L'invention concerne des microparticules et des nanoparticules composées de protéines.

L'invention concerne également leur utilisation comme système d'encapsulation et leur procédé de préparation.

Les particules capables d'encapsuler un principe actif d'intérêt ou unesubstance active d'intérêt font l'objet de recherches actives. Actuellement, les microparticules et nanoparticules peuvent être obtenues par trois grandes classes de procédés : (i)les procédés physico-chimiques basés sur des variations de la solubilité des matériaux utilisés pour l'encapsulation et sur de variations de température ou de pH/z¾ ⁾ les procédés mécaniques comme l'extrusion ou la gélification thermique « hot-melt »,et (iii)lQS procédés chimiques au cours desquels se déroulent de manière simultanée la synthèse dupolymère et l'encapsulation des molécules actives.

Lesdites particules doivent être capables de piéger une substance active d'intérêt, de la véhiculer dans l'organisme jusqu'à la cellule ou jusqu'au tissu cible, puis de la libérer sans qu'il y ait altération de sa structure. Il est donc important que ces particules ne soient pas toxiques. Cependant, du fait de la faible solubilité de certaines protéines dans l'eau, les procédés de préparation desdites particules font très souvent appel à des solvants organiques afin de dissoudre les protéines. Ces procédés présentent également d'autres désavantages. En effet, ceux-ci nécessitent souvent, au cours d'une étape au moins, l'utilisation de tensioactifs, l'utilisation de réactifs, voire une variation extrême de pH. Dans certains cas, il est aussi nécessaire de faire appel au chauffage ou à une forte agitation qui sont à l'origine d'une perte d'énergie et qui augmente le temps et le coût de la production.

La substance active d'intérêt peut ainsi subir une dégradation à cause des solvants, des tensioactifs, des réactifs utilisés, de l'agitation ou du chauffage nécessaire à la fabrication des particules. Ces conditions pourraient également être à l'origine d'une inefficacité thérapeutique des particules obtenues.

De plus, la majorité des procédés conduisant à la formation des particules à base de protéines se font en plusieurs étapes, ce qui augmente aussi le temps et le coût de la production. C'est le cas par exemple de la préparation de particules par émulsion-diffusion de solvant. De même, des étapes supplémentaires pour purifier les préparations et éliminer l'excès de réactifs, solvants ou tensioactifs sont bien souvent nécessairesaprès leur fabrication.

Aucun des procédés mentionnés ci-dessus n'est donc satisfaisant et c'est pourquoi un nouveau procédé de préparation de particules composées de protéines est souhaité.

Les protéines sont largement utilisées dans le domaine pharmaceutique ou dans le domaine cosmétique, notamment pour l'encapsulation de substances actives d'intérêt.Parmi les protéines couramment utilisées, la gliadine et la gélatine sont avantageuses en raison de leurs propriétés muco-adhésives.

La gliadine est une protéine issue du blé composée d'une chaîne de polypeptide de masse molaire variable entre 25 et lOOkDacaractérisée par la présence de ponts disulfures. La gliadine peut interagir avec la kératine au niveau de l'épiderme (Teglia, A. et Secchi, G., Int. J. Costa. Sci.16 (1994) 235 246). Cette protéine a par exemple été utilisée pour l'administration par voie orale de molécules actives, telles que la clarithromycine, l'oméprazole (Ramteke & Jain, Journal of Drug Targeting. 2008, 16(1), 65-72), et Γα- tocophérol (Duclairor et al, Journal of Microencapsulation, 2002, 19(1), 53-60). Les méthodes actuellement utilisées pour préparer lesdites particules font néanmoins appel à des solvants organiques, notamment Péthanol, puisque cette protéine a une très faible solubilité dans l'eau (Ezpeleta, I. et al, 1996. Int. J. Pharm. 131, 191-200).

D'une manièregénérale, les gélatines ont une masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) comprise entre50 Da et 100 kDa, et une masse moléculaire moyenne en masse (Mw) comprise entre 100 Da et 1000 kDa, avec un indice de polydispersité Ip (Mw/Mn) souvent supérieur à 2, dû àl' hétérogénéité même de la gélatine (Wiley, Gelatin Handbook). La gélatine est obtenue par hydrolyse partielle du collagène (Harding, J. J. (1965). The unusual links and cross-links of collagen. Advances in Protein Chemistry, 20, 109-190, Veis, A. (1964).The macromolecular chemistry of gelatin. Académie Press: London, Ward, A.G., & Courts, A. (1977). The science and technology of gelatin. London: AcademicPress.). Le collagène est extrait de la peau, par exemple la peau de proc, des os, des cartilages.

Scheffel U et al, (19Ί2, J Nucl Med, Jul;13(7):498-503), décrit la préparation de nanoparticules d'albumine par différentes méthodes telles que l'émulsification qui nécessite un apport important d'énergie et une augmentation de la température.

L'élastine est également une protéine très souvent utilisée, notamment dans le domaine cosmétique. Elle présente une structure très dense qui la rend insoluble dans l'eau. Des études ont néanmoins été faites pour montrer qu'il existe la possibilité de modifier l'élastine pour la rendre plus so lubie dans l'eau (US 4 363 760).

Le brevet US 4 659 740 décrit l'utilisation dans le domaine de la cosmétique de dérivés d'élastine greffés par des acides gras (tels que l'acide laurique, l'acide palmitique ou l'acide oléique) en formant des liaisons amide, par transformation de l'acide en anhydride capable de réagir avec les groupements aminé de l'élastine. Cette formulation a permis d'avoir une meilleure pénétration de l'élastine à travers la peau, notamment une meilleure absorption au niveau du stratum corneum.

L'utilisation de dérivés d'alpha-élastine capables de s'auto-associer en milieu aqueux a également été décrite. Les particules obtenues ont été réticulées par les radiations gamma pour les solidifier (Fujimoto et al, Radiation Physics and Chemistry, 2009, 78, 1046-1048). Des nanoparticules de taille de 150 nm et de 300 nm ont été obtenues (Fujimoto et al, Polymer Bulletin, 2010, 64, 707-716).

La demande internationale WO/2005/116085 décrit également l'association entre une cyclodextrine sur laquelle est liée un groupe organo-fonctionnel et une protéine hydrolysée.

L'un des buts de l'invention est donc de fournir des complexes d'inclusion entre une protéine hydrophobisée et une cyclodextrine.

L'un des autres buts de l'invention est de fournir des particules formées à partir desdits complexes d'inclusion.

L'un des autres buts de l'invention est de fournir un procédé de préparation simple desdites particules sans utilisation systématique de solvants, de tensioactifs ou de réactifs.

L'un des autres buts de l'invention est de fournir un procédé de préparation desdites particules ne nécessitant pas une forte augmentation de la température ou une forte agitation de la préparation.

L'invention concerne également l'utilisation desdites particules, ainsi que des compositions contenant lesdites particules.

L'invention concerne aussi un système d'encapsulation contenant lesdites particules, ainsi qu'un procédé de préparation dudit système d'encapsulation.

L'invention concerne ainsi un complexe d'inclusion formé par l'interaction entre

^■ au moins une protéine comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à ladite protéine, et ^■ au moins une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, la protéine et la cyclodextrine étant liées de façon non-covalente.

Le terme « complexe d'inclusion » désigne un système constitué d'une molécule hôte capable d'accueillir une espèce chimique.

