylE fueron analizadas por PCR para confirmar la deleción de MSMEG_6039, lo que significó la obtención de la cepa muíante CECT 8331 (MS6039).

Figura 2. Construcción de M. smegmatis CECT 8332 (MS6039-5941)

En primer lugar, utilizando como molde el genoma de M. smegmatis ίτκ^ δδ se amplificaron mediante PCR dos fragmentos de ADN, uno en la región aguas arriba del gen MSMEG_5941 y otro en la región aguas abajo del mismo gen. Los dos fragmentos de ADN generados se digirieron con enzimas de restricción y se clonaron en el plásmido pJQ200x, generando el plásmido pJQ5941 . El plásmido pJQ5941 se transformó mediante electroporación en células de la cepa CECT 8331 (MS6039) competentes y se procedió a un proceso de selección de la nueva cepa muíante. La nueva cepa muíaníe CECT 8332 (MS6039-5941 ) se obíuvo iras dos pasos de selección; en un primer paso se seleccionaron recombinantes simples (gentamicina resistentes, sacarosa sensibles y xylE positivos) y éstos se sembraron en una placa de agar 7H10 con 10% de sacarosa para seleccionar sucesos de doble recombinación. Las colonias resistentes a sacarosa, sensibles a gentamicina y no portadoras del gen xylE fueron analizadas por PCR para confirmar la deleción de MSMEG_5941, lo que significó la obtención de la cepa muíante CECT 8332 (MS6039-5941 ).

Figura 3. Cromaíogramas de GC/MS mosírando la producción de AD y ADD a partir de colesíerol en los muíaníes CECT MS6039 y CECT MS6039-5941 : A) paírones B) ADD en CECT MS6039 y C) AD en CECT MS6039-5941 .

Figura 4. Cromaíogramas de GC/MS mosírando la producción de AD y ADD a partir de fiíosíeroles en los muíaníes CECT MS6039 y CECT MS6039-5941 : A) paírones B) ADD en CECT MS6039 y C) AD en CECT MS6039-5941 .

Figura 5. Curvas de crecimienfo de M. smegmatis en colesíerol y en ADD como única fueníe de carbono Figura 6. Producción de AD en fermentador con la cepa Mycobacterium smegmatis CECT 8332 (MS6039-5941 ) utilizando fitosterol (20 g/L): ■ aceite de soja. □ metil-β- ciclodextrina.

Figura 7. Producción de ADD y AD con la cepa Mycobacterium smegmatis CECT 8331 (MS6039) utilizando fitosterol (20 g/L): ■ ADD con aceite de soja; □ ADD con metil-β- ciclodextrina; A AD con aceite de soja; Δ AD con metil-P-ciclodextrina

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION

AD y ADD son usados por las bacterias como fuente de carbono cuando se añaden a un medio de cultivo. De esta manera, aunque se puedan conseguir bacterias mutantes productoras de AD y/o ADD por fermentación, que secreten dichas sustancias al medio de cultivo, estos compuestos una vez secretados pueden ser parcialmente metabolizados a lo largo del tiempo de fermentación, con las consiguientes pérdidas de rendimiento en el proceso de producción de AD y ADD. Esto se ha descrito también para M. smegmatis (Anna Brzostek et al., Identification and targeted disruption of the gene encoding the main 3-ketosteroid dehydrogenase in Mycobacterium smegmatis Microbiology 2005, 151, 2393-2402).

No obstante lo anterior, las investigaciones realizadas por los inventores de la presente solicitud han llevado a determinar que, sorprendentemente, la bacteria salvaje M. smegmatis me 2 155 no puede utilizar las sustancias AD y ADD como fuente de carbono cuando dichas sustancias se añaden a un medio de cultivo, a pesar de ser intermediarios del catabolismo bacteriano del colesterol (ver Figura 5). Esto ocurre incluso en presencia de colesterol, el cual activaría su metabolización. Esta propiedad no la presentan otras actinobacterias de los géneros Mycobacterium o Rhodococcus que catabolizan el colesterol, puesto que sí son capaces de crecer utilizando AD y ADD como fuente de carbono.

De esta manera, la bacteria M. smegmatis me 2 155 es una bacteria ideal para la producción de AD y ADD, pues una vez secretadas al medio, no podrán ser catabolizadas por el metabolismo de la bacteria. Por otra parte, de acuerdo con las hipótesis establecidas sobre el funcionamiento de la ruta catabólica del colesterol descrita para las actinobacterias, ha sido postulado que para producir ADD a partir de esteróles naturales, es necesario inhibir cualquier actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa en la célula productora. Asimismo, se ha postulado que para producir AD a partir de esteróles naturales, es necesario inhibir tanto cualquier actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa, como cualquier actividad 3- cetosteroide-A1 -deshidrogenasa. No obstante lo anterior, hasta la fecha no se ha descrito ninguna cepa estable de M. smegmatis me 2 155 con la actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa inactivada, y aún menos una cepa estable con las actividades 3- cetosteroide 9a-hidroxilasa así como cualquier actividad 3-cetosteroide-A1 - deshidrogenasa inactivadas.

Las enzimas con actividad 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa contienen un solo tipo de subunidad y están codificadas por un único gen denominado genéricamente kstD.

Mientras, las enzimas descritas con actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa poseen dos subunidades proteicas y por lo tanto estas enzimas están codificadas por dos genes diferentes, denominados genéricamente kshA (que codifica el componente oxigenasa de la enzima) y kshB (que codifica el componente reductasa de la enzima), respectivamente.

Asimismo se sabe que las actinobacterias pueden poseer varios genes homólogos a los genes kshA, kshB o kstD en el mismo genoma, que codifican enzimas con las mismas actividades, por lo que en esos casos hay que eliminar vahos genes homólogos para eliminar completamente las mencionadas actividades 3-cetosteroide- ΔΙ -deshidrogenasa y 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa. Esto mismo ha sido descrito para M. smegmatis (Anna Brzostek et al., Identification and targeted disruption of the gene encoding the main 3-ketosteroid dehydrogenase in Mycobacterium smegmatis Microbiology 2005, 151, 2393-2402).

Así, sería esperable que la inactivación o deleción de un único gen kshA o kshB no condujera a la eliminación completa de la actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa en la bacteria modificada. De manera semejante, sería esperable que la eliminación de un único gen kshD no condujera de facto a la eliminación completa de la actividad 3- cetosteroide-ΔΙ -deshidrogenasa.

Para poder delecionar un gen de forma selectiva es imprescindible primero conocer su secuencia de ADN. Para la localización de dichos genes se utilizaron distintos programas informáticos dotados con algoritmos de análisis de homología de secuencia utilizando como secuencias modelo las secuencias de los genes kstH (equivalente a kstD) y orf17 (equivalente a kshB) de Comamonas testosteroni y las secuencias de los genes kstD, kshA1 y kshB de Rhodococcus jostii RHA1 . Esta búsqueda arrojó la presencia en la bacteria M. smegmatis de los genes MSMEG_5941 y otros 6 genes más que codifican posibles enzimas con actividad 3-cefosferoide-A1 -deshidrogenasa. Por otro lado se obtuvieron los genes MSMEG_6039 y MSMEG_2893 similares al gen kshB y los genes MSMEG_5925 y MSMEG_2870 similares al gen kshA como posibles genes codificantes de una enzima de dos componentes con actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa en la bacteria M. smegmatis.

