Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für Polypeptide kodieren, die wiederum an der enzymatischen Biosynthese von Polyketidverbindungen beteiligt sind sowie die Aminosäure-Sequenzen der Polypeptide.

Weiterhin betrifft die Erfindung die erstmalige Beschreibung von Synthesewegen für die Herstellung von Polyketidantibiotika aus Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Dabei weist mindestens ein Polyketidantibiotikum eine spezifische Wirkung gegen Bakterien, vorzugsweise Gram-positive Bakterien auf, besitzt jedoch keine Hemmwirkung gegen eukaryotische Organismen.

Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Biologie, die Medizin und die Pharmazie.

Stand der Technik

Das sporenbildende Gram-positive Bakterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 fördert das Pflanzenwachstum und unterdrückt das Wachstum phytopathόgener Mikroorganismen im Bereich der pflanzlichen Wurzelzone (Idriss et al. 2002. Microbiology 148: 2097-2109).

Die Suppression des phytopathogenen Pilzes Fusarium oxysporum wird durch die kombinierte Wirkung der cyclischen Lipopeptide BacillomycinD und Fengycin verursacht. Die Sequenz für das BacillomycinD Operon weist auf das Vorhandensein von drei modularen Peptidsynthetasen BmyA, B und C in FZB42 hin (Borriss et al. Anmeldung Deutsches Patent- und Markenamt C12N 15/52- Akz. 10326394.2).

Durch Inaktivierung des BmyA kodierenden Gens wurde nicht nur die BacillomycinD Synthese sondern auch die antifungale Wirkung von FZB42 auf Fusarium oxysporum eliminiert. Dagegen blieb die antibakterielle Wirkung von Kulturfiltraten der FZB42- Mutanten auf Gram-negative und Gram-positive Bakterien bestehen. (Koumoutsi et al. 2004, J.Bacteriol. 186, 1084-1096). Die Ausschaltung der Fengycin- und Surfactinsynthese hatte keinen Einfluss auf die antibakterielle Wirkung von FZB42. Eine antibakterielle Wirkung wurde bereits für verschiedene konjugierte Polyen- Antibiotika der Gattung Bacillus beschrieben (z.B. Zimmermann et al. 1987. J. Antibiotics 40:1677-1681, Patel et al. 1995. J. Antibiotics 48, 997-1003).

Gensequenzen, die die Synthese dieser antibakteriellen Wirkstoffe in Bacillus Biokontroll-Stämmen determinieren, sind jedoch nicht bekannt.

Das verstärkte Auftreten von Antibiotika-resistenten pathogenen Mikroorganismen hat zu einer intensiven Suche nach neuen wirksamen antibakteriellen und antifungalen Verbindungen geführt. Von mindestens ebenso großer Bedeutung ist die Suche nach antiviralen Verbindungen.

Dabei wird die Entdeckung neuer geeigneter Naturstoffe immer schwieriger. Neben dem Screening von natürlichen Produzentenstämmen verspricht die kombinatorische Biosynthese eine effiziente Alternative für die Entwicklung neuer wirksamer Medikamente zu werden.

Polyketide und nichtribosomale Peptide sind zwei große Naturstoff-Familien, die zahlreiche klinisch bedeutsame Verbindungen beinhalten, z.B. antimikrobielle Verbindungen (Penicillin, Bacitracin, Erythromycin, Oleandomycin, Tylosin und Vancomycin), Immunsuppressiva (Cyclosporin, FK506 und Rapamycin) und Antitumorverbindungen (Doxorubicin, Bleomycin und Epothilone).

Polyketide sind eine Klasse von Sekundärmetaboliten mit bemerkenswerter Vielfalt in Struktur und Funktion, die sowohl antimikrobielle als auch antivirale und antiparasitische Eigenschaften aufweisen können.

Ihr weites Aktivitätsspektrum macht sie zu einer der am meisten gesuchten Molekülgruppe in biologischen Screens. Z.B. ist das Polyketid Mupirocin für die Biokontroll-Funktion des Gram-negativen Bakteriums Pseudomonas fluorescens verantwortlich (El-Sayed et al. 2004. Chemistry & Biology 1:419-430). Das Polyketid Bacillaen, das in bisher unbekannter Weise in einigen Bacillus subtilis Stämmen produziert wird, ist als Inhibitor der prokaryotischen Proteinsynthese bekannt und weist ein Molekulargewicht von 580 und eine empirisch ermittelte Summenformel von C35H48O7 auf. Im Agar-Diffusionstest ist Bacillaen gegen eine Vielzahl von Bakterien, nicht aber gegenüber eukaryotischen Organismen aktiv (Patel et al. 1995. Journal of Antibiotics 48, 997-1003).

Durch Anwendung der „Suppression Subtractive Hybridization" (SSH) Methode wurden in FZB42 drei Gencluster identifiziert, die Homologie zu Polyketid-Synthasen aufwiesen (Koumoutsi et al. 2004. J.Bacteriol. 186). Eine Bestimmung der kompletten DNA Sequenzen sowie der translatierten Proteine erfolgte jedoch nicht. Ein Nachweis der Synthese von Polyketiden in Bacillus amyloliquefaciens bzw. einer damit verbundenen antibiotischen Aktivität wurde nicht durchgeführt. Es erfolgte keine Zuordnung der Polyketid-Synthase-Gencluster zur Synthese eines Polyketids.

Die meisten Entwicklungen der kombinatorischen Biosynthese basieren auf Verbindungen, die durch modulare Polyketidsynthasen (PKSs) synthetisiert werden. Daneben werden auch nichtribosomalen Peptidsynthasen (NRPSs) und PKSs für die Synthese aromatischer Polyketide und für die kombinatorische Biosynthese eingesetzt.

Kombinatorische Biosynthese beruht auf der genetischen Manipulation von Biosynthesewegen „klassischer" Antibiotika (z.B. von Lipopeptiden), die durch Polyketidsynthasen (PKS) bzw. nichtribosomalen Peptidsynthasen (NRPSs) synthetisiert werden.