Le terme « protéine » désigne une macromolécule biologique composée d'une ou plusieurs chaînes d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques.Les acides aminés sont une classe de composés chimiques de formule H ₂ N-CHR-COOH. Chaque acide aminé possède donc un groupe aminé -NH ₂ , un groupe carboxyle -COOH, et un groupe R qui représente la chaîne latérale qui identifie l'acide aminé, (par exemple CH ₂ -SH pour la cystéine, CH ₂ -OH pour la sérine, H pour la glycine ...).

L'expression « protéine comportant des groupes hydrophobes » signifie que la protéine a été hydrophobisée par greffage, sur les groupes aminés et/ou les groupes carboxyles et/ou les groupes hydroxyles et/ou les groupes thiols, de chaînes alkyles qui sont par nature hydrophobes en raison de leur caractère apolaire.Les protéines greffées par des chaînes hydrophobes sont des systèmes amphiphiles capables de s'auto-associer spontanément en milieu aqueux sous forme de micelles de type cœur-couronne pouvant accueillir un principe actif. Les protéines sont notamment greffées par des groupements lipidiques. Ces systèmes ont montré une grande stabilité au cours du temps. La solubilité desdites protéines en milieu aqueux décroit cependant à cause de la présence des chaînes greffées hydrophobes.

Une cyclodextrine (ou cycloamylose) est un oligosaccharide cyclique de β-D- glucopyranose reliés par des liaisons a(l-4). C'est une molécule cage d'origine naturelle qui permet d'encapsuler diverses molécules, notamment des molécules d'intérêt thérapeutique. Il en existe de différentes tailles (α, β,γ), chacune ayant la forme d'un « abat-jour ». Elle porte des groupes hydrophiles -OH localisés à l'extérieur, l'ensemble délimitant une cavité relativement hydrophobe. Ce caractère amphiphile permet à la cyclodextrine d'inclure dans sa cavité des molécules hydrophobes pour former des complexes d'inclusion so lubies dans l'eau. Son caractère biodégradable la prédispose à des applications importantes dans les domaines agro-alimentaires et pharmaceutiques. L'encapsulation dans les cyclodextrines permet en effet de protéger des molécules fragiles ou d'assurer leur libération lente et contrôlée.

Dans la présente invention, par « cyclodextrine », on désigne uniquement α- cyclodextrine.

L'expression « sous forme de monomère » signifie qu'une seule unité de cyclodextrine est présente. Le fait d'utiliser l'alpha-cyclodextrine sous forme de monomère au lieu d'un polymère de cyclodextrine représente un avantage évident d'un point de vue économique et réglementaire car cette cyclodextrine est disponible dans le commerce et est reconnue comme étant un excipient pharmaceutique accepté par la majorité des pharmacopées.

L'expression « la protéine et la cyclodextrine étant liés de façon non-covalente » signifie que les interactions entre ces molécules sont de type Van der Waals et/ou de type hydrogènes et/ou de type hydrophobes et/ou électrostatiques, et non pas des liaisons covalentes.

Les complexes d'inclusion selon l'invention sont ainsi exclusivement formés par des liaisons non-covalentes par simple mélange d'a-cyclodextrine et de protéine greffée par des groupements hydrophobes. En utilisant le même mode opératoire et en faisant varier le type de ces interactions non covalentes, il est alors possible de former des particules de taille et de structures variées.

De façon avantageuse, dans le complexe d'inclusion selon l'invention, la protéine a une masse molaire comprise de 100 Da à 1 000 000 kDa, et en particulier de 10 à 100 kDa.

De façon avantageuse, dans le complexe d'inclusion selon l'invention, le rapport entre la concentration de la cyclodextrine en g/L et celle de la protéine est compris de 10 ^"6 à 900 000.

Selon une autre façon avantageuse, dans le complexe d'inclusion selon l'invention, le rapport entre la concentration de la cyclodextrine en g/L et celle de la protéine est compris de 0,01 à 1500, en particulier compris de 4 à 15 et notamment égal à 10.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un complexe d'inclusion formé par l'interaction entre

^■ une association de protéines comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à ladite protéine, et

■ au moins une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, la protéine et la cyclodextrine étant liées de façon non-covalente.

L'expression « association de protéines » signifie qu'au moins deux protéines différentes sont présentes dans le complexe d'inclusion, par exemple la gélatine et la gliadine.

L'invention concerne en particulier un complexe d'inclusiondans lequel la protéine est choisie parmi l'élastine, le collagène, la gliadine, la gélatine, la kératine, l'albumine, la légumine, la viciline, la caséine, le fîbrinogène, l'insuline, la fibrinonectine, une hormone, une enzyme, un facteur de coagulation, la transferrine, la fibrilline, une immunoglobuline, une protéine céréalière (blé, riz, ...), une protéine issue de graines ou des noix, une protéine issue d'algue, une protéine de soie, une protéine d'œuf, une protéine de pomme de terre, et les dérivés desdites protéines, et est notamment la gliadine ou la gélatine.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, dans lecomplexe d'inclusion selon l'invention, le degré de substitution de la protéine par les groupes hydrophobes est compris de 0,001 à 100%.

Avantageusement, dans le complexe d'inclusion selon l'invention, le degré de substitution de la protéine par les groupes hydrophobes estcompris de 0,005 à 50%.

Le degré de substitution est aussi un paramètre permettant de moduler la taille moyenne des particules formées à partir des complexes d'inclusion.

Le taux de greffage de la protéine par les groupements hydrophobes peut être calculé en utilisant différentes méthodes analytiques telles que l'analyse élémentaire et la spectroscopie RMN du proton de la protéine greffée.

L'invention concerne en particulier un complexe d'inclusion formé par l'interaction entre

^■ au moins une protéine comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à ladite protéine, et

^■ au moins une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, la protéine et la cyclodextrine étant liées de façon non-covalente,

notamment dans lequel la protéine est choisie parmi l'élastine, le collagène, la gliadine, la gélatine, la kératine, l'albumine, la légumine, la viciline, la caséine, le fïbrinogène, l'insuline, la fibrinonectine, une hormone, une enzyme, un facteur de coagulation, la transferrine, la fïbrilline, une immunoglobuline, une protéine céréalière (blé, riz, ...), une protéine issue de graines ou des noix, une protéine issue d'algue, une protéine de soie, une protéine d'œuf, une protéine de pomme de terre, et les dérivés desdites protéines, et est notamment la gliadine ou la gélatine,

dans lequel les groupes hydrophobes sont des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment 2 à 20, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant 2 à 1000 atomes de carbone, notamment 2 à 20, contenant au moins une double liaison C=C, conjuguée ou non, et notamment des groupements hydrophobes lipidiques, en particulier l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide laurique, l'acide stéarique et/ou l'acide linoléique.

Selon un mode de réalisation avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant de 6 à 100 atomes de carbone, ou des groupements alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant de 6 à 100 atomes de carbones.

L'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide laurique, l'acide stéarique et/ou l'acide linoléique sont notamment utilisés pour le greffage des chaînes hydrophobes sur la protéine, mais cette liste n'est en aucun cas exhaustive et limitante.

e on un autre mo e e r a sat on part cu er, ans e comp exe nc us on e l'invention, les groupes hydrophobes sont des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment 2 à 20, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant 2 à 1000 atomes de carbone, notamment 2 à 20, et portant de 1 à 4double liaisons C=C, conjuguée ou non,

Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont fixés de façon covalente à la protéine par la fonction aminé et/ou la fonction carboxylique et/ou la fonction hydroxyle et/ou la fonction thiol.

Lesdits groupes hydrophobes sont ainsi fixés par réaction de N-acylation et/ou O- acylation et/ou de S-acylation avec un acide gras ou un dérivé d'acide gras tel qu'un chlorure d'acide gras (le chlorure d'acide palmitique ou le chlorure d'acide oléique par exemple).

