AGENTS DE SILANISATION A GROUPEMENT SACCHARIDIQUE

TERMINAL ET LEURS UTILISATIONS, NOTAMMENT POUR LA

FONCTIONNALISATION DE SUPPORTS SOLIDES

La présente Invention est relative à des agents de silanisation comportant un groupement saccharidique terminal et à leur utilisation pour la fonctionnalisation de supports solides. La présente Invention est également relative aux supports solides fonctionnalisés par ces agents de silanisation (puces à sucres), ainsi qu'à leur utilisation, notamment pour l'analyse biologique et en particulier pour le criblage de molécules saccharidiques ou de ligands protéiques d'intérêt. Le développement des technologies des puces à ADN a permis une avancée notable des programmes liés à la génomique fonctionnelle. En effet, la miniaturisation des techniques de dépôt ou de synthèse d'ADN a conduit à la réalisation d'analyses parallélisées, donc multi paramétrables, d'ADN sur des puces. Plus récemment, l'émergence de la protéomique a donné naissance au concept de puces à protéines (Zhu and Sydner, Current Op.; in Chem. Biol., 2003, 7, 55-63). Celles-ci permettent l'analyse parallélisée d'interactions de type protéines/ligands.

De façon encore plus récente, la recherche en biologie s'est intéressée à la "glycomique", c'est-à-dire à l'étude systématique des interactions carbohydrates/protéines. En effet, les glycoconjugués (c'est-à-dire toute molécule possédant un domaine de type glycane, comme les glycoprotéines, les glycolipides, les protéoglycanes, et plus généralement toute molécule contenant des carbohydrates), ont un répertoire fonctionnel particulièrement large. Chimiquement, ces carbohydrates sont des molécules constituées par l'assemblage de blocs monomériques simples. Ces assemblages peuvent être d'origine naturelle, et éventuellement fractionnés, ou d'origine synthétique. Les diverses fonctions des molécules appartenant à la famille des carbohydrates reposent sur la capacité des structures carbohydrates à interagir avec un très grand nombre de molécules. L'analyse des mécanismes des reconnaissances entre les carbohydrates et les autres molécules est un domaine de la recherche en pleine émergence. Elle devrait notamment ,permettre..d'aboutir à la conception de nouvelles molécules thérapeutiques et à une meilleure appréciation des risques toxicologiques de certaines molécules. A l'heure

actuelle, il existe peu de méthodes systématiques permettant de produire des molécules saccharidiques. De ce fait, la détermination des caractéristiques structurales impliquées dans une interaction entre une molécule et un carbohydrate, ainsi que la caractérisation de l'interaction elle-même supposent d'entreprendre des travaux longs et fastidieux. II est donc nécessaire, pour progresser dans la connaissance des mécanismes d'interaction entre des molécules de type saccharidique et leurs ligands, de pouvoir cribler des banques de molécules de type saccharidiques vis-à-vis d'un ligand particulier par exemple.

C'est pourquoi, on constate aujourd'hui qu'un nouveau type de biopuce émerge : différents types de puces à sucres ou "Glycochip", "carbohydrate array" ou bien encore "oligosaccharide array" en anglais, qui constituent une évolution de la puce à ADN ou à protéines dont il a été question ci-dessus, ont donc été proposés par différents auteurs.

Ces puces à sucres sont soit le résultat d'un dépôt sur un substrat donné d'une substance saccharidique naturelle ou synthétique (synthèse ex situ), soit le résultat d'une synthèse multiparallèle supportée (chimie combinatoire) de différentes séquences oligosaccharidiques (synthèse in situ), représentatives de la diversité moléculaire de certaines grandes familles de glycoconjugués endogènes tels que les héparanes par exemple. L'Invention qui va être décrite ci-après s'inscrit dans cette technologie en étant particulièrement bien adaptée à la fabrication de puces à sucres, en permettant notamment la fixation de molécules saccharidiques sur des supports solides selon un procédé de préparation plus simple à mettre en œuvre que les procédés connus de l'art antérieur. En effet, dans la majorité des biopuces, un bras espaceur fait le lien entre la surface du support solide et l'unité fonctionnelle terminale caractérisant la biopuce : oligopeptides, oligonucléotides (Osborn H. M. I. et al, Tetrahedron, 1999, 55, 1807-1850 ; Stetsenko D. A. et al, Bioconjugate Chemistry, 2001, 12, 576-586), ou qligosaccharides (brevet américain λ° 6,579,725).- Cet espaceur -peut jouer plusieurs rôles à la fois :