Una vez identificados los posibles genes responsables de las actividades 3- cetosteroide-ΔΙ -deshidrogenasa y 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa, se seleccionaron por mayor homología los genes MSMEG_5941 y MSMEG_6039, y se procedió a su deleción utilizando los procedimientos de disrupción/mutagénesis selectiva previamente descritos en la literatura para actinobacterias (Robert van der Geize R., et al. Unmarked gene deletion mutagenesis of kstD, encoding 3-ketosteroid- -dehydrogenase, in Rhodococcus erythropolis SQ1 using sacB as counter-selectable marker. FEMS Microbiol. Lett. 2001, 205, 197-202).

En una realización de la presente invención se delecionó en primer lugar el gen MSMEG_6039 (kshB, que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide 9a-hidroxilasa) basándose en la hipótesis de que la deleción de este gen reduciría la actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa y esto provocaría la acumulación del producto ADD cuando la bacteria metabolice esteróles en presencia de una fuente alternativa de carbono. De esta manera se construyó el muíante M. smegmatis CECT MS6039 que tiene delecionado el gen MSMEG_6039. Sería esperable una actividad residual 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa generada por otros genes homólogos presentes en la bacteria. Sorprendentemente, se comprobó que cuando la bacteria muíante M. smegmatis CECT MS6039 crecía en un medio mínimo de culíivo coníeniendo colesíerol o una mezcla de fitoesteroles y una fuente alternativa de carbono (como p.ej. glicerol), se producía una acumulación en el medio de cultivo de la sustancia ADD, sin presencia significativa de AD o de 9-OH-AD o de 9-OH-ADD (Ver Figuras 3 y 4).

En otra realización de la presente invención se delecionó el gen MSMEG_5941 (kstD) en la bacteria muíante M. smegmatis CECT MS6039. Esta nueva mutación se realizó asumiendo la hipótesis de que la deleción de este gen reduciría teóricamente la actividad 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa, y esto, unido a que la bacteria M. smegmatis CECT MS6039 ya carecía de la actividad 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa, provocaría la acumulación del producto AD cuando la bacteria metabolice esteróles en presencia de una fuente alternativa de carbono. De esta manera se construyó el muíante M. smegmatis CECT MS6039-5941 que tiene delecionados los genes MSMEG_6039 y MSMEG_5941. Sería esperable una acíividad residual 3-ceíosíeroide- Δ-1 -deshidrogenasa generada por otros genes homólogos presentes en la bacteria. Sorprendentemente, se comprobó que la bacteria muíante CECT MS6039-5941 cuando crecía en un medio mínimo de culíivo coníeniendo colesíerol o una mezcla de fiíoesíeroles y una fueníe alíernaíiva de carbono (como p.ej. glicerol) se producía una acumulación en el medio de culíivo de la susíancia AD, sin presencia significaíiva de AD o de 9-OH-AD o de 9-OH-ADD (Ver Figuras 3 y 4).

Por lo íanío, la preseníe invención, en un primer aspecío, se refiere a una cepa bacíeriana de la especie M. smegmatis, la cual comprende al menos una secuencia de nucleóíidos que codifica el componeníe reducíasa de la enzima 3-ceíosíeroide 9 a- hidroxilasa inacíivada funcionalmenfe o delecionada íoíal o parcialmenfe, y la cual es capaz de producir por fermenfación ADD de manera sustancialmente pura.

Preferiblemente, en dicha cepa bacteriana la secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa se corresponde con: a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ; o

b) una vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia.

De acuerdo con realizaciones preferidas, la variante a la secuencia de SEQ ID NO 1 preferiblemente es homologa en al menos el 80%, aún más preferiblemente en al menos el 85%. En otras posibles realizaciones, la vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 es homologa en al menos el 90%, el 95% o el 98%.

De acuerdo con otra realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa se corresponde con la secuencia de SEQ ID NO 1 .

En otra realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa está delecionada total o parcialmente.

Preferiblemente, la cepa bacteriana corresponde a la cepa depositada con número de referencia identificativa del depositante MS6039 y fecha 4 de Julio de 2013 en la Colección Española de Cultivos Tipo (situada en el Pare Científic Universitat de Valencia; Catedrático Agustín Escardino, 9; 46980 Paterna (Valencia); España) bajo el número de acceso CECT 8331 .

Otro aspecto de la invención se refiere a una segunda cepa bacteriana de la especie M. smegmatis, la cual comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, así como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente; la cual es capaz de producir por fermentación AD de manera sustancialmente pura.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa se corresponde con:

a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ; o

b) una vahante a la secuencia de SEQ ID NO 1 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia.

Aún más preferiblemente, dicha secuencia se corresponde con la secuencia de SEQ ID NO 1 .

De acuerdo con realizaciones preferidas, la vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 preferiblemente es homologa en al menos el 80%, aún más preferiblemente en al menos el 85%. En otras posibles realizaciones, la vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 es homologa en al menos el 90%, el 95% o el 98%.

También preferiblemente, la secuencia de nucleotidos que codifica la enzima 3- cetosteroide-A1 -deshidrogenasa se corresponde con:

a) la secuencia de SEQ ID NO 2; o

b) una vahante a la secuencia de SEQ ID NO 2 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleotidos de dicha secuencia.

Aún más preferiblemente, dicha secuencia se corresponde con la secuencia de SEQ ID NO 2.

De acuerdo con realizaciones preferidas, la vanante a la secuencia de SEQ ID NO 2 preferiblemente es homologa en al menos el 80%, aún más preferiblemente en al menos el 85%. En otras posibles realizaciones, la vanante a la secuencia de SEQ ID NO 2 es homologa en al menos el 90%, el 95% o el 98%.

De acuerdo con otra realización preferida, la secuencia de nucleotidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 α-hidroxilasa se corresponde con: a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ; o

b) una vahante a la secuencia de SEQ ID NO 1 que sea homologa en al menos el 75 % a la SEQ ID NO 1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleotidos de dicha secuencia;

y la secuencia de nucleotidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa se corresponde con:

c) la secuencia de SEQ ID NO 2; o

d) una vahante a la secuencia de SEQ ID NO 2 que sea homologa en al menos el 75% a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleotidos de dicha secuencia.

