DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN.

La presente invención se refiere a una nueva molécula aislada de la especie Koanophyllon gibbosum (Urb.) R.M. King & H. Rob. (sin. Eupatorium gibbosum ), endémica de la isla La Española, específicamente a una lactona sesquiterpénica tipo germacranólido, que ha mostrado una importante actividad anticancerígena in vitro en líneas celulares tumorales humanas, y el uso de dicha molécula en la preparación de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de distintos tipos de cáncer.

Las Lactonas Sesquiterpénicas son un grupo de metabolitos secundarios hallados a lo largo del reino vegetal que comprenden un gran grupo de, sobre 5,000 compuestos conocidos, siendo más comunes en familias tales como Cactaceae, Solanaceae, Araceae y la Euphorbiaceae. Sin embargo son más prevalentes en la Asteraceae, donde pueden ser halladas casi de manera omnipresente.

Las lactonas sesquiterpénicas son compuestos de 15 átomos de carbono que consisten de tres unidades de isopreno y un grupo lactona. De acuerdo a su esqueleto carbonado cíclico se pueden categorizar en los siguientes grandes grupos: germacranólido s (anillos de diez carbonos); eudesmanólidos y eremofilanólidos (compuestos con dos anillos fusionados de 6 carbonos); y guaianólidos, pseudoguaianólidos e hipocretenólidos (todos compuestos con anillos fusionados de 5 y 7 carbonos). Muchos miembros de estos grupos también llevan estructuras de anillo abierto tales como los iso-seco- tanapartólidos.

La mayoría de las lactonas sesquiterpénicas han mostrado actividad citotóxica. Una buena parte de ellas presentan la funcionalidad g-lactona-a, b-insaturada, la cual, vía adición conjugada, es capaz de reaccionar con grupos nucleofílicos (como tioles o aminas) presentes en moléculas biológicas, tales como enzimas, inhibiéndolas. De esta manera, por ejemplo, en el caso del cáncer este tipo de moléculas reaccionan con enzimas tales como la ADN polimerasa (misma que necesita la célula para hacer una copia de su ADN para una nueva célula) desactivándola.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN.

El cáncer es una de las principales causas de muerte tanto en países desarrollados como en países en vías de desarrollo y por lo tanto es un problema global. Según las estadísticas mundiales sobre la citada enfermedad, dadas a conocer por la Sociedad Americana del Cáncer, el número total de muertes debido a la misma en 2018 fue de 9.6 millones, con un 70% en países en vías de desarrollo. Los datos antes presentados evidencian que el cáncer es una enfermedad catastrófica que requiere atención inmediata.

La literatura científica provee numerosos estudios que presentan la actividad anticancerígena de las lactonas sesquiterpénicas. Concretamente para el caso del género Eupatorium (familia Asteraceae), género en el cual se clasificó inicialmente la especie en cuestión, podemos citar, entre otras, las moléculas Euparotín, Eupaclorín, Eupatólido, Eupaserín, y Eupatopicrín.

Se ha sugerido que los grupos metileno exocíclicos conjugados, bien con el grupo carbonilo del anillo lactónico, o bien con otros grupos carbonilo a, //-insaturados, son los responsables de la bioactividad observada en las lactonas sesquiterpénicas, pues son poderosos electrófilos capaces de, mediante reacciones tipo adición de Michael, enlazarse con nucleófilos biológicos tales como los grupos sulfhidrilo.

Las lactonas sesquiterpénicas son prometedoras candidatas en la formulación de nuevos fármacos para el cáncer dada su mayor selectividad para células tumorales y células madre, en fase acelerada de mitosis, por lo que se ubican en posición favorecida para su uso clínico. El partenólido es una lactona sesquiterpénica tipo germacrano que ha sido objeto de numerosos estudios anticancerígenos y que se encuentra en fase de estudios preclínicos.

Entre los múltiples estudios realizados al partenólido, podemos mencionar el llevado a cabo por el Dr. Shanshan Pei (2013) en el que se destaca que esta molécula ataca el metabolismo del glutatión en las células madre del cáncer de leucemia al inducir un agotamiento casi completo de glutaciones y una muerte celular grave. Como se ha señalado anteriormente, la bioactividad del partenólido recae sobre el grupo a, b- i n s a t u ado -g- 1 ac t o n a que reacciona fácilmente con el grupo tiol libre de glutatión. Además, se han probado efectos combinados del partenólido con los fármacos Ara-C e Idarubicina, estos últimos de uso común en quimioterapia, hallándose efectos sinérgicos que provocaron un aumento sustancial de la actividad anticancerígena.