- c'est une molécule liante, c'est-à-dire qu'il permet de relier la surface du support solide avec une molécule fonctionnelle (sonde) ;

- c'est un bras d'éloignement spatial, c'est-à-dire qu'il permet d'éloigner la molécule sonde de la surface du support solide. La proximité du support solide avec les sites de reconnaissance des molécules cibles par les molécules sondes peut en effet gêner ou empêcher la reconnaissance sonde/cible d'avoir lieu, et donc nuire à la finesse et à la qualité analytique des biopuces. Ceci est particulièrement vrai lorsque les molécules sondes sont de petite taille, notamment dans le cas des puces à sucres.

De nombreux bras espaceurs ont été proposés jusqu'à ce jour, mais ceux-ci ne donnent pas entièrement satisfaction sur le plan pratique car ils présentent un certain nombre d'inconvénients non résolus :

- leur structure implique souvent une limitation sévère quant au choix des procédés chimiques permettant leur fixation sur la surface du support solide,

- ils ne permettent pas tous de fixer des molécules sondes de nature saccharidique,

- ils sont généralement tellement stables après fixation sur la surface du support solide que leur clivage pour récupérer la molécule biologique ne peut pas se faire facilement et peut entraîner la détérioration de cette dernière ou du support,

- les étapes nécessaires à leur synthèse chimique, leur accrochage à la surface du support solide et leur fonctionnalisation sont multiples, parfois difficiles à réaliser et par conséquent souvent d'un coût élevé.

Le brevet américain n° 6,579,725 décrit en particulier un bras espaceur apte à fixer des molécules sondes de nature oligosaccharidiques. Cependant ce bras espaceur, bien que plus efficace que ceux présentés dans un art antérieur encore plus ancien, ne permet pas de résoudre en même temps tous les inconvénients cités précédemment. On peut notamment noter que sa longueur, sa fonctionnalité, sa réactivité et son encombrement ne peuvent pas toujours être générés à volonté.

Les Inventeurs se sont donc donnés pour but de pourvoir à de nouveaux agents.._de silanisation permettant de palier l'ensemble des inconvénients exposés précédemment. Ils se sont en particulier donnés pour but de pourvoir à de nouveaux

agents de silanisation permettant de fonctionnaliser, en une seule étape, la surface d'un support solide par des molécules de nature saccharidique et ce selon un procédé simple, fiable, souple quant à la nature et la longueur du bras espaceur et enfin moins onéreux que les procédés de l'art antérieur. C'est à cette occasion que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente Invention.

La présente Invention a donc pour premier objet un agent de silanisation à fonction terminale saccharidique, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule (I) suivante : A-X-B (I) dans laquelle :

- A représente une molécule sonde de nature saccharidique ;

- X représente un bras espaceur constitué d'une chaîne carbonée ou hétérocarbonée comportant deux extrémités, l'une de ses deux extrémités reliant, de façon covalente, ledit bras espaceur X à A et l'autre extrémité reliant, de façon covalente, ledit bras espaceur X a B, ladite chaîne comportant au moins une insaturation éthylénique située entre ses deux extrémités ; étant entendu que ladite chaîne ne peut pas contenir plusieurs insaturations acétyléniques ;

- B est un groupement silanisé. La présente Invention fournit donc une molécule saccharidique silanisée, pouvant jouer le rôle d'un bras espaceur modulable, dont les différentes structures influencent la réactivité du bras, c'est-à-dire son comportement chimique, électrochimique et/ou stérique.

Selon l'Invention, la molécule sonde de nature saccharidique constituant l'unité A des composés de formule (I) ci-dessus peut être d'origine naturelle ou synthétique, et être éventuellement protégée par un ou plusieurs groupements protecteurs.

Cette molécule sonde peut en particulier être choisie parmi toutes les molécules saccharidiques devant être fixées sur un support, par exemple pour des raisons

- analytiques- ou diagnostiques. ^~ Elte ^~ peut notamment ^" être -synthétisée dans le but de représenter une molécule ou biomolécule saccharidique à intérêt biologique tel qu'un

héparane sulfate par exemple, ou dans le but de représenter une chaîne saccharidique jouant elle-même le rôle d'espaceur entre une surface et une molécule ou biomolécule d'intérêt biologique.

Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, la molécule sonde de nature saccharidique présente un poids moléculaire compris entre 180 et 10 000 g/mol environ et encore plus préférentiellement entre 360 et 900 g/mol environ. Elle est de préférence choisie parmi : i) les monosaccharides et en particulier parmi la glucosamine, l'azidoglucosamine, le D-ribose, le D-xylose, le L-arabinose, le D-glucose, D-galactose, le D-mannose, le 2-désoxy-ribose, le L-fucose, la N-acétyl-D-glucosamine, la N-acétyl-D- galactosamine, l'acide N-acétylneuraminique, l'acide D-glucuronique, l'acide

L-iduronique, le D-sorbitol, le D-mannitol, etc.. ii) les oligosaccharides et en particulier parmi le saccharose, le lactose, les fragments d'héparanes sulfates, les fragments saccharidiques de l'héparine, de chondroïtine et de dermatanes sulfates, les antigènes de Lewis, etc..., iii) les poly-oligosaccharides et en particulier parmi les fractions saccharidiques des héparanes sulfates, de l'héparine et de la chondroïtine, les dermatanes sulfates, etc., iv) les glycoconjugués, et en particulier parmi les héparanes sulfates, l'héparine, la chondroïtine, les dermatanes sulfates, etc..., v) les glycoprotéines telles que l'immunoglobuline G, l'acide hyaluronique, etc., vi) les glycolipides tels que les galactosyl-céramides, les gangliosides et les cérébrosides, etc., viii) les glycolipoprotéines telles que la glycoprotéine G90 extraite de tissus du lombric Eisenia foetida (Famille des Lumbricidae) ou bien la glycoprotéine MPB83 fournie par le laboratoire "Veterinary Laboratories Agency" (VLA, Weybridge, UK).

... Une., ou -plusieurs -des -fonctions hydroxyle et/ou aminé des entités saccharidiques de la molécule sonde peuvent être protégées par un ou plusieurs

groupements protecteurs. Ces groupements protecteurs sont bien connus de l'homme du métier et sont amplement décrits dans l'ouvrage de T. W. Greene et al, "Protective Groups in Organic Chemistry", Second Edition, A Wiley-Interscience Publication 1991.

Selon une forme avantageuse de la présente Invention, ces groupements protecteurs sont choisis parmi les groupements acétyle ; benzyle ; aryle et en particulier les groupements aryle substitués par un radical R choisi parmi les chaînes alkyle ayant de 1 à 40 atomes de carbone ; 2,2,2-trichloroéthyloxycarbonyle (Troc) ; benzyloxycarbonyle (Z) ; trichloroacétamidate (TCA) ; tert-butyloxycarbonyle (BOC) et fluoranylméthoxycarbonyle (Fmoc). Selon une autre forme de réalisation avantageuse de l'Invention, une ou plusieurs des fonctions hydroxyle et/ou aminé des entités saccharidiques de la molécule sonde peuvent être substituées par un ou plusieurs groupements hydrophobes permettant de rendre le bras espaceur plus spécifique et/ou plus sélectif vis-à-vis de la molécule cible qui viendra se fixer sur la molécule sonde et/ou de son rôle lors de l'utilisation du bras espaceur.

On peut en particulier citer le cas où en protégeant les fonctions hydroxyle par des groupements protecteurs tels que les groupements benzyle, acétate, benzylidène, isopropylidène, phtalimide etc., la partie saccharidique peut être rendue plus ou moins hydrophobe. Selon encore une autre forme de réalisation avantageuse de l'Invention, la partie anomérique des entités saccharidiques peut être fonctionnalisée, comme tout donneur glycosidique, par un groupement qui sera de préférence choisi en fonction de la nature de la liaison covalente assurant la fixation de la molécule sonde de nature saccharidique à l'une des deux extrémités du bras espaceur X. Selon une forme de réalisation avantageuse de l'Invention, les liaisons covalentes assurant la fixation de chacune des extrémités de la chaîne constituant le bras espaceur X aux unités A et B sont issues de la réaction entre une fonction chimique initialement portée par le précurseur du bras espaceur X et une fonction chimique complémentaire portée , d'une part, par ..la molécule sonde-A - et -d'autre- part par le groupement silanisé B. Il existe bien entendu un grand nombre de couples

donneurs/accepteurs possibles bien connus de l'homme du métier dans le domaine de la chimie des sucres (Khan S. H. et al., "Moderne Methods in Carbohydrate Synthesis", Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, California, USA, 1996) et qui peuvent être utilisés pour former ladite liaison covalente. A titre d'exemple, on peut notamment citer les liaisons covalentes résultant de la réaction entre un radical hydroxyle et un groupement choisi parmi les atomes d'halogène tels que le chlore, le brome, l'iode ou le fluor, ainsi que parmi les groupements phosphite, trichloroacétamidate, thioalkyle, phosphate, pentényle, sulfoxyde et xanthate.