Mode opératoire général

L'hydrophobisation des protéines peut être effectuéeen dissolvant la protéine puis en chauffant le mélange à 90°C sous agitation magnétique continue. Le chlorure d'acide gras, par exemple le chlorure de palmitoyle est ensuite ajouté. Le mélangeest laissé à 90°C pendant quelques heures, puislaissé à température ambiante. La protéine acylée est ensuite précipitée, collectée, lavée puis séchée.

Après acylation, sur le spectre IR de la protéine acylée, la présence de bandes correspondantes aux chaînes alkyles de l'acide gras doit être observée, en comparaison avec le spectre IR de la protéine native.

Ladite hydrophobisation peut être faite dans un solvant si la protéine est soluble dans ce dernier et si on veut greffer la protéine avec un chlorure d'acide (le chlorure d'acide est hydrolysé en présence d'eau). On peut également ne pas utiliser de solvant, et réaliser Γ hydrophobisation uniquement en présence d'eau à condition que la protéine soit soluble dedans et à condition d'utiliser d'autres méthodes de greffage, telles que celles avec l'anhydride d'acide (voir le brevet US 4 659 740 par exemple).

Au sens de la présente invention, « solvant », désigne ainsi tout solvant à l'exception de l'eau ou d'un milieu aqueux.

Selon un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion de l'invention,la cyclodextrine (CD) a pour formule

dans laquelle

^■ p est un entier égal à 6,

^■ RI, R2, R3, identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisi parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH ₂ , des groupes ammonium -NH ₃ ⁺ , ou des groupes sulfates - S0 ₄ ^2" , et sont notamment des atomes d'hydrogènes ou des groupes méthyles,

ladite CD étant sous forme de monomère,

et notamment dans lequel la cyclodextrine est fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anticorps, des fragments d'anticorps, des récepteurs, des lectines, de la biotine ou ses dérivés.

L'a-cyclodextrine est schématisée ci-après :

Sa géométrie est comparable à un tronc de cône délimitant une cavité en son centre. Elle est décrite dans la figure 10. Il s'agit donc d'une molécule cage, capable d'accueillir des espèces chimiques par phénomène d'inclusion, espèces notamment moléculaires et hydrophobes. La partie interne de la cavité est hydrophobe, la partie externe est hydrophile.

Les groupes -OH peuvent être substitués, notamment par des groupes méthyles, hydroxypropyles ou sulfobutyles.Les substitutions peuvent augmenter la solubilité de la cyclodextrine.

L'avantage de Ρα-cyclodextrine est sa petite taille qui lui permet d'interagir avec les chaînes hydrophobes liées à la protéine.

Selon un mode de réalisation particulier, la cyclodextrine est fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anticorps, des fragments d'anticorps, des récepteurs, des lectines, de la biotine ou ses dérivés.

Le terme « ligand » désigne une molécule capable de se lier de façon covalente à la cyclodextrine. Le ligand est choisi parmi des composés protéiniques intervenant notamment dans la reconnaissance et/ou la neutralisation d'agents pathogènes (anti-corps ou fragments, récepteurs, lectines), intervenant dans le métabolisme des acides gras (biotine et dérivés).

Selon un autre aspect particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, la cyclodextrine est chargée ou non-chargée.

Selon encore un autre aspect, dans le complexe d'inclusion de l'invention, la cyclodextrine est substituée ou non-substituée.

Par « cyclodextrine substituée », on entend par exemple une cyclodextrine substituée par un groupe alkyle, par exemple une cyclodextrine méthylée, par un groupe hydroxyalkyle, par un groupe maltosyl, par un groupe galactosyl, ou par toutes autres molécules. Selon un autre aspect, l'invention concerne un complexe d'inclusion, dans lequel la protéine est fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anticorps, des fragments d'anticorps, des récepteurs, des lectines, de la biotine ou ses dérivés.

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un complexe d'inclusion, dans lequel la protéine est la gliadine portant des groupes hydrophobes fixés par la fonction aminé et/ou la fonction carboxylique et/ou la fonction hydroxyle et/ou la fonction thiol, et représentant des groupes de formule :

et/ou

et/ou

et/ou

dans laquelle

^ représente la protéine,

■ R représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :

° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH ₂ )i4-CH ₃ ou -(CH ₂ )i6-CH ₃ ,

° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et contenant au moins un double liaison C=C, notamment les groupes -(CH ₂ ) ₇ - CH=CH-CH ₂ -(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ ou -(CH ₂ ) ₇ -CH=CH-(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ .

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un complexe d'inclusion, dans lequel la protéine est la gélatine portant des groupes hydrophobes fixés par la fonction aminé et/ou la fonction carboxylique et/ou la fonction hydroxyle et/ou la fonction thiol, et représentant des groupes de formule :

dans laquelle

»¾· , ,

'* représente la protéine,

■ R représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :

° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH ₂ )i4-CH ₃ ou -(CH ₂ )i6-CH ₃ ,

° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et contenant au moins un double liaison C=C, notamment les groupes -(CH ₂ ) ₇ - CH=CH-CH ₂ -(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ ou -(CH ₂ ) ₇ -CH=CH-(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ .

A partir des complexes d'inclusion selon la présente invention, il est possible de former des particules. Lesdites particules contiennent en effet une association de plusieurs complexes d'inclusion.

Un autre aspect de l'inventionconcerne alors une particule de taille comprise de 1 nm à 100 000 nm, notamment 200 nm à 8000 nm, contenant des complexes d'inclusion entre

^■ au moins une protéine comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à ladite protéine, et ^■ au moins une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère.

L'invention concerne ainsi des particules nanométriques, de taille comprise de 1 nm à 1000 nm, et des particules micrométriques, de taille comprise de 1000 nm à 100 000 nm.

La taille des particules formées a été évaluée par diffusion quasi-élastique de la lumière (DQEL) d'une part et par microscopie électronique à transmission (MET) d'autre part.

La taille joue un rôle très important concernant la quantité de principe actif encapsulé et les applications envisagées, et la voie d'administration du principe actif.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne une particule dans laquelle la protéine a une masse molaire comprise de 100 Da à 1 000 000 kDa, et en particulier de 10 à 100 kDa, ladite protéine étant notamment choisie parmi l'élastine, le collagène, la gliadine, la gélatine, la kératine, l'albumine, la légumine, la viciline, la caséine, le fïbrinogène, l'insuline, la fïbronectine, une hormone, une enzyme, un facteur de coagulation, la transferrine, la fïbrilline, une immunoglobuline, une protéine céréalière (blé, riz, ...), une protéine issue de graines ou des noix, une protéine issue d'algue, une protéine de soie, une protéine d'œuf, une protéine de pomme de terre, et les dérivés desdites protéines, et est notamment la gliadine ou la gélatine.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une particuledans laquelle ladite protéine et/ou ladite α-cyclodextrine (CD) sont fonctionnalisées par un ligand choisi parmi des anticorps, des fragments d'anticorps, des récepteurs, des lectines, de la biotine ou ses dérivés.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une particulecontenant des complexes d'inclusion dans lequel le rapport entre la concentration de cyclodextrine en g/L et celle de la protéine, notamment la gliadine ou la gélatine, est compris de 10 ^"6 à 900 000.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une particulecontenant des complexes d'inclusion dans lequel le rapport entre la concentration de cyclodextrine en g/L et celle de la protéine, notamment la gliadine ou la gélatine, est compris de 0,01 à 1500, en particulier compris de 4 à 15 et notamment égal à 10.

