Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
SEPARATION OF SUBSTANCE MIXTURES USING POLYSACCHARIDES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1999/038594
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for separating substance mixtures by chromatography using spherical microparticles consisting of chemically and physically unmodified, water-insoluble, linear polysaccharides.

Inventors:
Bengs, Holger (Bindingstrasse 3 Frankfurt am Main, D-60598, DE)
Schneller, Arnold (Berliner Strasse 37 Messel, D-64409, DE)
Böhm, Gitte (Im Burgfeld 243 Frankfurt am Main, D-60439, DE)
Andert, Doris (Konrad-Adenauer-Ring 39 Rüsselsheim, D-65428, DE)
Application Number:
PCT/EP1999/000473
Publication Date:
August 05, 1999
Filing Date:
January 26, 1999
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
AVENTIS RESEARCH & TECHNOLOGIES GMBH & CO. KG (Frankfurt am Main, D-65926, DE)
Bengs, Holger (Bindingstrasse 3 Frankfurt am Main, D-60598, DE)
Schneller, Arnold (Berliner Strasse 37 Messel, D-64409, DE)
Böhm, Gitte (Im Burgfeld 243 Frankfurt am Main, D-60439, DE)
Andert, Doris (Konrad-Adenauer-Ring 39 Rüsselsheim, D-65428, DE)
International Classes:
B01J20/281; B01D15/08; B01J20/24; B01J20/26; C07B57/00; C07B63/00; C07C29/76; C07C37/82; G01N30/88; G01N30/90; (IPC1-7): B01D15/08; G01N30/48; B01J20/22
Domestic Patent References:
WO1995005879A11995-03-02
WO1997038018A11997-10-16
Foreign References:
EP0377046A11990-07-11
Other References:
See also references of EP 1071499A1
Download PDF:
Claims:
Patentansprüche
1. Verfahren zur chromatographischen Trennung von Stoffgemischen unter Einsatz von sphärischen Mikropartikeln aus chemisch und physikalisch unmodifizierten, wasserunlöslichen, linearen Polysacchariden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennungen säulenchromatographisch durchgeführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennungen mit Hilfe von HPLC (Hochleistungs (oder) Hochdruckflüssigkeitschromatographie) durchgeführt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennungen dünnschichtchromatographisch durchgeführt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da# die Trennung mit Hilfe der GelPermeationsChromatographie durchgeführt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoffgemische Stereoisomere sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoffgemische Enantiomere sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel einen Durchmesser von 10 nm bis 100 um aufweisen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel einen Durchmesser von 1 um bis 5 pm aufweisen.
Description:
Beschreibung Trennung von Stoffgemischen unter Einsatz von Polysacchariden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Stoffgemischen, insbesondere Enantiomeren, unter Einsatz von sphärischen Mikropartikeln aus chemisch und physikalisch unmodifizierten, wasserunlöslichen, linearen Polysacchariden als Trennmaterial.

Die Chromatographie ist eine effektive Methode zur vollständigen Trennung von Komponenten einer Mischung, insbesondere zur Auftrennung von Mischungen ähn- licher Verbindungen, z. B. von Stereoisomeren. Aufgrund des steigenden Interesses an reinen Enantiomeren für pharmazeutisch und biochemisch wirksame Substanzen und Pflanzenschutzmittel ist die chromatographische Trennung enantiomerer Ver- bindungen von besonderem Interesse. Für die Aufreinigung dieser Verbindungen werden ständig verbesserte Verfahren entwickelt und bessere Trennmaterialien gesucht, insbesondere auf der Basis der Polysaccharide Cellulose und Stärke, zwei leicht zugänglichen und kostengünstigen Polymeren mit chiralen Atomen.

So schildert der Artikel Chromatographie 65, LaborPraxis, 730-738 (1990) die Ver- wendung von mikrokristalliner Tribenzoylcellulose mit Korngrößen von 10 bis 20 um im Vergleich zu Triacetylcellulose als Sorbens für die Enantiomerentrennung in der Chromatographie. Beide Substanzen können für analytische und präparative Tren- nungen verwendet werden. Sie sind durch Derivatisierung von Cellulose zuganglich.

Unmodifizierte Polymere kommen nicht zum Einsatz. Die Einführung kleinerer Korn- größen bis zu 5 pm, um Totvolumina und eine im Verlauf des Betriebs auftretende Verdichtung der Saule zu vermeiden, wird als wünschenswert beschrieben.

WO 95/05879 behandelt ebenfalls die Trennung von Enantiomeren durch Flüssigkeitschromatographie. Besondere Aufmerksamkeit wird hier der mobilen Phase zur Verbesserung der Trennleistung gewidmet. Als stationäre Phase werden Carbamat-Derivate von Cellulose und Amylose und Ester-Derivate von Cellulose verwendet.

DE-A-43 17 139 beschreibt ein spezielles Verfahren zur Enantiomerentrennung von Inhalationsanästhetika mittels präparativer Gaschromatographie. Als stationäre Phase werden mit Estergruppierungen derivatisierte Cyclodextrine in Polysiloxan- 16sung auf porösem Trägermaterial (Chromosorb) verwendet. Um geeignetes Trenn- material zu erhalten, müssen die Cyclodextrine chemisch modifiziert, in Polysiloxan gelost und auf einem geeigneten Trägermaterial fixiert werden.

In US 5,403,898 werden Cyclodextrinderivate enthaltende polymere Siloxane als chirale stationäre Phase in der analytischen und präparativen Gaschromatographie (GC), Chromatoraphie (LC) eingesetzt. Diese Peralkyl-Cyclodextrine werden chemisch an die Polysiloxane gebunden. Das verwendete Material wird also durch chemische Modifizierung der Cyclodextrine und anschließende chemische Fixierung an Polysiloxane erhalten.

In US 5,302,633 wird, um eine Unlöslichkeit der chiralen stationäre Phase zu erreichen, ein Vinyiderivat eines Polysaccarids (z. B. Cellulose) auf der Oberfläche eines porösen Tragers (z. B. Kieselgel) erst adsorbiert, dann polymerisiert. Eine zweite Variante ist die Copolymerisation eines Vinylgruppen enthaltenden porösen Trägers (z. B. modifiziertes Kieselgel) mit einem Vinylderivat eines Polysaccharids.