Le bras espaceur X des composés de formule (I) conformes à l'Invention peut être de longueur et de structure variables. Ainsi qu'on l'a vu ci-dessus il comporte néanmoins toujours au moins une insaturation éthylénique sur la chaîne reliant directement A et B.

Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'Invention, le bras espaceur X représente une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée en C ₂ -C ₄₀ ou aryle en C ₆ -C ₄₀ , ladite chaîne comportant au moins une insaturation éthylénique et pouvant éventuellement être interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'oxygène, l'azote, le soufre et le silicium, et/ou une ou plusieurs fonctions telles que les fonctions amides, oximes et aminés tertiaires et/ou éventuellement substituée par un ou plusieurs substituants (de préférence de 1 à 10 substituants) choisis parmi les chaînes alkyles linéaires ou ramifiées en C ₂ -C ₂₀ ou aryle en C ₆ -C ₂₀ , lesdites chaînes pouvant éventuellement être également interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'oxygène, l'azote, le soufre et le silicium.

Selon l'Invention, le groupement silanisé B est de préférence choisi parmi les groupements -Si(Ri) ₃ , -SiRi (R ₂ ) ₂ et -SiRiR ₂ R ₃ dans lesquels les radicaux R], R ₂ et R ₃ , indépendamment les uns des autres, représentent un atome d'halogène tel que le fluor ou le chlore, un radical alkoxy en Ci-C ₄ , un radical alkyle en Ci-C ₄ , un radical amino ou une fonction ester.

Parmi les radicaux alkoxy définis pour les radicaux R ₁ , R ₂ et R ₃ , on préfère tout_particulièrement les radicaux-méthoxy et éthoxy et parmi les radicaux alkyle-

définis pour les radicaux Rj, R ₂ et R ₃ , on préfère tout particulièrement les radicaux méthyle et éthyle.

Parmi les fonctions esters définies pour les radicaux R ₁ , R ₂ et R ₃ , on peut en particulier citer le radical acétoxy. A titre d'unité terminale silanisée B, on peut notamment citer les groupements triméthoxysilyle, triéthoxysilyle, triméthylsilyle et triéthylsilyle.

Parmi les agents de silanisation de formule (I) ci-dessus, on préfère particulièrement ceux dans lesquels :

- A est choisi parmi les monosaccharides, les oligosaccharides et les polysaccharides, et encore plus particulièrement parmi des oligomères tels que Glc-Glc-Glc ; Lac-Lac ou Gal-Gal-Gal-Gal-Gal dans lesquels les abréviations GIc, Lac et GaI signifient respectivement glucose, lactose et galactose ;

- X représente une chaîne carbonée ayant de 2 à 40 atomes de carbone, comportant au moins une insaturation éthylénique, ladite chaîne étant linéaire ou ramifiée, et éventuellement interrompue par un ou plusieurs cycles et/ou une ou plusieurs fonctions telles que les fonctions amides, oximes et aminés tertiaires ;

- B représente un groupement triméthoxysilyle ou triéthoxysilyle. A titre de composé de formule (I) tout particulièrement préféré, on peut citer les composés répondant aux formules (1-1) et (1-2) suivantes :

(M)

dans lesquelles Ac représente le groupe acétyle.

Les agents de silanisations de formule (I) ci-dessus peuvent être facilement préparés selon les principes de synthèse organique bien connus de l'homme du métier suivant la nature des unités A, X et B.

En particulier, ces agents de silanisations peuvent généralement être préparés par un simple assemblage des unités A, X et B, lesdites unités étant soit préalablement préparées soit disponibles commercialement étant entendu que lesdites unités contiennent les fonctions chimiques appropriées à la formation d'une liaison covalente d'une part entre l'unité A et l'une des extrémités du bras espaceur X et, d'autre part, entre l'unité B et l'autre extrémité du bras espaceur X.