Le rapport entre la concentration de cyclodextrine en g/L et celle de la protéine est un paramètre très important car il permet de moduler la taille des particules obtenues à partir des susdits complexes d'inclusion, en modifiant le rapport de concentration entre la cyclodextrine et la protéine. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une particulecontenant des complexes d'inclusion dans lequel le degré de substitution de la protéine par les groupes hydrophobes est compris de 0,001 à 100%, notamment compris de 0,005 à 50%.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une particule contenant des complexes d'inclusion dans lequel les groupes hydrophobes sont des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment 2 à 20, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant 2 à 1000 atomes de carbone, notamment 2 à 20, contenantau moins une double liaison C=C, conjuguée ou non,

et notamment des groupements hydrophobes lipidiques, en particulier l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide laurique, l'acide stéarique et/ou l'acide linoléique.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une particulecontenant des complexes d'inclusion dans lequel les groupes hydrophobes sont fixés de façon covalente à la protéine par la fonction aminé et/ou la fonction carboxylique et/ou la fonction hydroxyle et/ou la fonction thiol.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne uneparticule contenant des complexes d'inclusion formés par l'interaction d'une association de protéines et d'au moins une α-cyclodextrine (CD).

Les protéines contenues dans les complexes d'inclusion selon l'invention peuvent également être utilisées pour encapsuler des substances actives d'intérêt.

Dans encore un autre aspect, l'invention concerne alors un système d'encapsulation contenant une ou plusieurs particules susmentionnées, et une ou plusieurssubstance(s)active(s) d'intérêt utilisée(s) pour ses propriétés dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, des dispositifs médicaux, cosmétique, vétérinaire, agroalimentaire, alimentation animale, agrochimie, des pesticides, des cosméto -textiles, de la parfumerie, environnemental, ou dans l'industrie des peintures, du bâtiment et/ou de l'automobile.

L'expression « système d'encapsulation » signifie alors qu'une protéine formant un complexe d'inclusion selon la présente invention peut elle-même être l'hôte d'une ou plusieurs substance(s) active(s) d'intérêt.

Selon un aspect avantageux, la substance active d'intérêt a des propriétés pharmaceutiques et est choisie parmi les composés inorganiques et les composés organiques, synthétiques ou naturels. Le système d'encapsulation précédemment défini peut être utilisé pour préparer des compositions appropriées dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, des dispositifs médicaux, cosmétique, vétérinaire, agroalimentaire, alimentation animale, agrochimie, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental, ou dans l'industrie des peintures, du bâtiment et/ou de l'automobile.

La substance active d'intérêt encapsulée peut posséder des propriétés pharmaceutiques et être un principe actif à usage thérapeutique. Elle peut appartenir à la liste suivante, cette dernière n'étant en aucun cas limitante, au groupe des composés à propriétés vitaminiques, notamment la vitamine A, la vitamine E, la vitamine C, les vitamines K, les vitamines B, la vitamine D, anti-tumorales, notamment le paclitaxel, le docétaxel, le tamoxifène, la doxorubicine, antidouleurs, notamment le paracétamol, anti-inflammatoires, notamment le diclofénac, l'ibuprofène, le kétoprofène, antibiotiques, notamment les pénicillines, les tétracyclines, antifongiques, notamment le kétoconazole, le clotrimazole, la nystatine, la chlorhexidine et ses dérivés, antiparasitaires, notamment l'albendazole, le métronidazole, enzymatiques, notamment la phosphatase alcaline, l'acetylcholinesterase, l'alcool déshydrogénase, hormonales, notamment la testostérone, le lévonorgestrel, anxiolytiques, notamment les benzodiazépines, antidiabétiques, notamment le glicazide, anti-hypertenseurs, notamment la nifédipine, ou vaccinales, antiviraux, notamment ΓΑΖΤ, analgésiques ou des combinaisons d'analgésiques, notamment le paracétamol antiépileptiques notamment les barbituriques et dérivés, anesthésiques locaux et généraux, notamment l'Atropine, mais également les hypnotiques, sédatifs, antipsychotiques, neuroleptiques, antidépresseurs, anxiolytiques, notamment antagonistes, agent bloquant neuronal, anticholinergiques, cholino mimétiques, antimuscariniques, muscariniques, notamment, antiadrénergiques, antiarythmiques, antiarthritiques, antiasthmatiques, anticonvulsif, antihistaminiques, anti- nausée, antinéoplasiques, antipyrétiques, antipruriginaux, antispasmodique, vasodilateurs, stimulants du système nerveux central, notamment préparations contre la toux et le rhume, décongestionnant, stimulants de la croissance osseuse, inhibiteurs de la résorption osseuse, immunosuppresseurs, relaxant musculaire, psychostimulants, sédatifs, tranquillisants, protéines, peptides ou leurs fragments, lesdites protéines, peptides ou fragments étant naturels, recombinants ou produits par voie chimique, acides nucléiques (ribonucléotides ou désoxyribonucléotides), notamment les molécules simples et double brin, les construits de gène, les vecteurs d'expression, molécules anti-sens et autres du même genre. Cette substance active d'intérêt à usage thérapeutique peut être utilisée chez l'homme et chez l'animal.

La substance active d'intérêt encapsulée peut aussi posséder des propriétés cosmétiques et appartenir au groupe des composés à propriétés anti-inflammatoires, anti-âge, anti-ultraviolets (anti-UV), dépigmentantes, cicatrisantes, hydratantes, parfumantes, désodorisantes, antibactériennes, anti-transpirants, nettoyantes, colorantes, conservatrices.

Dans un système d'encapsulation particulier, la substance active d'intérêt possède des propriétés alimentaires et appartient au groupe des composés à propriétés vitaminiques, enzymatiques, édulcorantes. Elle peut aussi être une huile essentielle, un colorant, un conservateur, un antioxydant, un probiotique.

Quelques molécules ou familles de molécules pouvant être encapsulées à titre de substances actives d'intérêt sont : la molsidomine, le kétoconazole, le gliclazide, le diclofénac, le lévonorgestrel, le paclitaxel, le docétaxel, le tamoxifène, l'hydrocortisone, pancratistatin, le kétoprofène, le diazépam, l'ibuprofène, nifédipine, la testostérone, le tamoxifène, le furosémide, le tolbutamide, le chloramphénicol, les benzodiazépines, le naproxène, la dexaméthasone, le diflunisal, l'anadamide, la pilocarpine, la daunorubicine, la doxorubicine , les huiles essentielles, les terpènes, les terpénoïdes.

Pour améliorer la solubilité desdites molécules, on peut prévoir d'utiliser un solvant ou un mélange de solvants, notamment: acétate d'alkyle (acétate d'éthyle, acétate de butyle, acétate de méthyle), acétone, acétonitrile, acide acétique, acide méthanoïque, ammoniac, anhydride acétique, aniline, anisole, benzène, butanol, butanone, chlorobenzène, chloroforme, cyclohexane, cyclopentane, dichloroéthane, dichlorométhane, éther diisopropylique, diméthylformamide, diméthylsulfoxide, dioxane, éthanol, éther de glycol, éther diéthylique, éthylène glycol, heptane, hexaméthylphosphoramide, hexane, méthanol, méthyle éthyle cétone, nitrobenzène, pentane, percgloroéthylène, propanol, propoxypropane, pyridine, sulfure de carbone, tétrachloroéthane, tétrahydrofurane, toluène, trichloroéthane, trichloroéthylène, trèméthylpentane, xylène.

Ledit solvant ou mélange de solvant est ajouté avant d'additionner la cyclodextrine et la protéine hydrophobisée.

