Trennung co-kultivierter Zellpopulationen

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Trennung co-kultivierter Zellpopulationen.

Co-Kultivierung ist für verschiedene biologische Systeme (Ge- webe-/Zellarten) möglich. Insbesondere werden oft tierische und humane embryonale Stammzellen primär auf einem Feederzel- len-Monolayer kultiviert, wobei die Feederzellen Wachstumsfaktoren liefern.

Das Hauptinteresse der Forschung an embryonalen Stammzellen gilt der Differenzierung in spezialisierte Zellen, um diese für mögliche Zellersatztherapien verfügbar zu machen. Zur Züchtung von Stammzellen werden beispielsweise Feederzellen eingesetzt. Zellen eines Embryos werden dissoziiert und als Monolayer kultiviert. Die heterogene Zellpopulation kann durch Bestrahlung oder Mitomycinbehandlung inaktiviert werden, so- dass die Zellen sich nicht mehr teilen können. Die Feederzellen sind jedoch metabolisch noch aktiv. Die Proliferation embryonaler Stammzellen ist von Substanzen abhängig, die von Feederzellen in das Medium abgegeben werden. Um Stammzellen zu differenzieren, wird die Gesamtkultur, inklusive der Feederzellen, von der verwendeten Kultivierungsplatte entfernt. In Suspensionskulturen können sich die Stammzellen zunächst in den so genannten hängenden Tropfen zu „Embryoid Bodies" entwickeln. Diese „Embryoid Bodies" sind eine Mischkultur aus Stammzellen und Feederzellen. Auch in den nächsten Differenzierungsschritten, in denen die Embryoid Bodies durch Zusatz spezifischer Botenstoffe in unterschiedliche Zelltypen diffe-

renziert werden, sind die Kulturen durch Feederzellen kontaminiert. Da sich die Stammzellen in den frühen Differenzierungsphasen teilen, die Federzellen aber inaktiviert wurden, verändert sich das quantitative Verhältnis des Stammzellen- und Feederzellenanteils. Im Falle der Co-Kultivierung mit Feederzellen liegen die Stammzellen also nicht rein, sondern in Mischung mit Feederzellen vor. Die Feederzellenkontamination ist auch in geringem Ausmaß in differenzierten Zellpopulationen nachzuweisen . Dies ist vor allem für regenerative Zellersatztherapien problematisch, da die Feederzellen zusammen mit den Stammzellen in entsprechende Organe transplantiert werden. Die Wirkung der heterogenen Feederzellenpopulation im transplan- tierten Organ ist nicht beschrieben. Es konnte allerdings in Untersuchungen gezeigt werden, dass die Feederzellen die Funktion differenzierter Stammzellen modulieren und dass trans- plantierte Feederzellen, auch einige Wochen nach Transplantation im entsprechenden Organ nachzuweisen waren. Aus diesem Grund ist eine vollständige Trennung von Stammzellen und Feederzellen zu einem frühen Zeitpunkt unabdingbar.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, co-kultivierte Zellpopulationen zu trennen.

Die Aufgabe wird durch die Verwendung einer Vorrichtung zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und mit einem Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen mit den Merkmalen des Anspruchs 5 gelöst. Die Unteransprüche enthalten zweckmäßige bzw. vorteilhafte Ausführungsformen und Merkmale des Verfahrens bzw. der Verwendung.

Erfindungsgemäß wird zur Trennung mindestens zweier co- kultivierter Zellpopulationen eine Vorrichtung verwendet, welche eine Mikroskopeinheit (1) zur mikroskopischen Abtastung der Zellkultur (8), welche mindestens zwei co-kultivierte

Zellpopulationen aufweist, in Kombination mit einer Bilderfassungseinheit (2) und einer Bildauswerteeinheit (3) zur Positi- onsdetektierung der Zellen in der Zellkultur (8), eine Steuer- und Speichereinheit (4) zum Speichern der detektierten Position der Zellen und ein Erntemodul (5) mit einem Entnahmewerkzeug (10a) zur Entnahme der Zellen an der detektierten Position der Zelle, umfasst.