Les réactions mises en œuvre sont généralement des réactions de glycosylation classiques de A sur X suivies de réactions d'hydrosilylation (de Karstedt par exemple) pour accrocher B. Les agents de silanisation de formule (I) conformes à l'Invention peuvent être utilisés pour la fonctionnalisation de supports solides.

La présente Invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un agent de silanisation de formule (I) tel que défini précédemment, pour la fonctionnalisation de supports solides, et en particulier pour la fabrication de puces à sucres. L'utilisation des agents de silanisation de formule (I) permet avantageusement de modifier rapidement la surface de supports solides par une couche stable porteuse de molécules sondes de nature saccharidique facilement clivables du support compte tenu de la présence d'au moins une insaturation éthylénique sur le bras espaceur ^" X des composés de formule (î) conformes à l'Invention.

Lorsqu'ils sont utilisés en particulier pour la préparation de puces à sucres, les composés de formule (I) conformes à l'Invention présentent les avantages suivants :

- Ils jouent tout d'abord le rôle d'un bras espaceur en permettant d'éloigner la chaîne saccharidique de la surface du support solide qui supporte cette chaîne. L'unité X des composés de formule (I) conformes à l'Invention permet notamment la liaison avec une très grande gamme de saccharides, d'oligosaccharides ou de polysaccharides. En particulier, les composés de formule (I) peuvent être utilisés soit comme bras espaceur d'une première unité saccharidique, par exemple oligosaccharidique, qui va être accrochée à l'unité X et qu'il est ensuite possible de faire croître (chimie combinatoire sur support solide) soit pour l'accrochage de molécules sondes saccharidiques présynthétisées (accrochage à l'unité X, en position anomérique de leur partie réductrice).

- Le bras espaceur est clivable : grâce à la présence d'au moins une insaturation éthylénique sur l'unité X des composés de formule (I) qu'il est possible de d'ouvrir facilement et de manière ciblée pour isoler le sucre de la phase solide, et ce dans des conditions qui n'altèrent en rien l'intégrité de la molécule sonde saccharidique. On peut en particulier utiliser comme méthode de clivage, une ozonolyse, une métathèse de Grubbs ou une dihydroxylation suivie d'une coupure oxydative de diol-osmylation (OsO ₄ , NaIO ₄ ), ainsi que d'autres réactions chimiques douces de clivage connues de l'homme du métier.

- Enfin, de part leurs fonctionnalités chimiques et le choix des substituants sur leur squelette saccharidique, les composés de formule (I) conformes à l'Invention restent inertes dans de nombreuses conditions expérimentales lors des réactions réalisées.

La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un support solide fonctionnalisé par des molécules sondes de nature saccharidique, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une étape de silanisation d'au moins une surface ..d'un .support -.solide -avec une-solution d-au-moins un- agent de silanisation de formule (I) dans un solvant organique.

Le solvant organique est de préférence choisi parmi le trichloroéthylène, le toluène, et les alcools inférieurs tels que l'éthanol ou le méthanol, ces solvants étant éventuellement additionnés d'un composé basique tel que la triéthylamine ou la N ₅ N- diisopropyléthylamine (DIEA). La mise en contact du support solide avec la solution de l'agent de silanisation de formule (I) est de préférence réalisée à une température comprise entre 4 et 80°C environ, pendant 1 à 48 heures environ.

Le substrat est ensuite rincé avec le solvant de Ia réaction ou avec du chloroforme, puis séché, de préférence à l'azote. Ce procédé présente l'avantage d'être simple à mettre en œuvre et de conjuguer l'étape de silanisation avec l'étape de fonctionnalisation du support solide alors que les procédés connus de l'art antérieur nécessitaient au moins trois étapes successives, c'est-à-dire une première étape de silanisation de la surface du support solide avec une molécule possédant un groupement fonctionnel permettant l'accrochage d'un bras espaceur dans une deuxième étape et enfin l'accrochage d'une molécule sonde saccharidique dans une troisième étape, par exemple selon une réaction de glycosylation. Dans ce cas, une étape d'inactivation ("capping" des sites non glycosylés) était alors nécessaire, ce qui n'est par contre pas le cas selon le procédé de la présente Invention.