Auch hier sind chemische Modifizierungen notwendig, um geeignetes Trennmaterial zu erhalten.

EP-B-0 157 365 beschreibt stationäre Phasen zur Enantiomeren-und Isomeren- trennung und für die Gelpermeationschromatographie auf der Basis von Poly- saccharid-Carbamat-Derivaten. Als Polysaccharide sind Cellulose, Amylose, Chitosan, Xylan, Dextran und Inulin geeignet. Hierbei kann das hergestellte Pulver mit einem Partikeldurchmesser von 1 um bis 300 um direkt oder nach physikalischer oder chemischer Fixierung auf einem porösen Träger eingesetzt werden. Es ist also eine chemische Modifizierung notwendig, um geeignetes Trennmaterial zu erhalten.

In DE-C 26 55 292 und DE-C 25 55 361 werden poröse Gele aus Dextranderivaten als Trennungsmedien in elektrophoretischen Trennungsmaterialien eingesetzt. Um eine Unlöslichkeit zu erzielen, müssen vinylgruppenhaltige Dextranderivate durch radikalische Polymerisation vernetzt werden.

Es sind also bereits zahireiche Polysaccharide bekannt, die in chromatographischen Trennverfahren eingesetzt werden. Diese müssen jedoch immer, um eine gute Trennleistung, Korngrößenverteilung, Lösungsmittelstabilität und-resistenz zu erzielen, chemisch und/oder physikalisch modifiziert werden. Dies ist immer mit einer Erhöhung der Kosten verbunden.

Unter chemischen und/oder physikalischen Modifizierungen sind insbesondere Derivatisierungen durch die Einführung spezieller Gruppen, kovalente Fixierungen auf einem Trägermaterial sowie nachträgliche chemische und/oder physikalische Vernetzungen zu verstehen.

Aufgabe der Erfindung ist daher eine Vereinfachung und Verbilligung des Chro- matographieverfahrens durch Umgehung von chemischen und physikalischen Modi- fizierungen des eingesetzten Trennmaterials.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur chromatographischen Trennung von Stoffgemischen unter Einsatz von sphärischen Mikropartikeln aus chemisch und physikalisch unmodifizierten, wasserunlöslichen, linearen Polysacchariden (nachstehend erfindungsgemäßes Trennmaterial genannt) als Trennmaterial gelöst.

Unter sphärischen Mikropartikeln sind Mikropartikel, die annähernd Kugelform besitzen, zu verstehen. Bei Beschreibung einer Kugel durch von einem gemein- samen Ursprung ausgehende, in den Raum gerichtete Achsen gleicher Länge, die den Radius der Kugel in allen Raumrichtungen definieren, ist für die sphärischen Mikropartikel eine Abweichung der Achsenlängen von 1% bis 40% möglich.

Bevorzugt werden sphärische Mikropartikel mit Abweichungen bis 25 %, besonders bevorzugt bis 15 % erhalten. Die Oberfläche der sphärischen Mikropartikel kann makroskopisch mit der einer Himbeere verglichen werden, wobei die Tiefe der "Eindellungen"oder"Einschnitte"maximal 20 % des mittleren Durchmessers der sphärischen Mikropartikel betragen soll. Die Figuren 1 bis 4 zeigen Rasterelektronenmikroskopaufnahmen (REM) (Camscan S-4) der verwendeten sphärischen Mikropartikel.

Durch die Umgehung von chemischen und physikalischen Modifizierungen der linearen Polysaccharide können zusätzlich kostenintensive Verfahrensschritte vermieden und dadurch die Wirtschaftlichkeit des Chromatographieverfahrens erhöht werden. Ein weiterer Vorteil ist die sehr gute Reproduzierbarkeit des Chromatographie-Prozesses.

Unter physikalischen Modifikationen sind nicht die üblichen Aufarbeitungsschritte wie Rühren, Zentrifugieren, Aufschlämmen usw. zu verstehen.

Lineare Polysaccharide gemäß der vorliegenden Erfindung können Polyglucane oder andere lineare Polysaccharide wie Pullulane, Pektine, Mannane oder Polyfructane sein. Besonders bevorzugt ist jedoch Poly- (1, 4-a-D-glucan).

Das erfindungsgemäße Trennmaterial kann zur chromatographischen Trennung von Substanzgemischen, besonders bevorzugt Stereoisomeren, ganz besonders bevorzugt Enantiomeren eingesetzt werden. Daher ist besonders der Einsatz des erfindungsgemäßen Trennmaterials in der präparativen und analytischen Chromatographie wie Gaschromatographie, präparativer und analytischer Dünnschichtchromatographie und besonders High Performance Liquid Chromatography (HPLC), von Interesse. Weiterhin ist die Verwendung des erfindungsgemäße Trennmaterials in der Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) bei der Auftrennung von Polymeren verschiedener Molekulargewichte von lnteresse.

Eine Anwendung, die ebenfalls in den Bereich der Erfindung fallut, ist die Abtrennung von Substanzen aus Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen durch spezifische oder unspezifische Wechselwirkungen mit niedermolekularen oder polymeren Verbindungen. Aber auch ionische Verbindungen, insbesondere Metallkationen, sind von Interesse für die Anwendung. Spezielle Effekte sind insbesondere aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu Polysacchariden bei der Abtrennung von Monosacchariden, Disacchariden und Oligosacchariden erzielbar.

Auch aus Gründen der Biokompatibilität des erfindungsgemäßen Trennmaterials ist ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung die Behandlung von Wasser, insbesondere Abwasser, die Analyse von biologischem Material, insbesondere Blut und Seren, oder beispielsweise die Auftrennung bzw. Abtrennung von Erbgutmaterial (Nukleinsäuren) oder anderen biogenen Verbindungen (z. B. Oligonucleotide, Peptide, Proteine).