Como se presenta más adelante, la nueva molécula que se intenta proteger en la presente solicitud es, desde el punto de vista estructural, muy similar al partenólido, pero con la presencia de algunas cadenas carbonadas cortas que la hacen única.

Existen varias publicaciones que presentan patentes de aplicación de lactonas sesquiterpénicas de origen natural que serían empleadas como agentes antitumorales, algunas de las cuales citamos a continuación. La solicitud de patente china CN 201610515609 presenta una lactona sesquiterpénica aislada del rizoma de la especie Valeriana jatamansi Jone, cuya estructura se presenta a continuación:

Esta molécula se emplearía para la inhibición de la proliferación de células de cáncer gástrico y la promoción de la apoptosis de las células cancerosas de dicho tipo de cáncer. Los ensayos clínicos mostraron eficacia en la inhibición de la proliferación del citado tipo de cáncer.

Se conoce también que la asociación de las lactonas sesquiterpénicas furanoeliangólidas con sistemas cargadores de fármacos tecnológicamente delineados permite mejorar la biodisponibilidad de esas sustancias, es por ello que existe un determinado grupo de patentes que se refieren a la asociación de estas lactonas sesquiterpénicas con otros principios activos para mejora su biodisponibilidad. La asociación por ejemplo de furanoeliangólidos con cargadores de fármacos, se describe en la patente WO2013059898 para aumentar la interacción de estas sustancias con los tejidos infectados con parásitos de la familia Trypanosomatidae, particularmente los causantes de la enfermedad de la enfermedad de Chagas, de las Leishmaniasis y de la Tripanosomiasis africana o estas sustancias también pueden utilizarse en el tratamiento de tumores. Se señala también que otra aplicación de la invención reportada en ese documento es para el tratamiento del cáncer. Se reconoce que una serie de alteraciones en los mecanismos de reproducción celular que controlan su crecimiento, y provocan crecimiento celular desordenado y continuo, provocan en esas células anormales la capacidad de invadir tejidos y órganos adyacentes, así como la capacidad de migrar y alojarse en otras regiones del organismo (metástasis). El cáncer puede por tanto surgir de cualquier tipo de célula y de cualquier tipo de tejido, no siendo una enfermedad única. De división rápida, estas células anormales tienden a ser muy agresivas e incontrolables, determinando la formación de tumores o neoplasias como resultado de la acumulación de células cancerosas. En dicha propuesta de invención se revela un sistema de nanoacarradores coloidales que contienen lactonas sesquiterpénicas lipofílicas unidas a un núcleo oleoso o a una matriz polimérica e incluso en la membrana polimérica de las formulaciones nanoestructuradas, denominadas también nanocápsulas o nanoesferas. El sistema de encapsulación de los compuestos químicos activos citados en esa invención contienen tensoactivos hidrofílicos y pofílicos, aceites y polímeros, además de las sustancias activas sesquiterpenóides furanoeliangolidos. Los principios activos de la citada invención tienen como grupos activos la a-metilen- lactona, la furanona y ásteres conjugados y son preferentemente sustancias que contienen la estructura del furanoeliangólido, representada abajo:

En la solicitud de patente US20120100175 se refiere un método para la inhibición de células cancerosas, que comprenden administrar una cantidad efectiva de una lactona sesquiterpénica, antrocina, y sus sales farmacéuticamente aceptables, juntas con un portador farmacéuticamente aceptable, en el que las células cancerígenas se seleccionan de células de cáncer colorrectal, células de cáncer de hígado, células de cáncer de pulmón o células de cáncer de mama.

El principio activo, la antrocina, se extrae de cuerpos fructíferos de Antrodia camphorata, un hongo medicinal que crece naturalmente dentro del tronco del árbol Cinnamomum kanehiare, una especie de árbol nativo de Taiwán. La extracción del principio activo se realiza con disolvente a reflujo y purificado por columna de gel de sílice. La cantidad efectiva de antrocina que se propone es una concentración de 0.5 hasta 50 mM para inhibición de células cancerígenas. Las pruebas realizadas mostraron que las células no tratadas exhibieron el patrón esperado para células en continuo crecimiento, mientras que las células tratadas con antrocina se acumularon progresivamente en Fase subGI, mostrando además una eventual progresión a apoptosis, mostrando que después de 48 h (58.3%) a 10 pM de antrocina como tratamiento la antrocina induce acumulación de subGI y apoptosis de células MDA- MB-231.