Modulare PKSs und NRPSs sind polyfunktionelle „Megasynthasen", die in repetitiven Einheiten oder „Modulen" organisiert sind. Jedes Modul ist für einen diskreten Schritt der Polyketid- oder Polypeptidkettenverlängerung verantwortlich.

Da jedes Modul die funktionellen Domänen für die Erkennung, Aktivierung und Kondensation einer Substrataminosäure einschließlich der Stereospezifität determiniert, ist es möglich, neue Verbindungen durch Manipulation der Domänen oder Module zu synthetisieren. Da die Strukturen von Polyketiden sehr komplex und reich an Stereozentren sind, erlaubt diese Technik die Manipulation von Verbindungen, die durch Anwendung konventioneller, chemischer Methoden schwer zu erhalten sind (E. Rodriguez and R. Daniel. 2001. Combinatorial biosynthesis of antimicrobials and other natural products. Current Opinion in Microbiology 4: 526-534).

Voraussetzung für die Anwendung der kombinatorischen Neusynthese ist die Kenntnis der Gensequenzen, die für die erforderlichen PKSs und NRPSs kodieren und eines Wirtsstammes, der die stabile Expression großer heterologer DNA-Bereiche erlaubt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Identifizierung und Charakterisierung von Genclustern im Genom des Bakteriums Bacillus amyloliquefaciens FZB42, die für die Synthese von Polyketiden verantwortlich sind sowie die Identifizierung von Synthesewegen für Polyketidantibiotika. Eine weitere Aufgabe der Erfindung war die Identifizierung von Polyketidantibiotika, die auf diesen Synthesewegen hergestellt werden.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind DNA-Sequenzen, die für Polypeptide kodieren, die wiederum an der enzymatischen Biosynthese von Polyketidverbindungen beteiligt sind sowie die Aminosäure-Sequenzen der Polypeptide.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Beschreibung von Synthesewegen für die Herstellung von Polyketidantibiotika aus Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Dabei weist mindestens ein Polyketidantibiotikum eine spezifische Wirkung gegen Bakterien, vorzugsweise Gram-positive Bakterien auf, besitzt jedoch keine Hemmwirkung gegen eukaryotische Organismen.

In dem Stamm FZB42 wurden drei Gencluster für die Synthese von Polyketiden identifiziert und durch Sequenzanalyse vollständig charakterisiert. Im Genom des Bakteriums Bacilliis amyloliquefaciens (Stamm FZB42) konnten überraschenderweise die DNA-Sequenzen mit den SEQ-ID NO: 1, 2 und 3 identifiziert und charakterisiert werden. Die DNA-Sequenzen kodieren für Polypeptide, die wiederum an der enzymatischen Biosynthese von Polyketidverbindungen mit antibakterieller Wirkung beteiligt sind.

Umfangreiche Untersuchungen ergaben, dass die Expressionsprodukte der Sequenz mit der SEQ-ID NO: 1 die enzymatische Biosynthese des antibakteriellen Polyketids Bacillaen bewirken. Die Expressionsprodukte der Sequenz mit der SEQ-ID NO: 2 bewirken die enzymatische Biosynthese der antibakteriellen Polyketide Difficidin und/oder Oxydiffϊcidin und die Expressionsprodukte der Sequenz mit der SEQ-ID NO: 3 sind für die Synthese eines bisher nicht bekannten antibakteriellen Polyketids verantwortlich.

Die Erfindung umfaßt darüber hinaus DNA-Sequenzen ausgewählt aus: a) DNA-Sequenzen gemäß den SEQ-ID NO: 1, 2 oder 3 oder deren komplementären Strängen; b) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen an die unter a) genannten Sequenzen oder an Fragmente davon hybridisieren; c) alle Variationen und durch Substitution, Insertion oder Deletion entstandenen Mutanten der unter a) und b) definierten DNA-Sequenzen, die isofunktionelle Expressionsprodukte ergeben, sowie rekombinante Expressionsvektoren umfassend mindestens eine unter a) bis c) definierte DNA-Sequenz.

Gegenstand der Erfindung sind auch prokaryotische oder eukaryotische Zellen, die mit mindestens einer unter a) bis c) definierten DNA-Sequenz oder mit mindestens einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert oder tranfiziert sind sowie Verfahren zur enzymatischen Biosynthese von Polyketidverbindungen mit antibakterieller Wirkung.

Die Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass Zellen mit mindestens einer unter a) bis c) definierten DNA-Sequenz oder mit mindestens einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert oder tranfiziert werden, die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden und die Polyketidverbindung aus dem Kulturüberstand isoliert wird.

Mit diesem Verfahren können die Polyketide Bacillaen, Difficidin und/oder Oxydiffϊcidin sowie ein bisher nicht charakterisiertes Polyketid mit antibakterieller Wirkung hergestellt werden.

Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung der unter a) bis c) definierten DNA- Sequenzen sowie der erfϊndungsgemäßen Expressionsvektoren zur kombinatorischen Neusynthese von Polyketiden, die eine verbesserte Stabilität und/oder Wirkung gegenüber phyto-, tier- und/oder humanpathogenen Bakterien aufweisen.

Die Aminosäure-Sequenzen von Polypeptiden, die an der enzymatischen Biosynthese von Polyketidverbindungen beteiligt sind, umfassend die Sequenzen mit den SEQ-ID NO: 4 bis 42 sowie die Verwendung der Aminosäure-Sequenzen zur kombinatorischen Neusynthese von Polyketiden, die eine verbesserte Stabilität und/oder Wirkung gegenüber phyto-, tier- und/oder humanpathogenen Bakterien aufweisen, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die modularen Anordnung von Typl-Polyketid-Synthasen erlaubt die gezielte Manipulation der nichtribosomalen Proteinmatrizen und befähigt somit erfϊndungsgemäß zum rationalen Design neuer Polyketidantibiotika.