Unter Chromatographie versteht man im Sinne der Erfindung physikalische Trennverfahren, bei denen die Stofftrennung durch Verteilung und/oder Adsorption zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erfolgt. Im Rahmen dieser Erfindung wird das erfindungsgemäße Trennmaterial, vorzugsweise Poly (1,4-alpha- D-Glucan), als stationäre Phase verwendet und mit einer flüssigen und/oder gasförmigen mobilen Phase kombiniert. Als besondere Ausführungsformen sind daher zu sehen : HPLC, GPC, GC, DC und weitere oder etwaige Spezifikationen chromatographischer Verfahren oder chromatogrphieähnlicher Verfahren. Prinzipiell ist jedes chromatographisches Verfahren der Erfindung zugänglich.

Unter HPLC (High Performance (oder) High Pressure Liquid Chromatography) ist die Hochleistungs- (oder) Hochdruckflüssigkeitschromatographie zu verstehen. Man arbeitet bei der HPLC mit sehr feinem Material (3-10 pm), da die Trennleistung einer Säule mit abnehmender Korngröße der stationären Phase zunimmt. Die Feinteilig- keit der Trennmaterialien erfordert hohe Drucke (bis zu 400 bar).

Bei der Gel-Permeations-Chromatographie (GPC), auch Ausschlußchromatographie, die auch als HPLC betrieben werden kann, besteht die stationäre Phase aus Perlen mit einem heteroporösen gequollenen Netzwerk, dessen Porengrößenverteilung über mehrere Größenordnungen variiert, so daß die Fraktionierung nach Molekulargröße erfolgt, was die rasche Bestimmung der molekularen Größenverteilung von Polymeren gestattet.

Die Gaschromatographie (GC) dient zur Trennung von Stoffgemischen, die gas- förmig vorliegen oder sich unzersetzt verdampfen lassen, wobei als mobile Phase ein Gas dient. Die gaschromatographische Analyse beginnt mit dem Aufbringen eines Gases, einer verdampfbaren Flüssigkeit oder eines verdampfbaren Fest- stoffes auf die thermostatisierte Trennsäule. Mit Hilfe des Trägergases (He, N2 oder H2) werden die Substanzen durch die Saule transportiert, wo die chromato- graphische Trennung stattfindet.

Bei der Dünnschichtchromatographie (DC) handelt es sich um ein chromatographisches Verfahren mit einem mehrstufigen Verteilungsprozeß, wobei die stationäre Phase (das Trennmaterial wird hier Sorptionsmittel genannt) als donne Schicht auf einem geeigneten Träger beispielsweise Glas, Polyester od.

Aluminium befindet. An dieser Schicht erfolgt die Trennung durch Elution mit dem Laufmittel (mobile Phase).

Ein Gegenstand der Erfindung ist daher das erfindungsgemäße Trennmaterial als solches enthaltend sphärischen Mikropartikeln aus chemisch und physikalisch unmodifizierten, wasserunlöslichen, linearen Polysacchariden und ggf. weitere Hilf-, Zusatz und Trägerstoffe.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist der Einsatz des erfindungsgemäßen Trennmaterials und ggf. weitere Hilf-, Zusatzstoffe zur Abtrennung oder Rückhaltung von Stoffen im Sinne eines Filtermittels oder Adsorbens (Vgl. Beispiel 12).

Lineare Polysaccharide sind Polysaccharide, die aus Monosacchariden, Disac- chariden oder anderen monomeren Bausteinen derart aufgebaut sind, daß die Monosaccharide, Disaccharide oder anderen monomeren Bausteinen stets in der gleichen Art miteinander verknüpft sind. Jede derart definierte Grundeinheit oder Baustein hat genau zwei Verknüpfungen, jeweils eine zu einem anderen Monomer.

Davon sind die beiden Grundeinheiten ausgenommen, die den Anfang und das Ende des Polysaccharids bilden. Diese Grundeinheiten haben nur eine Verknüpfung zu einem weiteren Monomer. Bei drei Verknüpfungen (kovalente Bindungen) spricht man von einer Verzweigung. Verzweigungen treten nicht oder nur in untergeordnetem Maß auf, so daß sie bei sehr kleinen Verzweigungsanteilen den herkömmlichen analytischen Methoden nicht zugänglich sind.

Beispiele für bevorzugte wasserunlösliche lineare Polysaccharide sind lineare Poly- D-glucane, wobei die Art der Verknüpfung unwesentlich ist, solange Linearität im Sinne der Erfindung vorliegt. Beispiele sind Poly (1,4-alpha-D-Glucan) und Poly (1,3- beta-D-Glucan), wobei Poly (1,4-alpha-D-Glucan) besonders bevorzugt ist.

Besitzt die Grundeinheit drei oder mehr Verknüpfungen, wird von Verzweigung gesprochen. Dabei ergibt sich aus der Anzahl der Hydroxylgruppen pro 100 Grundeinheit, die nicht am Aufbau des linearen Polymerrückgrats beteiligt sind und die Verzweigungen ausbilden, der sogenannte Verzweigungsgrad.

Erfindungsgemäß weisen die linearen wasserunlöslichen Polysaccharide einen Verzweigungsgrad von weniger als 8 % auf, d. h. sie haben weniger als 8 Verzweigungen auf 100 Grundeinheiten. Vorzugsweise ist der Verzweigungsgrad kleiner 4 % und insbesondere maximal 1,5 %.

Ist das wasserun ! ösliche lineare Polysaccharid ein Polyglucan, z. B. Poly- (1, 4-alpha- D-Glucan), ist der Verzweigungsgrad in 6-Position kleiner 4 %, vorzugsweise maximal 2 % und insbesondere maximal 0,5 % und der Verzweigungsgrad in den anderen nicht an der linearen Verknüpfung beteiligten Positionen, z. B. der 2-bzw. 3- Position im Fall des bevorzugten Poly- (1, 4-alpha-D-Glucans), ist vorzugsweise jeweils maximal 2 % und insbesondere maximal 1 %.

Besonders bevorzugt sind Polysaccharide, insbesondere Poly-alpha-D-Glucane, die keine Verzweigungen aufweisen, bzw. deren Verzweigungsgrad so minimal ist, daß er mit herkömmlichen Methoden nicht mehr nachweisbar ist.