Les supports solides pouvant être fonctionnalisés par les agents de silanisation de formule (I) conformes à l'Invention sont de préférence choisis parmi les supports à base de verre, de silice ou de tous autres matériaux connus de l'homme du métier comme pouvant être silanisés.

Ces supports solides possèdent au moins une surface plane ou non, lisse ou structurée, et peuvent se présenter par exemple sous la forme de lame, de plaque plane ou à puits, de capillaire ou encore de bille poreuse ou non.

La présente Invention a donc également pour objet des supports solides caractérisés par le fait qu'ils comportent au moins une surface fonctionnalisée par un ou plusieurs agents de silanisation de formule (I) tels que définis ci-dessus.

De tels supports constituent des puces à sucres qui sont par exemple susceptibles d'être utilisées pour l'identification, par criblage, de molécules saccharidiques

et en particulier de séquences oligosaccharidiques reconnaissant une protéine particulière d'intérêt, par exemple en utilisant la méthode décrite dans la demande internationale WO-A-03/008927.

A l'inverse, les puces à sucres conformes à la présente Invention peuvent également être utilisées pour l'identification, par criblage, de ligands, par exemple de ligands protéiques reconnaissant un saccharide d'intérêt.

Par conséquent, la présente Invention a enfin pour objet un procédé de criblage de molécules saccharidiques, et en particulier de séquences oligosaccharidiques, ou respectivement, de ligands protéiques, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une étape de mise en contact d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par au moins un agent de silanisation de formule (I) tel que défini précédemment avec une solution renfermant une ou plusieurs molécules oligosaccharidique potentielles ou, respectivement un ou plusieurs ligands protéiques potentiels. Dans ces applications particulières, les supports solides fonctionnalisés conformes à la présente Invention permettent d'optimiser les procédés de criblage et donc de disposer plus efficacement et plus rapidement de molécules à visée thérapeutique ou biotechnologique.

Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation d'un composé de formule (I) conforme à l'Invention ainsi qu'à un exemple de fonctionnalisation d'un support solide avec un composé de formule (I) conforme à l'Invention.

Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : PREPARATION DU COMPOSE DE FORMULE (1-1)

dans laquelle Ac représente acétyle.

1) Première Etape : Préparation d'un bras espaceur (3) et d'un dérivé de glucose (5)

La préparation du bras espaceur (3) est réalisée selon le schéma réactionnel A suivant :

SmI ₂ , THF

SCHEMA A

Le bras espaceur (3) est obtenu en 2 étapes successives : le 2-vinyl 3- chloro-tétrahydrofurane (2) est accessible à partir du 2,3-dichlorotétrahydrofurane (1) par traitement avec un réactif de Grignard selon le procédé décrit par L. Crombie, et R. D.

Wyvill, Journal of the Chemical Society, 1985, Perkin Trans 1, 1971 et références citées. .Le_ composé. (2) est ensuite -traité -à reflux dans Ie tétrahydrofurane en présence de 4-7 équivalents de diiodure de Samarium (SmI2) pendant 5 à 165 heures,

selon le procédé décrit par L. Crombie, et L. J. Rainbow, 1988, Tetrahedron Letters, 29(49), 6517.

Le composé (3) est obtenu avec un rendement de 93%. La préparation du dérivé de glucose (5) est réalisée selon le schéma réactionnel B suivant :

SCHEMA B

Le dérivé de glucose (5) (thioglycoside) est obtenu à partir du D- Glucose en deux étapes successives qui sont des réactions classiques de la chimie des sucres :

- une première étape de peracétylation en milieu anhydride acétique/acétate de sodium (Ac ₂ OZAcONa) à 12O ⁰ C pendant lheure (le produit obtenu après précipitation dans l'eau glacée est recristallisé dans l'éthanol à 95%) selon le procédé décrit par K. Takeo, Carbohydrate Research, 1980, 87, 147. Le sous-produit peracétylé est obtenu avec un rendement de 90%, la configuration de la position anomérique est majoritairement β ;

- une deuxième étape d'activation de la position anomérique, dans du dichlorométhane anhydre, en présence de thiophénol et d'un acide de Lewis, en l'occurrence l'éthérate de trifluorure de bore (BF ₃ -Et ₂ O), à température ambiante pendant une heure selon le procédé décrit par A. K Choudhury, N. Roy, Synthetic Communications, 1996, 26, 3937. Cette thioalkylation permet d'atteindre le thioglycoside (5), après recristallisation dans Ie méthanol, et de manière quantitative. Le groupement thiophényle se trouve en position β en raison de la présence d'un groupement participant en position 2.