Dans encore un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique contenant à titre de substance active d'intérêt une substance encapsulée dans des complexes d'inclusion tels que mentionnés précédemment ou dans des particules susmentionnées, sous forme solide, sous forme de solution ou sous forme de suspension dans un milieu aqueux tel que l'eau pure, une solution aqueuse comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient pharmaceutiquement acceptable.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique, ladite composition étant utilisable pour les voies :

parentérale, intraveineuse, orale, buccale, sublinguale, cutanée, sous-cutanée, nasale, rectale, vaginale, pulmonaire, ou oculaire et pour toute administration au niveau d'une muqueuse, ou au niveau d'un site précis (tumeur, lumière de certains vaisseaux sanguins),

sous forme de comprimé, capsule molle, capsule dure (gélule), poudre, granule, chewing- gum, dentifrice, les irrigations sous-gingivales, les solutions de pré-brossage dentaire ou buccal, patch, implant, suppositoire, solution, suspension, sirop, pâte, crème, gel, émulsion, spray, lotion, pommade, vernis, laque, shampooing.

Les formes avantageuses dans le domaine pharmaceutique sont les comprimés, les capsules molles, les capsules dures (les gélules), les poudres, les granules, les patchs, les implants, les suppositoires, les solutions, les suspensions, les sirops, les pâtes, les crèmes, les gels, les émulsions, les sprays, les lotions, les pommades, les vernis et les laques.

Les formes avantageuses dans le domaine paramédical sont les pansements, les cathéters, la compresse, la gaze, le coton hydrophile, le sérum physiologique, le spray...

Les formes avantageuses dans le domaine des dispositifs médicaux sont les implants, les prothèses, les laveurs-désinfecteurs d'instruments, les compresses, les pansements (notamment cicatrisants), les sprays, les gazes, le coton hydrophile ...

Les formes avantageuses dans le domaine vétérinaire sont les formes orales (comprimés, poudres, capsules molles, capsules dures (gélules), granules, pâtes, solutions, suspensions), injectables (solutions, suspensions, émulsions) et topiques dont l'action peut être locale ou systémique (spray, colliers, boucles auriculaires, poudres, lotions, pommades, shampooings, patch, émulsions, lait, gel, crème, vernis, laques).

Les formes avantageuses dans le domaine alimentaire sont les solutions, les émulsions, les pâtes, les gels, les poudres utilisées seules ou inclues dans des préparations alimentaires; dans le domaine des compléments alimentaires : les formes orales principalement (poudres, comprimés, gélules, granules, capsules molles ou capsules dures (gélules), pâtes, solutions, suspensions, infusions, émulsions). Selon un aspect particulier, l'invention concerne une composition cosmétique contenant à titre de substance active d'intérêt une substance encapsulée dans des complexes d'inclusion tels que mentionnés précédemment ou dans des particules susmentionnées, sous forme solide, sous forme de solution ou sous forme de suspension dans unmilieu aqueux tel que l'eau pure, une solution aqueuse comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou polymère(s), et/ou tensioactifs notamment le polysorbate 80 ou le laurylsulfate de sodium, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient cosmétiquement acceptable.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne une compositioncosmétique, ladite composition étant utilisable pour la voieorale,la voie cutanée, au niveau des ongles, au niveau capillaire,

sous forme de comprimé, capsule molle, capsule dure (gélule), poudre, granule, patch, implant, solution, suspension, pâte, crème, gel, émulsion, spray, lotion, pommade, vernis, shampooing.

L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion tel que défini précédemment comportant une étape de mélange d'au moins

^■ une protéine comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à ladite protéine, et

^■ une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel ladite protéine et ladite cyclodextrine sont liées de façon non-covalente.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion tel que défini précédemment comportant une étape de mélange d'au moins

^■ une association de protéines comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à ladite protéine, et

^■ une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel ladite protéine et ladite cyclodextrine sont liées de façon non-covalente.

L'utilisation de plusieurs protéines peut présenter l'avantage de moduler les propriétés des particules en modifiant le rapport entre les protéines. Ainsi, il est attendu que la taille, la charge globale et les applications visées de ces particules peuvent être modulées.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation comportant une étape de mélange d'au moins une protéine choisie parmi l'élastine, le collagène, la gliadine, la gélatine, la kératine, l'albumine, la légumine, la viciline, la caséine, le fîbrinogène, l'insuline, la fibronectine, une hormone, une enzyme, un facteur de coagulation, la transferrine, la fîbrilline, une immunoglobuline, une protéine céréalière (blé, riz, ...), une protéine issue de graines ou des noix, une protéine issue d'algue, une protéine de soie, une protéine d'œuf, une protéine de pomme de terre, et les dérivés desdites protéines, et est notamment la gliadine ou la gélatine, ladite protéine comportant des groupes hydrophobes de formule

et/ou

et/ou

et/ou

dans laquelle

*^ représente la protéine,

■ R représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :

° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH ₂ )i ₄ -CH ₃ ou -(CH ₂ )i ₆ -CH ₃ , ° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et contenant au moins un double liaison C=C, notamment les groupes -(CH ₂ )7-CH=CH-CH ₂ -(CH ₂ )7-CH ₃ ou -(CH ₂ ) ₇ -CH=CH- 2) ₇ -CH ₃ , etune α-cyclodextrine (CD) ayant pour formule

dans laquelle

^■ p est un entier égal à 6,

^■ RI, R2, R3, identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisi parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino - NH ₂ , des groupes ammonium -NH ₃ ⁺ , ou des groupes sulfates -SO ₄ ^2" , et sont notamment des atomes d'hydrogènes ou des groupes méthyles, ladite CD étant sous forme de monomère,

notamment dans laquelle ladite protéine et ladite α-cyclodextrine (CD) sont fonctionnalisées par un ligand choisi parmi des anticorps, des fragments d'anticorps, des récepteurs, des lectines, de la biotine ou ses dérivés.

pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel ladite protéine et ladite cyclodextrine sont liées de façon non-covalente.

Dans encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation dans lequel l'étape de mélange est effectuée à température ambiante.

Dans le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion selon la présente invention, la protéine peut être en solution dans un milieu aqueux ou sous forme de suspension dans un milieu aqueux.

Dans le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion selon la présente invention, la cyclodextrine peut être en solution dans un milieu aqueux ou sous forme de suspension dans un milieu aqueux.

Par milieu aqueux, on entend notamment au sens de la présente invention l'eau pure, une solution aqueuse comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient pharmaceutiquement acceptable. Selon un aspect particulier, l'invention concerne un procédé de préparation, dans lequel

^■ ladite protéine est sous forme de suspension dans un milieu aqueux,

^■ ladite α-cyclodextrine (CD) est, de préférence, en solution dans unmilieu aqueux,

ledit milieu aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 14, notamment 5 à 8, comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable, une solution de sérum physiologique, éventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire.

Par solution injectable, on entend notamment au sens de la présente invention l'eau pour préparations injectables, une solution de chlorure de sodium, ou une solution à base de sodium.

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un procédéde préparation, dans lequel

^■ ladite protéine est en solution dans un milieu aqueux,

^■ ladite α-cyclodextrine (CD) est, de préférence, en solution dans unmilieu aqueux,

ledit milieu aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 14, notamment 5 à 8, comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable, ou une solution de sérum physiologique, éventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire.