Erfindungsgemäß beziehen die Prafixe"alpha","beta"oder"D"allein auf die Verknüpfungen, die das Polymerrückgrat ausbilden und nicht auf die Verzweigungen.

Unter naturidentischen Polysacchariden sind dabei Polymere zu verstehen, die entweder so in der Natur nicht auftreten oder aber nur in einer Mischung mit anderen Verbindungen, die auch andere Polymere sein können. Die Herstellung solcher naturidentischen Polymere ist durch Verfahren möglich, die unter den im breitesten Sinn zu definierenden Begriff der bio-und gentechnologischen Verfahren fallen. Darunter sind einerseits biotechnische Verfahren oder Prozesse zu ver- stehen, wie sei weiter unten definiert werden, aber auch solche, die durch die Verwendung und Modifikation von zum Beispiel Bakterien, Pilzen oder Algen zu entsprechenden Verbindungen führen. Andererseits fallen unter den Begriff aber auch zum Beispiel Polysaccharide, die dadurch zu gewinnen sind, daß bio-oder gentechnische Verfahren auf höhere Pflanzen angewendet werden, so daß eine Separation aus der Pflanze erfolgen kann. Zu solchen Pflanzen gehören insbeson- dere die Kartoffel, Mais, Getreidearten, Maniok, Reis und Erbsen. Aber auch andere Pflanzen, die Polysaccharide produzieren sind unter dem erfindungsgemäßen Aspekt in diese Kategorie einzuordnen.

Im Rahmen der Erfindung werden bevorzugt lineare, wasserunlösliche Polysaccha- ride verwendet, welche in einem biotechnischen, insbesondere einem biokataly- tischen auch biotransformatorischen oder einem fermentativen Prozeß hergestellt werden. Unter biotechnische Prozesse fallen sämtliche biokatalytischen, (= biotransformatorischen Verfahren, also Verfahren, die nur mit Enzymen oder in der Kombination mit Organismen, die intra-oder extrazellulär Proteine bilden, die diese Aufgabe übernehmen, durchgeführt werden können) oder fermentative Verfahren, die mit in der Natur vorkommenden oder rekombinanten Organismen durchgeführt werden können.

Lineare Polysaccharide hergestellt durch Biokatalyse (auch : Biotransformation) im Rahmen dieser Erfindung bedeutet, daß das lineare Polysaccharid durch kataly- tische Reaktion von monomeren Grundbausteinen wie oiigomeren Sacchariden, z. B. von Mono-und/oder Disacchariden, hergestellt wird, indem ein sogenannter Bio- katalysator, üblicherweise ein Enzym, unter geeigneten Bedingungen zum Einsatz für die Umsetzung genutzt wird.

Lineare Polysaccharide aus Fermentationen sind im Sprachgebrauch der Erfindung lineare Polysaccharide, die durch fermentative Prozesse unter der Verwendung in der Natur vorkommender Organismen, wie zum Beispiel Pilze, Algen oder Bakterien oder unter der Verwendung von in der Natur nicht vorkommenden Organismen, aber unter Zuhilfenahme von gentechnischen Methoden aligemeiner Definition modifi- zierten natürlichen Organismen, wie zum Beispiel Pilze, Algen oder Bakterien gewonnen werden können.

Darüber hinaus können lineare Polysaccharide zum Erzielen der in der vorliegen- den Erfindung beschriebenen Effekte auch dadurch erhalten werden, daß nicht- lineare Polysaccharide, die Verzweigungen enthalten, derart mit einem oder mehr- eren Enzymen behandelt werden, daß die Verzweigungen vom Rückgrat des Poly- saccharids abgespalten werden, so daß nach ihrer Abtrennung lineare Polysac- charide vorliegen. Bei diesen Enzymen handelt es sich beispielsweise um Amy- lasen, iso-Amylasen, Pullulanasen oder auch Gluconohydrolasen.

Unter dem Begriff"wasserunlösliche Polysaccharide"werden für die vorliegende Erfindung Verbindungen verstanden, die nach der Definition des Deutschen Arzneimittelbuches (DAB = Deutsches Arzneimittelbuch, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Govi-Verlag, Frankfurt, Auflage, 1987) entsprechend den Klassen 4 bis 7 unter die Kategorien"wenig lösliche","schwer lösliche","sehr schwer lösliche"bzw."praktisch unlösliche"Verbindungen fallen.

Im Fall der erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharide bedeutet dies, daß mindestens 98 % der eingesetzten Menge, insbesondere mindestens 99,5 %, unter Normalbedingungen (T = 25 °C +/-20 %, p= 101325 Pascal +/-20 %) in Wasser unlöslich ist (entsprechend den Klassen 4 bzw. 5).

Für die vorliegende Erfindung sind schwer lösliche bis praktisch unlösliche Verbindungen, insbesondere sehr schwer lösliche bis praktisch unlösliche Verbindungen, bevorzugt.

"Sehr schwer löslich"entsprechend Klasse 6 kann durch folgende Versuchsbeschreibung veranschaulicht werden : Ein Gramm des zu untersuchenden Polyglucans/saccharids werden in 1 1 entionisierten Wasser auf 130° C unter einem Druck von 1 bar erhitzt. Die entstehende Lösung bleibt nur kurzzeitig über wenige Minuten stabil. Beim Erkalten unter Normalbedingungen fällt die Substanz wieder aus. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur und Abtrennung mittels Zentrifugation können unter Berücksichtigung der experimentellen Verluste mindestens 66 % der eingesetzten Menge zurückgewonnen werden.

Herstellung einheitlicher sphärischer Mikropartikel Das bevorzugt zum Einsatz gelangende Poly- (1, 4-a-D-glucan) kann auf verschie- dene Weisen hergestellt werden. Eine sehr vorteilhafte Methode wird in der WO 95/31553 beschrieben. Auf die Offenbarung der Schrift wird sich hier ausdrücklich bezogen. Darin wird das Poly- (1, 4-a-D-glucan) mittels eines biokatalytischen (bio- transformatorischen) Prozesses mit Hilfe von Amylosucrase hergestellt. Weiterhin kann das Poly- (1, 4-a-D-glucan) unter Verwendung von Polysaccharidsynthasen, Stärkesynthasen, Glycoltransferasen, 1,4-a-D-Glucantransferasen, Glycogen- synthasen oder Phosphorylasen mittels eines biokatalytischen Prozesses herge- stellt werden.