Die Vorrichtung, welche erfindungsgemäß zum Einsatz kommt, ist detailliert in der internationalen Anmeldung PCT/EP2007/059951 beschrieben. Alle in der PCT/EP2007/059951 offenbarten technischen Merkmale gehören zur Lehre der vorliegenden Erfindung.

Im Rahmen der Trennung verschiedener co-kultivierter Zellpopulationen sind diverse Kombinationen von Zellpopulationen möglich. Insbesondere können mindestens zwei co-kultivierte Zellpopulationen getrennt werden, welche Feederzellen- und Stammzellenpopulationen umfassen. Da die Aspirationsbedingungen den Kultivierungsbedingungen angepasst werden können, kann die Methodik auch auf die Trennung anderer co-kultivierter Zellpopulationen angewendet werden. Weitere Ausführungsformen betreffen die Verwendung zur Trennung von Endothelzellenpopulationen und Populationen von Zellen der glatten Muskulatur sowie zur Trennung von Endothelzellen- und Leberzellenpopulationen.

Es konnte gezeigt werden, dass eine reproduzierbare und vollständige Trennung von Feeder- und Stammzellen erreicht werden kann und dass diese Methode der Stammzellenaufreinigung die Pluripotenz der Stammzellen in keiner Weise beeinflusst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen umfasst das Ausführen eines ersten Detektionsschritts zum Auswählen von Zellen einer ersten Zellpopulation anhand von physischen und/oder physikali-

sehen Parametern und das Erfassen von Positionsdaten und Speichern der erfassten Positionsdaten der ausgewählten Zellen in einer Positionsdatenbank. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

- Ausführung mindestens eines zweiten Detektions- schritts zur Erkennung mindestens eines weiteren Parameters der Zellen der ersten Zellpopulation,

- Erstellen von Vergleichsdaten aus den Daten des ersten und zweiten Detektionsschritts und Zuordnen der Vergleichsdaten zu den Positionsdaten,

- Auswählen von Zellen anhand der Vergleichsdaten und - übergeben der mit den Vergleichsdaten verknüpften

Positionsdaten aus der Positionsdatenbank an eine Ernteeinheit .

Das Verfahren entspricht dem Verfahren, welches in der internationalen Anmeldung PCT/EP2007/059951 beschrieben wurde. Alle in der PCT/EP2007/059951 offenbarten Verfahrensbesonderheiten gehören zur Lehre der vorliegenden Erfindung.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen Feederzellen- und Stammzellenpopulationen umfassen. Ebenso ist es bevorzugt, das Verfahren zur Trennung von Endothelzellenpopulationen und Populationen von Zellen der glatten Muskulatur sowie zur Trennung von Endothelzellen- und Leberzellenpopulationen einzusetzen.

Zur Züchtung von Stammzellen werden beispielsweise Feederzellen aus 13,5 Tage alten Mausembryonen gewonnen. Den Embryonen werden Organe und Kopf entfernt. Die Zellen des Restembryos werden dissoziiert und als Monolayer kultiviert. Die heterogene Zellpopulation wird durch Bestrahlung oder Mitomycinbehand-

lung inaktiviert, sodass die Zellen sich nicht mehr teilen können, wobei die Feederzellen aber metabolisch aktiv bleiben. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen umfasst die Auswahl von Zellen einer ersten Zellpopulation anhand von physischen und/oder physikalischen Parametern. Wie beispielsweise mittels Lichtmikroskopie erkennbar ist, weisen Feederzellen und Stammzellen unterschiedliche Strukturen bzw. Formen auf (vgl. Abbildung 1) . In der Lichtmikroskopie ist deutlich zu erkennen, dass Stammzellen als fast runde Kolonien auf dem Monolayer der lang gestreckten Feederzellen wachsen. Entsprechend ist bei Verwendung der Vorrichtung aus PCT/EP2007/059951 überraschenderweise die Trennung der verschiedenen Zellpopulationen möglich.