De acuerdo con realizaciones preferidas, la vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 preferiblemente es homologa en al menos el 80%, aún más preferiblemente en al menos el 85%. En otras posibles realizaciones, la vanante a la secuencia de SEQ ID NO 1 es homologa en al menos el 90%, el 95% o el 98%. Asimismo, la vahante a la secuencia de SEQ ID NO 2 preferiblemente es homologa en al menos el 80%, aún más preferiblemente en al menos el 85%. En otras posibles realizaciones, la vahante a la secuencia de SEQ ID NO 2 es homologa en al menos el 90%, el 95% o el 98%. Más preferiblemente, la cepa bacteriana corresponde a la cepa depositada con referencia identificativa por el depositante MS6039-5941 y fecha 4 de Julio de 2013 en la Colección Española de Cultivos Tipo (situada en el Pare Científic Universitat de Valencia; Catedrático Agustín Escardino, 9; 46980 Paterna (Valencia); España) bajo el número de acceso CECT 8332.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de la primera cepa bacteriana arriba definida, para la producción de ADD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales. Preferiblemente, los esteróles naturales se seleccionan de colesterol o fitoesteroles. Los esteróles naturales pueden ser solamente colesterol o un fitoesterol, o bien una mezcla de fitoesteroles.

Otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de la segunda cepa bacteriana arriba definida, es decir, el doble muíante, para la producción de AD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales. Preferiblemente, los esteróles naturales se seleccionan de colesterol o fitoesteroles. Los esteróles naturales pueden ser solamente colesterol o un fitoesterol, o bien una mezcla de fitoesteroles.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de ADD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar y esterilizar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales, en un polialcohol o un aceite vegetal, con la adición de sales minerales;

b) crecer un cultivo de la cepa bacteriana que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 a- hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, y porque es capaz de producir por fermentación 1 ,4-androstadien-3,17-diona (ADD) de manera sustancialmente pura, tal y como definida anteriormente, en la mezcla obtenida en a); c) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura.

De acuerdo con una realización particular, en la etapa a) se añade un tensoactivo.

Este procedimiento se puede llevar a cabo tanto a nivel laboratorio como nivel industrial, preferiblemente a nivel industrial. Otras realizaciones preferidas están ejemplificadas por los ejemplos 8 y 9, especialmente en lo referente a la preparación de medios de cultivo.

Un aspecto de la invención adicional se refiere a un procedimiento para la obtención de AD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de: a) preparar y esterilizar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales, en un polialcohol o un aceite vegetal, con la adición de sales minerales;

b) crecer un cultivo de la cepa bacteriana que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 a- hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente; y porque es capaz de producir por fermentación 4-androsten-3,17-diona (AD) de manera sustancialmente pura, tal y como definida anteriormente, en la mezcla obtenida en a);

c) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

De acuerdo con una realización particular, en la etapa a) se añade un tensoactivo.

Este procedimiento se puede llevar a cabo tanto a nivel laboratorio como nivel industrial, preferiblemente a nivel industrial.

Otras realizaciones preferidas están ejemplificadas por los ejemplos 6 y 7, especialmente en lo referente a la preparación y composición de medios de cultivo.

De acuerdo con otro aspecto la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de ADD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol o un aceite vegetal;

b) preparar un cultivo de la cepa bacteriana que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 a- hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, y porque es capaz de producir por fermentación 1 ,4-androstadien-3,17-diona (ADD) de manera sustancialmente pura, tal y como definida anteriormente;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el cultivo celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura. De acuerdo con una realización preferida, la mezcla de a) se esteriliza con anterioridad a su uso en la etapa c). Esta etapa es conocida al experto en la materia.

Preferiblemente, el polialcohol de la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en metil-beta-ciclodextrina, polietilenglicol, etilenglicol, sorbitan monostearato, sorbitan monopalmitato, o mezclas de los mismos, o con otros polialcoholes.

Preferiblemente, el aceite vegetal de la etapa a) se selecciona de aceite de soja, de girasol, de colza, de oliva, de palma, de jatropha y de coco, o mezclas de los mismos, o con otros aceites vegetales.

Otras realizaciones preferidas están ejemplificadas por los ejemplos 8 y 9, especialmente en lo referente a la preparación y composición de medios de cultivo.

Preferiblemente, a la mezcla de a) se añaden sales minerales, tales como ZnSO 4 , FeSO , MnSO , CuSO , CoSO , H 3 PO 3 , y Kl.

En la etapa a) puede preferiblemente incorporarse un tensoactivo. Dicho tensoactivo se selecciona, según una realización particular, de polisorbato 80 (Tween 80™) o polisorbato 20 (Tween 20™).

La etapa b) de preparación de un cultivo celular o bacteriano se puede llevar a cabo en medios conocidos al experto en la materia, o incluso comerciales, tales como medio rico Middlebrook 7H9 (Difco), preferiblemente complementado con álbum ina-dextrosa- catalasa (Becton Dickinson). Alternativamente, se puede preparar un medio de cultivo que incorpore por ejemplo uno o más de melazas, un aceite vegetal como por ejemplo aceite de soja, NaNO 3 y NH 4 H 2 PO 4 . Preferiblemente, la temperatura de cultivo se encuentra entre 30 y 44 °C, más preferiblemente entre 34 y 40 °C, aún más preferiblemente entre 36 y 38°C.

El medio de incubación de la etapa c) puede comprender componentes tales como aceite de soja, metil-beta-ciclodextrina, NH NO 3 , KH 2 PO , K 2 HPO , KCI o CaCI 2 . Asimismo preferiblemente se añade una mezcla de micronutrientes, que incorpore al menos uno de entre ZnSO , FeSO , MnSO , CuSO , CoSO , H 3 PO 3 , y Kl. Preferiblemente, la temperatura de incubación se encuentra entre 30 y 44 °C, más preferiblemente entre 34 y 40 °C, aún más preferiblemente entre 36 y 38°C. Según otra realización particular, con anterioridad a la etapa c) de incubación, se puede obtener un sedimento celular según técnicas conocidas al experto en la materia.

De acuerdo con una realización preferida, el procedimiento para la obtención de ADD en forma sustancialmente pura comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol, en presencia de un tensoactivo;

b) preparar un cultivo de la primera cepa bacteriana arriba definida y obtener un sedimento celular de la misma;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el sedimento celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de ADD en forma sustancialmente pura.

Asimismo la invención se refiere a ADD en forma sustancialmente pura, obtenible mediante el procedimiento anterior, así como al uso de dicho ADD para la preparación de esferoides. Otro aspecto de la invención es un esteroide obtenible a partir de dicho ADD. Un aspecto adicional de la invención es un esteroide obtenido a partir de dicho ADD.

Son conocidos en el estado de la técnica metodologías y procesos para producir esferoides usando ADD como producto de partida. Por ejemplo, tales procesos y metodologías están descritas en publicaciones tales como The Organic Chemistry of Drug synthesis, vol 1, Lednicer D. Mitscher L, Wiley 1977; Encyclopedia of Pharmaceutical substances, Kleeman and Engeis, Thieme Verlag, 2001; y Organic reactions in Steroid Chemistry vol II, Fried J, Edwards J, Van Nostrand Reinhold, 1972. Estos textos se incorporan a la solicitud como referencia. Tales esferoides obtenibles según la presente invención son preferentemente aquellos que forman parte de las familias de Estrógenos, Andrógenos, Progestágenos y Glucocordticoides; por ejemplo, estrona, estradiol, testosterona o fluoxymestrona, entre otros.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de AD en forma sustancialmente pura, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol o un aceite vegetal; b) preparar un cultivo de la cepa bacteriana que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9 a- hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, y al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1 -deshidrogenasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente; y porque es capaz de producir por fermentación 4-androsten-3,17-diona (AD) de manera sustancialmente pura, tal y como definida anteriormente;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el cultivo celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

De acuerdo con una realización preferida, la mezcla de a) se esteriliza con anterioridad a su uso en la etapa c). Esta etapa es conocida al experto en la materia.