Die Patentanmeldung DE-A-197 37 481 beschreibt die Herstellung von sphärischen Mikropartikeln aus linearen wasserunlöslichen Polysacchariden, sowie deren Molekulargewichte und Durchmesser. Auf die oben genannte Anmeldung wird hier Bezug genommen.

Die Herstellung der sphärischen Mikropartikel erfolgt durch Lösen des wasser- unlöslichen, linearen Polysaccharids, insbesondere des Poly- (1, 4-a-D-glucans), in einem Lösungsmittel, besonders bevorzugt in DMSO, Einbringen der Lösung in ein Fällungsmittel, bevorzugt Wasser, Kühlen des dabei entstehenden Gemisches auf vorzugsweise 10°C bis-10°C und Abtrennen der gebildeten Mikropartikel.

Durch Mitverwendung geeigneter Zusatzstoffe iäßtsich auf die Eigenschaften der Partiel wie Größe, Struktur der Oberfläche, Porosität usw. sowie auf die Prozeß- führung Einfluß nehmen. Geeignete Zusatzstoffe sind beispielsweise oberflächen- aktive Stoffe wie Natriumdodecylsulfat oder N-Methylglucanoamid, Zucker, z. B.

Fructose, Saccharose, Glucose.

Eigenschafen der sphärischen Mikropartikel Die Molekulargewichte Mw der erfindungsgemä# verwendeten linearen Polysac- <BR> <BR> <BR> <BR> charide können in einem weiten Bereich von 103 g/mol bis 10'g/mol variieren. Für das vorzugsweise verwendete lineare Polysaccharid Poly- (1, 4-a-D-glucan) werden <BR> <BR> <BR> <BR> bevorzugt Molekulargewichte Mw im Bereich von 104 g/mol bis 105 g/mol, insbeson-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> dere 2 x 104 g/mol bis 5 x 104 g/mol verwendet. Das Molekulargewicht Mw be- schreibt das Gewichtsmittel des Molekulargewichts und wird mittels Gel-Per- meations-Chromatographie im Vergleich zu einer Eichung mit Pullulanstandards ermittelt.

Die Partiel können mittlere Durchmesser (Zahlenmittelwert) aufweisen wie 1 nm bis 100 um, bevorzugt 100 nm bis 10 um, besonders bevorzugt 1 pm bis 5 um. Die Ver- teilung der Durchmesser zeichnet sich durch eine hohe Einheitlichkeit aus.

Die Mikropartikel aus Poly- (1, 4-a-D-glucan) zeichnen sich durch eine spezifische Oberfläche von 1 m2/g bis 100 m21g, besonders bevorzugt 3 m2/g bis 10 m2/g aus.

Versuche zur Stabilität der Mikropartikel in verschiedenen Lösungsmitteln zeigen, da# eine große Vielfalt an Lösungsmitteln für den Einsatz in dem erfindungsge- mäßen Chromatographieverfahren geeignet sind. Ais Lösungsmittel, in Funktion des Elutionsmittels, werden z. B. n-Hexan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Ethanol, Aceton, Acetonnitril, Methanol, n-Heptan und Wasser verwendet.

Chromatographieverfahren Im Chromatographieverfahren werden erfindungsgemäß Mikropartikel aus linearen Polysacchariden, besonders bevorzugt Poly- (1, 4-a-D-glucan), insbesondere in einem Lösungsmittel, z. B. n-Heptan, aufgeschlämmt, mittels eines Ultraturrax aufge- wirbelt und im Ultraschallbad entgast. Die Supension wird in eine Saule gefüllt und durch ständiges Klopfen an der Saule, ständiges Schütteln in Kombination mit kurz- zeitiger Behandlung im Ultraschallbad gleichmäßig und dicht gepackt, so da# totvo- lumenarme Packungen entstehen. Die Trennungen werden in einer dem Stand der Technik entsprechenden Chromatographie-Anlage für die HPLC durchgeführt. Da- bei beträgt die Probenkonzentration 2,0 bis 0,025 mg/l Lösungsmittel, besonders bevorzugt 0,25 bis 0,05 mg/I Lösungsmittel. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 2,0 bis 0,25 ml/min, bevorzugt 1,0 bis 0,4 ml/min, besonders bevorzugt 0,5 ml/min.

Diese Angaben können in Abhängigkeit von dem verwendeten Lösungsmittel vari- ieren. Die verwendeten Drucke sind stark von der Polarität des Lösungsmittels ab- hängig. Sie liegen i. a. in einem Bereich zwischen 30 bar und 200 bar. Es wurden beispielsweise die folgenden Drucke gemessen : 138 bis 159 bar für Acetonitril, etwa 100 bar für Essigester, etwa 62 bar für t-Butyl-methyl-ether und 54 bis 70 bar für n- Heptan. Es kann ein innerer Standard, z. B. 1,3,5-Tri-tert-butylbenzol, verwendet werden.

Beschreibung der Figuren : Fig. 1 : Rasterelektronenmikroskopaufnahme (siehe Beispiel 4) der verwendeten sphärischen Mikropartikel in 5000x Vergrößerung.

Fig. 2 : Rasterelektronenmikroskopaufnahme (siehe Beispiel 4) der verwendeten sphärischen Mikropartikel in 1 0000x Vergrößerung.

Fig. 3 : Rasterelektronenmikroskopaufnahme (siehe Beispiel 4) der verwendeten sphärischen Mikropartikel in 15000x Vergrößerung.

Fig. 4 : Rasterelektronenmikroskopaufnahme (siehe Beispiel 4) der verwendeten sphärischen Mikropartikel in 20000x Vergrößerung.

Fig. 5 : Agarosegel (Detektion mit Ethidiumbromid 0,5 pg/ml bei 256 nm) gemäß Beispiel 12, beachte Legende.

Fig. 6 : Agarosegel (Detektion mit Ethidiumbromid 0,5 pg/ml bei 256 nm) gemäß Beispiel 12, beachte Legende.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher, ohne die Erfindung auf diese Beispiele einzuschränken.