Das Verwendung der Vorrichtung nach PCT/EP2007/059951 sowie das Verfahren sollen nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiele

Beispiel 1

Trennung von Stamm- und Feederzellen

Stammzellen (D3) wurden für 5-8 Tage auf Neomycin resistenten Federzellen kultiviert. Stammzellen einzelner Kolonien wurden mit dem „Tool for non-floating cells" (Glaskapillare) unter standardisierten Bedingungen (Saugdruck, Flüssigkeitsmenge) aspiriert. Mit der Vorrichtung nach PCT/EP2007/059951 war es möglich, Stammzellen, die von verschiedenen Kolonien innerhalb einer Petrischale gepickt wurden, individuell in spezifischen Wells zu transportieren, so dass einzelne Klone untersucht werden konnten. Der Feederzellenmonolayer wurde mit dem Neomy- cin-Resistenzgen transfiziert . Dieses Gen wird nicht in der Stammzelllinie D3 exprimiert. Nach der erfolgreichen Trennung der Zellpopulationen sollte das Neomycin-Resitenzgen entsprechend nicht in den aspirierten Stammzellklonen nachzuweisen sein. Die Trennung von Stamm- und Feederzellen ist in den Abbildungen 2A bis 2E dargestellt. Diese Abbildungen zeigen die wiederholte Aspiration von Stammzellen einer Kolonie (mikroskopische Analyse) . Eine Expressionsanalyse (RT-PCR) des in Feederzellen exprimierten Neomycin-Gens ist in Abbildung 3 zu sehen. Die mikroskopische Analyse und die daran anschließende Expressionsanalyse verdeutlichen, dass die Aspiration der Stammzellen mehrmals wiederholt werden konnte, bevor die Federzellen des Monolayers mit aspiriert wurden. Erst nach der fünften Wiederholung wurden auch Feederzellen aspiriert. Der Nachweis erfolgte anhand der Expression des Neomycin-Gens in Spur E des elektrophoretisch aufgetrennten Agarosegels.

Be i spie l 2

Nachweis der funktionellen Integrität der Stammzellen nach Aufreinigung (Trennung von Feederzellen)

Embryonale Stammzellen sind pluripotent, d.h. sie können in vitro in unterschiedliche Zelltypen differenziert werden. Um nachzuweisen, dass die frühe Trennung der embryonalen Stammzellen von den Feederzellen die Fähigkeit der Stammzellen zur Differenzierung in spezifische Zelltypen nicht attenuiert, wurden das Differenzierungspotential von Feeder-freien Stammzellen und Stammzellen, die nach dem Standardverfahren, also mit Feederzellen kultiviert wurden, anhand der neuronalen Differenzierung verglichen. Die neuronale Differenzierung wurde anhand morphologischer Kriterien, aber auch anhand der Expression von Markern, die in den verschiedenen Phasen der neuronalen Differenzierung exprimiert werden, analysiert. Es konnten zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede im Differenzierungspotential der Feeder-freien und der nach Standard- Protokoll differenzierten Stammzellen gefunden werden (vgl. Abbildung 3) . Es konnte gezeigt werden, dass eine reproduzierbare und vollständige Trennung von Feeder- und Stammzellen erreicht werden kann und dass diese Methode der Stammzellenauf- reinigung die Pluripotenz der Stammzellen in keiner Weise be- einflusst (vgl. Abbildung 4) .

Beschreibung der Abbildungen/Figuren

Abb. 1: Lichtmikroskop-Aufnahme von Stamm- und

Feederzellen (Stammzellen, die auf Feederzellen kultiviert wurden)

Abb. 2A bis 2E: wiederholte Aspiration von Stammzellen einer Kolonie (mikroskopische Analyse)

Abb. 3: Expressionsanalyse (RT-PCR) des in

Feederzellen exprimierten Neomycin- Gens

Abb. 4: Nachweis des Differenzierungspotentials (Vergleich Feeder-freier und nach Standard-Protokoll differenzierter Stammzellen)

Abb. 5: Vorrichtung nach PCT/EP2007/059951 in einer beispielhaften Ausführungsform

Bezugszeichenliste

1 Mikroskopeinheit

Ia Umlenkprisma

Ib Linsensystem

2 Bildaufnahmeeinheit

3 PC

3a Bildauswerteeinheit

4 Steuer- und Speichereinheit

4a Monitor, Display

5 Erntemodul

5a Hubsäule

5b Verfahrantrieb

6 Beleuchtung

7 Beleuchtungsfilter

8 Zellkultur

9 xy-Tisch

10 Werkzeugkopf

10a Entnahmewerkzeug

11 Vereinzelungsbatterie