2) Deuxième étape : Préparation d'un bras espaceur glycosylé (6)

Ce bras espaceur glycosylé est préparé selon le Schéma réactionnel C suivant :

SCHEMA C

Le couplage de ces deux molécules est une réaction de glycosylation d'un glucose protégé sur une chaîne insaturée.

Le thioglycoside (5) (500 mg, 1,13 mmoles, 1 éq.) et le bras espaceur insaturé (3) (127 mg, 1,13 mmoles, 1 éq.) sont dissous dans le dichlorométhane anhydre, en présence de tamis moléculaire (630 mg). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante, puis le milieu réactionnel est amené à une température de -30 ⁰ C. De la N-iodosuccinimide (NIS) (510 mg, 2,26 mmoles, 2 éq.) est alors ajoutée, puis de l'acide trifluorométhanesulfonique (30 μl, 0,34 mmole, 0,15 éq./NIS). Le mélange est alors lentement ramené à température ambiante, sous agitation pendant 30 minutes. Le milieu réactionnel est ensuite neutralisé par une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium puis filtré sur célite. La phase organique est extraite, lavée successivement à l'eau, par une solution aqueuse et saturée de thiosulfate de sodium et par une solution aqueuse et saturée de chlorure de sodium. Les phases organiques réunies sont séchées sur.sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous

vide. Le résidu solide obtenu est purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice. Le produit (6) est obtenu avec un rendement de 70 %. 2) Troisième étape : Préparation du composé de formule fl-l)

Cette étape est réalisée selon le Schéma réactionnel D suivant :

SCHEMA D

Durant cette étape, 100 mg du composé (5) obtenu ci-dessus à l'étape précédente (2,26.10 ^"4 mole, 1 éq.) ont été mis à réagir avec 71 μl (3,62.10 ^"4 mole, 1,6 éq.) de triéthoxysilane en présence de 2,84 μl (4,5.10 ^"4 mole) de catalyseur de Karstedt pendant 3 heures à une température de 50 ⁰ C environ pour conduire à un liquide incolore de composé de formule (6), avec un rendement de 60%.

EXEMPLE 2 : PREPARATION D'UN SUPPORT SOLIDE FONCTIONNALISE AVEC UN AGENT DE SILANISATION DE FORMULE (I)

Dans cet exemple, on a utilisé un substrat plan en SiO2. I) Réhydratation du substrat (réhydratation de Brown)

Un substrat de SiO2 a été mis à tremper pendant 2 heures à température ambiante dans un mélange d'eau désionisée (15 ml) et d'éthanol absolu (20 ml) renfermant 5 g de NaOH.

Le substrat a ensuite _. _été,.lavé...à lleau désionisée, -puis il a été mis à tremper pendant 1 heure dans de l'acide chlorhydrique 0,2 N. Après trempage, le substrat

a de nouveau été lavé à l'eau désionisée puis séché à l'étuve à une température de 8O ⁰ C pendant 30 minutes

2) Silanisation du substrat par le composé de formule (1-1)

Le substrat réhydraté a été mis à tremper dans 10 ml d'une solution de trichloroéthylène (TCE) renfermant 10 mM (21 mg) de composé de formule (I- 1) tel que préparé à l'exemple 1 ci-dessus. Après 1 nuit à température ambiante, le substrat était silanisé par le composé de formule (I- 1) conforme à l'Invention.

Le substrat ainsi fonctionnalisé a ensuite été lavé au TCE, à l'éthanol et enfin au chloroforme. Il a ensuite été séché à l'étuve pendant 30 minutes à une température de 5O ⁰ C.

En vue d'une utilisation ultérieure, le substrat fonctionnalisé a été conservé sous atmosphère inerte (argon ou azote).

Ce substrat peut ensuite être utilisé pour la préparation d'une puce à sucre (croissance d'oligosaccharides sur le substrat silanisé ainsi préparé) ou de toute autre puce à molécule ou biomolécule (dans ce cas, le silane sucré qui fonctionnalise le substrat devient un espaceur pour l'accrochage de toute nouvelle molécule ou biomolécule, naturelle ou synthétique).