Beispiele : Beispiel 1 In-vitro-Produktion eines linearen wasserunlöslichen Polysaccharids in einem bio- katalytischen Prozeß am Beispiel des Poly- (1, 4-a-D-glucans) mit Amylosucrase In ein sterilisiertes (Dampfsterilisation) 15 I Gefäß werden 101 einer 20 % igen Saccharose Lösung gegeben. Der Enzymextrakt, Amylosucrase enthaltend, wird in einer Portion zugegeben. Die Enzymaktivität beträgt in diesem Experiment 20 units (1 unit = 1 pmol Saccharose x min-'x mg Enzym). Die Apparatur wird mit einem ebenfalls sterilisierten KPG-Rührer versehen. Das Gefäß wird verschlossen, bei 37°C aufbewahrt und gerührt. Bereits nach einer Zeit von wenigen Stunden bildet sich ein weißer Niederschlag. Die Reaktion wird nach einer Zeitdauer von 96 Stun- den beendet. Der Niederschlag wird abfiltriert und zur Abtrennung niedermole- kularer Zucker mehrfach mit Wasser gewaschen. Der im Filter verbleibende Rück- stand wird bei 40°C im Trockenschrank unter Anlegung eines Vakuums mit Hilfe einer Membranpumpe (Firma Vacuubrand GmbH & Co., CVC 2) getrocknet. Die Masse beträgt 651 g (Ausbeute 65%).

Beispiel 2 Bestimmung des Molekulargewichts des mit Amylosucrase synthetisierten wasserunlöslichen Poly- (1, 4-a-D-glucans) aus Beispiel 1 Es werden 2 mg des Poly- (1, 4-a-D-glucans) aus Beispiel 1 bei Raumtemperatur in Dimethylsulfoxid (DMSO, p. a. von Riedel-de-Haen) gelöst und filtriert (2 um Filter).

Ein Teil der Lösung wird in eine Gel-Permeations-Chromatographie Saule injiziert.

Als Elutionsmittel wird DMSO verwendet. Die Signalintensität wird mittels eines Rl- Detektors gemessen und gegen Pullulanstandards (Firma Polymer Standard Systems) ausgewertet. Die Flußrate beträgt 1.0 mi pro Minute.

Die Messung ergibt ein Zahlenmittel des Molekulargewichts (Mn) von 7.000 g/mol und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts (M,) von 34.000 g/mol.

Beispiel 3 Herstellung von Mikropartikeln aus Poly- (1, 4-a-D-glucan) a) 400 g Poly- (1, 4-a-D-glucan) werden in 2 I Dimethylsulfoxid (DMSO, p. a. von Riedel-de-Haen) bei 60°C innerhalb von 1,5 h gelöst. Dann wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in 201 bidestilliertem Wasser unter Rühren durch einen Tropftrichter über einen Zeitraum von 2 h hinzugegeben. Der Ansatz wird für 44 h bei 4°C gelagert. Es bildet sich eine feine Suspension aus.

Die Partiel werden abgetrennt, indem zunächst der Überstand abdekantiert wird.

Der Bodensatz wird aufgeschlämmt und in kteinen Portionen zentrifugiert (Ultrazentrifuge RC5C : je 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen pro Minute). Der feste Rückstand wird insgesamt drei Mal mit bidestilliertem Wasser aufgeschlämmt und erneut zentrifugiert. Die Feststoffe werden gesammelt und die Suspension von ca. 1000 mi gefriergetrocknet (Christ Delta 1-24 KD). Es werden 283 g wei#er Feststoff isoliert (Ausbeute 71 %). b) Die gesammelten Überstände werden bei einer Temperatur von 18°C über Nacht verwahrt. Die Aufarbeitung erfolgt wie beschrieben. Es werden weitere 55 g des weißen Feststoffs isoliert (Ausbeute 14 %).

Die Gesamtausbeute dieses Prozesses beträgt somit 85 %.

Beispiel 4 Untersuchungen der Mikropartikel aus dem Beispiel 3 mittels Elektronenmikroskopie Zur Charakterisierung der Partiel werden Rasterelektronenmikroskopaufnahmen (REM) (Camscan S-4) durchgeführt. Die Figuren 1 bis 4 zeigen Aufnahmen der Partiel, die verdeutlichen, daß es sich um sphärische, sehr einheitliche Partiel hinsichtlich der Form, Grö#e und Oberflächenrauheit handelt.

Beispiel 5 Untersuchungen der Größenverteilungen der Partiel aus Beispiel 3 Zur Charakterisierung der Größenverteilung der Partiel aus den Beispielen 3 wurden Untersuchungen mit einem Mastersizer durchgeführt (Fa. Malvern Insturments). Die Untersuchung erfolgte im Fraunhofer Modus (Auswertung : multimodal, Anzahl) unter Annahme einer Dichte von 1,080 g/cm3 und einer Volumenkonzentration im Bereich von 0,012 % bis 0,014 %.

Tabelle 1 : Charakterisierung der Partikeldurchmesser aus den Beispielen 3 Beispiele Durchmesser Partikelverteilung 1 No. dw/dn*3d(10%)*4D(50%)*5d(90%)*6Dw*2 (µm)(µm)(µm)(µm)(µm) 3a 1,664 4,184 2,541 0,873 1,504 2,624 3b 0,945 2,345 2,481 0,587 0,871 1,399 dn : Zahlenmittelwert des Durchmessers ^2 dw : Gewichtsmittelwert des Durchmessers ^3 dw/dn : ispersität der Partikeldurchmesser *4 (10 %) : 10 % aller Partiel haben einen kleineren Durchmesser als der angegebene Wert ^5 d (50 %) : 50 % aller Partiel haben einen kleineren Durchmesser als der angegebene Wert *6 d (90 %) : 90 % aller Partikel haben einen kleineren Durchmesser als der angegebene Wert Beispiel 6 Bestimmung der spezifischen Oberfläche von Poly- (1, 4-a-D-glucan) (Vergleichsbeispiel) und Mikropartikein aus Poly- (1, 4-a-D-glucan) und Kartoffelstärke (Vergleichsbeispiel) Die Messungen der spezifischen Oberfläche werden mit einem Sorptomatic 1990 (Fa. Fisons Instruments) hergestellt. Zur Auswertung wird die'default method sorptomatic'-Methode angewendet. Für die Untersuchung werden die Proben bei 80°C im Vakuum (Membranpumpe der Firma Vacuubrand GmbH & Co., CVC 2) über Nacht getrocknet. Die Kartoffelstärke und das direkt aus der Biotransformation gewonnene Poly- (1, 4-a-D-glucan) werden zuvor gemahlen, so daß die Masse der Partiel im Bereich kleiner 200 Mikrometer liegt. Hierzu wird eine handelsübliche Mühle verwendet (Fa. Waring#).