En la patente US7563913 se refiere el uso de lactonas sesquiterpénicas, que han sido extraídas y aisladas de plantas pertenecientes a la Familia Compositae (Asteraceae) o plantas pertenecientes al género Ludwigia de la familia Onagraceae, en preparaciones farmacéuticas con efectos farmacológicos, como por ejemplo, inhibidores contra enfermedades de la piel (tinea), hepatitis, icterus y cistitis. Los principios activos corresponden a compuestos con la fórmula general presentada a continuación:

La actividad citostática de los compuestos ensayados se estudió en términos de valores numéricos de la actividad citotóxica utilizando células humanas de leucemia mieloide con cepa de células HL-60. Los valores de IC ₅₀ fueron calculados a partir de una curva de dosis-respuesta, obteniéndose valores entre 0.05 y 4.97 pg/mL.

En la solicitud de patente WO200539523 se proponen unas composiciones que comprenden como agentes activos al menos una lactona sesquiterpénica o al menos un extracto vegetal que contiene una lactona sesquiterpénica. La invención también se refiere al uso de una lactona sesquiterpénica o un extracto vegetal que contiene una lactona sesquiterpénica en los campos farmacéutico, dermatológico o cosmético, para tratar y/o prevenir afecciones patológicas o trastornos estéticos resultantes de procesos por muerte celular vía apoptosis. La invención también se refiere al campo nutracéutico. Entre las lactonas sesquitérpenicas, la invención contempla particularmente la vulgarina cuya fórmula estructural se presenta a continuación.

Las composiciones farmacéuticas, nutracéuticas, dermatológicas o cosméticas que se proponen en la patente antes indicada son capaces de inhibir las caspasas y por lo tanto resultan particularmente útiles para el tratamiento o la prevención de patologías o trastornos estéticos resultantes del proceso de muerte celular apoptótica. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.

De acuerdo con la presente solicitud, el término cáncer se refiere al crecimiento maligno de células en distintos órganos del cuerpo o la piel, por ejemplo, sin limitación, mama, pulmón, cérvix o colon; además, el término cáncer en la presente solicitud incluye tanto células tumorales metastásicas, tales como, sin limitación, leucemia, linfoma, melanoma, como carcinomas de tejido, por ejemplo, sin limitación, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon.

En la presente solicitud el término“farmacéuticamente aceptable” significa aprobado o capaz de ser aprobado por una agencia reguladora del gobierno de la República Dominicana, o de un gobierno de estado, o la correspondiente agencia, en países diferentes de la República Dominicana; o bien citado en una farmacopea generalmente reconocida para el uso en sujetos. El término“sujeto” incluye humanos. Los términos “sujeto” y“humano” se usan indistintamente en la presente solicitud. En esta solicitud el término“sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal del compuesto de la invención que es farmacéuticamente aceptable, y que tiene la actividad farmacológica deseada del compuesto original. Dichas sales no son tóxicas, y pueden ser orgánicas o inorgánicas de adición de distintos ácidos y bases.

Una“cantidad terapéuticamente efectiva” significa la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto para el tratamiento de una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento de la enfermedad. La“cantidad terapéuticamente efectiva” puede variar según la enfermedad y su gravedad, así como distintas características del sujeto tratado (edad, peso, etc.).

La presente invención consiste en el uso de una nueva molécula, más específicamente de una lactona sesquiterpénica tipo germacranólido, aislada a partir de la especie Koanophyllon gibbosum (Urb.) R.M. King & H. Rob. (sin. Eupatorium gibbosum ), endémica de la isla La Española, de fórmula general (I):