Preferiblemente, el polialcohol de la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en metil-beta-ciclodextrina, polietilenglicol, etilenglicol, sorbitan monostearato, sorbitan monopalmitato, o mezclas de los mismos, o con otros polialcoholes.

Preferiblemente, el aceite vegetal se selecciona de aceite de soja, de girasol, de colza, de oliva, de palma, de jatropha y de coco, o mezclas de los mismos, o con otros aceites vegetales.

Otras realizaciones preferidas están ejemplificadas por los ejemplos 6 y 7, especialmente en lo referente a la preparación y composición de medios de cultivo.

Preferiblemente, a la mezcla de a) se añaden sales minerales, tales como ZnSO 4 , FeSO , MnSO , CuSO , CoSO , H 3 PO 3 , y Kl.

En la etapa a) puede opcionalmente incorporarse además un tensoactivo. Dicho tensoactivo se selecciona, según una realización particular, de polisorbato 80 (Tween 80™) o polisorbato 20 (Tween 20™).

La etapa b) de preparación de un cultivo celular o bacteriano se puede llevar a cabo en medios conocidos al experto en la materia, o incluso comerciales, tales como medio rico Middlebrook 7H9 (Difco), preferiblemente complementado con álbum ina-dextrosa- catalasa (Becton Dickinson). Alternativamente, se puede preparar un medio de cultivo que incorpore por ejemplo uno o más de melazas, un aceite vegetal como por ejemplo aceite de soja, NaNÜ3 y NH4H2PO4. Preferiblemente, la temperatura de cultivo se encuentra entre 30 y 44 °C, más preferiblemente entre 34 y 40 °C, aún más preferiblemente entre 36 y 38°C.

El medio de incubación de la etapa c) puede comprender componentes tales como aceite de soja, metil-beta-ciclodextrina, NH4NO3, KH 2 P0 4 , K 2 HP0 4 , KCI o CaCI 2 . Asimismo preferiblemente se añade una mezcla de micronutrientes, que incorpore al menos uno de entre ZnS0 , FeS0 , MnS0 , CuS0 , CoS0 , H3PO3, y Kl. La temperatura de incubación se encuentra preferiblemente entre 30 y 44 °C, más preferiblemente entre 34 y 40 °C, aún más preferiblemente entre 36 y 38°C.

Según otra realización particular, con anterioridad a la etapa c) de incubación, se puede obtener un sedimento celular según técnicas conocidas al experto en la materia.

De acuerdo con una realización preferida, el procedimiento para la obtención de AD en forma sustancialmente pura comprende las etapas de:

a) preparar una mezcla de un esterol natural o una mezcla de esteróles naturales en un polialcohol, en presencia de un tensoactivo;

b) preparar un cultivo de la segunda cepa bacteriana anteriormente definida y obtener un sedimento celular de la misma;

c) incubar la mezcla del apartado a) con el sedimento celular del apartado b);

d) separar el sedimento celular para obtener una disolución de AD en forma sustancialmente pura.

Asimismo la invención se refiere a AD en forma sustancialmente pura, obtenible mediante el procedimiento anterior, así como al uso de dicho AD para la preparación de esferoides. Otro aspecto de la invención es un esferoide obtenible a partir de dicho AD. Un aspecto adicional de la invención es un esferoide obtenido a partir de dicho AD. Son conocidos en el estado de la técnica metodologías y procesos para producir esferoides usando AD como producto de partida. Por ejemplo, tales procesos y metodologías están descritas en publicaciones tales como The Organic Chemistry of Drug synthesis, vol 1, Lednicer D. Mitscher L, Wiley 1977; Encyclopedia of Pharmaceutical substances, Kleeman and Engels, Thieme Verlag, 2001; y Organic reactions in Steroid Chemistry vol II, Fried J, Edwards J, Van Nostrand Reinhold, 1972. Estos textos se incorporan a la solicitud como referencia. Tales esferoides obtenibles según la presente invención son preferentemente aquellos que forman parte de las familias de Estrógenos, Andrógenos, Progestágenos y Glucocordticoides; por ejemplo, estrona, estradiol, testosterona o fluoxymestrona, entre otros.

El término "deleción de un gen" tal y como se emplea en la presente invención se refiere a la eliminación total o parcial de un gen mediante la eliminación total o parcial de la secuencia de ADN que caracteriza ese gen en el genoma de una bacteria.

El término "secuencia de nucleótidos funcionalmente inactivada" tal y como se emplea en la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que no es capaz de ejercer su funcionalidad, es decir, no es capaz de proporcionar una enzima funcional.

El término "secuencia homologa" tal y como se emplea en la presente invención se refiere a una secuencia que presenta el % de homología indicado, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dicha secuencia.

El término "sustancialmente pura" en el marco de la presente invención se refiere a una pureza de 95% o más, preferiblemente del 97% o más, aún más preferiblemente del 99% o más, más preferiblemente del 100% del producto obtenido, en el caso de la obtención de ADD, con respecto al contenido de AD, en el caso de la obtención de AD, con respecto al contenido de ADD.

El término "catabolismo" tal y como se emplea en la presente invención se refiere al conjunto de los procesos enzimáticos que conducen a la transformación de una sustancia compleja en otras sustancias más sencillas que son incorporadas a la biomasa bacteriana o eliminadas al ambiente.

A continuación los siguientes ejemplos sirven para ¡lustrar la presente invención pero en ningún caso limitan la misma.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Identificación de los genes kshA, kshB y kstD en M. smegmatis me 2 155

Para identificar los genes kshA, kshB y kstD en M. smegmatis me 2 155 se compararon in silico los genes de C. testosteroni TA441 o R. jostii RHA1 frente al genoma de M. smegmatis mc 2 155. Para ello se utilizó el programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).

Las secuencias de los genes codificantes de las enzimas 3-cetoesteroide-A1 - deshidrogenasa y 3-cetosteroide 9-a-hidroxilasa de C. testosteroni TA441 se encuentran depositadas en las bases de datos de secuencias DDBJ, EMBL y GenBank con el número de acceso AB076368, en tanto que las correspondientes secuencias del genoma de R. jostii RHA1 se encuentra depositada en la base de datos de secuencias GenBank con el número de acceso CP000431 .1 .

Una vez identificadas las secuencias de M. smegmatis se determinó el porcentaje de similitud entre las secuencias proteicas correspondientes mediante el programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2).

Las secuencias identificadas en M. smegmatis y los porcentajes de similitud se muestran en las Tablas 1 y 2.