Funktionelle Hybrid-Matrizen können in vitro und in vivo hergestellt werden. Zahlreiche modifizierende Enzyme (z.B. Reduktasen, Dehydratasen, Methyltransferasen) aus einem der drei in FZB42 vorhandenen PKS-Cluster können ebenfalls für die kombinatorische Biosynthese neuer Polyketidwirkstoffe eingesetzt werden.

Weiterhin erlaubt die natürliche Kompetenz für DNA-Aufnahme und Rekombination und die Kenntnis der DNA-Sequenzen bei FZB42 den gezielten Einsatz stärkerer und regulierbarer Promotoren um die Produktausbeute zu steigern. Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert und durch Ausfuhrungsbeispiele belegt, ohne dass diese Erläuterungen eine einschränkende Wirkung hätten.

Antibakterielle Aktivität von FZB42

Kulturfiltrate von FZB42 nach 24 h bzw. 48 h Kultur weisen sowohl antibakterielle Aktivität gegenüber den meisten überprüften Bakterien, als auch antifungale Aktivität (Arxula adeninovorans, Saccharomyces cerevisiae) auf. Die höchste Empfindlichkeit wurde bei Gram-positiven Bakterien (Ausnahme Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) beobachtet. Auch die überprüften Vertreter der α-Proteobakterien wurden durch das Kulturfiltrat von FZB42 deutlich gehemmt. Dagegen waren Vertreter der Enterobakterien und andere Repräsentanten der γ-Proteobakterien relativ unempfindlich (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1: Hemmung von Mikroorganismen durch Kulturfiltrate von FZB42 (24 und 48 h Wachstum). Der Durchmesser der Hemmzonen ist in cm angegeben.

Stamm 24h 48h taxon Bacillus subtilis - - 0,3 trüb Gram+ lowGC Bacillus megaterium 1,3 klar 1,1 klar Gram+ lowGC Paenibacillus larvae larvae I1 klar 1,32 klar Gram+ lowGC Streptococcus faecalis 0,8 klar 0,6 klar Gram+ lowGC Micrococcus luteus - - 0,5 klar Gram+ lowGC Staphylococcus aureus - - - - Gram+ lowGC Arthrobacter spec. 0,7 klar 0,9 klar Gram+ lowGC Streptomyces coelicolor 40/233 1,6 klar 1,2 klar Gram+ highGC Streptomyces viridochromogenes 40110 1,6 klar 1,2 klar Gram+ highGC Streptomyces F2 0,8 klar 0,8 klar Gram+ highGC Agrobacterium tumefaciens 0,4 klar 0,9 klar α-proteobacteria Agrobacterium tumefaciens AGLl 0,5 klar 1 klar α -proteobacteria Flavobacterium spec. 0,3 trüb 0,3 trüb α -proteobacteria Acinetobacter spec. - - - - α -proteobacteria Klebsiella terrigena 0,3 klar 0,2 klar γ-proteobacteria Klebsiella pneumoniae 0,2 trüb 0,2 klar γ -proteobacteria

1 Bestimmung nach 5 Tagen Wachstum auf Blutagar 2 Bestimmung nach 8 Tagen Wachstum auf Blutagar Enterobacter spec. 0,3 trüb γ -proteobacteria Erwinia carotovora 0,3 trüb 0,4 trüb γ -proteobacteria Serratia marcescens 0,6 klar 0,5 klar γ -proteobacteria Proteus vulgaris 0,2 trüb 0,2 trüb γ -proteobacteria Pseudomonas aeruginosa 0,2 trüb 0,4 trüb γ -proteobacteria Pseudomonas fluorescens 0,5 trüb 0,4 trüb γ -proteobacteria Pseudomonas fluorescens 15 0,2 trüb - - γ -proteobacteria Pseudomonas aureofaciens PS49 - - - - γ -proteobacteria Pseudomonas putida 62 - - - - γ -proteobacteria Pseudomonas spec. 14a 0,3 trüb 0,2 klar γ -proteobacteria Pseudomonas spec. 20 0,4 klar 0,3 klar γ -proteobacteria Pseudomonas spec. 79 - - - - γ -proteobacteria Pseudomonas spec. Kl 9 - - - - γ -proteobacteria

Arxula adeninovorans 0,2 klar 0,6 klar Hefen Saccharomyces cerevisiae 1,2 klar 1,1 klar Hefen

Im Kulturfϊltrat von FZB42 und in Mutanten, in denen die Synthese der antifungal wirkenden Lipopeptide BacillomycinD, Fengycin und Surfactin ausgeschaltet wurde, konnte überraschenderweise eine spezifische antibakterielle Wirkung, insbesondere gegenüber Gram-positiven Bakterien (u.a, Bacillus sp., Streptomyces sp., Streptococcus sp.) nachgewiesen werden.

Durch Ausschaltung der pks3 -Gensequenz in der Mutante CH8 wurde der antibakterielle Effekt gegen . die. genannten Bakterienweitgehend aufgehoben. Dieser Befund beweist, dass durch die Polyketidsynthetasen des pks3 Genclusters ein Polyketid mit spezifischer antibakterieller Wirkung synthetisiert wird. Eine chemische Charakterisierung des Polyketids durch Massenspektroskopie war bisher nicht möglich. Eine Ähnlichkeit zu den bisher aus Bacillus beschriebenen Polyketiden (Bacillaen und Difficidin/Oxydifficidin) konnte j edoch ausgeschlossen werden.

Im Kulturfiltrat des Bakteriums Bacillus amyloliquefaciens FZB42 und einzelnen Mutanten konnten überraschenderweise die Polyketide Bacillaen und Difficidin/Oxydifficidin nachgewiesen werden. Nach Auftrennung des Kulturfϊltrats von FZB42 durch HPLC konnte in dem nach 18 min. Retentionszeit eluierten Peak durch Electrospray-Massenspektroskopie (ESM) ein Peak mit m/z von 581.1 nachgewiesen werden, der dem Bacillaen entspricht. Die höchste Intensität dieses Peaks wurde nach 48 h Kultur in Landy-Medium beobachtet.