Selon encore un autre aspect particulier, l'invention concerne un procédé de préparation, dans lequel

^■ ladite protéine est en solution dans un milieu aqueux,

^■ ladite α-cyclodextrine (CD) est sous forme de suspension dans unmilieu aqueux,

ledit milieu aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 14, notamment 5 à 8, comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable, une solution de sérum physiologique, éventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation, dans lequel

^■ ladite protéine est sous forme de suspension dans un milieu aqueux,

^■ ladite α-cyclodextrine (CD) est sous forme de suspension dans unmilieu aqueux,

ledit milieu aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 14, notamment 5 à 8, comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable, une solution de sérum physiologique, éventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire.

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un procédé de préparation, ledit procédé,comportant préalablement à l'étape de mélange, une étape de préparation d'une protéine portant des groupes hydrophobes, par réaction de N-acylation et/ou de O- acylationet/ou de S-acylation entre ladite protéine et 0,1 à 100 équivalents par unité de protéine, de chlorure d'acide gras de formule

dans laquelle

■ R représente un groupe hydrophobe et est choisi parmi :

° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH ₂ )i4-CH ₃ ou -(CH ₂ )i ₆ -CH _3,

° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes -(CH ₂ ) ₇ -CH=CH- CH ₂ -(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ ou -(CH ₂ ) ₇ -CH=CH-(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ .

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un procédé de préparation comportant une étape de mélange entre

^■ une protéine, notamment la gliadine ou la gélatine comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à ladite protéine, et ^■ une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,

et notamment comportant une étape de mélange entre une gliadine ou la gélatine portant sur la fonction aminé et/ou la fonction carboxylique et/ou la fonction hydroxyle et/ou la fonction thiol, des groupes hydrophobes de formule

et/ou

et/ou

dans laquelle

* ^■ ' ^* représente la protéine,

■ R représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :

° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH ₂ )i4-CH ₃ ou -(CH ₂ )i6-CH ₃ ,

° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et contenant au moins un double liaison C=C, notamment les groupes -(CH ₂ ) ₇ - CH=CH-CH ₂ -(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ ou -(CH ₂ ) ₇ -CH=CH-(CH ₂ ) ₇ -CH _3,

et une cyclodextrine de formule

dans laquelle

^■ p est un entier égal à 6,

^■ RI, R2, R3, identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisi parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH ₂ , des groupes ammonium -NH ₃ ⁺ , ou des groupes sulfates - SO ₄ ^2" , et sont notamment des atomes d'hydrogènes ou des groupes méthyles,

à la concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L de milieu aqueux, en particulier comprise de 1 à 300 g/L, et notamment à environ 200 g/L de milieu aqueux,

ladite protéine, notamment la gliadine ou la gélatine, étant

• en suspension, à la concentration comprise de de 0,01 à 9000 g/L, en particulier étant comprise de 1 à 300 g/L, et notamment étant environ égale à 200 g/L, dans un milieu aqueux, choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable ou une solution de sérum physiologique, éventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire,

le pourcentage massique de ladite protéine, notamment la gliadine ou la gélatine, étant compris de 0,01% à 99,9%, notamment de 0,5% à 70%,

le pourcentage massique de la cyclodextrine étant compris de 0,01% à 99,9%>, notamment de 0,5%> à 70%>,

le pourcentage massique de l'eau ou du milieu aqueux étant compris de 0,01% à 99,9%, notamment de 70% à 99%, ledit mélange étant effectué sous agitation, à une température comprise de 0 à 100 °C, en particulier à une température comprise de 10 à 40 °C, et notamment à une température environ égale à 20 °C.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation, ledit procédé étant dépourvu d'utilisation de solvant et/ou de tensioactif et/ou de réactif.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation, ledit procédé pouvant contenir une étape de purification.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation, ledit procédé étant dépourvu d'une étape de purification.

L'invention concerne également une gliadine portant des groupes hydrophobes ayant pour formule :

et/ou

et/ou

et/ou

dans laquelle

représente la protéine,

■ R représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :

° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH ₂ )i4-CH ₃ ou -(CH ₂ )i ₆ -CH ₃ , ° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et contenant au moins un double liaison C=C, notamment les groupes -(CH ₂ ) ₇ - CH=CH-CH ₂ -(CH ₂ )7-CH ₃ ou -(CH ₂ ) ₇ -CH=CH-(CH ₂ ) ₇ -CH ₃ .

L'invention concerne également des particules comprenant un complexe d'inclusion tel que défini précédemment, pour leur utilisation comme médicaments, notamment des médicaments ayant au moins une activité anti-tumorale, antidouleur, anti-inflammatoire, antibiotique, antifongique, antiparasitaire, enzymatique, hormonale, anxiolytique, antidiabétique, anti-hypertenseur, vaccinale, antivirale, analgésique, antiépileptique, anesthésique locale et générale, hypnotique, sédative, antipsychotique, neuroleptique, antidépresseur, anticholinergique, cholino mimétique, antimuscarinique, muscarinique, antiadrénergique, antiarythmique, antiarthritique, antiasthmatique, anticonvulsif, antihistaminique, anti-émétique, antinéoplasique, antipyrétique, antiprurigineuse, antispasmodique, vasodilatrice, stimulante du système nerveux central, décongestionnante, stimulante de la croissance osseuse, inhibitrice de la résorption osseuse, immunosuppresseur, relaxante musculaire, psychostimulante, tranquillisante, ou notamment des médicaments contenant des protéines, peptides ou leurs fragments, lesdites protéines, peptides ou fragments étant naturels, recombinants ou produits par voie chimique, acides nucléiques (ribonucléotides ou désoxyribonucléotides), notamment les molécules simples et double brin, les construits de gène, les vecteurs d'expression, molécules anti-sens et autres du même genre.

L'invention concerne aussi des particules, comprenant un complexe d'inclusion tel que défini précédemment, pour leur utilisation dans la préparation de médicaments ayant au moins une activité anti-tumorale, antidouleur, anti-inflammatoire, antibiotique, antifongique, antiparasitaire, enzymatique, hormonale, anxiolytique, antidiabétique, anti-hypertenseur, vaccinale, antivirale, analgésique, antiépileptique, anesthésique locale et générale, hypnotique, sédative, antipsychotique, neuroleptique, antidépresseur, anticholinergique, cholino mimétique, antimuscarinique, muscarinique, antiadrénergique, antiarythmique, antiarthritique, antiasthmatique, anticonvulsif, antihistaminique, anti-émétique, antinéoplasique, antipyrétique, antiprurigineuse, antispasmodique, vasodilatrice, stimulante du système nerveux central, décongestionnante, stimulante de la croissance osseuse, inhibitrice de la résorption osseuse, immunosuppresseur, relaxante musculaire, psychostimulante, tranquillisante, ou notamment des médicaments contenant des protéines, peptides ou leurs fragments, lesdites protéines, peptides ou fragments étant naturels, recombinants ou produits par voie chimique, acides nucléiques (ribonucléotides ou désoxyribonucléotides), notamment les molécules simples et double brin, les construits de gène, les vecteurs d'expression, molécules anti-sens et autres du même genre.