Tablas 1 y 2. Comparación in silico de genes de C. testosteroni TA441 o R.jostii RHA1 frente al genoma de M. smegmatis mc 2 155. La identificación de las secuencias se realizó mediante el programa BLAST. Se señala el porcentaje de identidad (%) hallado en cada caso entre las secuencias proteicas con mayor similitud utilizando el programa ClustalW2. Las secuencias de las sondas utilizadas de C. testosteroni TA441 se encuentran depositadas en las bases de datos de secuencias DDBJ, EMBL y GenBank con el número de acceso AB076368. La secuencia del genoma de R. jostii RHA1 se encuentra depositada en la base de datos de secuencias GenBank con el número de acceso CP000431 .1 .

Tabla 1 Genes en Genes similares

Comamona en

% identidad

Función s Mycobacterium

(clustalW) testosteron smegmatis

/ TA441 mc 2 155 -cetoesteroide-A1 - MSMEG_5941 36 deshidrogenasa tesH

(KstD) MSMEG_4864 33 -cetosteroide 9-a- hidroxilasa, MSMEG_6039 44 orf17

componente MSMEG_2893 43 reductasa (KshB)

Tabla 2

Genes

Genes en similares en

% identidad Rhodococcu Mycobacterium

(clustalW) s jostii RHA1 smegmatis

mc 2 155

MSMEG_5941 65

MSMEG_4864 39

MSMEG_2869 40-cetoesteroide-A1 - deshidrogenasa ro04532 MSMEG_2867 31

(KstD)

MSMEG_5835 17 MSMEG_0817 13 MSMEG_4870 30 Genes

Genes en similares en

% identidad

Rhodococcu Mycobacterium

(clustalW) s jostii RHA1 smegmatis

mc 2 155

3-cetosteroide 9-α- hidroxilasa, MSMEG_6039 56

ro05833

componente MSMEG_2893 63

reductasa (KshB)

3-cetosteroide 9-a- hidroxilasa, MSMEG_5925 67

ro04538

componente MSMEG_2870 53

oxigenasa (KshA)

EJEMPLO 2: Construcción de la cepa mutante M. smegmatis CECT 8331 (MS6039)

La cepa CECT MS6039 se construyó mediante recombinación homologa usando el plásmido pJQ200x, un derivado del vector suicida pJQ200 que no replica en Mycobacterium (Jackson, M., Camacho, L.R., Gicquel, B., and Guilhot, C. (2001 ) Gene replacement and transposon delivery using the negative selection marker sacB. Mycobacterium tuberculosis Protocols. Parish, T., and Stoker, N.G. (eds). Totowa, NJ, USA: Humana Press Inc, pp. 59-75.). La estrategia consiste en la amplificación mediante PCR de dos fragmentos de ~600 pares de bases, uno que contiene una región aguas arriba del gen MSMEG_6039 (de ~500 pares de bases) y ~100 pares de bases del extremo 5 'del gen (utilizando los oligonucleótidos MSMEG_6039 Up F: CTAG CTC GAG C C AGTTGTGC AC AC C G ATG (SEQ ID NO 3) y MSMEG_6039 Up R: CTAGACTAGTGCAGCGTCAGGAACTGGC (SEQ ID NO 4)) y el segundo que contiene una región aguas abajo del gen (de ~500 pares de bases) y ~100 pares de bases del extremo 3' del gen (utilizando los oligonucleótidos MSMEG_6039 Down F: CTAG ACTAGTG GTG CAC ATG G AGATC AAC G (SEQ ID NO 5) y MSMEG_6039 Down R: CTAGTCTAGAGTACCAGTCGATCGGTGTC (SEQ ID NO 6)). Los dos fragmentos generados se digirieron con las enzimas correspondientes y se clonaron en el plásmido pJQ200x, generando el plásmido pJQ6039. pJQ6039 se sometió a electroporacion en células de M. smegmatis mc 2 155 competentes para obtener la cepa MS6039. Los sucesos de recombinación simple se seleccionaron en placas de agar 7H10 (Difco) conteniendo 5 g mi "1 de gentamicina, resistencia que confiere este plásmido, y la presencia del gen xy/E codificado en pJQ200x se confirmó mediante la adición de catecol sobre las colonias individuales. La aparición de una coloración amarilla indica la presencia del gen xylE. Las colonias fueron también contra-seleccionadas en 10% de sacarosa, que hace inviables a las células en las que pJQ200x ha recombinado, debido a la presencia en el plásmido del gen sacB que confiere sensibilidad a la misma. Una sola colonia gentamicina resistente, catecol positiva y sensible a sacarosa se cultivó en 10 mi de medio 7H9 con 5 g mi "1 de gentamicina hasta una densidad óptica de 0.8- 0.9. 20 μΙ de una dilución 1 : 100 se sembraron en una placa de agar 7H10 con 10% de sacarosa para seleccionar sucesos de doble recombinación. Posibles recombinantes dobles (resistentes a sacarosa) fueron seleccionados para comprobar su sensibilidad a gentamicina y la ausencia del gen xylE. Las colonias resistentes a sacarosa, sensibles a gentamicina y no portadoras del gen xy/E fueron analizadas por PCR para confirmar la eliminación de MSMEG_6039, lo que significó la obtención de la cepa muíante MS6039.

EJEMPLO 3: Producción de ADD con la cepa mutante M. smegmatis CECT 8331 (MS6039) a partir de esteróles.

Los medios de producción para la obtención de ADD en este trabajo están compuestos por una mezcla de glicerol 18 mM y colesterol 1.8 mM o una mezcla de glicerol 18 mM -mezcla de fitoesteroles. La mezcla de fitoesteroles contiene (porcentaje p/p): brasicasterol (2.16%), estigmasterol (14.69%), campesterol (25.19%) y β-sitosterol (53.07%). La cantidad de mezcla de fitoesteroles añadidos al medio de producción es aquella en la cual el β-sitosterol está a concentración 1 mM. El colesterol o los fitoesteroles se disolvieron en Tiloxapol 10% ó 5%, respectivamente, antes de su adición al medio mínimo con glicerol. Debido a la baja solubilidad del colesterol y los fitoesteroles, las soluciones madre de estos compuestos se calentaron a 80°C en agitación en un baño de ultrasonidos durante 1 hora y después se esterilizaron en autoclave.

Para los ensayos de producción de ADD, la cepa CECT MS6039 se cultivó primero en 10 mi de medio rico Middlebrook 7H9 (Difco) complementado con 10% de albumina- dextrosa-catalasa (Becton Dickinson), durante 24 h, a una temperatura de aproximadamente 37°C. Los cultivos se centrifugaron y se lavaron. Los sedimentos celulares se utilizaron para inocular 20 mi de los medios de producción a ϋθβοο inicial 0.05 y se incubaron durante 120 horas. Alícuotas de los cultivos (2 mi) se extrajeron a diferentes tiempos de incubación para su análisis mediante cromatografía liquida- espectrometría de masas (GC/MS) como se explica a continuación.