donde Ri, R ₂ , R ₃ , R ₄ y R ₅ son sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en hidrógeno (-H), halógeno (por ejemplo, flúor, cloro, bromo o yodo), hidroxilo (-OH), cadenas alifáticas C ₁ -C ₁₀ , sustituidas o no (-R), fenilo (-C _Ó H _S ), fenilo sustituido (-C ₆ H ₄ R), acilo (-COR), alcoxi (-OR), carboxilo (-COOH), aldehido (- CHO), ásteres de ácidos carboxílicos (-COOR), amida (-CONR ₂ ), amino (-N¾, o - NHR, o -NR ₂ ), azo (-N=N-), diazo (-N ₂ ⁺ ), azida (-N ₃ ), hidracina (-NR-NR ₂ ), nitro (- NO ₂ ), nitroso (-NO), ciano (NC-), isociano (CN-), cianato (-OCN), isocianato (-NCO), tiol (-SH), tioéter (-SR), sulfóxido (-SOR), sulfona (-SO ₂ R), ácido sulfónico (-SO ₃ H), ésteres de sulfonilo (-SO ₃ R), siendo R un grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo, sustituido o no, cíclico o no, de 1 a 10 átomos de carbono en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con la presente solicitud,“alquilo” se refiere a cadenas de átomos de carbono, con o sin ramificación de 1 a 10 átomos de carbono;“alquenilo” se refiere a cadenas carbonadas con o sin ramificación, que tengan por lo menos un doble enlace carbono-carbono con entre 2 a 10 átomos de carbono;“alquinilo” se refiere a cadenas carbonadas con o sin ramificaciones, que tengan por lo menos un triple enlace carbono- carbono con entre 2 a 10 átomos de carbono.

Una realización muy preferible es que la molécula de la invención sea el (laR,4£',5aR,8aR,9R,10aR)-10a-metil-9-[(2-metilacryloyl)oxi ]-8-metilideno-7-oxo- la, 2, 3, 5a, 7, 8, 8a, 9, 10, 10a decahidrooxireno[5,6]ciclodeca[l,2-h]furano-4-carboxilato de metilo (compuesto de fórmula II).

El compuesto de fórmula (II) presenta una importante actividad anticancerígena, observada in vitro, siendo capaz de inhibir el crecimiento celular de las líneas celulares tumorales humanas A549, HBL-100, HeLa, SW-1573, T-47D, y WiDr.

Una realización preferible es una composición farmacéutica que comprende al compuesto de fórmula (II), bien sin modificación, o bien en forma de una sal farmacéuticamente aceptable de dicha molécula junto con excipientes adecuados, para el tratamiento de distintos tipos de cáncer.

La administración preferible de la composición farmacéutica de la invención es vía intravenosa, aunque también puede ser administrada por vía oral, muscular o intramuscular. Preferiblemente dicha composición farmacéutica está presentada en una unidad de dosificación.

Otra realización preferible es la composición farmacéutica de la invención junto con excipientes farmacéuticamente aceptables y al menos otro agente terapéutico para el tratamiento de distintos tipos de cáncer. Algunos otros posibles agentes terapéuticos a emplear conjuntamente con el compuesto de fórmula (II), son por ejemplo, sin limitación, camptotecina, cisplatino, etopósido, paclitaxel (taxol ^® ), vinblastina, vincristina.

Otra realización de la invención, es un método de tratamiento de distintos tipos de cáncer, que consiste en administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la molécula de la invención, bien sin modificación, o bien en forma de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.

Ejemplo 1. Aislamiento y caracterización del compuesto de fórmula II.

Las partes aéreas de Koanophyllon gibbosum (sin. Eupatorium gibbosum ) se secaron al aire libre y a la sombra y se molieron hasta obtener un polvo fino. El material vegetal molido (405 g) se extrajo con acetona a temperatura ambiente. El extracto crudo resultante (10 g) se disolvió en etanol al 95% (250 mL) y se trató con una solución de acetato de plomo al 5% (250 mL) para precipitar la clorofila. Después de 24 horas, la mezcla se filtró, se concentró a presión reducida para remover la mayoría del etanol, y se extrajo sucesivamente con hexanos (3 x 250 mL) y acetato de etilo (3 x 250 mL). El residuo de acetato de etilo se lavó con una solución de cloruro de sodio al 1% (1 x 250 mL) obteniéndose un total de 3.2 gramos de extracto soluble en acetato de etilo. Este último extracto se sometió a cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con mezclas de hexanos-acetato de etilo de polaridad creciente, colectándose 7 fracciones (F1-F7). La fracción F6 (478.1 mg) se sometió a cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con mezclas de hexanos-acetato de etilo de polaridad creciente, obteniéndose finalmente en forma pura el compuesto de fórmula II (8.1 mg). A dicho compuesto se le asignó la fórmula molecular C ₂₀ H ₂₄ O ₇ , basándose en el análisis de espectrometría de masas de alta resolución con ionización por electrospray (HRESIMS), (m/z 399.1419 [M + Na] ⁺ , caled 399.1420). Los análisis espectroscópicos de resonancia magnética nuclear (RMN) de protón ( H) y carbono 13 ( C), entre otros, (ver tabla 1), permitieron elucidar la estructura del compuesto en cuestión. La estructura elucidada del compuesto de fórmula II se sometió a diversas bases de datos de compuestos químicos para compararla con estructuras existentes. No se encontró ninguna estructura igual, lo que evidenció que se estaba en presencia de un nuevo producto natural.