Ein optimierter Wirkstoff auf der Basis des Polyketids Bacillaen stellt eine Alternative bei dem Einsatz gegen pathogene Gram-positive Bakterien der Gattungen Staphylococcus sp. und Streptococcus sp. dar, deren medizinische Behandlung durch die sich rasant verbreitende Multiresistenz gegenüber herkömmlichen Antibiotika zunehmend erschwert wird.

Hinzu kommt, dass das pks3-Polyketid keine Inhibition eukaryotischer Zellen verursacht und somit potentiell für den Einsatz im humanen Bereich geeignet ist.

Diese besonders vorteilhafte Eigenschaft konnte dadurch belegt werden, dass in der Mutante CH8 keine Reduktion der antifungalen Wirkung gegenüber Fusarium oysporum oder Saccharomyces cerevisiae verursacht wurde.

Zur Identifizierung der für die antibakterielle Aktivität möglicherweise verantwortlichen Gencluster (pksl, pks2, pks3) wurden alle drei Gencluster komplett sequenziert (SEQ-ID NO: l=pksl, SEQ-ID NO: 2=pks2, und SEQ-ID NO: 3=pks3) und durch Homologie-Sequenzvergleich weiter charakterisiert.

Genomanalyse: pks-Gencluster

An verschiedenen Positionen im Genom von B.amyloliquefaciens FZB42 wurden drei große Gencluster mit Homologie zu dem Polyketidsynthase-Operon (pksX) von B.subtilis (Albertini et al. 1995. Microbiology 141,299-309) nachgewiesen. Pksl (SEQ- ID NO: 1, 72612 bp, Tab.2 und 7), pks2 (SEQ-ID NO: 2, 53724 bp, Tab.3 und 8) und pks3 (SEQ-ID NO: 3, 74700, Tab.4 und 9) weisen strukturelle Gemeinsamkeiten auf und sind wahrscheinlich durch Genduplikation aus einem gemeinsamen Vorfahren entstanden. Konstruktion von gene-knock-out Mutanten in FZB42

Die Ausschaltung der Genexpression erfolgte durch Kassettenmutagenese in das jeweils erste Keto-Synthase Modul (KS) unter Verwendung von Erythromycin- (EmR) und Chloramphenicol-Resistenz (CmR) vermittelnder Gene (Koumoutsi et al. 2004. J. Bacteriol. 186,1084-1096). pMX39 (EmR) wurde mit Spei verdaut. Das resultierende 2.9 kb Fragment wurde mit Hindlll verdaut und ein 1.8 kb emrAM Fragment erhalten. emrAM wurde in die Polylinker-region von Hindlll verdauten pUC18 inseriert. Das Plasmid (pUCemR) wurde für die weiteren Geninsertionsexperimente zur Einführung der Erythromycin-Resistenz genutzt. Ein 1.8 kb Fragment mit dem CmR-Markergen wurde durch SphI and Hindlll V erdau aus pDG268 erhalten und in pUC18 Moniert. In dem resultierende Plasmid (pUCemR) war das CmR-Gen durch die Polylinker-Region von pUC18 flankiert. Unter Nutzung der Primer pkslUp 5'-AAAGGAGCGGAGTGCAACATC und pkslDw 5 '-TGAGATGATGCCGTCCTCTTC, wurde ein 3.3 kb Fragment durch PCR amplifiziert und in den Vektor pGEM-T Moniert. Dieser wurde mit EcoRI and Hpal verdaut und ein 1,4 kb Fragment mit der ersten KS-Domäne (KSl, Tabelle 2) entfernt. Das CmR-Gen aus EcoRI/Smal geschnittenen pUCemR wurde inseriert und das Plasmid pCH6 erhalten. Nach Linearisierung durch Seal wurde das Plasmid in kompetente B. amyloliquefaciens FZB42 Zellen (Koumoutsi et al. 2004. IBacteriol. 186,1084-1096) transformiert. Durch Gensubstitution via homologe Rekombination wurde die Cv^pksl Mutante CH6 erhalten. Ein 3.0 kp PCR Fragment mit dem 5' Teil des pks2-Operons wurde durch die Primer pks2Up 5'-AGCTCATTGACAGCGATGCTGC and pks2Dw 5'- ATGATCGCCGCTTCCTCATCAG erhalten und in den Vector.pGEMT Moniert. Ein 1.3 kb Fragment mit der ersten KS-Domäne vonpks2 (KSl, Tab.3), wurde durch EcoRI und Kpnl herausgeschnitten und durch das 1.3 kb CmR Gen aus pUCCmR ersetzt. Nach Linearisierung mit Seal wurden kompetente FZB42 Zellen transformiert und die CmR pks2 knock out Mutante CH7 erhalten. Das pks2> Gen wurde durch Insertion einer EmR cassette aus pUCemR zerstört. Ein 2.2 kb pks3 Genfragment wurde mit den Primern pks3Up 5'- ACATTGACCGCATCCTCAATCTG und ρks3Dw 5'- TCAGCTGCTGTTCGGAATGTG amplifiziert und in den Vektor pGEM-T Moniert. Durch Verdau mit EcoRI und Eco72l wurde ein 376 bp Fragment in der Mitte der amplifizierten Region entfernt. Die ermAM Kassette (1.9 kb) wurde von pUCemR durch EcoRI IPvuII Verdau erhalten und inseriert. Das resultierende Plasmid pCH8 wurde mit Apal linearisiert und in kompetente FZB42 Zellen transformiert. Die EmR pks3 Mutante CH8 wurde erhalten. Die genetische Konfiguration der Mutanten wurde durch PCR der chromosomalen DNA mit den spezifischen Primern bestätigt.