Para el análisis mediante GC/MS, alícuotas de los cultivos (2 mi) se extrajeron a distintos tiempos de incubación con un volumen igual de cloroformo. Esta fracción de cloroformo se concentró posteriormente por evaporación. 50 μΙ de una solución de pregnenolona 20 mg/ml en cloroformo se añadió a las alícuotas como estándar interno previamente a su extracción con cloroformo. Las fracciones de cloroformo concentradas se analizaron por GC/MS como se describe a continuación:

Las muestras secas fueron procesadas con el fin de obtener sus correspondientes trimetilsilil-derivados. Para ello, se añadió a cada muestra 50 μί de piridina (Merk) y 50 μί de N,0-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA, Fluka), incubando a 60°C durante 45 min en un termobloque. Los trimetilsilil-derivados fueron identificados y cuantificados mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM). Los análisis se realizaron en un equipo 7980A-5975C de Agilent utilizando una columna HP-5MS (Agilent, 30 m x 0,25 mm, 0,2 μΓΠ espesor de la película) y helio (22 psi) como gas portador. El inyector split/splitless se programó a una temperatura de 300°C, inyectando para su análisis 1 μί de muestra con una relación de split 20: 1 . Para la separación de los trimetilsilil-derivados se empleó un programa de temperaturas que comienza isotérmicamente a 240°C (3 min), aplicando a continuación una rampa de temperatura de 5°C min "1 hasta una temperatura final de 300°C. La detección de los compuestos se realizó registrando simultáneamente los cromatogramas en modo full sean (rango de m/z 50-550) y SIM (monitorización selectiva de iones). En este último modo, se detectaron exclusivamente iones característicos de cada uno de los compuestos de interés: m/z 458 para el colesterol, 384 para la colestenona, 286 para AD y 284 para ADD. El pico de cada analito en el cromatograma se identificó comparando su tiempo de retención y su espectro de masas con los de patrones analizados en idénticas condiciones. La cuantificación se realizó utilizando el software GC-ChemStation Rev.B.04.02 (96) de Agilent atendiendo al área de los picos detectados en modo SIM, aplicando los factores de respuesta calculados previamente para cada compuesto respecto al patrón interno (colestenona). Cuando se utilizó colesterol como fuente de esferoides, se obtuvo una acumulación de 1 .2 mM de ADD en el medio de cultivo de en 72 horas equivalente a una transformación del 50% del colesterol suministrado. El cromatograma de GC/MS puede verse en la Figura 3b.

Cuando se utilizaron fitoesteroles como fuente de esferoides, se obtuvo una acumulación de 1 .3 mM de ADD en el medio de cultivo en 96 horas, equivalente a una transformación del 50% de los fitoesteroles suministrados. El cromatograma de GC/MS puede verse en la Figura 4b.

EJEMPLO 4: Construcción de la cepa mutante M. smegmatis CECT 8332 (MS6039-5941 )

La cepa CECT MS6039-5941 se construyó mediante recombinación homologa usando el plásmido pJQ200x, sobre la cepa ya mutada MS6039. Se amplificaron por PCR dos fragmentos de ~600 pares de bases, uno que contiene una región aguas arriba del gen MSMEG_5941 (de ~ 500 pares de bases) y -100 pares de bases del extremo 5 'del gen (utilizando los oligonucleótidos MSMEG_5941 Up F: CTAGACTAGTGATGTTGCGAATGTCG ATGTC (SEQ ID NO 7) y MSMEG_5941 Up R: CTAGTCTAG AC C AC C AC AAC GTC GTACTC C (SEQ ID NO 8)) y el segundo que contiene una región aguas abajo del gen (de ~500 pares de bases) y ~100 pares de bases del extremo 3' del gen (utilizando los oligonucleótidos MSMEG_5941 Down F: CTAGTCTAGACCATGACATT CGGTTACCTGG (SEQ ID NO 9) y MSMEG_5941 Down R: CTAGGAGCTCGCAGGGA GATCTCGAAATCG (SEQ ID NO 10)). Los dos fragmentos generados se digirieron con las enzimas correspondientes y se clonaron en el plásmido pJQ200x, generando el plásmido pJQ5941 . pJQ5941 se sometió a electroporación en células de la cepa MS6039 competentes para obtener la cepa MS6039-5941 . Los sucesos de recombinación simple se seleccionaron en placas de agar 7H10 conteniendo 5 g ml-1 de gentamicina, y la presencia del gen xylE codificado en pJQ200x se confirmó mediante la adición de catecol sobre las colonias individuales. Las colonias fueron también contra-seleccionadas en 10% de sacarosa. Una sola colonia gentamicina resistente, catecol positiva y sensible a sacarosa se cultivó en 10 mi de medio 7H9 con 5 g mi "1 de gentamicina hasta una densidad óptica de 0.8-0.9. 20 μΙ de una dilución 1 : 100 se sembraron en una placa de agar 7H10 con 10% de sacarosa para seleccionar sucesos de doble recombinación. Posibles recombinantes dobles (resistentes a sacarosa) fueron seleccionados para comprobar su sensibilidad a gentamicina y la ausencia del gen xyIE. Las colonias resistentes a sacarosa, sensibles a gentamicina y no portadoras del gen xyIE fueron analizadas por PCR para confirmar la eliminación de MSMEG_5941 , lo que significó la obtención de la cepa muíante MS6039-5941 .

EJEMPLO 5: Producción de AD con la cepa mutante M. smegmatis CECT 8332 (MS6039-5941) a partir de esteróles.

Los medios de producción para la obtención de AD son los mismos que los utilizados para la obtención de ADD (EJEMPLO 3).

Para los ensayos de producción de AD, la cepa CECT MS6039-5941 se cultivó primero en 10 mi de medio rico Middlebrook 7H9 complementado con 10% de albumina- dextrosa-catalasa durante 24 h. Los cultivos se centrifugaron y se lavaron. Los sedimentos celulares se utilizaron para inocular 20 mi de los medios de producción a ϋθβοο inicial 0.05 y se incubaron durante 120 horas. Alícuotas de los cultivos (2 mi) se extrajeron a diferentes tiempos de incubación para su análisis mediante cromatografía gases-espectrometría de masas (GC/MS) como se explica a continuación.

Para el análisis mediante GC/MS, alícuotas de los cultivos (2 mi) se extrajeron a distintos tiempos de incubación con un volumen igual de cloroformo. Esta fracción de cloroformo se concentró posteriormente por evaporación. 50 μΙ de una solución de pregnenolona 20 mg/ml en cloroformo se añadió a las alícuotas como estándar interno previamente a su extracción con cloroformo. Las fracciones de cloroformo concentradas se analizaron por GC/MS como se describe en el Ejemplo 3.

Cuando se utilizó colesterol como fuente de esferoides, se obtuvo una acumulación de 1 .4 mM de AD en el medio de cultivo de en 72 horas equivalente a una transformación del 80% del colesterol suministrado. El cromatograma de GC/MS puede verse en la Figura 3c.