L'invention concerne égalementdes particules, comprenant un complexe d'inclusion tel que défini précédemment, pour leur utilisation comme médicaments vétérinaires, notamment des médicaments vétérinaires anti-tumoraux, antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques, antifongiques, antiparasitaires, enzymatiques, hormonaux, anxiolytiques, antidiabétiques, anti-hypertenseurs, vaccins, antiviraux, analgésiques, antiépileptiques, anesthésiques locaux et généraux, hypnotiques, sédatifs, antipsychotiques, neuroleptiques, antidépresseurs, anticholinergiques, cholinomimétiques, antimuscariniques, muscariniques, antiadrénergiques, antiarythmiques, antiarthritiques, antiasthmatiques, anticonvulsifs, antihistaminiques, anti-émétiques, antinéoplasiques, antipyrétiques, antiprurigineux, antispasmodiques, vasodilateurs, stimulants du système nerveux central, décongestionnants, stimulants de la croissance osseuse, inhibiteurs de la résorption osseuse, immunosuppresseurs, relaxants musculaire, psychostimulants, tranquillisants, ou notamment des médicaments contenant des protéines, peptides ou leurs fragments, lesdites protéines, peptides ou fragments étant naturels, recombinants ou produits par voie chimique, acides nucléiques (ribonucléotides ou désoxyribonucléotides), notamment les molécules simples et double brin, les construits de gène, les vecteurs d'expression, molécules anti-sens et autres du même genre.

L'invention concerne aussi l'utilisation des particules comprenant un complexe d'inclusion tel que défini précédemment comme agent-cosmétique, notamment comme agent anti-âge, dépigmentant, éclaircissant, dépigmentant, anti-cernes, anti-poches, apaisant, gommant, exfoliant, nourrissant, matifîant, régulateur de la sécrétion de sébum, astringent, purifiant, régénérant, restructurant, retexturisant, dermoprotecteur, anticellulite, raffermissant, amincissant, tenseur, tonifiant, tenseur immédiat, tonifiant immédiat, anti-pelliculaire, antiséborrhéique, anti-chute, démêlant, bouclant, fortifiant capillaire, restructurant, facteur de protection solaire, autobronzant, accélérateur de bronzage, prolongateur de bronzage, cicatrisant, anti-vergetures, anti-rougeurs, activateur du renouvellement cellulaire, hydratant, parfumant, désodorisant, anti-transpirant, nettoyant, colorant, conservateur.

L'invention concerne aussi l'utilisation de ces particules dans le maquillage.

L'invention concerne aussi l'utilisation des particules, comprenant un complexe d'inclusion tel que défini précédemment pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de dispositifs, notamment pansements cicatrisants, lesdits dispositifs comportant lesdites particules, et étant susceptibles de libérer lesdites particules ou une ou plusieurs substance(s) actives(s) d'intérêt contenue(s) dans lesdites particules.

L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un système d'encapsulation comportant une étape de mélange de particules contenant des complexes d'inclusion selon l'invention, avec une substance active d'intérêt utilisée pour ses propriétés dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, des dispositifs médicaux, cosmétique, vétérinaire, agroalimentaire, alimentation animale, agrochimie, des pesticides, des cosméto -textiles, de la parfumerie, environnemental, ou dans l'industrie des peintures, du bâtiment et/ou de l'automobile,

ladite substance active d'intérêt étant préalablement dissoute dans un milieu aqueux tel que l'eau pure, une solution aqueuse comprenant un ou plusieurs solutés, notamment un ou plusieurs sel(s) et/ou sucre(s), notamment le saccharose ou le glucose, une solution ou une suspension injectable ou une solution de sérum physiologiqueéventuellement enrichie de glucose, une émulsion, un gel, une crème, ou tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire,

ledit milieu aqueux contenant éventuellement un solvant choisi notamment parmi l'éthanol ou l'acétone, ou un tensio-actif choisi parmi les dérivés de polysorbates, notamment le Tween 80 ou le Tween 40, pour obtenir des particules contenant des complexes d'inclusion contenant ladite substance active d'intérêt.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un système d'encapsulation selon l'invention comporte une étape de mélange :

• d'une protéine comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente à la protéine par la fonction aminé et/ou la fonction carboxylique et/ou la fonction hydroxyle et/ou la fonction thiol,

ladite protéine étant choisie parmi l'élastine, le collagène, la gliadine, la gélatine, la kératine, l'albumine, la légumine, la viciline, la caséine, le fïbrinogène, l'insuline, la fibrinonectine, une hormone, une enzyme, un facteur de coagulation, la transferrine, la fïbrilline, une immunoglobuline, une protéine céréalière (blé, riz, ...), une protéine issue de graines ou des noix, une protéine issue d'algue, une protéine de soie, une protéine d'œuf, une protéine de pomme de terre, et les dérivés desdites protéines, et est notamment la gliadine ou la gélatine,

• d'une cyclodextrine désignée ci-dessus,

• d'une substance active d'intérêt utilisée pour ses propriétés dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, des dispositifs médicaux, cosmétique, vétérinaire, agroalimentaire, alimentation animale, agrochimie, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental, ou dans l'industrie des peintures, du bâtiment et/ou de l'automobile,

le pourcentage massique de ladite protéine, notamment la gliadine ou la gélatine, étant compris de 0,01% à 99,9%, notamment de 0,5% à 70%,

le pourcentage massique de la cyclodextrine étant compris de 0,01% à 99,9%, notamment de 0,5%> à 70%>,

le pourcentage massique du milieu aqueux étant compris de 0,01% à 99,9%, notamment de 70% à 99%,

le pourcentage massique du solvant étant compris de 0% à 99,9%, notamment 10% à

80%.

L'étape de mélange du procédé de préparation d'un système d'encapsulation comporte une étape de dissolution de la substance active d'intérêt en milieu aqueux, suivie de l'addition dans le milieu de la protéine et de Γα-cyclodextrine. Le mélange est placé sous agitation magnétique pendant 3 jours. Mais de façon pratique, il est possible de mélanger tous les composants en même temps.

Les particules peuvent être isolées :

- soit par sédimentation, soit par centrifugation s'il s'agit de microparticules (diamètre hydrodynamique supérieur au micromètre),

- soit par ultracentrifugation ou par des méthodes de séparations membranaires telles que l'ultrafiltration et la micro fîltration,s'il s'agit de nanoparticules (diamètre hydrodynamique inférieur au micromètre).

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1

La figure 1 représente le spectre IR caractéristique de la gélatine N-acylée par l'acide palmitique en comparaison avec celui de la gélatine native.

Figure 2

La figure 2 représente le spectre IR caractéristique de la gliadine N-acylée par l'acide palmitique en comparaison avec celui de la gliadine native.

Figure 3 La figure 3 représente la taille des particules formées à partir d'a-cyclodextrine et de gliadine greffée par l'acide palmitique (API) avec un degré de substitution (DS)de 0,22%.

Figure 4

La figure 4 représente la taille des particules formées à partir d'a-cyclodextrine et de gliadine greffée par l'acide palmitique (AP2)avec un degré de substitution (DS) de 0,69%.

Figure 5

La figure 5 représente les particules obtenues en solution avec la gélatine greffée par l'acide palmitique (API) avec un degré de substitution(DS) de 0,19%.

Figure 6

La figure 6 représente la taille des particules formées à partir d'a-cyclodextrine et de gélatine greffée par l'acide palmitique (APl)avec un degré de substitution (DS) de 0,19%.

Figure 7

La figure 7 représente les particules obtenues en solution avec la gélatine greffée par l'acide palmitique(AP2) avec un degré de substitution(DS) de 0,59%>.

Figure 8

La figure 8 représente la taille des particules formées à partir d'a-cyclodextrine et de gélatine greffée par l'acide palmitique (AP2) avec un degré de substitution(DS) de 0,59%>.

Figure 9

La figure 9 représente des images de particules de gélatine observées en microscopie à transmission électronique (Gélatine AP2DS 0,59 1/10 % m/m).

Figure 10

La figure 10 représente Γα-cyclodextrine. Dans la figure, les dimensions sont indiquées en Angstrôms.