Tabelle 5: Stämme und Plasmide. Für die Herstellung der gewünschten Knockout-Stämme wurden die Plasmide pCH6, pCH7 und pCH8 zur Transformation in FZB42 eingesetzt.

Beschreibung, Resistenz Quelle/Herstellung B. amyloliquefaciens Stämme FZB42 Produzent von Surfactin, Fengycin, Bacillomycin FZB Biotech GmbH Berlin CH6 Δpksl ::Cmr pCH6^FZB42 CH7 Δpks2::Cmr pCH7^FZB42 CH8 ApksSr. Emr pCH8->FZB42 Plasmide pMX39 ApR, Emr, Tetr Derivat von pDB 101 pDG364 amyE ApR, CmR Integrativer Vektor pGEM-T Cloning Vector , ApR Labor Kollektion pUC18 Cloning Vector, ApR Labor Kollektion pUCemR pUC18 mit erm_amp , ApR pUCcmR pUC18 mit cat , AmpR, CmR

pCH6 pGEM-T mit einem 1.9 kb Fragment von pksl::Cmr, ApR pCH7 pGEM-T mit einem 1.7 kb fragment frompks2::Crnr, ApR pCH8 pGEM-T mit einem 1.8 kb fragment from pksß : :Emr, ApR

Antibakterielle und antifungale Aktivität von Gen-Knock-out Mutanten

Bei Ausschaltung des pks3 Gens durch Kassetten-Mutagenese wurde nahezu die gesamte antibakterielle Aktivität in dem Mutantenstamm CH8 ausgeschaltet (Indikatorstamm B.megaterium, Abb. 1). Dagegen wies die pks2 Mutante CH7 unverändert antibakterielle Aktivität gegenüber den eingesetzten Indikatorstämmen Bacillus megateήum und Arthrobacter spec. auf. Beide Mutanten waren in ihrer antifungalen Wirkung {Saccharomyces cerevisiae, Fusarium oxyspomm) gegenüber dem Wildtyp nicht verändert. Umgekehrt war keiner der Lipopeptidsynthese-Mutanten (AKl, AK2, AK3, CHI, CH2, CH3) in der Wirkung gegenüber Bacillus megaterium und Arthrobacter spec. beeinflusst. Die Ausschaltung des sfp-Gens, das für eine Phosphopantetheinyl Transferase kodiert, hat den Ausfall der Synthese biologisch aktiver Lipopeptide und Polyketide zur Folge (Tab.5). Von besonderem Interesse ist der Effekt der .yczE-Mutation (CH4) durch die sowohl die Synthese von Lipopeptiden der Iturin-Familie als auch der Polyketide unterbunden wird. Der Ausfall der Synthese von Bacillomycin D in CH4 (yczE), und von BacillomycinD, Fengycin und Surfactin in der sfp, yczE Doppelmutante CH5 konnte durch Matrix-unterstützte Laser Desorptions- Ionisations-Flugzeit Massenspektroskopie (MALDI TOF MS) nachgewiesen werden. Der Ausfall der Synthese von Bacillaen und Difficidin/Oxydifficidin in CH4 iyczE), und von BacillomycinD, Fengycin und Surfactin in der sfp, yczE Doppelmutante CH5 konnte durch Matrix-unterstützte Laser Desorptions-Ionisations-Flugzeit Massenspektroskopie (MALDI TOF MS) nachgewiesen werden. Die entsprechende Untersuchung der Kulturfiltrate der pks-Mutanten (CH6-CH8) ergab, dass das pksl Gencluster die Synthese von Bacillaen und das pks2-Gencluster die Synthese von Difficidin/Oxydifficidin bewirkt. Überraschenderweise hatte die Ausschaltung der Bacillaen-Biosynthese keinen drastischen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung gegenüber den eingesetzten Indikatorstämmen im Agar-Diffusionstest. Gegenüber B. megaterium war der inhibitorische Effekt des Kulturfϊltrats leicht reduziert, gegenüber St. aureus — ähnlich wie in der CH8 pks3 knock out Mutante - überhaupt erst nachweisbar. Ursache könnte die gegenüber dem Wildtyp erhöhte Bildung von Difficidin und Oxydifficidin in beiden Mutanten sein. Nach Ausschaltung des pks2 Genclusters war kein Difficidin/Oxydifficidin im Kulturfiltrat von CH7 nachweisbar. Die antibiotische Aktivität gegenüber B. megaterium blieb unverändert während keine inhibitorische Aktivität gegenüber St. aureus verblieb (Abb.2). Obwohl bisher kein 3. Polyketid durch die von uns ein eingesetzten Untersuchungsmethoden in FZB 42 nachgewiesen werden konnte, zeigt der deutliche Abfall in der inhibitorischen Aktivität gegenüber dem Indikatorstamm B.megaterium bei der pks-3 knock out Mutante CH8, dass durch dieses Gencluster ein potentes Antibiotikum mit spezifischer Wirkung produziert wird (Abb.l, Tabelle 6). Insbesondere die Gencluster pks2 (Difficidin/Oxydifficidin-Biosynthese) und pks3 (unbekanntes Polyketid) sind für die Synthese von Wirkstoffen mit spezifischer Wirkung gegenüber phyto-, tier- und humanpathogenen Bakterien (z.B. dem Erreger

des Kartoffelschorfes, Streptomyces Scabies, dem Erreger der Faulbrut bei

Bienenlarven, Paenibacillus larvae larvae und dem humanpathogenen Staphylococcus

aureus) von Interesse.

Durch Domänen-Shuffling innerhalb der drei pks-Gencluster in FZB 42 besteht die

Möglichkeit zur Synthese „massgeschneiderter" Polyketide, die eine verbesserte

Haltbarkeit und Wirksamkeit gegenüber den pathogenen Zielmikroorganismen

aufweisen. Da alle drei Polyketide keine Wirksamkeit gegenüber den eingesetzten

eukaryotischen Modellorganismen S. cerevisiae und Fusarium oxysporum aufwiesen ist

der Einsatz der Wirkstoffe auch im medizinischen Bereich möglich.