Cuando se utilizaron fitoesteroles como fuente de esferoides, se obtuvo una acumulación de 0.9 mM de AD en el medio de cultivo en 96 horas, equivalente a una transformación del 44% de los fitoesteroles suministrados. El cromatograma de GC/MS puede verse en la Figura 4c. EJEMPLO 6. Producción de AD en fermentador con la cepa Mycobacterium smegmatis CECT 8332 (MS6039-5941 ) utilizando fitosterol y aceite vegetal.

La fermentación se realizó en 2 fases: vegetativo y fermentador. El vegetativo se sembró con 1 mi del microorganismo (aproximadamente 10 8 células) y se incubó en un fermentador de 5 L con 3 L de un medio de cultivo con la siguiente composición: 54 g/L de melazas, 5,4 g/L de NaNo 3 , 0,6 g/L de NH4H2PO4, y 20 g/L de aceite de soja; todo ello ajustado a pH 7.0. El vegetativo se incubó durante 48-72 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. De esta forma se alcanzaron volúmenes de sedimento celular del 5-20% analizado por centrifugación durante 10 minutos a 2.000 x g.

La fermentación (biotransformación) se realizó en un fermentador de 42 L con 30 L de un medio de cultivo con la siguiente composición (g/L): 2 g/L de NH4NO3, 1 g/L de KH2PO4, 2 g/L de K 2 HP0 4 , 0,2 g/L de KCI, 0,3 g/L de CaCI 2 , 150 g/L de aceite de soja, y 20-40 g/L de fitosterol; adicionalmente se añadió 1 mL de una mezcla de micronutrientes por cada L de medio de fermentación. La composición de la mezcla de micronutrientes es la siguiente: 1 1 g/L de ZnS0 4 , 1 g/L de FeS0 4 , 6 g/L de MnS0 4 , 0,04 g/L de CuS0 4 , 0,3 g/L de C0SO4, 0,03 g/L de H3PO3, y 0,001 g/L de Kl; todo ello ajustado a pH 7,0. El fermentador se sembró con 3 L de vegetativo y se incubó durante 120-192 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 6.

EJEMPLO 7. Producción de AD en fermentador con la cepa Mycobacterium smegmatis CECT 8332 (MS6039-5941 ) utilizando fitosterol y metil-p-ciclodextrina.

La fermentación se realizó en 2 fases: vegetativo y fermentador. El vegetativo se sembró con 1 mi del microorganismo (aproximadamente 10 8 células) y se incubó en un fermentador de 5 L con 3 L de un medio de cultivo con la siguiente composición: 54 g/L de melazas, 5,4 g/L de NaNo 3 , 0,6 g/L de NH4H2PO4, y 20 g/L de aceite de soja; todo ello ajustado a pH 7.0. El vegetativo se incubó durante 48-72 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. De esta forma se alcanzaron volúmenes de sedimento celular del 5-20% analizado por centrifugación durante 10 minutos a 2.000 x g. La fermentación (biotransformación) se realizó en un fermentador de 42 L con 30 L de un medio de cultivo con la siguiente composición (g/L): 2 g/L de NH4NO3, 1 g/L de KH2PO4, 2 g/L de K 2 HP0 4 , 0,2 g/L de KCI, 0,3 g/L de CaCI 2 , 40 g/L de metil-β- ciclodextrina (Cavasol® W7M, Wacker Chemie), y 20 g/L de fitosterol; adicionalmente se añadió 1 mL de una mezcla de micronutnentes por cada L de medio de fermentación. La composición de la mezcla de micronutnentes es la siguiente: 1 1 g/L de ZnS0 4 , 1 g/L de FeS0 , 6 g/L de MnS0 , 0,04 g/L de CuS0 , 0,3 g/L de CoS0 , 0,03 g/L de H3PO3, y 0,001 g/L de Kl; todo ello ajustado a pH 7,0. El fermentador se sembró con 3 L de vegetativo y se incubó durante 120-192 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 6.

EJEMPLO 8. Producción de ADD en fermentador con la cepa Mycobacterium smegmatis CECT 8331 (MS6039) utilizando fitosterol y aceite vegetal.

La fermentación se realizó en 2 fases: vegetativo y fermentador. El vegetativo se sembró con 1 mi del microorganismo (aproximadamente 10 8 células) y se incubó en un fermentador de 5 L con 3 L de un medio de cultivo con la siguiente composición: 54 g/L de melazas, 5,4 g/L de NaNo 3 , 0,6 g/L de NH H 2 P0 , 20 g/L de aceite de soja y 20 pg/ml de kanamicina; todo ello ajustado a pH 7.0. El vegetativo se incubó durante 48- 72 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. De esta forma se alcanzaron volúmenes de sedimento celular del 5-20% analizado por centrifugación durante 10 minutos a 2.000 x g.

La fermentación (biotransformación) se realizó en un fermentador de 42 L con 30 L de un medio de cultivo con la siguiente composición (g/L): 2 g/L de NH 4 N0 3 , 1 g/L de KH 2 P0 , 2 g/L de K 2 HP0 , 0,2 g/L de KCI, 0,3 g/L de CaCI 2 , 150 g/L de aceite de soja, 20 pg/ml de kanamicina, y 20-40 g/L de fitosterol; adicionalmente se añadió 1 mL de una mezcla de micronutrientes por cada L de medio de fermentación. La composición de la mezcla de micronutrientes es la siguiente: 1 1 g/L de ZnS0 4 , 1 g/L de FeS0 4 , 6 g/L de MnS0 , 0,04 g/L de CuS0 , 0,3 g/L de CoS0 , 0,03 g/L de H3PO3, y 0,001 g/L de Kl; todo ello ajustado a pH 7,0. El fermentador se sembró con 3 L de vegetativo y se incubó durante 120-192 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7.

EJEMPLO 9. Producción de ADD en fermentador con la cepa Mycobacterium smegmatis CECT 8331 (MS6039) utilizando fitosterol y metil-p-ciclodextrina.

La fermentación se realizó en 2 fases: vegetativo y fermentador. El vegetativo se sembró con 1 mi del microorganismo (aproximadamente 10 8 células) y se incubó en un fermentador de 5 L con 3 L de un medio de cultivo con la siguiente composición: 54 g/L de melazas, 5,4 g/L de NaNo 3 , 0,6 g/L de NH4H2PO4, 20 g/L de aceite de soja, y 20 pg/ml de kanamicina; todo ello ajustado a pH 7.0. El vegetativo se incubó durante 48- 72 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. De esta forma se alcanzaron volúmenes de sedimento celular del 5-20% analizado por centrifugación durante 10 minutos a 2.000 x g.