Tabelle 2 : Charakterisierung der spezifischen Oberfläche der Mikropartikel aus Poly- (1, 4-a-D- glucan) (siehe Beispiel 3) Beispiel No. Substanz Spezifische Oberfläche m2l9 1 Poly- (1, 4-a-D-glucan) 2,243 3 Mikropartikel aus Poly- (1, 4-a-D-glucan) 4,527 -Kartoffelstärke (Toffena, Fa. Südstärke) 1,280 Beispiel 7 Versuche zur Stabilität der Mikropartikel in verschiedenen Lösungsmitteln zur Bestimmung der verwendbaren Lösungsmittel Zur Austestung der Eignung verschiedener Lösungsmittel in der chromatographischen Anwendung mit Mikropartikeln aus Poly- (1, 4-a-D-glucan) wird wie folgt verfahren : 100 mg der Partiel aus Beispiel 3 werden in einem Rollrandglaschen mit jeweils 3 ml des Lösungsmittel überschichtet. Die Beobachtungszeit beträgt 24 Stunden. In stundenweisen Abständen werden die Partiel nach Veränderungen untersucht. Zu diesem Zweck wird das Reaktionsgefäß geschwenkt.

Die Ergebnisse zeigen, daß eine hohe Vielfalt an Lösungsmitteln für die hier beschriebene chromatographische Verwendung zum Einsatz kommen kann.

Auszuschließen sind nur Toluol, Essigester und Dimethylsulfoxid. Im nichtaufgeführten Einzelfall muß das Lösungsmittel zunächst auf seine Verwendbarkeit hin überprüft werden. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 3 festgehalten. Dabei wurden die Dielektrizitätskonstanten, sowie das Dipolmoment und/oder der Polaritätsindex nach Snyder angegeben, um einen Anhaltspunkt für die Polarität des Lösungsmittels zu geben.

Tabelle 3 : Ergebnisse der Untersuchungen zur Stabilität von Mikropartikeln aus Poly- (1, 4-a-D- glucan) (siehe Beispiel 3) in verschiedenen Lösungsmitteln Lösungsmittel Dielektrizitäts-Dipol-Polaritäts-Beobachtung Konstante (#)*1 moment D*2 Index*3 (nach 24 h) n-Hexan 1,8865-0, -- 0,0 keine Veränderung n-Heptan 1,9209--0,0 keine Veränderung Toluol 2,379 0,375 2,3 Transparent, leicht gequollenes Material, trüber Überstand Essigester 6,0814 1,78--Partikel verkleben, trüber Überstand Dichlormethan 8,93 1,60 3,4 keine Veränderung Tetrahydrofuran 7,2 1,75 4,2 keine Veränderung 1,4-Dioxan keine Veränderung Ethanol 25,3 1,69 5,2 keine Veränderung Aceton 21,01 2,88 5,4 keine Veränderung Acetonitril 36,64 3,924 6,2 keine Veränderung Methanol 33,0 1,7 6,6 keine Veränderung Dimethylformamid 38,25 3,82--keine Veränderung Dimethylsulfoxid 47,24 3,96--gelöst Wasser 80,100 1,854 9,0 keine Veränderung ''Dielektitzitätskonstante nach"Handbook of Chemistry and Physics, 77t" Edition" '2 Dipolmoment nach"Handbook of Chemistry and Physics, 77th Edition" 3 Polaritätsindex nach Snyder aus : Merck, ChromBook Beispiel 8 Füllen einer Chromatographiesäule mit Mikropartikeln aus Beispiel 3a <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 5 g der Partiel aus Beispiel 3a werden in ca. 60 ml Heptan aufgeschlämmt. Mittels eines Ultraturrax (Fa. Ika) wird die Suspension kurz aufgewirbelt und anschließend in einem Ultraschallbad (Sonorex Super RK510H) entgast. Die Suspension wird dann unter Maximalfluß in eine Saute mit den Maßen 125 mm Länge und 4 mm Durchmesser (bar@ Fertigsäule der Firma Merck AG) gefüllt. Ständiges Klopfen an der Säule, bzw. ständiges Schütteln der Säule in Kombination mit kurzzeitiger, etwa einminütiger Behandlung im Ultraschallbad gewährteistet eine dichte und gleichmäßige Packung des Trennmaterials, so daß totvolumenarme Packungen entstehen.

Beispiel 9 Trennung von Indol und 2-Methylindol in Heptan Die Trennungen werden in einer Chromatographie-Anlage Lichograph der Firma Merck durchgeführt. Die einzelnen Bauteile sind : eine Gradentienpumpe L 6200 A, ein UV-Detektor L-400 (Messung bei 254 nm), ein Chromato-Integrator D-2500 und eine Trennsäule Hibar# Fertigsäule RT-125-4. Die Probenkonzentration beträgt idealerweise 0,05 bis 0,1 mg/ml Lösungsmittel. Als innerer Standard kann 1,3,5-Tri- tert.-butylbenzol (Fa. Fluka) verwendet werden.

Die Chromatographiesäule ist mit n-Heptan (Aldrich zur HPLC) vorbereitet. Die Anlage wird mit n-Heptan gefahren. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 0,5 ml/min.

Der Druck beträgt 54 bar. Die zu trennenden Substanzen sind : Indol und 2- Methyllindol.