Tab. 6: Antibakterielle, antifungale und hämolytische Aktivität von Gen-knock-out

Mutanten. Herstellung der Mutanten CH6, CH7 und CH8 s.o. Übrige Mutanten wie

beschrieben (Koumoutsi et al. 2004, J. Bacteriol., 186, 1084- 1096)

3 Nachweis in dem Kulturfϊltrat nach HPLC Chromatographie und Massenspektroskopie 4 nicht bestimmt Tabelle 2: Das pksl-Gencluster von B. amyloliquefaciens FZB42 Größe/ Gene/pks orf Modul Domäne Reduktion Funktion Position G+C aa pkslB Hvdroxyacylglutathione hvdrolase TEC 3.1.2.6) 229aa 4254_pksl 1..690 42.79% Malonyl-CoA-facyl-carrier-protein] transacylase (EC 2.3.1.39) 293 aa

pkslD Malonyl-CoA-facyl-carrier-protein] transacylase (EC 2.3.1.39) 379aa 4256_pksl 4256 Load AT 1850..2989 47.49% -t- pkslE 746aa u 4257_pksl 4257 Load AT FabD, (acyl-carrier-protein) S-malonyltransferase 2991..5231 48.57% Dioxygenases related to 2-nitropropane dioxygenase 330...672 pkslF 82aa 5297..5545 ACP Acyl carrier protein 46.34% ( pkslG -'4260jpksl 4260 HMG CoA PksG, 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA synthase 420aa 5597..Ö859 50.32% pksH ' ■'

Fortsetzung von Tabelle 2 pksl 4262_pksl 4262 ECH Enoyl-CoA hvdratase TEC 4.2.1.17) 249aa 7Ö39..8388 49.13% pksP Putative polyketide synthase pksK 4273_pksl EntF Non-ribosomal peptide synthetase modules 32...474 8428..23376 50.32% Load CaiC Acyl-CoA synthetases (AMP-forming)/AMP-acid ligases II 22...567 AMP-binding enzyme 61...477 ACP AcpP, Acyl carrier protein 580...658 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 593...652 Condensation domain 679...974 EntF Non-ribosomal peptide synthetase modules 904...1557 CaiC Acyl-CoA synthetases (AMP-forming)/AMP-acid ligases II 11333...1632 AMP-binding enzyme 1167...1564 Ml COG3321 Polyketide synthase modules 1750...3777 KSl FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1754...2178 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 175 L..2000 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2008...2177 KRl beta-ketoacyl- ACP reductase 2880...3038 ACPI PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 3098...3163 ACP PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 3190...3256 M2 COG3321 Polyketide synthase modules 3307...4064 KS2 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 3306...3745 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 3307...3556 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 3564...3745 ACP2 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 4418...4484 frame shift Fortsetzung von Tabelle 2 pksJ" Putative polyketide synthase pksK 445aa 4274_pksl 4274 M3 COG3321 Polyketide synthase modules 1...435 22040...23374 51.24% KS3 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-caπier-protein) synthase 10...399 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 234...398

pksL Putative polyketide synthase pksL 448 laa 4281_pksl 4281 M4 COG3321 Polyketide synthase modules 418...1455 23360..36805 50.23% KS4 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 418...855 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 419...673 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 681...858 KR FabG, Dehydrogenases with different specificities 1498...1656 ACP4 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1772...1836 M5 Polyketide synthase modules 1899...2509 KS5 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1898...2330 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1898...2153 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 21161...2338 ACP5 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 2609...2667 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 2717...2783 M6 COG3321 Polyketide synthase modules 2839...3479 KS6 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 2844...3264 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 2844...3087 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 3095...3263 KR FabG, Dehydrogenases with different specificities 3643...3781 ACP6 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 3927..J993 M7 Polyketide synthase modules 4030...4056 KS7 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-caπier-protein) synthase 4032...4436 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 4030...4230 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 4271...4435 Fortsetzung von Tabelle 2 pksM Putative polyketide synthase pksL 3518aa 4290_pksl 4290 ACP7 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 299-363 36802..47358 49.82% M8 COG3321 Polyketide synthase modules 397...1474 KS8 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase (I and II) 398...833 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 397...642 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 655...832 KR adh short, short chain dehydrogenase 1533...1669 ACP8 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 2169...2234 M9 COG3321 Polyketide synthase modules 2290...2878 KS9 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 2290...2707 Beta-ketoacyl' synthase, N-terminal domain 2292...2526 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2534...2702 KR adh_short, short chain dehydrogenase 3136...3237 ACP9 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 3389...3454 -~J