La fermentación (biotransformación) se realizó en un fermentador de 42 L con 30 L de un medio de cultivo con la siguiente composición (g/L): 2 g/L de NH4NO3, 1 g/L de KH2PO4, 2 g/L de K 2 HP0 4 , 0,2 g/L de KCI, 0,3 g/L de CaCI 2 , 40 g/L de metil-p- ciclodextrina (Cavasol® W7M, Wacker Chemie), 20 pg/ml de kanamicina, y 20 g/L de fitosterol; adicionalmente se añadió 1 mL de una mezcla de micronutnentes por cada L de medio de fermentación. La composición de la mezcla de micronutrientes es la siguiente: 1 1 g/L de ZnS0 4 , 1 g/L de FeS0 4 , 6 g/L de MnS0 4 , 0,04 g/L de CuS0 4 , 0,3 g/L de C0SO 4 , 0,03 g/L de H3PO3, y 0,001 g/L de Kl; todo ello ajustado a pH 7,0. El fermentador se sembró con 3 L de vegetativo y se incubó durante 120-192 horas a 37°C, con una aireación de 0,5 volumen/volumen/minuto (vvm), 0,5 barg de presión relativa, y una agitación de 150 r.p.m. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7. LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO 1 Y SEQ ID NO 2

SEQ ID NO 1 (MSMEG_6039)

GTGCTCGAACTGCAGGTGGCCGAGGTCGTCGAGGAGACCTCCGATGCCCGCTCCCTGGTG TTCACGGTGCCCGAGGGCGCCGAGATCGCCGCGGACCGGCTTCGGTACTCCCCCGGCCAG TTCCTGACGCTGCGGGTCCCCAGCGACCGCACCGGGTCGGTCGCACGCTGCTACTCGCTG TCCTCGTCGCCGACCACCGACGACCGGCTCACGGTGACGGTCAAGCGCACCGCCGACGGT TACGCCTCGAACTGGCTGTGCGACAACGCCCACGCCGGCATGCGCATCCACGTCCTGGCG CCCTCGGGGACGTTCGTCCCGAAGGACCTCGACACCGACTTCCTGCTGCTGGCCGCGGGC AGCGGCATCACCCCGATGATGGCGATCTGCAAATCCGCGCTCGCCGAGGGCACCGGCAAC GTGGTGCTGATCTACGCCAACCGCGACGAGAACTCGGTGATCTTCGCTGGCGCACTGCGC GAACTGGCCGCGAAATACCCCGACCGGCTGACCGTGGTGCACTGGCTGGAGACCGTGCAG GGCCTGCCGACGGCGGCCGGCCTCGGCGCGCTCGCCAAGCCGTTCGCCGGGCGTGAGGCC TTCATCTGCGGGCCCGGTCCGTTCATGACCGCAGCCGAGGACGCGCTGCGCGCCGCGGGC ACCCCCGACGACCACATCCACATCGAGGTGTTCAAGTCGCTGGAGTCCGATCCGTTCGCC GCGGTCGTGATCCCCGAGGACGACGGGGACGACCAGGGCCCGGCGACCGCTGTGGTGACG CTGGACGGCACCACACACGAGATCCGTTGGCCGCGTTCGGCCAAGCTGCTCGATGTACTG CTGGACAAGGGTCTCGACGCGCCGTTCTCGTGCCGCGAGGGACACTGCGGCGCCTGCGCG GTGCTCAAGAAATCCGGCGAGGTGCACATGGAGATCAACGACGTTCTGGAGCCGTCGGAT CTCGAGGAGGGTCTGATCCTGGGTTGCCAGGCGACACCCGTGTCCGATTCCGTCGAAGTC AC C T AC GAC GAATAG

SEQ ID NO 2 (MSMEG_5941)

ATGACTGGACAGGAGTACGACGTTGTGGTGGTCGGGAGCGGTGCTGCCGGCATGGTCGCC GCCCTCACCGCAGCCCACCAGGGCCTCTCGACAGTAGTCGTAGAAAAGGCTCCGCACTAC GGTGGTTCCACTGCGCGGTCAGGTGGTGGTGTGTGGATCCCGAACAACGAGATCCTCAAG CGCGACGGCGTCAAGGACACTCCTGACGAGGCGCGGAAATACCTGCACGCGATCATCGGT GACGTCGTCCCGGCCGAGAAGATCGACACGTATCTGGACCGCGGGCCGGAAATGCTGTCG TTCGTCCTCAAGCACTCGCCGCTGAAGCTGTGCTGGGTGCCCGGATACTCCGACTACTAC CCCGAGACCCCGGGTGGCAAGCCCACGGGGCGGTCGGTCGAGCCGAAGCCGTTCGACGCC AACAAGCTGGGCCCCGACCTCAAAGGTCTCGAACCGCCGTACGGCAAGGTCCCCATGAAC ATGGTGGTCATGCAGCAGGACTACGTGCGGCTCAACCAGCTCAAACGTCATCCGCGCGGC GTACTGCGCAGCCTCAAGGTCGGCATCCGCGCGACGTGGGGCAAGGTCAGCGGCAAGAAC CTCGTCGGTATGGGCCGCGCGCTCATCGCGCCGCTGCGTATCGGCCTGCGCGAGGCCGGG GTTCCGGTGCTGCTGAACACCGCGCTGACCGATCTGTACGTCGAGGACGGCCGCGTGCTG GGCATCTACGTCCGCGACACGACGGCCGGCGACGACGCCGAGCCCCGGCTGATCCGCGCA CGCCACGGCGTGATCCTCGGATCCGGCGGGTTCGAGCACAACGAGCAGATGCGCGTGAAG TACCAGCGCGCGCCCATCACCACGGAGTGGACCGTCGGCGCGGTCGCCAACACCGGCGAC GGTATCGTCGCCGCCGAAAAGCTCGGGGCGGCACTCGAACTCATGGAAGACGCGTGGTGG GGCCCCACGGTTCCGCTGGTCGGCGCCCCGTGGTTCGCCTTGAGCGAGCGCAACTCCCCC GGATCGATCATCGTCAACATGTCCGGCAAGCGCTTCATGAACGAATCCATGCCCTACGTC GAGGCATGCCACCACATGTACGGCGGCCAGTACGGCCAGGGCCCCGGTCCCGGCGAGAAC ATCCCGGCGTGGCTCATCTTCGACCAGCAATACCGCGACCGCTACATCTTCGCCGGTTTG CAACCAGGGCAGCGGATCCCGTCGAAGTGGCTGGAATCCGGTGTGATCGTCAAGGCCGAC ACGCTGGTCGAACTGGCCGAGAAGACCGGCCTGCCCGCCGATCAGTTCACCTCGACCATC GAGCGCTTCAACGGGTTCGCACGCTCGGGTGTCGACGAGGACTTCCACCGCGGCGAGAGT GCCTACGACCGTTACTACGGCGATCCCACCAACAAACCCAACCCGAACCTGGGCGAGATC AAGCACGGCCCCTTCTACGCCGCCAAGATGGTGCCCGGTGACCTCGGCACCAAGGGCGGC ATCCGCACCGACGTGCGCGGACGCGCTCTGCGCGACGACGATTCGGTGATCGAGGGTCTG TATGCTGCCGGCAATGTCAGCTCACCGGTGATGGGCCACACCTATCCGGGACCCGGCGGC ACCATCGGTCCCGCCATGACATTCGGTTACCTGGCCGCACTCGACATCGCCGCTACCGCG GCGGCCTCCCGGAAGGGCTGA