Tabelle 4 Ergebnisse der Trennung von Indol und 2-Methyllindol in Heptan Substanz Reaktionzeit (min) 1,3,5-Tri-tert.-butylbenzol 1,86 (Standard) Indol 9,12 Indol/2-Methyllindol 8,98/7,37 2-Methylindol 7,20 Beispiel 10 Trennung von Indol und 2-Naphthol in Heptan Der Versuch wird wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt.

Tabelle 5 : Ergebnisse der Trennung von 2-Naphthol und Indol in Heptan Substanz Retentionszeit (min) 2-Naphthol 2,24 2-Naphthol/Indol 1,92/9,16 Indol 9,12 Beispiel 11 Trennung eines Enantiomerengemisches : racemisches 1- (2-Naphthyl)-ethanol Der Versuch wird analog zu Beispiel 10 durchgeführt. In diesem Beispiel liegt der Druck bei ca. 70 bar. Die Konzentration der Proben beträgt 0,25 mg/ml Lösungsmittel.

Tabelle 6 : Ergebnisse der Trennung von racemischem 1- (2-Naphthyl)-ethanol in Heptan Substanz Retentionszeit (min) 1,3,5-Tri-tert.-butylbenzol 1,89 (Standard) S-(-)-1-(2-Naphthyl)-ethanol(-)-1-(2-Naphthyl)-ethanol 32,03 1,3,5-Tri-tert.-butylbenzol 1,87 (Standard) R- (+)-1- (2-Napthyl)-ethanol 36,30 Beispiel 12 Abtrennung oder Rückhaltung von Stoffen, Verwendung des erfindungsgemäßen Trennmaterials als Filtermittel Einwegzentrifugenfilter (Firma Schleicher & Scull, z. B. Centrix, Katalognummer 467012 (April 1996) : Filter 1"in Fig. 5 und 6) werden unter Einsatz von 580 mg der hergestellten Mikropartikel gemäß Beispiel 3 als Filtermaterial oder Adsorbens mit 3 ml einer Puffer 1 (siehe unten) Lösung equilibriert. (ggf. Zentrifuge (2000 U/min)).

Anschließend werden 2ml einer wässrigen DNA-Plasmidlösung (verwendetes Plasmid : pBluescript 11 SK) mit der Konzentration 50 lug/ml auf den Filter gegeben (ggf. Zentrifuge (5min bei 2000 U/min)). Es erfolgt ein Referenzlauf mit ("Filter 2"in Fig. 5 und 6) QiagenO Midipräp (Hilden, Deitschland) und ein weiterer Referenzlauf mit Qiagen Midipräp-Kartuschen ohne Qiagen Filtermittel, welche mit dem Trennmaterial bestückt wurden.

Jeweils 5 pi Eluat, wird mit etwa 1/10 der Konzentration mit Anfärbereagenz (Marker) versehen und auf eine Agarosegelplatte (60% Saccharose, 20 mM EDTA, 0,025 % Bromphenolblau) aufgetragen mit anschließender Gelelektrophorese (Firma Biorad, Power Supply, Modell 100/200). Als Referenz zur Abschätzung und Einordnung detektierter Plasmide wird ein Marker 'MG 5.000) in Spur 1 und die verwendete DNA-Plasmidlösung als Referenz aufgetragen. Fig. 5 zeigt, daß am erfindungsgemäßen Trennmaterial (hier Filtermittel) die Proben-DNA zurückgehalten wurde.

Anschießend werden 5ml eines zweiten Puffers (Puffer 2) auf die Saute (Filter) zum Eluieren gegeben und schnell durch Zentrifugation aufgearbeitet (5min bei 2000 U/min).

Die Eluate (Referenzen wie vorgenannt) werden auf eine Agarosegelplatte (60% Saccharose, 20 mM EDTA, 0,025 % Bromphenolblau) aufgetragen und anschließend eine Gelelektrophorese (Firma Biorad, Power Supply, Modell 100/200) durchgeführt (siehe Fig. 6). Als Vergleich wurde ein Marker (MG 5.000) (Spur 1) und die DNA-Plasmidlösung (Spur 7) aufgetragen.

Fig. 6 zeigt, daß sich bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Trennmaterials die eingesetzte Plasmid DNA wieder von der Saule eluiert wird. Der Vergleich mit kommerziell erhältlichen Filtermitteln zeigt die Güte des Filterprozesses, der mindestens die gleiche Qualtiät aufweist.

Pufferbeschreibung : Puffer 1 : 750 mM NaCl 50 mM MOPS (3- [N-morpholino] propanesulfonic acid, pKa 7.2) 15% Isopropanol 0,15% X-100 Puffer 2 : 1,25 M NaCl 50 mM Tris, Tris*Clm, Ph 8,5 15% Isopropanol Fig 5 : Von links nach rechts : Spur 1 : Marker (Boehringer Mannheim DNA Molecular Weight Marker X) Spur 2 : Filter 2 ohne Trennmaterial (Blindreferenz) Spur 3 : Filter 2 gefüllt mit erfindungsgemäßen Trennmaterial Spur 4 : Filter 1 : Kartusche QiagenO mit erfindungsgemäßen Trennmaterial Spur 5 : Filter 1 : QiagenO Midipräp (Hilden, Deutschland) Referenz Spur 6 : Filter 2 mit Trennmaterial Spur 7 : reine DNA-Plasmidlösung (handelsübliches Plasmid pBluescript 11 SK) Fig. 6 Von links nach rechts : Spur 1 : Marker (Boehringer Mannheim DNA Molecular Weight Marker X) Spur 2 : Filter 2 ohne Trennmaterial (Blindreferenz) Spur 3 : Filter 2 gefüllt mit erfindungsgemäßen Trennmaterial Spur 4 : Filter 1 : Kartusche QiagenO mit erfindungsgemäßen Trennmaterial Spur 5 : Filter 1 : QiagenO Midipräp (Hilden, Deutschland) Referenz Spur 6 : Filter 2 mit Trennmaterial Spur 7 : reine DNA-Plasmidlösung (handelsübliches Plasmid pBluescript 11 SK)




 
Previous Patent: PLAY SYSTEM

Next Patent: FILTER NOZZLE