pksN ( Putative polyketide synthase pksK 5433 aa 4302_pksl 4302 pfam00668 Condensation domain 35...326 47348..Ö3649 50.30% MIO COG1020 EntF, Non-ribosomal peptide synthetase modules 256...913 CaiC Acyl-CoA synthetases (AMP-forming)/AMP-acid ligases II 479...987 pfam00501 AMP-binding enzyme 514...913 ACPlO PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 1007...1071 MI l COG3321 Polyketide synthase modules 1103...2125 KSI l FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1106...1531 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1103...1353 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 1361...1530 KR FabG, Dehydrogenases with different specificities 2198...2409 ACPI l PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 2453...2519 M12 COG3321 Polyketide synthase modules 2572...3610 KS 12 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-caπier-protein) synthase 2575...3009 Fortsetzung von Tabelle 2 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 2575...2823 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2831...3009 KR adh_short, short chain dehydrogenase 3679...3780 ACP12 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 3933...3999 M13 COG3321 Polyketide synthase modules 4051...5029 KS 13 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 4053...4487 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 4052...4298 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 4306...4487 pksR Polyketide synthase 2377aa 4306_pksl 4306 MeT methyltransferase 102...243 63753..70886 50.30% ACP13 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 352...412 M14 COG3321 Polyketide synthase modules 477...995 KS 14 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 479...913 OO Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 479...730 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 738...913 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 1350...1409 M15 COG3321 Polyketide synthase modules 1457...2374 KS15 FabB, 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1458...1870 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1458...1686 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 1686...1870 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site. 2062...2120 TE Thioesterase domains of type I polyketide synthases 2149...2349 pksS Cytochrome P450 (EC 1.14.-.-) 415aa 4307_pksl 4307 CypX CypX, Cytochrome P450 11...415 71247..72494 46.51% Tabelle 3: Das pks2-Gencluster von B.amyloliquefaciens FZB42 Größe/ Gene/pks G+C Modul Domäne Reduktion Funktion Position AS/bp pks2A 2146 768aa 2146jpks2 43% Load AT Malonyl-CoA-facyl-caπier-protein] transacylase (EC 2.3.1.39) 1...302 1..2307 Dioxygenases related to 2-nitropropane dioxygenase 332-646 pks2B 2150 4086aa 2150_pks2 44% Ml COG3321 Polyketide synthase module 10...583 2329..14589 KSl 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 10...430 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1...256 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 264-433 KRl hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 1166...1344 ACPI PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1440...1503 COG3321 Polyketide synthase module 1548...1988 VO KS2 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1556...1985 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1550...1800 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 1808..1984 KR2 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 2703...2863 ACP2 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 2954...3018 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 3048...3114 COG3321 Polyketide synthase module 3164...4002 KS3 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 3163...3602 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 3164...3413 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 3421...3602 Fortsetzung von Tabelle 3 pks2C 2153 1590aa 2153jpks2 44% KR3 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 278...455 14589..19361 ACP3 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 547...611 J M4 COG3321 Polyketide synthase module 657...1257 KS4 hydroxyl 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 661...1086 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 660...907 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 915...1085 DHl Dehydratase 1289-1430

2154_pks2 KR4 alkene beta-ketoacyl-ACP reductase 331...435 19379..28117 ACP4 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 555...619 M5 COG3321 Polyketide synthase module 672...1247 KS5 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 674...1090 K) O Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 674...917 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 925...1093 ACP5 keto PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 2030...2096 M6 COG3321 Polyketide synthase module 2155...2626 KS6 3-oxoacyl-(acyl-caπier-protein) synthase 2155...2584 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 2155...2410 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2408...2587 ACP6 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 2644...2710 Fortsetzung von Tabelle 3 pks2E 2157 2334 aa 2157_pks2 45% KR5 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 277...433 28110..35114 MZ COG3321 Polyketide synthase module 646...1223 KS7 3 -oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 649...1069 Beta-ketoacyl syntliase, N-terminal domain 648...869 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 901...1069 KR6 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 1470...1601 ACP7 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1753...1819 M8 COG3321 Polyketide synthase module 1867...2306 KS8 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1864...2283 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1868...2109 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2112...2284 N> >— > pks2F 2160 1906 aa 2J60_pks2 44% ACP8 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 329...393 35129..40849 ACP PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 43 L..495 KR7 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 759...964 M9 COG3321 Polyketide synthase module 1021...1549 KS9 3 -oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1022...1444 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1021...1266 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 1274...1443 Fortsetzung von Tabelle 3 pks2G 2162 2460aa 2162_pks2 43% KR8 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 294...462 40846..48228 ACP9 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 545...607 MIO COG3321 Polyketide synthase module 665...1125 KSlO 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 665...1087 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 665...901 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 909...1086 ACP PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1145...1211 KR9 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 1604...1786 ACPlO PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1892...1952 MI l COG3321 Polyketide synthase module 1999...2431 KSI l 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 1998...2412 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 1998...2240 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2248...2412 pks2H 2164 1283aa 2164jpks2 42% ACPI l PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 393...459 48279..52130 KRlO hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 729...860 TE Thioesterase 1077...1166 Tabelle 4: Das pks3- Gencluster von B.amyloliquefaciens FZB42