Tabla 1. Datos de RMN ( ^l U, 700 MHz; ¹³ C, 175 MHz, CDCI ₃ , d en ppm, J en Hz) para el compuesto de fórmula II

Ejemplo 2. Actividad Antiproliferativa del compuesto de fórmula II.

La actividad antiproliferativa del compuesto de fórmula II se estudió en un panel de líneas celulares humanas procedentes de tumores sólidos de origen diverso compuesto por: HBL-100 y T-47D (mama); HeLa (cérvix); A549 y SW1573 (pulmón), y WiDr (colon).

Las células se mantuvieron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 5% de suero fetal bovino y 2 mM de glutamina. Las células se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa. Se aplicó el protocolo del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de los EEUU con las modificaciones introducidas por el BioLab del Instituto Universitario de Bio-Orgánica “Antonio González”, de la Universidad de La Laguna, Tenerife, Islas Canarias, España. Las células se cultivan en monocapa en placas de 96 pocilios. Los productos a ensayar se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) a 400 veces la concentración máxima de ensayo, que es 250 pg.mL ¹ . A las 24 h de la siembra las células son expuestas a diluciones decimales seriadas del producto en el rango 0.0025-250 pg.mL ¹ durante un periodo de tiempo de 48 h. Las células control son expuestas a una concentración de DMSO equivalente (0.25% v/v, control negativo). Cada compuesto se ensaya por triplicado.

Tras el tiempo de exposición de 48 h las células de cada pocilio se precipitan con 25 pL de ácido tricloroacético frío al 50% (p/v) y se fijan durante 60 min a 4 °C. Una vez transcurrido este tiempo los pocilios se lavan con agua y se secan. Entonces se realiza el ensayo colorimétrico de la sulforrodamina B (SRB). La células fijadas se tiñen durante 15 min con 25 pL de una disolución de SRB al 0.4% (p/v) en ácido acético al 1% (v/v). El exceso de colorante se elimina con 3-4 lavados con una disolución de ácido acético al 1% (v/v). Los pocilios se secan y el colorante se disuelve con 150 pL de una disolución de Tris base 10 mM en agua milliQ.

La densidad óptica (DO) de cada pocilio se mide a 492 nm con un lector de microplacas (PowerWave XS, BioTek). A los valores de DO se les corrige el efecto del ruido de fondo que se cuantifica en los pocilios que solo contienen medio de cultivo. Para cada concentración de producto se calcula el porcentaje de crecimiento (PC) según las fórmulas del NCI. Para los cálculos se utilizan los valores de DO de los pocilios que contienen células no tratadas (control, C), células al inicio del tratamiento (To) y células al final del tratamiento (T). Si T > To el cálculo es PC = 100 x [(T-To)/(C-To)]. Si T < To el cálculo es PC = 100 x [(T-To)/(To)]. La actividad biológica se define en términos de GI50 (concentración inhibitoria del crecimiento del 50%), que representa la concentración a la cual PC es +50. Con estos cálculos un valor de PC = 0 corresponde a la cantidad de células presentes al comienzo de la exposición a los productos, y un valor negativo de PC implica muerte celular neta. Para todos estos cómputos se utilizan hojas de cálculo y programas informáticos.

Los resultados de los ensayos de actividad antiproliferativa del compuesto de fórmula II frente a las líneas celulares de tumores humanos sólidos citados, se indican en la tabla 2.

Tabla 2. Actividad Antiproliferativa (GI ₅₀ ) del compuesto de fórmula II frente a líneas celulares de tumores humanos sólidos ⁶¹ .

“Los valores se dan en mM y son el promedio de tres a cuatro experimentos; la desviación estándar se da entre paréntesis.