EXEMPLES Signification des abréviations utilisées :

AP : acide palmitique

DS : degré de substitution

IR : Infrarouge

MET : microscopie électronique par transmission RMN : résonance magnétique nucléaire

Caractéristiques/types des appareils d'analyse utilisés : RMN : Tous les composés obtenus ont été analysés par RMN du carbone ¹³ C-RMNdu solide (10 kHz (Bruker-500 MHz spectrometer, Bruker Instrument Inc. Wissembourg, France). Les spectres sont réalisés à température ambiante.

Les spectres IR (ATR-FTIR, spectromètre FT/IR-4100, JASCO) : le principe consiste à mettre en contact un cristal (diamant) avec l'échantillon à analyser, avant d'être traversé par le faisceau infrarouge.

Mesures de taille des particules : Les tailles des particules ont été évaluées par le diamètre hydrodynamique. Les mesures des diamètres hydrodynamiques moyens des nanoparticules ont été réalisées avec un Zetasizer nanoséries Nano-ZS90 de la société Malvern instruments SA (Orsay, France) par diffusion quasi-élastique de la lumière. Les diamètres hydrodynamiques des microparticules ont été mesurés par un granulomètre laser (MasterSizer 2000) de la société Malvern instruments SA (Orsay, France).

La microscopie électronique par transmission (MET) a été utilisée pour observer les microparticules et nanoparticules à l'aide d'un microscope Philips EM208 et d'une caméra. Lyophilisation des protéines greffés par des groupements hydrophobes : Certainsdérivés de protéines synthétisés ont été lyophilisés en utilisant un lyophilisateur Alpha 1-2 (Avantec, France) pendant 24 heures après avoir congelé les solutions pendant au moins 12 heures.

Détails sur les produits utilisés : Tous les solvants : le formamide, l'éther diéthylique(diéthylether), l'éthanol, proviennent de VWR, France.

La gliadine de blé, la gélatine, le chlorure de palmitoyleetla pyridine anhydreont été fournis par Sigma- Aldrich Chemical Co, Saint Quentin Fallavier, France.

L'alpha-cyclodextrine provient de Cyclolab (Budabest, Hongrie). L'hydroxypropyl-β- cyclodextrine (ΗΡ-β-CD) a été fournie par Sigma-Aldrich Chemical Co, Saint quentin Fallavier, France. La gamma-cyclodextrine (γ-CD) a été obtenue auprès de Wacker-Chemie (Allemagne). Synthèse des protéines portant des groupes hydrophobes :

Exemple 1 : Synthèse et caractérisation de la gélatine V-acylée

La gélatine (1 g) a été dissoute dans 11 mL de formamide. Le mélange est chauffé à 90 °C sous agitation magnétique continue. Par la suite, 3 mL de pyridine anhydre et 1,2 mL de formamide contenant le chlorure de palmitoyle ont été additionnés à la solution. La quantité de chlorure de palmitoyle a été modifiée de façon à obtenir des degrés de substitution différents (1 g (DS 0,19), 3 g (DS 0,56) et 5 g (DS 1,70)). Les gélatines obtenues portent respectivement les codes : gélatine-APl, gélatine- AP2 et gélatine- AP3. Après 3 h à 90 °C et 10 minutes à température ambiante, le mélange est versé dans 100 mL d'éthanol. Le précipité a été collecté et lavé avec 200 mL d'éthanol puis avec 150 mL de diéthylether en utilisant une filtration de type Buchner. Le solide est lyophilisé pendant 24 h.

Les résultats sont présentés sur la figure 1 : après acylation, il est observé sur le spectre IR la présence de bandes à 1539 et 3275 cm ^"1 correspondant aux groupes NH de la liaison amide. La bande observée à 1650 cm ^"1 correspond aux groupes carbonyle de la fonction amide. Les bandes à 2915 cm ^"1 et 2848 cm ^"1 et 1470 cm ^"1 correspondent aux chaînes alkyles de l'acide gras.

Exemple 2 : Synthèse et caractérisation de la gliadine V-acylée

La gliadine (1 g) est dissoute dans 11 mL de solution d'éthanol à 70%. Le mélange est chauffé à 60 °C sous une agitation magnétique continue. Puis, 3 mL de pyridine et 1,2 mL de solution d'éthanol à 70 % contenant le chlorure de palmitoyle sont rajoutés à la solution précédente. La quantité de chlorure de palmitoyle est variée 1 g à 5 g pour obtenir des degrés de substitutions différents. Les gliadines obtenues portent les codes gliadine- API et gliadine- AP2 respectivement. Après 2 heures à 60 °C et 1 heure à température ambiante, le mélange est versé dans 100 mL d'éthanol préalablement refroidi. Le précipité est collecté et lavé avec 100 mL d'éthanol puis avec 100 mL de diéthyléther en utilisant le filtre de type Buchner. Le solide récolté est lyophilisé pendant 24 h.

Les résultats sont présentés sur la figure 2 : après acylation, il est observé sur le spectre IR la présence de bandes à 1540 et 3294 cm ^"1 correspondant aux groupements -NH de la fonction amide. La bande observée à 1650 cm ^"1 correspond aux groupes carbonyle de la fonction amide. Les bandes à 2972 cm ^"1 et 2884 cm ^"1 et 1473 cm ^"1 correspondent aux chaînes alkyles de l'acide gras. La bande à 1083 cm ^"1 correspond à la liaison C-C de la chaîne linéaire de l'acide palmitique.

Exemple 3 : Formation de microparticules et de nanoparticules à partir d'à cyclodextrine et de gliadines acylées

Les microparticules et nanoparticules ont été formées à partir d'a-cyclodextrine et de protéine greffée par l'acide palmitique. Le protocole consiste à peser Γ -cyclodextrine ainsi que la protéine acylée dans un petit flacon. Par la suite, l'eau distilléeest rajoutée au mélange. Le même résultat est obtenu quel que soit l'ordre d'addition des ingrédients. Une agitation magnétique ou orbitale pendant au maximum 3 jours est à l'origine de la formation des particules.

Différentes gliadines ont été utilisées :

■= La gliadine-APl DS 0,22

Les résultats sont présentés sur la figure 3.

^■ = La gliadine-AP2 DS 0,69

Les résultats sont présentés sur la figure 4.

Exemple 4 : Formation de microparticules et de nanoparticules à partir d'à cyclodextrine et de gélatine acylée Les microparticules et nanoparticules ont été formées à partir d'a-cyclodextrine et de protéine greffée par l'acide palmitique. Le protocole consiste à peser Γ -cyclodextrine ainsi que la protéine acylée dans un petit flacon. Par la suite, l'eau distilléeest rajoutée au mélange. Le même résultat est obtenu quel que soit l'ordre d'addition des ingrédients. Une agitation magnétique ou orbitale pendant au maximum 3 jours est à l'origine de la formation des particules.

Différentes gélatines ont été utilisées :

■= La gélatine- AP1DS 0, 19

Les résultats sont présentés sur la figure 5 et sur la figure 6.

^■ = La gélatine-AP2 DS 0,59 %

Les résultats sont présentés sur la figure 7, la figure 8 et la figure 9.

Exemple comparatif 5 : Expériences effectuées en faisant interagir les protéines amphiphiles avec les dérivés de béta-cyclodextrine (β-CD)

En présence de β-cyclodextrine, aucune particule ne se forme.

En présence de β-cyclodextrine, aucune particule ne se forme.

Exemple comparatif 6 : Expériences effectuées en faisant interagir les protéines amphiphiles avec les dérivés de gamma-cyclodextrine (γ-CD)

En présence de γ-cyclodextrine, aucune particule ne se forme.