Größe/ Gene/pks G+C Modul Domäne Position aa/nt pks3A 1160 Malonyl-CoA-facyl-carrier-protein] transacylase (EC 1160j)ks3 46% Loading AT 2.3.1.39) 791 4085..6460 40-325 FMN dependent oxidoreductase 350-790 pks3B 1157 457 1157_pks3 47% CaiC Long-chain-fattv-acid— CoA ligase CEC 6.2.1.3) 2-452 7775..9139 pks3C 1155 LO 1155_pks3 49% KR adh hydroxyl 3-oxoacyl-[acyl-carrier protein] reductase (EC 1.1.1.100) 8-245 9154..9891 pks3D 1154 polyketide synthase 4196 1154_pks3 50% ACP PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 6...71 9931..22521 COG3321 Polyketide synthase module 1 117-914 KSl 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 118-541 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 115-364 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 372-541 KR KRl hydroxyl keto reductase [module 1] 1245-1393 ACPI PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1873-1937 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1980-2047 Fortsetzung von Tabelle 4 M2 COG3321 Polyketide synthase module 2 2095-3002 KS2 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 2094-2482 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 2096-2330 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2338-2515 DH alkene Dehydratase 2710-2873 KR KR2 Beta-keto-acyl-reductase 3182-3383 ACP2 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 3427-3493 M3 COG3321 Polyketide synthase module 3 3536-4139 KS3 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 3541-3976 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 3539-3787 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 3795-3976 pks3E polyketide synthase 2098 1150_pks3 COG3321 Polyketide synthase modules 32-288 £ 22540..28836 ACP3 keto PP binding, phosphopantetheine attachement site 333-395 M4 COG3321 Polyketide synthase module 4 450- 1056 KS4 3-oxo-acyl-(acyl carrier protein) synthase 452-832 Beta ketoacyl synthase N terminal domain 449-699 Beta ketoacyl synthase C terminal domain 707-884 KR KR3 hydroxyl keto reductase, related to short-chain alcohol dehydrogenases 1267-1468 ACP4 PP binding, phosphopantetheine attachement site 1539-1605 M5 COG3321 Polyketide synthase module 5 1642-2079 KS5 3-oxo-acyl-(acyl carrier protein) synthase 1646-2050 Beta ketoacyl synthase N terminal domain 1644- 1877 Beta ketoacyl synthase C terminal domain 1885-2049 Fortsetzung von Tabelle 4 pks3F 1148 polyketide synthase 1913 1148_pks3 50% ACP5 keto PP binding, phosphopantetheine attachement site 322-386 28861..34602 M6 COG3321 Polyketide synthase module 6 431-923 KS6 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 431-868 Beta ketoacyl synthase N terminal domain 431-683 Beta ketoacyl synthase C terminal domain 691-868 ACP6 keto PP binding, phosphopantetheine attachement site 930-994 MZ COG3321 Polyketide synthase module 7 1015-1426 KR KR4 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 1695-1908 ρks3G 1144 polyketide synthase 5182 1144_pks3 51% MeT MeTl Methyltransferase 139-264 34720..50268 ACP7 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 373-438 ACP PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 471-536 N) Ui MS COG3321 Polyketide synthase module 8 598-1297 KS7 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 598-1016 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 597-830 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 838-1015 KR KR5 hydroxyl beta-ketoacyl-ACP reductase 1674-1837 ACP8 Acyl carrier protein 1956-2020 M9 COG3321 Polyketide synthase module 9 2071-2960 KS8 3-oxoacyl-(acyI-carrier-protein) synthase 2076-2479 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 2076-2479 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2310-2479 DH DH2 alkene dehydratase 2670-2833 KR KR6 short chain dehydrogenase 3145-3343 ACP9 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 3388-3454 Fortsetzung von Tabelle 4 COG3321 Polyketide synthase module 10 3505-4521 KS9 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 3507-3936 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 3505-3754 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 3762-3936 KR KR7 hydroxyl ketoreductase 4329-4450 ACPlO PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 4607-4673 COG3321 Polyketide synthase module 11 4714-5144 KSlO 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 4714-5131 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 4714-4956 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 4964-5131 ρks3H 1134 polyketide synthase 2537 U34jpks3 50% ACPI l PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 248-362 50378..57991 KR KR8 hydroxyl ketoreductase 570-778 NJ M12 COG3321 Polyketide synthase module 12 839-1428 KSI l 3 -oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 843-1263 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 843-1091 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 1099-1270 KR KR9 hydroxyl ketoreductase 1670-1876 ACP12 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1947-2012 M13 COG3321 Polyketide synthase module 13 2055-3481 KS 12 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 257-2466 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 2056-2290 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 2298-2466 Fortsetzung von Tabelle 4 pks3I 1 129 polyketide synthase 2050 1129_pks3 51% ACP13 keto PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 274-340 58014..64166 M14 COG3321 Polyketide synthase module 14 653-1723 KS 13 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 655-1081 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 655-902 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 910-1080 DH DH3 Dehydratase 1281-1431 KR KRlO ketoreductase 1800-1937

pks3J 1127 polyketide synthase 2071 1127_pks3 49% MeT MeT2 Methyltransferases 166-340 64163..70378 ACP 14 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 403-467 ER ERl methylene enoyl reductase 532-851 M15 COG3321 Polyketide synthase module 15 882-1459 KS 14 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase 883-1288 Beta-ketoacyl synthase, N-terminal domain 881-1114 Beta-ketoacyl synthase, C-terminal domain 1122-1291 ACP 15 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1542-1608 PP-binding, Phosphopantetheine attachment site 1646-1712 TE TEl hydrolysis Thioesterase domains of type I polyketide synthases 1755-1959

pks3K 1123 MO MO Cytochrome P450 109 TEC 1.14.-.-) 386 1123_pks3 CypX, Cytochrome P450 [Secondary metabolites biosynthesis 9-386 70454..71614 Fortsetzung von Tabelle 4 pks3L 1 ] 415 U22_pks3 HMGS Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (EC 4.1.3.5) 71672..72919 PksG 3-hydroxy-3-methyIglutaryl CoA synthase 1-413 pks3M 1120 1120_pks3 49% ER Enoyl-CoA hydratase TEC 4.2.1. \1\ 248 72979..73725 CaiD Enoyl-CoA hydratase/carnithine racemase [Lipid metabolism] 1-246

OO Tabelle 7: Das pksl-Genkluster von Bacillus amyloliquefaciens FZB42

Quelle: SEQ-ID-NO: 1, GenBank Accession Number: AJ634060, Länge: 72612 bp, beinhaltet das pksl -Operon (bp L.71249)

Gene des Bacillus amyloliquefaciens pksl Operons (pkslB, C, D, E, F, G, H, I, J, L, M, N, R) und das pksl S Gen

Tabelle 8: Das pks2-Genkluster von Bacillus amyloliquefadens FZB42

Quelle: SEQ-ID-NO: 2, GenBank Accession Number: AJ634061, Länge: 53724 bp, beinhaltet das pks2-Operon (bp L. 52130)

Gene des Bacillus amyloliquefadens pks2 Operons (pks2A, B, C, D, E, F, G, H)

Tabelle 9: Das pks3-Genkluster von Bacillus amyloliquefaciens FZB42

Quelle: SEQ-ID-NO: 3, GenBank Accession Number: AJ634062, Länge: 74700 bp, beinhaltet das pks3-Operon (bp 3469..73761)

rbamOl 165 Gen, rbamOl 163 Gen, nusG Gen, prol Gen und das pks3 operon (pks3A, B, C, D, E, F, G, H, I5 J, K, L, M Gen) von Bacillus amyloliquefaciens